Isolierung und Charakterisierung Pathogen-induzierter Gene der Gerste (Hordeum vulgare L.) und Markerentwicklung für den Mlg Resistenzgenlocus mittels cDNA-AFLP

Abstract

In Gerste vermittelt das Resistenzgen Mlg Resistenz gegenüber bestimmten Rassen des Echten Gerstenmehltaupilzes (Blumeria graminis f.sp. hordei, Bgh). In dieser Arbeit konnte über die Darstellung differentieller Genexpression in Mlg- und mlg-Gerstenlinien mittels cDNA-AFLP (amplified fragment length polymorphism) ein neuer Marker für den Mlg Resistenzgenlocus generiert werden. Der Marker CAPS9-1 (cleaved amplified polymorphic sequence) zeigte in allen getesteten Gerstenlinien außer Palmella Blue zuverlässig den Mlg-Locus an. Das Resistenzgen konnte jedoch nicht isoliert werden. Eine Mlg-spezifische Transkript-akkumulation Abwehr-relevanter Gene nach Inokulation mit Bgh wurde im cDNA-AFLP und in anschließenden Genexpressionsanalysen nicht festgestellt. Ungefähr 3,5 % der 16500 im cDNA-AFLP dargestellten Genfragmente waren vier und zwölf Stunden nach Inokulation mit Bgh in Gerstenblättern differentiell reguliert. 120 dieser früh induzierten cDNA-Fragmente wurden isoliert und sequenziert. Neben einem pilzlichen Gen konnten Gerstengene identifiziert werden, die zu einem großen Teil für Proteine aus den Bereichen Phenylpropanoidstoffwechsel, Redox-Regulation und Signaltransduktion kodieren. Für rund ein Viertel der cDNA-Fragmente fanden sich entweder keine homologen Sequenzen in den Datenbanken oder sie kodieren für Proteine mit unbekannter Funktion. Von 28 überprüften Bgh-induzierten Genen akkumulierten fünf auch nach Behandlung mit dem chemischen Resistenzinduktor BTH (Benzo(1,2,3)-thiadiazolcarbothionsäure-S-methyl-ester). Drei dieser chemisch induzierten Gene lassen sich dem Phenylpropanoid-metabolismus zuordnen. Bei einem Vergleich der Genexpression nach Inokulation mit Bgh und dem Nichtwirt-Pathogen Blumeria graminis f.sp. tritici zeigte sich, dass einige Gene durch das Nichtwirt-Pathogen sogar stärker induziert waren. Einer MAP Kinase und einem WRKY Transkriptionsfaktor konnten durch Funktions-analysen im transienten Transformationsassay eine Bedeutung in der Gerste-Bgh Interaktion zugeordnet werden. Silencing der MAP Kinase mittels RNA Interferenz führte zu einer erhöhten Suszeptibilität von Gerstenblättern gegenüber Bgh. Die funktionale MAP Kinase scheint in Gerste damit eine Bedeutung für die Ausbildung von Resistenzreaktionen zu haben. Ein knockout des WRKY Transkriptionsfaktors resultierte dagegen in einer um ca. 30 % erhöhten Resistenz von Gerstenblättern gegenüber Bgh. Somit könnte es sich bei diesem Protein um einen Suszeptibilitätsfaktor handeln, der Abwehrreaktionen negativ reguliert. The resistance gene Mlg mediates race-specific resistance in barley to the powdery mildew fungus Blumeria graminis f.sp. hordei (Bgh). In this study a new marker for the Mlg locus was generated via analysis of differential gene expression in Mlg- and mlg-carrying barley lines by cDNA-AFLP (amplified fragment length polymorphism). The marker CAPS9-1 (cleaved amplified polymorphic sequence) tags the Mlg locus in all tested barley lines, except Palmella Blue. A Mlg-specific transcript accumulation of defence-related genes after inoculation was not detected, neither in the cDNA-AFLP nor in following gene expression studies. About 3.5 % of the 16500 screened cDNA fragments were differentially regulated four and twelve hours after inoculation with Bgh. 120 of the early induced fragments were isolated and sequenced. Besides one fungal gene many barley genes were identified that code for proteins from the phenylpropanoid pathway, redox regulation and signal transduction. For approximately one quarter of the cDNA fragments no homologous sequences with known function could be found in the databases. The expression of 28 Bgh-induced genes was analysed after treatment with the chemical resistance inducer BTH (Benzo(1,2,3)-thiadiazol-carbothionsäure-S-methylester). Five of the corresponding trancripts accumulated after BTH treatment. Three out of them belong to the phenylpropanoid metabolism. A comparison of gene expression after inoculation with Bgh and the non-host pathogen Blumeria graminis f.sp. tritici revealed that some of the investigated genes were even stronger activated upon inoculation with the non-host pathogen. A MAP kinase and a WRKY transcription factor were shown to play a role in the barley-powdery mildew interaction by means of functional analysis in a transient transformation assay. Silencing of the MAP kinase by RNA interference led to enhanced accessibility of barley epidermal cells towards Bgh. The functional MAP kinase seems to have significance for the activation of defence reactions. The knockout of the WRKY transcription factor on the contrary resulted in a 30 % increase of penetration resistance to Bgh. Thus the protein may be a susceptibility factor that negatively regulates defence reactions.