Das strukturelle Korrelat von chronischem Vorhofflimmern : Immunhistochemische und ultrastrukturelle Untersuchung an humanem Atrium

Abstract

Vorhofflimmern ist eine der häufigsten kardialen Arrhythmien und wurde bereits in einigen klinischen und experimentellen Studienuntersucht. Der progressive, zur Chronizität neigende Charakter dieser Erkrankung und die erhöhte Inzidenz mit zunehmendem Alter lassenvermuten, daß strukturelle Veränderungen des atrialen Myokards unabhängig von elektrophysiologischen Veränderungen wesentlich zurEtablierung der Arrhythmie beitragen. In der Pathogenese von Vorhofflimmern wie auch ventrikulären Tachykardien ist eine veränderteReizweiterleitung zwischen einzelnen Zellen durch gap junctions sowie aufgrund fibrotischer Veränderungen von grundlegender Bedeutung.Veränderungen in der Verteilung und Anzahl von gap junction- und extrazellulären Matrixproteinen wurden an ventrikulärem Myokard beinormalem Wachstum, während des Alterns und bei mit Arrhythmie assoziierten Erkrankungen nachgewiesen. Veränderungen von gapjunctions bei Vorhofflimmern wurden bisher überwiegend nur experimentell an normalen Tierherzen untersucht. Die Ergebnisse dieserUntersuchungen variieren stark zwischen den verschiedenen Modellen und die Übertragbarkeit auf die klinische Erkrankung ist durch diefehlende zugrundeliegende chronische atriale Pathologie und die akuten Veränderungen in den Kurzzeit-Modellen limitiert. Die strukturellen Korrelate von chronischem Vorhofflimmern sind immer noch unbekannt. Veränderungen in der Kardiomyozytenverbindungdurch gap junctions werden neben fibrotischen und degenerativen Veränderungen auch als Ursache für die Entstehung von chronischemVorhofflimmern diskutiert. Daher wurde in der vorliegenden Studie Gewebe von 31 Patienten mit chronischem Vorhofflimmern (Maze) im Vergleich zu Gewebe von12 Patienten mit Sinusrhythmus immunhistochemisch (qualitativ und quantitativ) sowie ultrastrukturell im Hinblick auf folgendeFragestellungen untersucht:

remodeling mechanischer und elektrischer interzellulärer Verbindungen, Zunahme extrazellulärer Matrixproteine, 3) Degenerative, nekrotische und apoptotische Veränderungen, 4) Quantitativ veränderteExpression von Connexin 43 und 40 (atriale gap junction Proteine), N-Cadherin (fascia adherens) und Kollagen I (EZM). Nachimmunhistochemischer Darstellung verschiedener intra- und extrazellulärer Proteine erfolgte eine eingehende morphologischeUntersuchung von Kontroll- und Patientengeweben mit Hilfe der konfokalen Mikroskopie sowie eine weiterführende ultrastrukturelleUntersuchung zur Bestätigung der immunhistochemischen Befunde. Im Anschluß an ein exakt standardisiertes Färbeprotokoll wurden die atrialen gap junction proteine Connexin 43 und 40 sowie N-Cadherinder f. adherens und Kollagen I als Protein der EZM mit Hilfe entsprechender software Ausstattung des konfokalen Mikroskopesquantifiziert. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen ergaben deutliche strukturelle Veränderungen im Gewebe von Patienten mit chronischemVorhofflimmern gegenüber Gewebe von Patienten mit Sinusrhythmus. Alle Patienten mit chronischem Vorhofflimmern zeigten einegleichzeitige Lateralisierung bzw. oberflächliche Verteilung von Connexin 43, Connexin 40, N-Cadherin und Desmoplakin.Elektronenmikroskopisch wurden laterale gap junctions innerhalb intakter lateraler Glanzstreifen sowie isoliert von diesen nachgewiesen.Bei isolierten lateralen gap junctions handelte es sich sowohl um intakte, normal erscheinende gap junctions als auch um sogenannte'anular profiles'. An den lateralen Zellgrenzen traten häufig abnorme Ansammlungen elektronendichten Materials auf, bei denen es sich umN-Cadherin handeln kann. Bei Vorhofflimmern waren die atrialen gap junction Proteine reduziert gegenüber dem Kontrollgewebe. Dabeiwar Connexin 43 sowohl in Atrium als auch Appendix der Maze-Patienten vermindert, während Connexin 40 nur in den Appendicesreduziert war. Die Expression von N-Cadherin war bei Vorhofflimmern unverändert. Ausgeprägte fibrotische Veränderungen waren beiallen Patienten mit Vorhofflimmern immunhistochemisch sowie ultrastrukturell nachweisbar. Degenerative Veränderungen traten beiVorhofflimmern aber auch im Kontrollgewebe bei Sinusrhythmus auf. Die Anzahl Ubiquitin, Komplement C9 oder TUNEL-positiverKardiomyozyten war bei Vorhofflimmern vernachlässigbar gering. TUNEL-positive Zellkerne konnten elektronenmikroskopisch nicht alsApoptose bestätigt werden. Diese Ergebnisse zeigen, daß chronisches Vorhofflimmern zu deutlichen strukturellen Veränderungen im atrialen Myokard führt.Zusammenfassend läßt sich sagen, daß sowohl das remodeling mechanischer und elektrischer interzellulärer Verbindungen und dieverminderte Connexinexpression als auch die ausgeprägten fibrotischen Veränderungen und die Zunahme extrazellulärer Matrixproteineals strukturelle Korrelate von chronischem Vorhofflimmern anzusehen sind. Strukturelles remodeling der interzellulären Verbindungen kannzusammen mit den fibrotischen Veränderungen lokale Leitungsabnormalitäten verursachen und so zur Entstehung und Aufrechterhaltungvon reentry-Kreisläufen und Vorhofflimmern beitragen.

Atrial fibrillation is one of the most common cardiac arrhythmias and has been already investigated in numerous clinical and experimentalstudies. The progressive character of the disease, its tendency to become chronic and the increased incidence with advancing agesuggest that independent of electrophysiological changes structural changes of the atrial myocardium may significantly contribute to theestablishment of the arrhythmia. Conduction disturbances between individual myocytes due to changes of gap junctions have a fundamentalimportance in the pathogenesis of atrial fibrillation as well as ventricular tachycardia. Changes in number and distribution of gap junctionsand an increase in fibrosis have been reported in ventricular myocardium during normal growth, aging and in cardiac diseases which areassociated with arrhythmia. Changes of gap junctions in atrial fibrillation were mainly investigated in experimental animal models. Theresults of these studies are still contradictory and their clinical relevance is limited because of the absence of chronic atrial pathology.Furthermore only acute changes can be studied in short-time experiments. The structural correlates of chronic atrial fibrillation are still unknown. Changes in the intercellular connection of cardiomyocytes concerninggap junctions as well as fibrotic and degenerative changes are discussed as possible causes for the initiation and self-perpetuation ofchronic atrial fibrillation. Therefore in the present study the atrial tissue of 31 patients with chronic atrial fibrillation (Maze) were immunohistochemically (qualitativelyand quantitatively) and ultrastructurally examined in comparison to the atrial tissue of 12 patients with sinus rhythm with regard to thefollowing questions: 1) remodeling of intercellular mechanical and electrical connections, 2) extent of interstitial fibrosis, 3) quantitativelychanged expression of Connexin 43 and 40 (atrial gap junction proteins), N-Cadherin (fascia adherens) and Collagen I (extracellularmatrix). After immunolabeling of different intra- and extracellular proteins all tissues were morphologically examined in detail by laserscanning confocal microscopy. In addition an ultrastructural examination was performed to confirm the immunohistochemical results. Following a standardized labeling protocol Connexin 43 and Connexin 40 as well as N-Cadherin and Collagen I have been quantified usinga suitable software of the confocal microscope. The results of the present study showed obvious structural changes in the tissues of patients with chronic atrial fibrillation as compared totissues from patients with sinus rhythm. All patients with chronic atrial fibrillation demonstrated a concomitant lateralisation andredistribution of Connexin 43, Connexin 40, N-Cadherin and Desmoplakin. Electron microscopy showed lateral gap junctions both, in intactlateral intercalated discs and isolated from intercalated discs. Isolated lateral gap junctions were either intact and of normal appearance orpresented 'anular profiles'. At the lateral cell borders abnormal accumulations of electron dense material were often detected, which mightbe N-Cadherin. Quantitative studies showed that the atrial gap junction proteins were reduced in atrial fibrillation. The Connexin 43 was reduced in atriumand appendages of Maze-patients whereas Connexin 40 was only reduced in the appendages. The expression of N-Cadherin was notaltered in atrial fibrillation. Distinct interstitial fibrosis was immunohistochemically and ultrastructurally shown in all patients with atrialfibrillation. Degenerative changes were present in atrial fibrillation but also in control tissue of patients with sinus rhythm. The rate ofubiquitin, complement C9, or TUNEL positive cardiomyocytes was extremly low in atrial fibrillation. TUNEL positivity of nuclei could not beconfirmed as apoptosis by electron microscopy. These results show that chronic atrial fibrillation is associated with distinct structural changes of the atrial myocardium. Both the remodelingof mechanical and electrical intercellular junctions, the reduced expression of connexins and the high degree of interstitial fibrosis can beregarded as structural correlates of chronic atrial fibrillation. Structural remodeling of intercellular junctions accompanied by fibrosis maycause localized abnormal conduction and thereby contribute to the initiation and establishment of reentry pathways and atrial fibrillation.