Diversität und Klonalität multiresistenter Acinetobacter-Stämme von Patienten deutscher Tierkliniken und Tierarztpraxen

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Klassifizierung und Charakterisierung Acinetobacter-Isolate, die von Patienten aus deutschen Tierkliniken stammten. Der Schwer¬punkt lag dabei auf der Analyse des Verwandtschaftsgrads der animalen Isolate untereinander sowie des Verwandtschaftsgrads zu humanen Stämmen. Für die Untersuchungen standen 56 Acinetobacter-Feldisolate, die zwischen 2000 und 2008 aus unterschiedlichen Proben von Hunden, Katzen, Pferden, Rindern, einem Meerschweinchen, einem Wellensittich und einer Umgebungsprobe kultiviert werden konnten, zur Verfügung. Den Abschluss dieser Studie bildete eine retrospektiv durchgeführte Datenrecherche zur Ermittlung des Vorkommens von A. baumannii in veterinärmedizinischem Probenmaterial sowie einer etwaigen klinischen Bedeutung des Erregers.Hinsichtlich des Phänotyps unterschieden sich die Isolate lediglich in ihrer Wachstumsfähigkeit bei 44 °C. Dadurch war eine Einteilung in A. baumannii (n = 52) bzw. non-A. baumannii-Spezies (n = 4) möglich. Die animalen Acinetobacter-Isolate wiesen Mehrfachresistenzen auf. Mit Ausnahme der Antibiotika Amikacin, Imipenem und Polymyxin B waren die getesteten Chemotherapeutika bei der Mehrzahl der untersuchten Feldisolate unwirksam. Die molekulare Charakterisierung der 56 Acinetobacter-Feldisolate erfolgte durch Analyse der 16S rDNS und DNS-Fingerprinting.Mittels der Amplified Ribosomal DNA Restriction Analysis der 16S rRNS-Gene mit fünf Restriktionsenzymen wurde die phänotypische Klassifizierung von 52 der 56 Feldisolate als Angehörige der klinisch bedeutsamsten Spezies A. baumannii bestätigt. Für drei der phänotypisch als non-A. baumannii deklarierten Isolate konnte ein dem A. genomosp. 3 (A. pittii sp. nov., [157]) ATCC 19004-Referenzstamm entsprechendes Restriktionsprofil nachgewiesen werden. Ein Isolat (Nr. 43) wies ein bislang nicht klassifizierbares Profil auf. Durch die Makrorestriktion genomischer DNS mit der Endonuclease ApaI und der sich anschließenden Pulsfeldgelelektrophorese wurde ein genetischer Fingerabdruck erstellt. Die Acinetobacter-Isolate aus deutschen Tierkliniken zeigten hierbei einen hohen, bis zu 100 %igen Verwandtschaftsgrad. Auch die zehn Isolate aus außeruniversitären Tierkliniken und privaten Tierarztpraxen wiesen z. T. identische Bandenmuster auf. Insgesamt konnten drei Cluster sowie neun einzelne PFGE-Typen differenziert werden. Die Ergebnisse lassen darauf schließen, dass mehrere epidemische A. baumannii-Klone in deutschen Tierkliniken und Tierarztpraxen kursieren. Die genetische Diversität innerhalb dieser Spezies scheint darüber hinaus begrenzt zu sein.Eine weitere hochauflösende Fingerprinting-Methode, die sog. AFLP-Analyse, ermöglicht zeitgleich eine Speziesidentifikation sowie eine Typisierung von Acinetobacter-Feldisolaten. Die Ergebnisse der AFLP-Analysen stimmten weitgehend mit denen der PFGE überein. Darüber hinaus konnte die Zugehörigkeit von 19 Isolaten zu humanen Stämmen, den EU-Klonen I, II oder III, nachgewiesen werden. Nach diesen Ergebnissen ist A. baumannii die vorherrschende Acinetobacter-Spezies in Probenmaterial von Patienten deutscher Tierkliniken. Das Vorkommen von Isolaten des PFGE-Clusters 2 bei verschiedenen Tieren in einer Kleintierklinik über einen Zeitraum von acht Jahren weist auf ein endemisches Geschehen hin. Der Nachweis der Europäischen Klone I, II und III in kranken, hospitalisierten Tieren lässt darauf schließen, dass es sich bei der Spezies A. baumannii, ähnlich wie in der Humanmedizin, um einen ernst zunehmenden nosokomialen Erreger in der Veterinärmedizin handelt. Auf Grund der Verwandtschaft animaler und humaner Stämme ist nicht auszuschließen, dass es zu einer wechselseitigen Übertragung der A. baumannii-Stämme zwischen Mensch und Tier kommt. The aim of the present study was to classify and characterize Acinetobacter isolates from German veterinary clinic patients. Analysing the degree of relationship among the animal isolates themselves as well as comparison with human strains has been the main focus. Altogether, 56 Acinetobacter isolates gaining from samples taken from dogs, cats, horses, cattle, one guinea pig, one budgerigar and one environmental swab in between 2000 and 2008 were examined thoroughly. Finally, a retrospective data investigation was performed to determine the frequency of A. baumannii in veterinary samples and a possible clinical impact of this organism.Regarding the phenotype, isolates only differed in their ability to grow at 44 degrees. Based on this result, they were either identified as A. baumannii (n = 52) or non-A. baumannii species (n = 4). Animal Acinetobacter isolates featured multiple drug resistances. Except amikacin, imipenem and polymyxin B, tested chemotherapeutics were ineffective against the majority of the field isolates. Molecular characterization of the 56 Acinetobacter field isolates was performed by 16S rDNA analysis and DNA fingerprinting. The 16S rRNA gene sequences have been the target of PCR-RFLP studies by use of five restriction endonucleases resulting in the classification of 52 from 56 field isolates as members of the clinically most important species A. baumannii. Three phenotypically assigned to non-A. baumannii isolates yielded the same restriction profile like the A. genomosp. 3 (A. pittii sp. nov., [157]) ATCC reference strain 19004. One isolate (no. 43) revealed a not yet classified profile.DNA fingerprints were produced by macrorestriction of genomic DNA with the endonuclease ApaI and subsequent pulsed-field gel electrophoresis. Acinetobacter isolates from different German veterinary clinics showed a high degree of molecular relatedness of up to 100 %. Even the ten isolates from non-university hospitals featured in part identical band patterns. In general, three clusters and nine unique PFGE types could be detected. These results imply circulating of several epidemic A. baumannii clones in German veterinary clinics as well as animal veterinary practices and that the genetic diversity within this species seems to be limited. Another high resolution fingerprinting method called AFLP analysis was performed. Thereby species identification and typing of the Acinetobacter field isolates can be carried out simultaneously. The AFLP results showed a correlation with those obtained by PFGE. In addition, membership of 19 isolates to human strains, the European clones I, II or III, could be detected. Within the genus Acinetobacter, A. baumannii is the predominant species in specimens from patients of German veterinary clinics. The occurrence of PFGE cluster 2 isolates in different animals of a small animal clinic over eight years might indicate endemic occurrence of these organisms. Occurrence of the European clones I, II and III in ill, hospitalized animals might indicate that, like in human medicine, A. baumannii is an upcoming nosocomial pathogen in veterinary medicine. Due to the relationship of animal and human strains, it cannot be ruled out that it comes to a mutual transmission of A. baumannii strains between humans and animals.