Translocation proteomics : a novel proteomic approach for the identification of signalling intermediates

Abstract

Members of the transforming growth factor (TGF)-beta superfamily are keyregulators of lung development and homeostasis, as well as alveolar epithelial cellfunction. TGF-beta signalling involves ligand-dependent phosphorylation of receptorserine/threonine kinases, phosphorylation of pathway-specific transcription factors(Smads), nuclear translocation of Smads, and ultimately, modulation of geneexpression. Although Smad-dependent responses represent the primary signallingsystem activated by TGF-beta receptors, alternative signalling systems have recentlybeen described, which also mediated TGF-beta-induced effects. In this study, aproteomic approach was employed to identify: a) candidate proteins that are subjectedto nuclear-cytoplasmic shuttling in response to TGF-beta stimulation and b) novelproteins phosphorylated within TGF-beta signaling pathway. In order to reducecomplexity of the total proteome subcellular fractionation and phosphoproteomeenrichment of A549 cells had been performed. Cytoplasmic, nuclear, andphosphoprotein enriched fractions were subjected to two dimensional polyacrylamidegel electrophoresis, tryptic digestion, and mass spectrometry in order to identify novelcandidates/mediators of the TGF-beta signaling pathway. In the first part of this study, arapid increase of KHRSP, FUBP1, hnRNP-L, and hnRNP-H1 localization in thecytosol of A549 cells was observed, concomitant with a decrease in their nuclearlocalization after TGF-beta stimulation. Proteomic data were confirmed byimmunofluorescence and immunoblotting analyses. In the second part of this study,25 phosphoproteins were identified after TGF-beta stimulation, 20 of them with differentphosphorylation pattern in 2-DE and 5 of them without changes after TGF-betastimulation. In conclusion, we showed that proteomic approach can be used fordetecting novel intermediate proteins in signalling pathways and that regulatoryfunctions of TGF-beta signalling are broader than previously thought. Mitglieder der TGF-beta Familie stellen Schlüsselfaktoren für die Entwicklung und Homöostase der Lunge dar, sowie für die Funktion des alveolären Epithels. Die TGF-beta Signalkaskade erfolgt durch ligandenabhängige Phosphorylierung von Rezeptor Serin/Threoninkinasen, anschließende Phosporylierung von spezifischen Transkriptionsfaktoren (Smads), die Translokation der Smads in den Nukleus und schließlich die Regulierung der Genexpression. Obwohl die smadabhängige Signaltransduktion das primäre Signalsystem darstellt, das durch TGF-beta Rezeptoren aktiviert wird, wurden kürzlich auch andere Signalsysteme beschrieben, die ebenfalls durch TGF-beta induzierte Effekte vermitteln. In der vorliegenden Studie nutzten wir einen proteomischen Ansatz um a) mögliche Proteine zu identifizieren, die als Reaktion auf TGF-beta-Stimulation zwischen dem Nukleus und dem Zytoplasma pendeln und b) neue Proteine zu finden, die durch den TGF-beta Signalweg phosphoryliert werden. Um die Komplexität des Proteoms zu reduzieren wurde eine subzelluläre Fraktionierung und eine Anreicherung der Phosphoproteine von A549 Zellen durchgeführt. Mit den zytoplasmatischen, den nukleären und den Phosphoproteinfraktionen wurden jeweils zweidimensionale Polyacrylamid Gelelektrophoresen durchgeführt, anschließend eine Verdauung durch Trypsin und schließlich wurden mit Hilfe von Massenspektrometrie neue Kandidaten bzw. Mediatoren des TGF-beta Signalweges identifiziert. Im ersten Teil der Studie wurde nach der TGF-beta Stimulation ein rapider Anstieg von KHRSP, FUBP1, hnRNP-L und hnRNP-H1 im Zytosol der A549 Zellen beobachtet, einhergehend mit einer Abnahme dieser Proteine im Zellkern. Diese Daten wurden mit Hilfe von Immunfluoreszenz und Immunblots bestätigt. Im zweiten Teil der Studie wurden nach TGF-betaStimulation 25 Phosphoproteine identifiziert, von denen 20 ein verändertes Phosphorylierungsmuster in der 2 dimensionalen Gelelektrophorese aufwiesen und 5 Proteine keine Veränderung zeigten. Insgesamt zeigten wir, dass ein proteomischer Ansatz geeignet ist, um neue vermittelnde Proteine in Signaltransduktionswegen zu identifizieren und dass die regulatorischen Funktionen des TGF-beta Signalweges umfassender sind als bisher angenommen.