Die Reaktivierungskinetik humaner Polyomaviren bei Nierentransplantierten und ihre Quantifizierung mittels differentieller Real-Time-PCR

Abstract

Die Reaktivierung des humanpathogenen Polyomavirus BKV wird zunehmend als Ursache für eine Funktionsverschlechterung transplantierter Nieren bis hin zum Transplantatverlust im Rahmen einer PAN erkannt. Die Nadel-Biopsie des Nierentransplantats ist derzeit noch der genaueste Test zur Diagnose einer PAN. Einem nicht-invasiven Verfahren zur frühzeitigen Diagnostik einer PAN kommt somit eine große klinische Bedeutung zu. Im Rahmen dieser Arbeit ist es uns gelungen eine LC-PCR-Methode zu entwickeln, die eine gleichzeitige Amplifikation der BKV- und JCV-DNA und deren Differenzierung aufgrund unterschiedlichen Annealing-Verhaltens der eingesetzten Hybridisierungssonden ermöglicht. Die PCR dient dem quantitativen Nachweis der BKV- und JCV-DNA in Urin- und Serumproben von Nierentransplantat-Empfängern und ist dadurch den bisherigen nicht-invasiven diagnostischen Verfahren zur Erkennung einer BKV-/JCV-Reaktivierung überlegen. Insgesamt wurden von uns 152 Nierentransplantatempfänger mittels differenzieller real-time-PCR auf BKV- und JCV-DNA in Serum und Urin untersucht. Die Gesamtprävalenz der BKV-DNA in Urin und Serum betrug 81,6% und 10,5%, die der JCV-DNA im Urin 11,2%. Eine JC-Virämie kam nicht vor.Zur Darstellung von BKV-Reaktivierungskinetiken innerhalb der ersten zwei Jahre p. t. wählten wir 26 Patienten aus den 152 untersuchten aus. Anhand vorliegender Serum-Kreatininwerte der Patienten konnten zugleich mögliche Einflüsse der BKV-Reaktivierungskinetiken auf die Nierentransplantat-Funktion beobachtet werden. Es zeigte sich, dass eine BKV-Reaktivierung in den meisten Fällen bereits innerhalb der ersten drei Monate p. t. beginnt und eine Häufung der maximalen Virurie und Virämie im dritten und vierten Monat p. t. vorliegt. Des Weiteren deuten unsere Verlaufsbeobachtungen darauf hin, dass selbst BKV-Reaktivierungen mit einer geringen Virusausscheidung im Urin Einfluss auf die Nierenfunktion nehmen können und dass der Anteil der Patienten, die einen Funktionsverlust der Nierenfunktion zeigen, unter den BKV-Serum-positiven deutlich höher liegt, als unter den BKV-Serum-negativen. Die Gefahr einer BKV-Positivität im Serum ist unseren Beobachtungen zufolge im Rahmen eines Anstiegs der BK-Virurie um zwei log-Stufen und einer erreichten BK-Virurie >104 Ge/ml gegeben. Aus unseren Untersuchungsergebnissen schließen wir daher, dass eine einmalige BKV-Quantifizierung in Urin und/oder Serum und die Festlegung eines generellen Cut-off-Wertes für die BK-Virurie oder -Virämie zur Diagnose einer PAN nicht sinnvoll ist. Erst eine kinetische Beurteilung der BK-Virurie unter Berücksichtigung der laborchemischen Parameter der Nierenfunktion und ergänzender Quantifizierung der BK-Virämie ermöglicht die frühzeitige Diagnostik einer PAN. Die Screening-Intervalle sollten aufgrund der gewonnenen Erkenntnisse innerhalb des ersten Jahres p. t. engmaschig gewählt werden. A reactivation of the human pathogenic BK virus is increasingly being seen as the cause of deterioration in kidney function and transplant loss through PAN in transplanted kidneys. A needle biopsy of kidney transplants is currently the most accurate test for the diagnosis of PAN and a non invasive method for the early diagnosis of PAN would therefore be of significant clinical value. In this study we developed a LC-PCR method which makes a simultaneous amplification and differentiation of BK and JC virus DNA possible. This is a result of different annealing behaviours of the implemented hybridising probes. The PCR serves as a quantitative measure of BK and JC virus DNA in urine and serum samples of kidney transplant receivers making it more advanced than other non invasive methods of determining BK/JC virus reactivation. We investigated a total of 152 kidney transplant receivers for BK and JC virus DNA in serum and urine samples with differential real-time PCR. The total prevalence of BK virus DNA in urine and serum was 81.6% and 10.5% respectively, and the prevalence of JC virus DNA in urine was 11.2%. A JC viremia did not occur. To illustrate the kinetics of BK virus reactivation in the first two years post-transplant, we monitored the serum creatinine levels 26 of the 152 patients. Through this, possible influences of BK virus reactivation kinetics on the transplanted kidney function could also be observed. It was seen that in most cases a BK virus reactivation began within the first three months post-transplant and showed a maximum viremia and viruria in the third and fourth months post-transplant. Furthermore, our observations indicated that even BK virus reactivations with a low urine virus excretion can have an influence on kidney function and the proportion of patients showing deterioration in kidney function is considerably higher in the BK virus serum positive group than in the BK virus serum negative one. We observed that a higher risk of BK virus serum positivity is given with an increase of BK viruria by two log units and a BK viruria of >104 ge/ml. From our investigation results we therefore conclude that a single BK virus quantification in urine and/or serum and the determination of a general cut off value for BK viruria or viremia for the diagnosis of a PAN is insufficient. Only a kinetic evaluation of the BK viruria together with the laboratory parameters for kidney function and quantification of the BK viremia allow an early diagnosis of PAN. Our findings also show that the screening intervals should be kept short in the first year post-transplant.