Nachweis des FcgammaRIIa-Polymorphismus bei Patienten mit aggressiver Parodontitis (AP) und einer parodontal gesunden Kontrollgruppe mittels allelspezifischer PCR

Abstract

In der vorliegenden Arbeit sollte ein möglicher Zusammenhang zwischen der aggressiven Parodontitis und dem FcgammaRIIa-Polymorphismus (rs1801274) innerhalb einer mitteleuropäischen Population nachgewiesen werden. Um diese Untersuchungen reproduzierbar und einfach durchführen zu können, sollte zum Nachweis ein System mit allelspezifischen Primern etabliert werden. Alle Studienteilnehmer wurden vor Untersuchungsbeginn über das Ziel und den Ablauf der Studie aufgeklärt und gaben ihr schriftliches Einverständnis. Die Probanden und Patienten wurden nach bestimmten Kriterien ausgewählt und in zwei Gruppen eingeteilt. Von den insgesamt 96 Teilnehmern an der Studie wurden 46 als Probanden und 50 als Patienten mit einer AP klassifiziert. Die Erkrankung war anhand von klinischen und radiologischen Faktoren diagnostiziert worden. Ihnen wurde Blut entnommen und daraus die DNA isoliert. Zur Darstellung der klinischen Situation wurden die Parameter PI, PBI, ST, SB und AL bestimmt. Erwartungsgemäß waren diese Werte bei der Gruppe der Patienten deutlich erhöht und gaben die Einschlusskriterien wieder. Zum Nachweis des Polymorphismus wurde ein System mit allelspezifischen Primern, wie es ähnlich schon von Flesch et al. (1998) beschrieben wurde, gewählt.In einer Reihe von Vorversuchen wurden verschiedene Polymerasen, Konzentrationsverhältnisse der PCR-Komponenten und PCR-Programme ausgetestet, bis schließlich ein funktionsfähiges System gefunden war. Die beiden Allele 131R und 131H konnten nach PCR und Gelelektrophorese unter UV-Licht sichtbar gemacht werden. Die Ergebnisse wurden dann zur Dokumentation fotografiert. Für dieses System hat sich die Kombination aus HotStarTaqÔ-Polymerase einschließlich aller mitgelieferten Komponenten in Verbindung mit den allelspezifischen Sense-Primern 131R, 131H und dem entsprechenden Antisense-Primer 131R/131H rev als besonders tauglich erwiesen (modifiziert n. Flesch et al. 1998). Als Positivkontrolle diente das Primerpaar HGH-I/HGH-II (Bein et al. 1992). Es ergaben sich charakteristische Banden bei 253bp für 131R bzw. 131H und bei 439bp für die Positivkontrolle. Dies wurde durch eine extern durchgeführte Sequenzierung von zufällig ausgewählten PCR-Produkten nochmals verifiziert. Mit diesem System wurde eine Gruppe AP-Patienten und eine gesunde Kontrollgruppe untersucht. In der Allelhäufigkeit waren keine großen Unterschiede zwischen den beiden Gruppen erkennbar. Jedoch konnten bei der Genotypverteilung eindeutig Unterschiede nachgewiesen werden. Die Genotypen 131R/131H und 131H/131H kamen bei den Probanden zu 60,9% und 32,6%, bei den AP-Patienten zu 56,0% und 20,0% vor. Der für die AP relevante Genotyp 131R/131R war bei den Patienten mit 24,0% gegenüber 6,5% bei den Probanden deutlich überrepräsentiert.Dies bekräftigt die Aussage von Wilson & Kalmar (1996), die einen Zusammenhang zwischen den polymorphen Formen des FcgammaRIIa und der AP vermuteten. Deren Vermutung stützt sich auf die Tatsache, dass der 131R-Allotyp IgG2 als vorherrschende Antikörperklasse bei parodontalen Erkrankungen nicht effizient bindet. Aufgrund dieser Ergebnisse muss man möglicherweise davon ausgehen, dass der untersuchte Polymorphismus mit einer Prädisposition für die AP assoziiert werden kann. Es sollten unbedingt weitere Studien mit einer noch größeren Anzahl an Studienteilnehmern durchgeführt werden, um die Bedeutung dieses und anderer FcgammaRIIa-Polymorphismen für die Ätiologie und Pathogenese der AP besser zu klären. The aim of the present study was to determine a possible association between aggressive periodontitis and FcgammaRIIa-polymorphism (rs1801274) within a Caucasian population from central Europe. To make this investigation simple and reproducible, an assay technique to detect this polymorphism should be established.At the beginning of this study, all participating persons were informed about the aims and the course of the examination and gave their declaration of consent. All subjects were selected by certain criteria and divided into two groups. Among the 96 participants of the study, 46 of them were classified as control subjects and 50 as patients suffering from aggressive periodontitis. The diagnosis of the disease is based on clinical and radiological parameters. Genomic DNA was isolated from whole blood samples. The clinical situation was described by parameters such as plaque index (PI), gingival index (PBI), pocket depth (ST), bleeding on probing (SB) and clinical attachment loss (AL). As expected, the clinical parameters of the patients were considerably above those of the control subjects. For the detection of the polymorphism a system with allelspecific primers was used similar to that described by Flesch et al. (1998).In several preliminary tests diverse polymerases, concentrations of all PCR components and cycle programs were tested in order to find a functional PCR system. After amplification by polymerase chain reaction (PCR) and agarose gel electrophoresis the two alleles 131R and 131H could be shown with help of UV-light. The results of the gel electrophoresis were documented by photographs.The combination of HotStarTaqÔ-polymerase, including the provided buffers and reagents, and the allelspecific senseprimers 131R and 131H as well as the antisenseprimer 131R/131H rev were proved to be very suitable (modified by Flesch et al. 1998). For internal control the primers HGH-I/HGH-II were used (Bein et al. 1992). 131R and 131H resulted in 253bp-fragments, the internal control HGH-I/HGH-II in 439 bp-fragments. A sequencing analysis of random selected PCR products was arranged by an external institute to verify the reliability of the described method.The system described above was used to determine a group of AP-patients and a healthy control group. No significant differences in allelic frequency but in the distribution of the 3 genotypes were detectable between the two groups. The genotypes 131R/131H and 131H/131H occurred quite similar in both groups (control subjects 60,9% and 32,6%; AP-patients 56% and 20%). The 131R/131R genotype occurred considerably more frequent (24%) in aggressive periodontitis patients and relatively rare (6,5%) in control subjects.This confirms the statement of Wilson & Kalmar (1996), who suspected the polymorphic forms of FcgammaRIIa to be associated with aggressive periodontitis. This assumption is based on the fact, that 131R is not able to bind IgG2 efficiently, which is the predominant Ig-subclass in periodontal disease. Due to the results of this study we have to conclude, that the investigated FcgRIIa-polymorphism can be potentially associated with aggressive periodontitis. Further studies with a larger number of participants should be arranged to resolve the impact of FcgammaRIIa-polymorphisms on the aetiology and pathogenesis of aggressive periodontitis.