Expressionsanalysen von hepatischen microRNA in murinen Langzeit-Modellen der hepatischen Cholestase

Abstract

MicroRNA beeinflussen auf posttranskriptioneller Ebene die Proteinsynthese und sind in einer Vielzahl von Signalwegen sowie Prozessen involviert. Insbesondere bei Tumorerkrankungen wurde eine veränderte Expression spezifischer microRNA gezeigt, allerdings ist die genaue Funktion in der Entstehung und Modulation von Pathologien größtenteils unverstanden. In dieser Arbeit erfolgten microRNA-Expressionsanalysen im murinen Langzeit-Modell mit verschiedenen hepatischen Erkrankungen. Hierzu wurden Inzuchtmäuse des genetischen Hintergrundstammes BALB/c im Alter von 8, 16, 26 so-wie 52 Wochen untersucht. Das erste Modell (ABCB4-/-) mit Knockout des ABCB4-Gens entwickelt im Rahmen einer sklerosierenden Cholangitis durch chronische Cholestase eine Leberfibrose und Tumore. Das zweite Modell (HBVTg) weist eine Überexpression und Akkumulation des Hepatitis-B-Oberflächenantigens LHB auf und bildet eine Pathologie, vergleichbar einer chronischen HBV-Infektion. Im Verlauf entwickeln diese Tiere das Bild einer chronischen Hepatitis sowie hepatozelluläre Tumore. Das dritte verwendete sogenannte Hybrid-Mausmodell (HBVTg-ABCB4-/-) ist eine Kombination der beiden vorherigen und zeichnet sich insbesondere durch eine erhöhte Tumorinzidenz aus. Mit Array-Analysen wurden 1900 microRNA in 16 Wochen alten, weiblichen Mäusen des Hybridmodells analysiert. 51 microRNA wiesen eine signifikant verstärkte, 69 eine verminderte Expression auf. Sechs microRNA (miR-199a-3p, miR-182a-5p, miR-21a-5p, miR-122-5p, miR-23a-3p, miR-101a-3p) wurden mittels qRT-PCR analysiert. MiR-199a-3p wurde sowohl im HBVTg- und vor allem im ABCB4-/--Modell verstärkt und im zeitlichen Verlauf zunehmend exprimiert. Im Hybridmodell ergab sich ein synergistischer Effekt beider Pathologien und die größte Zunahme der miR-199a-3p Expression. MiR-182a-5p zeigte im ABCB4-/-- und Hybridmodell eine globale Expressionsverstärkung, wobei der Effekt zum Zeitpunkt von 16 und 26 Wochen am stärksten ausgeprägt war. Das HBVTg-Modell hingegen wies einen nahezu linearen Anstieg des Expressionslevels auf. MiR-21a-5p zeigte im ABCB4-/-- und im Hybridmodell eine Hochregulation, wo-hingegen im HBVTg-Modell nahezu keine Änderung der Expression zu verzeichnen war. Die leberspezifische miR-122-5p zeigte mit Ausnahme der 16 Wochen alten ABCB4-/--Mäuse eine global verminderte Expression, welche im HBVTg-Modell am stärksten ausgeprägt war. Eine inhomogene Expressionsänderung im zeitlichen Verlauf wies miR-23a-3p auf. Es ergab sich eine nahezu gleichbleibend erhöhte Expression im HBVTg-Modell sowie ein undulierender Verlauf des erhöhten Expressionslevels im Hybridmodell mit maximaler Ausprägung im Alter von 16 Wochen. Ein anderes Bild zeigte sich im ABCB4-/--Modell mit verminderter Expression zum Zeitpunkt 16 Wochen und progredienter Expressionsverstärkung mit zunehmendem Alter der Versuchstiere. Die Expressionsänderung von miR-101a-3p wiesen im ABCB4-/-- und HBVTg-Modell einen vergleichbaren Verlauf auf. Einer initial minimal bestehenden Verstärkung folgte zum Zeitpunkt 16 bzw. 26 Wochen eine verminderte Expression mit nachfolgendem Anstieg auf einen dem Wildtyp vergleichbarem Ausgangswert (HBVTg) bzw. vermehrte Expression (ABCB4-/-). Im zeitlichen Verlauf ergibt sich im Hybridmodell eine stetig sinkende Expression. Letztendlich konnte mit der Arbeit gezeigt werden, dass in den unterschiedlichen Lebermodellen in Abhängigkeit von Ätiologie und Zeitverlauf spezifische microRNA reguliert werden. MicroRNA affect protein synthesis at the post-transcriptional level and are involved in a variety of signaling pathways as well as processes. Especially in carcinogenesis an altered expression of specific microRNA has been shown. However, the exact function in formation and modulation of pathologies is not well understood. In this work, microRNA expression analysis was performed in murine long-term models of various hepatic diseases. For this purpose, mice of the genetic background BALB/c at the age of 8, 16, 26 and 52 weeks were examined. The first murine model (ABCB4-/-) with knock-out of the ABCB4 gene develops liver fibrosis and tumors caused by cholangitis and chronic cholestasis. The second model (HBVTg) with transgenic overexpression and accumulation of HBsAg constitutes a pathology comparable to a chronic HBV infection. Over time, these animals develop the picture of chronic hepatitis and tumors as well. The third mouse model used (HBVTg-ABCB4-/-), a combination of the previous ones, is characterized in particular by an increased tumor incidence. Array analyses were used to assess 1.900 microRNA in 16-week-old female mice of the hybrid model. 51 microRNAs showed a significantly increased, 69 a reduced expression. Six microRNA (miR-199a-3p, miR-182a-5p, miR-21a-5p, miR-122-5p, miR-23a-3p, miR-101a-3p) were analyzed by qRT-PCR. Expression level of miR-199a-3p was elevated in both the HBVTg and especially in the ABCB4-/- model and showed an increase over time. The hybrid model showed a synergistic effect of both pathologies and the largest increase in expression. MiR-182a-5p showed a global expression enhancement in the ABCB4-/- and hybrid model, with the most pronounced effect at 16 and 26 weeks. In contrast, the HBVTg model showed a nearly linear increase in miR-182a-5p expression level. MiR-21a-5p was upregulated in the ABCB4-/- and hybrid model, whereas in the HBVTg model almost no expression changes could be observed. The liver-specific miR-122-5p showed globally diminished expression especially in the HBVTg model. However, in 16-week-old ABCB4-/- mice a minimal increase of miR-122-5p was observed.Inhomogeneous expression changes over time of miR-23a-3p were seen. There was an almost constant increased expression in the HBVTg model as well as an undulatory course of the likewise increased expression level in the hybrid model with maximal expression at the age of 16 weeks. In contrast, the ABCB4-/- model showed reduced expression at the time point of 16 weeks with an increase at later timepoints.The expression changes of miR-101a-3p showed a similar course in the ABCB4-/- and HBVTg models. An initially minimally elevated level was followed by a reduced expression at 16 and 26 weeks with a subsequent increase to a wild-type comparable baseline (HBVTg) or slightly increased expression (ABCB4-/-). Over time, the hybrid model shows a steadily declining expression. Our data show that specific microRNAs are regulated in different liver pathologies depending on age and the respective etiology.