Die Bedeutung tonoplastenständiger Ca2+-Transporter für die zytoplasmatische Signalübertragung und Ca2+-Homöostase bei Zea mays L.-Koleoptilen

Abstract

An isolierten Einzel-Vakuolen und Vakuolensuspensionen aus Z. mays L.-Koleoptilen konnte erstmals gleichzeitig an einem Objekt mittels Patch-Clamp-Technik(wv-, co-und ci-Konfiguration), extravakuolärer Ca2+-Bestimmung (Ca2+-selektive Mini-Elektroden) und intravakuolärer pH-Bestimmung (Acridinorange-absorption)direkte Nachweise zum Ca2+-Transport in die Vakuole (Ca2+-ATPase und H+/Ca2+-Antiporter), sowie zur Ca2+-Freisetzung aus der Vakuole(InsP3-Rezeptor-Kanal-Komplex (InsP3R) und Ryanodin-Rezeptor-Kanal-Komplex (RyR)) erbracht werden. I. Ca2+-Transport in die Vakuole durch primär aktive Ca2+-ATPase und sekundär aktiven H+/Ca2+-Antiporter: Mit Vakuolensuspensionen wurden Versuche zur Aktivität der zur Energetisierung des sekundär aktiven H+/Ca2+-Antiporters verantwortlichen Protonenpumpen, dervakuolären H+-ATPase (v-H+-ATPase) und Pyro-phosphatase (PPase), durchgeführt. Die Vakuolen von Z. mays L. wiesen nach der Präparation zum Versuchsmedium einen pH-Gradienten von 1,5 Einheiten auf. Die Aktivität der v-H+-ATPase undPPase resultierte in einer weiteren Absenkung des vakuolären pH um 0,9 Einheiten auf pH 4,8 ± 0,2 in einem Zeitraum von 30 min bzw. 4 - 6 h. Die halbmaximaleAktivierung der Protonentranslokation der v-H+-ATPase durch ATP wurde auf 125 µM bestimmt. Die halbmaximale Inhibition der Protonentranslokation derv-H+-ATPase durch Bafilomycin wurde auf 120 pM bestimmt. An Vakuolensuspensionen konnte ein ATP-abhängiger Ca2+-Transport in die Vakuole beobachtet werden, der durch Bafilomycin nicht hemmbar war. DerATP-abhängige Ca2+-Fluß hatte eine maximale Transportrate von 152 pmol.m-2.s-1. Die Auswirkung von 10 µM bis 1 mM Ca2+ auf den im Gleichgewicht befindlichen Protonengradienten zeigte einen partiellen, konzentrationsabhängigen Abbaudesselben. Die Ergebnisse sprechen für die Existenz einer tonoplastenständigen Ca2+-ATPase und H+/Ca2+-Antiporters. II. Ca2+-Freisetzung aus der Vakuole durch InsP3R und RyR: Vakuolensuspensionen von Z. mays L. reagierten auf den Zusatz von Inositol-1,4,5-triphosphat (InsP3) und Ryanodin mit einer von [Ca2+zyt] abhängigenCa2+-Freisetzung. Der InsP3-aktivierbare Ca2+-Fluß hatte eine Transportrate von 124 pmol.m-2.s-1 und war in Gegenwart von Ryanodin auf 279 pmol.m-2.s-1 steigerbar. Mit Hilfe der PC-Technik konnte in der wv-, co- und ci-Konfiguration) nachgewiesen werden, daß die durch InsP3 induzierte Ca2+-Freisetzung der Vakuolensuspensionvon einem InsP3R mit 12 pS Leitfähigkeit verursacht wurde. Die InsP3R-Dichte wurde zu 1 InsP3R.7 µm-2, bei einer Transportrate von 103 nmol.m-2.s-1 bestimmt. DerInsP3R hatte die relative Selektivitätsreihe von PCa2+: PSr2+: PBa2+: PMg2+: PK+ = 105 - 139 : 18 : 8 : 1,7 : 1. Die Leitfähigkeitsreihe des InsP3R war ([50 mM X2+] aufder vakuolären Seite): Ba2+> Sr2+ > Mg2+ » Ca2+ = 21,1 : 17 : 15,5 : 12 pS. Dies spricht für eine voneinander abhängige Permeation divalenter Kationen durch dieKanalpore. Der InsP3R war durch La3+ (halbmaximale Inhibition 8 µM), 100 µM Gd3+ und 1 mM Zn2+ auf der vakuolären Seite reversibel hemmbar. Der Ryanodin-aktivierbare Ca2+-Fluß durch den Tonoplasten hatte eine Transportrate von 147 pmol.m-2.s-1 und war in Gegenwart von InsP3 auf 199 pmol.m-2.s-1steigerbar. Durch Analysen in der wv- und co-Konfiguration konnte nachgewiesen werden, daß die durch Ryanodin induzierte Ca2+-Freisetzung der Vakuolensuspension voneinem RyR mit 122 pS Leitfähigkeit verursacht wurde. Der RyR hatte die relative Permeabilität von PCa2+:PK+= 0,8:1. Der RyR war durch 1 µM zyklischeAdenosin-Diphosphat-Ribose aktivierbar und durch 1 - 100 µM Ruthenium Rot hemmbar. III. Es konnten drei weitere Kationenkanäle nachgewiesen werden:

In der wv-, co- und ci-Konfiguration konnte ein spannungsabhängiger Kationenkanal vom FV-Typ mit einer Leitfähigkeit von 19 pS nachgewiesen werden. DerFV-Kanal hatte die relativen Permeabilitäten von PK+:PCa2+:PNa+:PRb+:PCl- = 1:0,8:1,7:1,4:0,16. In der ci-Konfiguration konnte ein spannungsabhängiger Kationenkanal vom SV-Typ mit einer Leitfähigkeit von 37 pS nachgewiesen werden. Der SV-Kanal hatte dierelativen Permeabilitäten von PK+:PCa2+:PNa+:PRb+:PCl- = 1:0,7:1:1,3:0,14. In der ci-Konfiguration konnte ein spannungunabhängiger Kationenkanal mit einer Leitfähigkeit von 7 pS nachgewiesen werden. Der Kationenkanal hatte dierelativen Permeabilitäten von PK+:PCa2+:PNa+:PRb+:PCl- = 1 : 0,5 : 0,9 : 0,4 : 0,4.