Funktionelle Charakterisierung der SANT-Domänen des Korepressors N-CoR

Abstract

Der Korepressor N-CoR vermittelt die Repression von nukleären Hormonrezptoren in Abwesenheit ihrer Liganden und ist dar ber hinaus für die embryonale Entwicklung von Säugern entscheidend. N-CoR ist in der Zelle mit Histondeacetylasen (HDACs) komplexiert. Diese Enzyme bewirken im Zusammenspiel mit ihren Gegenspielern, den Histonacetyltransferasen, durch Deacetylierung und Acetylierung von Histonen eine dynamische Modifikation des Chromatins und beeinflussen so die Transkription von Genen. Die Interaktion zwischen regulatorischen Proteinen, Histonen und histonmodifizierenden Proteinen ist ein fundamentaler und konservierter Mechanismus der Genregulation in höheren Eukaryonten. Koregulatoren (Koaktivatoren und Korepressoren) und Transkriptionsfaktoren enthalten eine Fülle noch uncharakterisierter Domänen, die in ähnlicher Weise wirken könnten. Der Korepressor N-CoR enthält beispielsweise zwei uncharakterisierte SANT-Domänen. Die SANT-Domäne ist zwischen Hefe und S ugern konserviert und spielt vermutlich in der Chromatinmodifizierung oder Transkription eine Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Screeningmethoden zur Identifikation von Interaktionspartnern der N-CoR SANT-Domänen eingesetzt. In einem Hefe-Zwei-Hybrid Screen war es möglich, Interaktionspartner der N-CoR SANT-Domäne zu isolieren. Insgesamt 14 verschiedene Proteine wurden in dem Hefescreen identifiziert. Die Proteine PIAS1, Ubc9, TDG, Hoxa-4, TAFII250 und cDNA I interagierten in vitro mit der N-CoR SANT1-Domäne. Drei der im Hefescreen gefundenen Proteine (PIAS1, Ubc9 und Pc2) deuteten darauf hin, dass N-CoR durch die Konjugation von SUMO-Proteinen posttranslational modifiziert sein könnte. In Ko-Immunopräziptitationen konnte die Interaktion zwischen N-CoR und der SUMO-E3-Ligase PIAS1 in vivo bestätigt werden. Die N-CoR SUMO-Modifikation wurde indirekt in vivo und in einem in vitro Sumoylierungstest nachgewiesen. Endogenes N-CoR und PIAS1 kolokalisieren im Zellkern, wobei die heterologe Expression der SUMO-E3 Ligase die für N-CoR typische Aggregatbildung im Kern verhindert und eine diffusere Verteilung und eine Häufung in der Nähe der Kernmembran induziert. In Kolokalisierungsstudien konnte ferner gezeigt werden, dass eine N-CoR-DSUMO Konsensussequenzmutante eine veränderte zytoplasmatisch-nukleäre Lokalisation aufweist. Dies traf ebenfalls auf DSANT-Mutanten von N-CoR zu, die im Vergleich zum N-CoR Wildtypprotein eine unterschiedliche Lokalisation bei heterologer Expression von PIAS1 zeigten. Die Koexpression von PIAS1 reduzierte die Repression eines Luziferasereporters durch N-CoR. Andererseits war die Repression des Proteins ebenfalls durch Alanin-Substitution in potentiellen SUMO-Stellen vermindert.