Untersuchungen am methylgerichteten mismatch-Reparatursystem MutHLS von E. coli zur Identifizierung der Verbindung zwischen mismatch-Erkennung und Strangdiskriminierung

Abstract

Im Zuge dieser Dissertation wurden einzelne Aspekte des postreplikativen mismatchReparatur Systems von E. coli (MutHLS) mittels biochemischer und molekularbiologischerMethoden untersucht, um die spezifischen Abläufe dieses Prozesses genauer charakterisierenzu können. Besonderer Fokus lag dabei auf die Reaktionen, die zwischen dem Schritt dermismatch-Erkennung und dem der Strangdiskriminierung erfolgen. Durch die Verwendungeines eigens kreierten Testsystems sollten die dabei vorhandenen kritischenVersuchsparameter des MutHLS-Systems identifiziert und gleichzeitig mit den gefundenenDaten ein mögliches Modell für diesen Mechanismus vorgestellt werden.Bei den Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass bei niedrigen KCl-Konzentration einemismatch-unabhängigen Nebenreaktion von MutHL erfolgt, die der eigentlichenHauptreaktion von MutHLS aufgelagert ist. Diese Nebenreaktion kann durch die Verwendunghoher Salzkonzentrationen (> 125 mM) nahezu vollständig unterdrückt werden. Ein weitererwichtiger Parameter der identifiziert werden konnte, ist beim DNA-Substrat die vorhandeneDistanz zwischen der d(GATC)-Sequenz zum DNA-Ende. Die Effizienz der Spaltreaktionwird mit kleiner werdendem Abstand zum Ende deutlich reduziert. Der Einfluss auf die dieMutHLS-Reaktion ist dabei deutlich höher als auf die Nebenreaktion von MutHL.Weiterhin konnte nachgewiesen werden, dass MutS während der Strandiskriminierungsreaktionvon MutH nicht am mismatch gebunden vorliegt, anders als es breits inverschiedenen Publikationen beschrieben wird. Eine d(GATC)-Stelle, die so dicht ammismatch liegt, dass sie von einem gebundenen MutS bedeckt wurde, konnte trotz dieserNähe in einer mismatch-abhängigen Weise geschnitten werden. Der Stimulus für dieseSpaltung kommt dabei nachgewiesenerweise vom gleichen DNA-Molekül (in cis) und nichtvon einem anderen aus (in trans), wie es bei dieser Art des Mechanismus möglich wäre.Durch weiterführende Experimente liess sich nachweisen, dass eine Blockade auf der DNAzwischen mismatch und d(GATC)-Sequenz, kein Hindernis für dieStrangdiskriminierungsreaktion darstellt. Damit kann ein Mechanismus bei dem MutSL aufder DNA gleitend den Kontakt zu MutH herstellen (sliding clamp-Modell) ausgeschlossenwerden. Die in dieser Arbeit gefundenen Resultate unterstützen vielmehr einen 'looping'-Mechanismus, bei dem der Kontakt zwischen MutSL und der d(GATC)-Spaltstelle über eineSchleifenbildung der DNA ermöglicht wird. Aber anders als dieser Mechanismus bisherbeschrieben wurde, bleibt MutS während der Reaktion nicht am mismatch gebunden.