Regulation of translation initiation at the Poliovirus IRES
| dc.contributor.author | Hirnet, Juliane | |
| dc.date.accessioned | 2023-03-03T14:42:01Z | |
| dc.date.available | 2010-07-15T12:48:51Z | |
| dc.date.available | 2023-03-03T14:42:01Z | |
| dc.date.issued | 2010 | |
| dc.identifier.uri | http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-77223 | |
| dc.identifier.uri | https://jlupub.ub.uni-giessen.de//handle/jlupub/10778 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10161 | |
| dc.description.abstract | Poliovirus (PV) translation and replication can occur in neuronal cells where it causes degeneration and lysis of cells leading to paralytic poliomyelitis. Other cell types are much less affected by PV infection and do not support translation and replication of the virus as well. Apart from the poliospecific receptor, the reasons for the tissue preference of poliovirus may be found in its translation initiation via an internal ribosome entry site (IRES), which in addition to cellular initiation factors uses proteins normally not involved in translation to achieve efficient translation (ITAFs). Several ITAFs are known, but neither do these known factors explain the tissue specificity of poliovirus nor are they sufficient to initiate translation at the PV IRES using only purified components. Additional factors may be present in cells, especially in neuronal cells, that are both necessary for translation initiation on the PV IRES. One potential new factor, ErB3 binding protein (EbP1), was identified here to bind to the PV IRES. Translation initiation complexes were formed with labelled Poliovirus IRES RNA in an in vitro reconstitution system. A double labeled RNA allowed to identify 48S complexes in sucrose gradients and to enrich proteins present in these complexes. As controls RNAs containing the IRESs of Hepatitis C virus (HCV) and encephalomyocarditis virus (EMCV) were used. One protein, specific for PV and EMCV was identified in the light RNA peak but not in the 48S peak. It was identified by mass spectrometry as EbP1, which is a known ITAF for the IRES of Foot-and-mouth-disease virus. However, its role in PV translation initiation seems to be inhibiting rather than stimulating since it could not be found in 48S complexes. Additionally I identified a neuron specific microRNA (miRNA) that stimulates translation at the Poliovirus IRES. By screening the poliovirus IRES sequence for potential target sites for miRNAs that are preferentially expressed in neuronal cells, I found sequences partially complementary to three neuron-specific miRNAs, miRNA-127, miRNA-326 and miRNA-422a. These miRNAs were co-transfected into cultured cell-lines together with a poliovirus IRES reporter RNA. Of these miRNAs, only miRNA-326 enhanced poliovirus translation efficiency. The target site for miRNA-326 is located in a loop of the central IRES domain IV. Mutagenesis of this miRNA-326 target site disabled the stimulation by added miRNA-326, indicating a physical interaction of miRNA-326 with the poliovirus IRES. However, this mutation could only be partially rescued by a miRNA with a complementary mutation in the seed sequence of miRNA-326. Since two binding sites of miRNA-326 in the 5 untranslated region of PV are identical with binding sites for the known ITAF PCBP2, a connection between those two factors may be assumed. | en |
| dc.description.abstract | Poliovirus (PV) Translation und Replikation findet in neuronalen Zellen statt. Infizierte Zellen werden degradiert oder lysiert, was zum Krankheitsbild der Kinderlähmung führt. Andere Gewebe sind von Polioinfektionen weit weniger betroffen, da sie Translation und Replikation des Virus nicht unterstützen. Der Grund für die Gewebespezifität von Poliovirus liegt neben dem Rezeptor auch an der Initiation der Translation, die mit Hilfe einer internen Ribosomen Eintrittsstelle (IRES) realisiert wird. IRES abhängige Translation benötigt neben zellulären Initiationsfaktoren auch andere zelluläre Proteine (ITAFs), welche normalerweise nicht an der Translation beteiligt sind. Mehrere ITAFs für PV sind bekannt, allerdings kann durch sie weder die Gewebespezifität von PV erklärt werden, noch sind all diese Faktoren ausreichend, um in aufgereinigter Form Translation durch die PV IRES zu initiieren. Es muss also noch weitere Faktoren geben, die für die Translation durch die PV IRES in neuronalen Zellen notwendig sind. Ein neuer potentieller ITAF, ErB3-binding protein (EbP1), wurde in dieser Arbeit identifiziert. Dafür wurden Translationsinitiationskomplexe an der PV IRES gebildet. Eine doppelte Markierung erlaubt sowohl die Identifikation der 48S Komplexe im Gradienten, als auch eine Isolierung von RNA bindenden Proteinen aus diesen Komplexen. Als Kontrolle wurden RNAs mit der Hepatitis C Virus und der Encephalomyocarditis Virus (EMCV) IRES eingesetzt. Ein Protein konnte in den leichten Sucrose Fraktionen an der PV und EMCV IRES beobachtet werden, jedoch nicht in den 48S Komplexen. Dieses Protein wurde durch Massenspektrometrie als EbP1 identifiziert. EbP1 wurde bereits als ITAF für das Maul-und Klauenseuche Virus identifiziert. Zusätzlich wurde eine neuronen-spezifische mikroRNA (miRNA) identifiziert, welche die Translation an der PV IRES stimuliert. Dafür wurden mehrere neuronen-spezifische miRNAs, miRNA-127, miRNA-326 und miRNA-422a ausgewählt, die Bindestellen in der PV IRES haben. Diese miRNAs wurden zusammen mit einem PV IRES Reporterkonstrukt in Zelllinien transfiziert. Nur miRNA-326 zeigte eine Stimulation der Translation. Die Bindestelle für miRNA326 befindet sich in einer nicht gepaarten Region innerhalb von Domäne IV in der Mitte der PV IRES. Mutagenese dieser miRNA-326 Bindestelle verhinderte die Stimulation durch miRNA-326. Der Effekt konnte jedoch mit einer kompensatorisch mutierten miRNA nur teilweise wieder hergestellt werden. Beide Bindestellen für miRNA-326 in der PV IRES sind mit Bindestellen für den ITAF PCBP2 identisch, daher kann ein Zusammenspiel dieser beiden Faktoren in der Translation angenommen werden. | de_DE |
| dc.language.iso | en | de_DE |
| dc.rights | In Copyright | * |
| dc.rights.uri | http://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | * |
| dc.subject | Poliovirus | de_DE |
| dc.subject | RNA | de_DE |
| dc.subject | IRES | de_DE |
| dc.subject | Poliovirus | en |
| dc.subject | RNA | en |
| dc.subject | IRES | en |
| dc.subject.ddc | ddc:570 | de_DE |
| dc.title | Regulation of translation initiation at the Poliovirus IRES | en |
| dc.title.alternative | Regulation der Translationsinitiation an der Poliovirus IRES | de_DE |
| dc.type | doctoralThesis | de_DE |
| dcterms.dateAccepted | 2010-07-13 | |
| local.affiliation | FB 08 - Biologie und Chemie | de_DE |
| thesis.level | thesis.doctoral | de_DE |
| local.opus.id | 7722 | |
| local.opus.institute | Biochemisches Institut | de_DE |
| local.opus.fachgebiet | Biologie | de_DE |
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