Structure-function analysis of heterogeneous nuclear ribonucleoproteins L and LL

Abstract

The heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L (hnRNP L), an abundant nuclear RNA-binding protein, plays both nuclear and cytoplasmic roles in mRNA export of intronless genes, IRES-mediated translation, mRNA stability and alternative splicing regulation. Recently, it was reported that hnRNP L autoregulates its own expression on the level of alternative splicing. HnRNP L protein recognises CA-repeat as well as CA-rich clusters. HnRNP L-like (LL) protein is a paralog of hnRNP L, whose expression is upregulated in a tissue-specific manner. It was shown that hnRNP LL regulates alternative splicing of CD45 exon 4 upon T-cell activation.HnRNP L and hnRNP LL share 58% overall amino acid identity and have similar sizes (558 vs. 542 amino acids). Both proteins contain four classical RNA recognition motifs (RRMs). The glycine-rich region of hnRNP L is less pronounced in hnRNP LL, and proline-rich region of hnRNP L is absent in hnRNP LL.To investigate the role of individual domains in hnRNP L and hnRNP LL protein function, I created a series of deletion derivatives and mutants with one or several amino acid substitutions in individual RNA-binding domains.First, I analysed the RNA-binding properties of the full-length and deletion constructs of hnRNP L and LL by EMSA (electrophoretic mobility shift assay) and filter binding assay. Two substrates were used: CA-repeat and CA-rich RNAs. I demonstrated that the combination of two RNA-binding domains of hnRNP L (RRMs 1/2 and 2/3) is both necessary and sufficient for high-affinity binding to CA-repeat RNA. In contrast, the high-affinity binding of hnRNP L to CA-rich RNA requires all four RRMs. In the case of hnRNP LL all four RRM domains are required for high-affinity binding to both substrates. Mutation analysis revealed that hnRNP L RRM2 is a major determinant for RNA binding specificity and affinity.EMSA in combination with gel filtration of protein-RNA complexes indicated that hnRNP L requires at least two high-score binding motifs, separated by a short spacer (7-10 nucleotides) to bind tightly to the RNA.Second, hnRNP L mutant derivatives were tested for alternative splicing activity, using a SLC2A2 minigene construct and hnRNP L depleted nuclear extract. I demonstrated that only full-length protein and not the truncated mutant proteins could function as a repressor in regulation of alternative splicing.In addition, a specific role of inter-domain interaction between RRMs 3 and 4 in CA-rich RNA binding and function of hnRNP L as a splicing repressor was uncovered.In sum, my results suggest that the presence of all four RRMs is essential for splicing repressor activity of hnRNP L, whereas two RRMs are sufficient for tight associationwith CA-repeat RNA Das abundante kernlokalieserte RNA-Bindeprotein hnRNP L (heterogeneous nuclear ribonucleoprotein L) erfüllt eine Reihe von verschiedenen Aufgaben, die im Cytoplasma beziehungsweise im Zellkern stattfinden, u.a. Export von Intron-freien mRNAs, IRES-vermittelte Translation, mRNA-Stabilität und Regulation von alternativem Spleißen. Es ist bekannt, dass hnRNP L seine eigene Expression auf der Ebene des alternativen Spleißens reguliert, ein Prozess, der als Autoregulation bezeichnet wird. HnRNP L bindet neben CA-Wiederholungssequenzen auch CA-reiche Sequenzen. Ein bekanntes Paralog von hnRNP L, hnRNP L-like (LL), wird gewebespezifisch exprimiert. Bisher konnte gezeigt werden, dass hnRNP LL in Abhängigkeit von der T-Zell-Aktivierung das alternative Spleißmuster von CD45 reguliert.Die beiden Proteine, hnRNP L und hnRNP LL, zeigen bei etwa gleicher Größe (L: 558 Aminosäuren vs. LL: 542 Aminosäuren) 58% Übereinstimmung in ihrer Aminosäuresequenz. Beide besitzen vier klassische RNA-Erkennungsmotive, sogenannte RRMs, aber die Glycin-reiche Region von hnRNP L ist in hnRNP LL weniger stark ausgeprägt, und die Prolin-reiche Region fehlt vollständig.Um die Funktion der einzelnen Domänen beider Proteine im Detail zu untersuchen, habe ich eine Reihe von Proteinvarianten kloniert. Bei einigen wurden Teile der Proteinsequenz entfernt, während bei anderen einzelne oder mehrere Aminosäuren substitutiert wurden.Zunächst habe ich die Bindungseigenschaften von hnRNP L und hnRNP LL sowie ihrer Varianten an CA-Wiederholungssequenzen bzw. CA-reichen Sequenzen mittels EMSA (electrophoretic mobility shift assay) und Filterbindungsexperimenten untersucht. Ich konnte zeigen, dass für hnRNP L eine Kombination von zwei RNA-Bindedomänen, entweder RRMs 1 und 2 oder RRMs 2 und 3, notwendig und ausreichend ist, um CA-Wiederholungssequenzen mit hoher Affinität zu binden. Im Gegensatz dazu werden alle vier RRMs für eine hoch-affine Bindung von CA-reichen Sequenzen benötigt. Im Falle von hnRNP LL sind allerdings für die Bindung sowohl von CA-Wiederholungssequenzen als auch von CA-reichen Sequenzen alle vier RRMs nötig. Mutationsanalysen für hnRNP L haben zudem gezeigt, dass RRM2 hauptverantwortlich für die RNA-Bindungsspezifität sowie Bindungsaffinität ist.EMSA und Gelfitrationsexperimente zeigen, dass hnRNP L mindestens zwei high-score Bindemotive benötigt, welche durch einen kurzen Abschnitt von 7 bis 10 Nukleotiden Länge getrennt sein müssen, um die RNA fest binden zu können. Des Weiteren wurden die unterschiedlichen hnRNP L Varianten auf ihre regulatorische Aktivität in in vitro Spleißkomplementierung getestet. Als Substrat diente ein SLC2A2 Minigen-Konstrukt, welches in hnRNP L-depletiertem Kernextrakt inkubiert wurde. Durch Zugabe der verschiedenen Proteinvarianten konnte ich zeigen, dass nur das komplette Wildtyp-Protein und keine der verkürzten Mutanten eine Repressorfunktion bei der Regulation des alternativen Spleißens ausübt.Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Interaktion zwischen den RRMs 3 und 4 des hnRNP L Proteins für die Bindung CA-reicher Sequenzen und die Spleißregulation wichtig ist.Zusammenfassend ist zu sagen, dass aufgrund der vorliegenden Ergebnisse alle vier RRMs von hnRNP L nötig sind, um die volle Repressor-Funktion des Proteins bei der Regulation von alternativem Spleißen zu entfalten, während die beiden N-terminalen RRMs für die stabile Bindung zu CA-repetitiver RNA ausreichend sind.