Structural characterisation of cyanobacterial phytochrome Cph1
| dc.contributor.author | Mailliet, Joël | |
| dc.date.accessioned | 2023-03-03T14:42:23Z | |
| dc.date.available | 2011-12-16T08:52:42Z | |
| dc.date.available | 2023-03-03T14:42:23Z | |
| dc.date.issued | 2011 | |
| dc.identifier.uri | http://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-85063 | |
| dc.identifier.uri | https://jlupub.ub.uni-giessen.de//handle/jlupub/10821 | |
| dc.identifier.uri | http://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10204 | |
| dc.description.abstract | The 3D structure solution of the photosensory module from the cyanobacterial phytochrome Cph1 forms the basis to elucidate the photoconversion and the signalling mechanism of canonical phytochromes. The first crystal structure of the sensor module, comprising the PAS, GAF and PHY domains, from Cph1 in its Pr state was solved at 2.45 Å resolution. 2VEA confirmed the figure-of-eight knot, produced by an N-terminal extension from the PAS domain passing through a protruding loop of the GAF domain. Furthermore, the structure shows that the GAF and PHY domains are related thus placing phytochromes among tandem GAF proteins. Unlike previous structures of incomplete bidomains from bacteriophytochromes, 2VEA displays a completely closed chromophore pocket, sealing of the chromophore cavity being accomplished by a tongue-like protrusion from the PHY domain. Hence, 2VEA provides structural evidence for the necessity of the PHY domain to have a photochemically competent phytochrome. Several key residues were identified and selected for site-directed mutagenesis based on 2VEA that might be involved in either the photoconversion or the signalling mechanism. 48 different mutants were expressed, purified and characterised by UV-Vis spectroscopy. Selected mutants underwent further investigation (fluorescence spectroscopy, SEC, kinetic studies and crystallisation) to determine their function in phytochromes. Three tyrosines close to the D-ring (Tyr-176, Tyr-203 and Tyr-263) of the chromophore were identified to play a significant role in the photoconversion mechanism. This work confirmed the importance of Tyr-176 which was analysed in detail in previous studies. Furthermore Tyr-203 mutations showed that this residue is also essential for effective photoconversion. Studies on Tyr-263 mutants suggest that its aromatic character is essential for photoconversion, but that the hydroxyl group only improves the quantum yield of phototransformation. The 3D structure of Y263F solved at 1.95 Å resolution gave new insights into the heterogeneity of phytochrome structures; apart from the PHY domain shift in relation to the PAS-GAF lobe enabled by a straightening of the connecting & #945;9 helix, the attachment site of the chromophore as well as several residues in the pocket displayed two possible conformations. Based on the results obtained by UV-Vis as well as fluorescence spectroscopy, the primary step in the photoconversion mechanism is most likely the isomerisation of the D-ring.This work also identified key residues interacting with the propionate side chains of the chromophore in either the Pr or Pfr states which might transfer the signal from the chromophore to the transmitter module. Furthermore, conserved residues belonging to the PRxSF motif within the tongue of the PHY domain may be involved in the signalling mechanism. This work suggests that both the tongue and the propionate side chains act in conjunction to transmit the signal from the sensor to the transmitter module by shifting the PHY domain.The crystal structure of the sensor module in its Pr state and the characterisation of conserved residues within the GAF and PHY domains constitute a crucial step in the elucidation of the photoconversion and signalling mechanism. Solving the structure of either the Pfr state of a canonical phytochrome or the full length photoreceptor comprising both the sensor and the transmitter modules might not only confirm but also improve the proposed models of photoconversion and phytochrome signalling in this work. | en |
| dc.description.abstract | Die Strukturlösung des Sensormoduls des cyanobakteriellen Phytochroms Cph1 bildet die Grundlage für die Aufklärung des Photokonversionsmechanismus und der Signaltransduktion in kanonischen Phytochromen.Die erste Kristallstruktur des kompletten sensorischen Moduls von Cph1 im Pr Zustand, das aus den PAS, GAF und PHY Domänen besteht, konnte bis zu einer Auflösung von 2.45 Å gelöst werden. 2VEA bestätigte den Achtknoten, der zwischen der N-terminalen Verlängerung der PAS Domäne und einer herausragenden Schleife der GAF Domäne gebildet wird. Des Weiteren zeigt die Struktur, dass GAF und PHY Domänen strukturell verwandt sind und Phytochrome somit zu den Tandem GAF Proteinen gehören. Im Gegensatz zu den zuvor veröffentlichten unvollständigen Bidomänstrukturen von bakteriellen Phytochromen, zeigt 2VEA, dass die Chromophortasche mit Hilfe einer zungenartigen Ausstülpung der PHY Domäne versiegelt ist. Daher beweist 2VEA die Notwendigkeit der PHY Domäne für eine effektive Photokonversion von Phytochrom.Entscheidende Aminosäuren, die möglicherweise an der Photokonversion oder der Signaltransduktion beteiligt sind, wurden mit Hilfe der 2VEA Struktur identifiziert und für die ortsspezifische Mutagenese ausgewählt. 48 verschiedene Mutanten wurden exprimiert, aufgereinigt und über UV-Vis Spektroskopie charakterisiert. Einige ausgewählte Mutationen wurden zudem intensiver analysiert (Fluoreszenzspektroskopie, SEC, kinetische Studien und Proteinkristallisation) um deren Funktion in Phytochrom zu ermitteln.Drei Tyrosine (Tyr-176, Tyr-203 and Tyr-263), die sich in der Nähe des D-Rings des Chromophors befinden, spielen eine signifikante Rolle im Photokonversionsmechanismus. Diese Arbeit bestätigt die Bedeutung von Tyr-176, die schon in vorherigen Studien analysiert wurde. Des Weiteren zeigen Tyr-203 Mutationen, dass diese Aminosäure essentiell für die Photokonversion ist. Studien an Tyr-263 Mutanten weisen darauf hin, dass die aromatische Eigenschaft dieses Restes unabdinglich für die Photokonversion ist. Allerdings verbessert die Hydroxylgruppe lediglich die Quanteneffizienz der Phototransformation. Die Kristallstruktur von Y263F wurde bis zu einer Auflösung von 1.95 Å gelöst und gab neue Einblicke in die strukturelle Heterogenität von Phytochromen. Neben der Verschiebung der PHY Domäne in Relation zum PAS-GAF Teil, die durch eine gerade Ausrichtung der verbindenden & #945;9 Helix bewerkstelligt wird, gibt es bei der Bindung zwischen dem Chromophor und Cys-259 sowie bei weiteren Aminosäuren in der Tasche zwei mögliche Konformere. Basierend auf den UV-Vis- sowie Fluoreszenzdaten kann davon ausgegangen werden, dass die Isomerisierung des D-Rings den ersten Schritt der Photokonversion darstellt.Diese Arbeit hat außerdem entscheidende Aminosäuren identifiziert, die mit den Propionatseitenketten des Chromophors in beiden Zuständen interagieren und so das Signal vom Chromophor auf das Transmittermodul übertragen. Des Weiteren gibt es konservierte Aminosäurereste die dem PRxSF Motiv der Zunge aus der PHY Domäne zugeordnet werden und an der Signaltransduktion beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Zunge und die Propionatseitenketten gemeinsam dazu beitragen, das Signal durch eine strukturelle Umpositionierung der PHY Domäne vom Sensor zum Transmitter weiter zu leiten.Die Kristallstruktur des Sensormoduls im Pr Zustand und die Charakterisierung von konservierten Aminosäuren, die sich in der GAF bzw. PHY Domäne befinden, bilden einen entscheidenden Schritt um den Mechanismus der Photokonversion sowie der Signaltransduktion zu entziffern. Die Strukturlösung des Pfr Zustands eines kanonischen Phytochroms und des kompletten Photorezeptors könnten dazu beitragen, das in dieser Arbeit vorgestellte Modell der Photokonversion und der Signaltransduktion zu bestätigen und zu verbessern. | de_DE |
| dc.language.iso | en | de_DE |
| dc.rights | In Copyright | * |
| dc.rights.uri | http://rightsstatements.org/page/InC/1.0/ | * |
| dc.subject | Phytochrom | de_DE |
| dc.subject | Strukturbiologie | de_DE |
| dc.subject | Photorezeptoren | de_DE |
| dc.subject | intramolekulare Signaltransduktion | de_DE |
| dc.subject | Spektroskopie | de_DE |
| dc.subject | Phytochrome | en |
| dc.subject | structural biology | en |
| dc.subject | photoreceptors | en |
| dc.subject | intramolecular signaling | en |
| dc.subject | spectroscopy | en |
| dc.subject.ddc | ddc:570 | de_DE |
| dc.title | Structural characterisation of cyanobacterial phytochrome Cph1 | en |
| dc.title.alternative | Strukturelle Charakterisierung des cyanobakteriellen Phytochroms Cph1 | de_DE |
| dc.type | doctoralThesis | de_DE |
| dcterms.dateAccepted | 2011-11-18 | |
| local.affiliation | FB 08 - Biologie und Chemie | de_DE |
| thesis.level | thesis.doctoral | de_DE |
| local.opus.id | 8506 | |
| local.opus.institute | Institut für Pflanzenphysiologie | de_DE |
| local.opus.fachgebiet | Biologie | de_DE |
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