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dc.contributor.authorPanzer, Imke
dc.date.accessioned2023-03-03T14:42:24Z
dc.date.available2012-01-20T12:18:35Z
dc.date.available2023-03-03T14:42:24Z
dc.date.issued2011
dc.identifier.urihttp://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-85641
dc.identifier.urihttps://jlupub.ub.uni-giessen.de//handle/jlupub/10822
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.22029/jlupub-10205
dc.description.abstractCTCF ist ein multivalenter Faktor, der in eine Reihe von Regulationsvorgängen involviert ist. Im Mittelpunkt der vorliegenden Arbeit standen Untersuchungen zu seiner Fähigkeit, Chromatin-Isolation zu vermitteln. Die Fähigkeit, die aktivierende Wirkung von Enhancern zu blockieren, stellt hinsichtlich der Chromatin-Isolation eine zentrale Aktivität des Faktors CTCF dar, und es konnte in der vorliegenden Arbeit eine funktionelle Enhancer-Blockade-Domäne im N-terminalen Teil des Proteins näher charakterisiert werden.Um weitere Einblicke in Mechanismen und Regulationsmöglichkeiten der CTCF-vermittelten Isolation zu erhalten und die Frage zu beantworten, wie ein einzelner Faktor maßgeblich in einer solchen Vielzahl biologischer Vorgänge involviert sein kann wie es für CTCF bekannt ist, galt besonderes Interesse der Identifikation von CTCF-Interaktionspartnern.Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein System etabliert, um CTCF-assoziierte Proteine und Proteinkomplexe aus Embryonalzellen von Drosophila melanogaster zu reinigen und massenspektrometrisch zu analysieren. Das System ermöglicht die Expression eines HA-FLAG-dCTCF-Fusionsproteins, das unter der Kontrolle eines CuSO4-induzierbaren Promotors steht. Mittels Ionenaustausch- und Gelfiltrations-Chromatographie konnte hier gezeigt werden, dass dCTCF mit mindestens zwei verschiedenen hochmolekularen Komplexen assoziiert im Zellkern vorliegt, was mit dem Wissen über die Multifunktionalität des Faktors übereinstimmt.Die massenspektrometrische Analyse zeigte, dass CTCF mit einer Vielzahl von Proteinen und Proteinkomplexen interagiert, die in völlig unterschiedlichen biologischen Funktionen involviert sind und auf unterschiedliche Art und Weise zur CTCF-vermittelten Isolation beitragen können. So konnten neben weiteren bekannten Isolator-Proteinen Drosophilas auch Chromatin-modifizierende chromatin remodelling Faktoren sowie Transkriptions- und Translationsfaktoren, als CTCF-assoziierte Proteine identifiziert werden. Interessanterweise wurde auch eine Interaktion mit dem Exosom gefunden, einem hochkonservierten Multiproteinkomplex, der 3´-5´- Exoribonukleaseaktivität besitzt und somit für den prä-mRNA und mRNA-Abbau verantwortlich ist und Untereinheiten des Schwesterchromatid-Kohäsion-Komplexes Cohesin.Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen die Existenz zahlreicher Protein-Protein-Interaktionen, wie sie auch im Model des CTCF-Codes postuliert werden. Dem liegt zugrunde, dass es eine Vielzahl divergierender CTCF-Zielsequenzen im Genom gibt, zu deren Bindung verschiedene CTCF-Zinkfinger eingesetzt werden. Die spezifische Zinkfinger-Kombination führt zu einer spezifischen exponierten Oberfläche des Proteins, was unterschiedliche Protein-Protein-Interaktionen zur Folge hat und den Schlüssel zur Multifunktionalität des Faktors darstellt. Durch zusätzliche Modifikationen könnte eine ausreichende Variations-Komplexität erreicht werden, um dynamische Chromatindomänen und epigenetische Zustände zu organisieren.Die vorliegende Arbeit liefert Einblicke in ein solches hochkomplexes CTCF-Interaktom , das maßgeblich in die Übersetzung regulatorischer Außensignale in nukleare Funktionen involviert sein könnte.de_DE
dc.description.abstractCTCF is a multivalent factor that is involved in a number of regulatory processes. The focus of this work was to study its ability to mediate chromatin insulation. The ability to block the activating effect of enhancers. is a central activity of the factor CTCF. In this study a functional enhancer-blocking domain in the N-terminal part of the protein could be characterized in detail.To provide further insights into the mechanisms and regulation of the CTCF-mediated insulation and to answer the question of how a single factor can be significantly involved in such a variety of biological processes, the identification of CTCF-interacting partners was of particularly interest. .In this work, a system was established to clean CTCF-associated proteins and protein complexes from embryonic cells of Drosophila melanogaster and to analyze these by mass spectrometry. The system allows the expression of an HA-FLAG dCTCF fusion protein, which is under the control of a CuSO4-inducible promoter. By ion exchange and gel filtration chromatography it could be shown that dCTCF is associated with at least two different high molecular weight complexes in the nucleus, which is consistent with the knowledge of the multi-functionality of the factor.Mass spectrometric analysis revealed that CTCF interacts with a variety of proteins and protein complexes involved in completely different biological functions, which could contribute to CTCF-mediated insulation in many different ways. Among these identified factors there are other known Drosophila insulator proteins, chromatin-modifying and chromatin remodeling factors as well as transcriptional and translational factors. Interestingly, CTCF was also found to interact with the exosome, a highly conserved multiprotein complex that possesses 3´-5´-Exoribonukleaseaktivität and thus is responsible for the pre-mRNA and mRNA degradation. Furthermore sister chromatid cohesion subunits of the cohesin complex were identified as CTCF-interacting partners.The results of this study confirm the existence of numerous protein-protein interactions, as postulated in the model of the "CTCF-Code." This model is based on the knowledge that there are a multitude of divergent CTCF-target sequences in the genome and that different CTCF-zinc fingers are used for binding. This leads to a specific surface of the protein, which is exposed for protein binding and therefore to different protein-protein interactions. This might be the key for the multifunctionality of the factor. In addition, modifications could generate sufficient variations in order to organize dynamic chromatin and epigenetic states.The present work provides insight into such a highly complex "CTCF-interactome", which could be significantly involved in the translation of external regulatory signals in nuclear functions.en
dc.language.isode_DEde_DE
dc.rightsIn Copyright*
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/page/InC/1.0/*
dc.subjectCTCFde_DE
dc.subjectChromatin-Isolationde_DE
dc.subjectCTCFen
dc.subjectchromatin -insulationen
dc.subject.ddcddc:570de_DE
dc.titleIdentifizierung und Analyse von Protein-Interaktionspartnern des Isolationsfaktors CTCFde_DE
dc.typedoctoralThesisde_DE
dcterms.dateAccepted2011-12-06
local.affiliationFB 08 - Biologie und Chemiede_DE
thesis.levelthesis.doctoralde_DE
local.opus.id8564
local.opus.instituteInstitut für Genetikde_DE
local.opus.fachgebietBiologiede_DE


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