Charakterisierung einer transportrelevanten Domäne im intrazellulären C-Terminus des humanen Vasopressin-V2-Rezeptors

Abstract

Bis heute ist wenig über den intrazellulären Transport von G-Protein-gekoppelte Rezeptoren (GPCR) bekannt. Frühere Studien an GPCR zeigten, dass Aminosäurereste vor den konservierten, palmitoylierten Cysteinresten in den intrazellulären C-Termini wichtig für den Transport an die Plasmamembran sind. Für den humanen V2-Vasopressin-Rezeptor wurde in dieser Arbeit untersucht, ob die Sequenz 335EXXXLL340 unmittelbar vor den palmitoylierten Cysteinen transportrelevant ist. Mittels Deletionen und Punktmutationen wurden verschieden V2-Rezeptor-Mutanten hergestellt und in COS.M6-Zellen transient exprimiert. Die Ergebnisse von [3H]AVP-Bindungsstudien an intakten COS.M6-Zellen sowie Immunfluoreszenzstudien an permeabilisierten und nicht permeabilisierten COS.M6-Zellen zeigen, dass die Reste E335 und L339 für den Rezeptortransport an die Plasmamembran notwendig sind. Der Rest L340 spielt eine wichtige, aber nicht essentielle Rolle. Mit Hilfe von GFP-Fusionsproteinen des V2-Rezeptors konnte an lebenden, transient transfizierten COS.M6-Zellen gezeigt werden, dass die transportdefekten Mutanten E335Q, L339T und L339/340T im ER retiniert werden und dass das Glutamat/Dileucinmotiv daher für den Transport von ER zu Golgi-Apparat notwendig ist. In Übereinstimmung mit diesen Befunden wurden bei diesen Mutanten keine komplexen Glykosylierungen gefunden. Für diese Ergebnisse sind zwei Interpretationen möglich: 1.) Das Glutamat/Dileucinmotiv könnte ein lineares Transportsignal darstellen, das von spezifischen ER-zu-Golgi-Vesikel-Proteinen erkanntwird. 2.) Es könnte sich um ein Motiv handeln, das für den Rezeptor faltungsrelevant ist und damit das Passieren des Qualitätskontrollsystemsdes ER ermöglicht. Um beide Möglichkeiten voneinander zu unterscheiden, wurde ein Rezeptorfragment hergestellt, das Transportstudien für den C-Terminus erlaubt, die unabhängig von der Gesamtrezeptorfaltung sind. Hierfür wurde der Bereich zwischen TMDII-VII des V2-Rezeptors deletiert und die IZS1 an Position 71 mit dem C-Terminus fusioniert. Die Mutationen des Glutamat/Dileucinmotivs, die am gesamten Rezeptor zu einem Transportdefekt führten, wurden in das verkürzte Konstrukt eingeführt und in transient transfizierten HEK293-Zellen hinsichtlich ihrer Transporteigenschaften untersucht. Alle mutierten Rezeptorfragmente konnten mittels Laser Scanning Mikroskopie an der Plasmamembran lokalisiert werden. Damit konnte gezeigt werden, dass das Glutamat/Dileucinmotiv kein lineares Transportsignal für ER zu Golgi-Vesikel darstellt. Die Daten zeigen vielmehr, dass das Motiv für eine transportkompetente Faltung des vollständigen Rezeptors notwendig ist. Diese Interpretation wurde auch durch ein 3D-Homologie-Strukturmodell des V2-Rezeptors unterstützt. Das Model sagt voraus, dass das Motiv Teil einer U-förmigen Schleife im C-Terminus ist. Der Rest L339 könnte für das Zurückfalten des C-Terminus an die IZS1 notwendig sein, in dem er mit L62 eine hydrophobe Wechselwirkung eingeht. Bei Patienten mit nephrogenem Diabetes insipidus treten in der entsprechenden IZS1-Region Mutationen auf (L62P und [Delta]L62-R64). Die Eigenschaften der mutierten Rezeptoren wurden in dieser Arbeit ebenfalls charakterisiert. Beide Mutationen führten zu transportdefekten V2-Rezeptoren, die im ER retiniert wurden. Diese Ergebnisse stehen ebenfalls in Übereinstimmung mit der postulierten IZS1/IZS4-Interaktion und dem Strukturmodell. Eine Datenbankanalyse zeigte, dass sowohl das hydrophobe Faltungsmotiv im C-Terminus als auch die entsprechende IZS1-Region in derGPCR-Familie konserviert sind. Little is known concerning the intracellular transport of the G protein-coupled receptors (GPCR). Previous studies suggested a functional role for residues immediately preceding the conserved palmitoylated cysteine residues in the intracellular carboxyl termini of some GPCR in cell surface transport. The significance of a dileucine sequence with an upstream glutamate residue (EXXXLLCC) in mediating cell surface delivery was assessed for the human V2 vasopressin receptor. A series of deletion and point mutants in this region were constructed, and the mutant receptors were expressed in transiently transfected COS.M6 cells. By using [3H]arginine-vasopressin binding assays to intact cells and immunofluorescence studies with intact and permeabilised cells, it was shown that residues E335 and L339 are obligatory for receptor transport to the plasma membrane. Residue L340 has a minor but significant influence. Studies with green fluorescent protein-tagged receptors demonstrate that the bulk of the mutant receptors E335Q, L339T and L339/340T are trapped in the endoplasmic reticulum. Complex glycosylation was absent in these mutant receptors, supporting this conclusion. The motif may represent a transport signal that is recognised by a component of ER to Golgi vesicles. Alternatively, it may be necessary for transport-competent receptor folding to pass the quality-control system of the ER. To assess these two possibilities, a receptor fragment that allows transport studies independent of full-length receptor folding was constructed. Transmembrane domains II-VII were deleted, thereby fusing the intracellular C terminus to the first cytoplasmic loop. The mutations that impaired transport of the full-length receptor were introduced, and receptor fragments were localised in transiently transfected HEK293 cells. All mutant receptor fragments were detectable at the plasma membrane, demonstrating that the glutamate/dileucine motif does not function as a small, linear vesicular transport signal. Instead, the results strongly suggest that this motif is required for transport-competent folding of the full-length receptor. To assess the underlying conformational features, a three-dimensional homology model of the V2 receptor was computed. The model predicts that the glutamate/dileucine motif contributes to a U-like loop within the intracellular C terminus. Residue L339 may be required for folding back the intracellular C terminus to residue L62 of the first cytoplasmic loop. The naturally occurring L62P and [Delta]L62-R64 mutations in the first cytoplasmic loop were characterised and shown to lead to transport-defective full-length V2 receptors that are retained in the ER, consistent with the structure model and phenotype. A databank analysis revealed that these residues are part of a conserved region in the GPCR family.