Kontrolle der glattmuskulären GC-Aktivität via NO-Sensitivität, Häm-Redox-Status und Proteinexpression

Abstract

Im ersten Teil dieser Studie wurde zunächst untersucht, welche Mechanismen für die akute und chronische Desensitivierung derglattmuskulären löslichen Guanylylcyclase (GC) gegenüber NO bei intakter Gefäßfunktion verantwortlich sind. Das Kontraktions- undRelaxationsverhalten von isolierten Rattenaorten im Organbad diente als Maß für die GC-Aktivität. Es wurden sowohl der Einfluß desendogen gebildeten NO als auch der Einfluß von exogen zugeführtem NO untersucht. Hierbei wurde ermittelt, ob die Sensitivitätsänderungder GC gegenüber NO direkt durch NO vermittelt wird oder ob eine gesteigerte cGMP-Bildung die indirekte Ursache für dieDesensitivierung des Rezeptorproteins ist. Es konnte gezeigt werden, daß die Desensitivierung aufgrund der basalen NO-Freisetzungerfolgte. Wir konnten weiterhin zeigen, daß exogen zugeführtes NO die glatte Gefäßmuskulatur der Ratte gegenüber NO in gleichem Maßedesensitiviert wie endogen gebildetes NO. Durch Untersuchungen mit dem Atrialen Natriuretischen Faktor konnten wir denSignaltransduktionsweg näher charakterisieren und zeigen, daß sehr wahrscheinlich eine gesteigerte cGMP-Bildung für die akuteDesensitivierung der GC verantwortlich ist. Ergänzend führten wir Analysen über das Redoxgleichgewicht der GC durch. Hierzu wurden neu entwickelte selektive Aktivatoren der Eisen(III)-Form der GC - S973448 und HMR1766 (schwefelsubstituierte Sulfonylamino-carbonsäure-N-arylamide) - verwendet. Wir konnten inunseren Befunden zeigen, daß die akute Desensitivierung der GC durch physiologische Konzentrationen von NO nicht auf einer Oxidationdes Hämeisens des Enzyms beruht. In Tiermodellen wurden die Auswirkungen einer chronischen Aktivierung der Eisen (II)-Form und der Eisen (III)-Form der GC auf dieNO-Sensitivität, den Redoxstatus und die Proteinexpression der GC analysiert. Außerdem wurde untersucht, ob Aktivatoren der Häm-oxidierten GC bei chronischer in vivo Anwendung eine Toleranz induzieren. Hierbei wurde insbesondere die Frage berücksichtigt,inwieweit diese Substanzen langfristig in der Lage wären, organische Nitrate bei der Behandlung von Krankheitsbildern mit endothelialerDysfunktion, wie z. B. Atherosklerose und Bluthochdruck, zu ersetzen. Wir konnten erstmals zeigen, daß die Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC wesentliche Vorteile gegenüber den organischen Nitratenaufweisen, da dieBehandlung der Ratten mit S973448 und HMR1766 weder über einen Zeitraum von drei Tagen noch über vier Wochen zueiner Wirkungsabschwächung dieser Substanzen (Eigentoleranz) führt. Auch gegenüber organischen Nitraten sowie endogenem NO(Kreuztoleranz) konnten wir trotz der chronischen Aktivierung der Häm-oxidierten GC keinen Wirkungsverlust dieser Pharmakabeobachten. Expressionsänderungen der GC konnten wir ebenfalls nicht feststellen. Es ist daher anzunehmen, daß die neuen, selektiven Aktivatorengünstigere Eigenschaften als die bisher verwendeten organischen Nitrate aufweisen und therapeutisch zur Behandlung der genanntenHerz- Kreislauf- Erkrankungen geeignet sind. Im zweiten Teil der Arbeit untersuchten wir in Tiermodellen mit einer experimentell induzierten Störung der Funktion des glattenGefäßmuskels, ob die chronische Aktivierung der Eisen (II)-Form der GC zu einer Veränderung der NO-Empfindlichkeit, desOxidationsstatus des Enzyms und der Expression der GC-Untereinheiten a (alpha) 1 und ß(beta) 1 führt. Wir konnten im Tiermodell der nitrattoleranten Ratte sowohl eine Toleranz gegenüber Nitroglycerol als auch gegenüber endothelabhänigenDilatatoren und - wenn auch nicht so ausgeprägt - gegenüber Natriumnitroprussid (Kreuztoleranz) beobachten. Einen Wirkungsverlustgegenüber den Aktivatoren der Eisen (III)-Form der GC konnten wir nicht feststellen. Weiterhin zeigten wir, daß die chronische Aktivierungdes Renin-Angiotensin-Systems zu einer gesteigerten Superoxidbildung führt, die wiederum eine verminderte Bioverfügbarkeit von NObewirkt. Dies führt zu einer kompensatorisch gesteigerten Expression der GC-Untereinheiten ( a(alpha) 1 / ß (beta) 1 ) in nitrattolerantenRattten. Im Tiermodell der genetisch salzsensitiven Dahl-S-Ratte konnten wir nachweisen, daß die durch den renalen Bluthochdruck hervorgerufeneGefäßdysfunktion in den Rattenaorten zu einer Abnahme der Sensitivität gegenüber Acetylcholin und Natriumnitroprussid sowie dem NO-unabhängigen, direkten Aktivator der GC, YC-1, führt. Auch war die Expression beider GC-Untereinheiten in den Aorten der hypertensivenRatten vermindert. We investigated the mechanism responsible for the acute and chronic desensitization of soluble guanylyl cyclase (GC) in intact bloodvessels to NO. The relaxant response of the isolated rat aorta to NO served as a measure for the in vivo GC activity. We analyzed theinfluence of endogenously and exogenously produced NO, and studied whether the desensitization of the GC was a direct NO-inducedeffect, or an indirect cGMP mediated process. We showed that the basal endothelial NO-release is responsible for the desensitization.Furthermore we demonstrated that exogenously applied NO shows the same desensitizing effect as endogenously produced NO. Weanalyzed the signaling pathway by using atrial natriuretic peptid (ANP), an activator of the particulate GC, and showed that an increasedcGMP-production by ANP likely accounts for the desensitization of the GC. We analyzed the redox state of GC by using the selective activators of the heme-oxidized GC S973448 and HMR1766. Our results provedthat the acute desensitization of the GC by physiological concentrations of NO is not based on oxidation of the GC heme. In animal models we analyzed the effects of chronic activation of the Fe2+- and Fe3+-form of GC on NO-sensitivity, redox state and proteinexpression of GC. Moreover we investigated whether chronic application of activators of the heme-oxidized GC leads to tolerance. Inaddition, we put special attention to the question whether these compounds are able to replace the organic nitrates in the treatment ofendothelial dysfunctions, e.g. atherosclerosis and hypertension. We demonstrated for the first time that the activators of the heme-oxidized GC exhibit significant advantages compared to organic nitrates.The treatment of the rats for 3 days or 4 weeks with these substances neither induced tolerance to these substances nor cross tolerance toendogenous NO or organic nitrates. Also we could not find changes in the protein expression. Therefore we conclude that the new selective activators of the heme-oxidized GCmay be more suitable than organic nitrates for the treatment of cardiovascular diseases, especially if the NO-insensitive form of GCprevails in the affected vascular tissues. Furthermore we investigated in animal models with pharmacologically induced dysfunction of the vascular smooth muscle, whether thechronic GC activation is responsible for changes in NO-sensitivity, oxidation state and expression of the GC subunits. We demonstrated in nitrate tolerant rats cross tolerance to sodium nitroprusside and endothelium derived relaxing factor but no tolerance tothe activators of heme-oxidized GC. Furthermore we showed that chronic activation of the renin-angiotensin-system causes increasedO2--formation and therefore a reduced NO bioavailability. This leads to a compensatory increase in expression of both GC subunits in thenitrate tolerant rat. In the genetic salt-sensitive hypertensive Dahl-rat we showed that the vascular dysfunction leads to a decreased sensitivity to acetylcholine,sodium nitroprusside and to the direct, NO-independent GC activator YC-1. In accordance with these findings the expression of both GCsubunits was decreased.