Virusökologische Untersuchungen zur Bornaschen Krankheit in Bayern

Abstract

Die Bornasche Krankheit wird durch das Borna Disease Virus 1 (BoDV-1), einem Virus aus der Ordnung Mononegavirales, ausgelöst. Vor allem Pferde und Schafe können an dieser tödlich endenden Krankheit, die eine Meningoenzephalitis auslöst, erkranken. Aufgrund epidemiologischer Untersuchungen wird seit längerem ein natürliches Virus-reservoir in den Endemiegebieten vermutet. In der Schweiz wurde BoDV-1 im Jahre 2006 bei Feldspitzmäusen (C. leucodon) nachgewiesen. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Charakterisierung des Virusreservoirs in den Endemiegebieten in Bayern. Das Hauptaugenmerk wurde auf die Rolle der Feldspitzmaus und die unterschiedlichen Verläufe der Infektion bei den Kleinsäugern gelegt. Zusätzlich sollten zuverlässige Nachweise einer BoDV-1-Übertragung von der Spitzmaus auf das Pferd erbracht werden. In einem zweiten Teil der Studie wurde untersucht, ob sich Füchse (Vulpes vulpes), Dachse (Meles meles) und andere kleinen Karnivoren durch den Kontakt mit BoDV-1-infizierten Feldspitzmäusen anstecken und als Reservoir fungieren können.Für den ersten Teil der Studie wurden insgesamt 337 Kleinsäuger, davon 87 Soricidae, 122 Muridae und 128 Cricetidae aus der Schädlingsbekämpfung von 16 Pferdebetrie-ben beziehungsweise von Privatpersonen aus Bayern, Baden-Württemberg und Hessen untersucht. Elf Betriebe aus Endemiegebieten in Bayern verzeichneten mindestens einen Fall von equiner Bornascher Krankheit. Die Auswertung der Betriebsdaten zeigte unter anderem, dass die Umgebung der Betriebe mit den Habitatbedingungen von C. leucodon korrelierte und es in fast allen Betrieben offene Zugänge zu Ställen und Fut-terkammern gab, die ein Endringen von Kleinsäugern ermöglichten. Die Kleinsäuger wurden auf anti-BoDV-1-Serumantikörper mittels indirektem Immunofluoreszenztest (IIFT) und auf BoDV-1-RNA mittels RT-qPCR und nested-RT-PCR untersucht. BoDV-1-positive Tiere und Kontrolltiere wurden zusätzlich mittels Immunhistologie (IHC) und In-situ-Hybridisierung (ISH) auf BoDV-1-Antigen, genomische und messenger RNA untersucht und die virale RNA wurde sequenziert. Bei fünf C. leucodon waren BoDV-1-RNA und -Antigen im zentralen und peripheren Nervensystem, sowie in peripheren Organen und Geweben nachweisbar. Von diesen fünf C. leucodon waren drei seropositiv mit Titern bis zu 1:20480, eine wies einen Titer von <1:10 auf, und von einer C. leucodon war kein Serum verfügbar. Zwei C. leucodon waren nur serologisch positiv. Die BoDV-1-positiven C. leucodon stammten aus zwei Betrieben im Landkreis Günzburg in Schwaben. Der Vergleich der Virussequenzen einer BoDV-1-positiven C. leucodon und einem an BD erkrankten Pferd aus demselben Betrieb ergab eine 100% Homologie. Zusätzlich konnte eine 98% Homologie zu anderen Feldisolaten aus dem Cluster Baden-Württemberg und Bayern II festgestellt werden (über 2150 Nukleotide). Desweiteren wurden noch bei sechs Soricidae, vier Muridae und einer Cricetidae anti-BoDV-1-Antikörper mit Titern bis zu 1:320 festgestellt.Im zweiten Teil der Studie wurden Blut- und Gehirnproben von 232 Rotfüchsen, elf Dachsen, einem Mauswiesel (Mustela nivalis) und einem Iltis (Mustela putorius) aus Bayern, Baden-Württemberg und Hessen auf anti-BoDV-1-Serumantikörper, BoDV-1-RNA und ggf. auf BoDV-1-Antigen mittels IIFT, RT-qPCR, nested-RT-PCR und IHC untersucht. Eine speziell entwickelte pan-Borna-RT-PCR, die auch das zoonotische VSBV-1 erkennt, sowie eine metagenomische Analyse von drei repräsentativen Ge-hirnproben wurden weiterhin angewendet. Insgesamt lagen bei 38 von 238 untersuchten Kleinsäugerseren (37 Füchse und ein Dachs) anti-BoDV-1-Antikörper vor. Die Titer reichten von 1:40 bis 1:2650. Die positiven IIFT-Resultate wurden mit Hilfe eines Wes-tern Blots bestätigt. Es konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen dem Vorkommen von seropositiven Füchsen aus Endemie- und Nichtendemiegebieten fest-gestellt werden. Histologisch wiesen 16 Rotfüchse eine nicht-eitrige (Meningo-) Enze-phalitis auf. Es konnte jedoch weder BoDV-1-Antigen noch -RNA im Gehirn der Tiere nachgewiesen werden. Bei sechs von zehn Füchsen wurde eine Staupeinfektion fest-gestellt, allerdings konnte bei den restlichen zehn Tieren die Ursache der Enzephalitis nicht geklärt werden. Tollwut, Staupe, Aujeszky sche Krankheit, Toxoplasmose, Parvo-virose, sowie Infektionen mit Flaviviren und caninen Adenoviren konnten ausgeschlos-sen werden. Abschließend kann C. leucodon als Reservoirwirt für BoDV-1 in Bayern bestätigt wer-den. Es kann von einer BoDV-1-Übertragung von infizierten C. leucodon auf das Pferd ausgegangen werden. Die BoDV-1-Infektion der Kleinsäuger kann sich in unterschied-lichen Infektionsverläufen manifestieren. Füchse und Dachse stellen aufgrund bisher vorliegender Daten kein Reservoir für Bornaviren in Deutschland dar. The etiological agent of Borna disease (BD) is the Borna disease virus (BoDV-1) within the order Mononegavirales. BD is a fatal disease and can induce a meningoencephalitis in the main natural hosts horses and sheep. Epidemiologic studies have indicated natural virus reservoirs in endemic regions for BD for a long time. The first evidence of BoDV-1-infection in the bicoloured white-toothed shrew (C. leucodon) was found in 2006 in Switzerland. The aim of the present study was to characterise BoDV-1 reser-voirs in endemic regions in Bavaria. The role of C. leucodon in natural BoDV-1 infection and the different courses of BoDV-1-infection in small mammals were of particular in-terest. An additional objective was to provide reliable evidence for a shrew to horse transmission. The aim of the second part of the study was to investigate whether red foxes (Vulpes vulpes), badgers (Meles meles) and other small carnivores can be af-fected by BoDV-1 and act as a reservoir after they have been in contact with BoDV-1-shedding C. leucodon.In a first study, we investigated samples from 337 small mammals, including 87 Sori-cidae, 122 Muridae and 128 Cricetidae from pest control of a total of 16 horse farms respectively from private persons in Bavaria, Baden-Württemberg and Hesse. Eleven farms in Bavaria had a history of equine borna disease. The evaluation of farm data showed amongst other factors that the surroundings of the farms correlated with the habitat conditions of C. leucodon and almost all farms presented open access to stables and feeding chambers for small mammals. Antibody detection was performed by indirect immunofluorescence test (IIFT) and BoDV-1-RNA-detection by RT-qPCR and nested-RT-PCR. BoDV-1 positive small mammals and control animals were addition-nally analysed by immunohistochemistry (IHC) and in situ hybridization (ISH) for the detection of BoDV-1 antigen, genomic and messenger BoDV-1 RNA. Viral RNA was sequenced.A total of five out of 30 C. leucodon were positive for BoDV-1-antigen and -RNA in the central and peripheral nervous system and in peripheral organs and tissues. However, only three C. leucodon displayed anti-BoDV-1-antibodies with titers up to 1:20480. One C. leucodon displayed no antibodies and no serum sample was available for another C. leucodon. Two out of 30 C. leucodon displayed only anti-BoDV-1 antibodies. The posi-tive shrews originated from two horse farms in the Günzburg administrative district in Swabia. A BoDV-1 shrew sequence revealed 100% homology to an amplificate from a diseased horse of the same flock and 98% homology to field strains from the virus clus-ter of Baden-Württemberg and Bavaria II (covering 2150 nucleotides). Furthermore, six Soricidae, four Muridae and one Cricetidae displayed anti-BoDV-1-antibodies with titers up to 1:320.In the second part of the study, samples of 232 red foxes, eleven badgers, one weasel (Mustela nivalis) and one polecat (Mustela putorius) from Bavaria, Baden-Württemberg and Hesse were analysed for anti-BoDV-1-antibodies, BoDV-1-RNA and BoDV-1-antigen (where applicable) by IIFT, RT-qPCR, nested-RT-PCR and IHC. A specially designed pan-Borna-RT-PCR detecting the zoonotic VSBV-1 and a metagenomic analysis for three representative brain samples were additionally applied. 38 out of 238 small carnivores (37 foxes and one badger) displayed anti-BoDV-1-antibodies. Titers reached from 1:40 to 1:2560. The specificity of the antibodies was confirmed by west-ern blot. There was no statistically significant difference between the occurrences of seropositive small carnivores in endemic and non-endemic regions. 16 red foxes showed a non suppurative (meningo-) encephalitis by histological examination. Neither BoDV-1-antigen nor -RNA could be detected in the brain samples. Canine distemper virus was found in the brains of six foxes, but for ten out of 16 foxes with encephalitis the cause remained unclear. Foxes with non-suppurative encephalitis were investigated for the presence of rabies, canine distemper, toxoplasmosis, aujeszky s disease, parvovirus, flavivirus and canine adenovirus infections.To conclude, C. leucodon act as a reservoir for BoDV-1 in Bavaria. The transmission from BoDV-1-infected C. leucodon to horses is highly likely. There exist different courses of BoDV-1-infection in small mammals. Regarding the present data there are no indices that small carnivores act as a reservoir for BoDV-1 in Germany.