Die Regulation von Nampt nach Myokardinfarkt

Abstract

Das Protein Nampt wurde in der Literatur bereits mehrfach als protektiver Ein-flussfaktor im Zusammenhang mit dem Schutz vor Apoptose von Kardiomyozy-ten sowie der Förderung von Angiogenese von Endothelzellen beschrieben. Auch in vivo konnte eine Verkleinerung der Infarktfläche nach Induktion eines Myokardinfarktes bzw. I/R unter dem Einfluss von Nampt gezeigt werden. Es scheint des Weiteren über die Bereitstellung von NAD+ in Stress-Situationen einen Einfluss auf die Aktivität der Deacetylase SIRT1 zu entfalten.Ein neuerer Ansatz zu Beeinflussung von mRNA- und Proteinexpression stellen miRNAs dar, die ihre target mRNA degradieren bzw. in der Translation inhibie-ren. Durch in silico Analysen konnte miRNA 374 als potentieller Regulator der Nampt-spezifischen mRNA- und -Proteinexpression identi-ziert werden. In die-sem Projekt wurde daher die Möglichkeit einer Einflussnahme auf die Expressi-on von Nampt nach Myokardinfarkt durch miRNA-374 näher untersucht.Hierfür wurde bei C57Bl6-Mäusen ein experimenteller Myokardinfarkt über die Ligatur der LAD induziert und nachfolgend zu verschiedenen Zeitpunkten (24, 48 und 72 h) die Expressionsrate von Nampt sowie von miRNA-374 bestimmt. Es konnte erstmals gezeigt werden, dass es auch zu späteren Zeitpunkten nach Myokardinfarkt in vivo zu einer signifikanten Herunterregulation von Nampt sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene kommt. Diese Herunter-regulation konnte vornehmlich in der endothelzellreichen Zellfraktion im Herzen nachgewiesen werden. Als beeinflussender Faktor dieser verminderten Expres-sion in vitro konnte Hypoxie ermittelt werden. Im Gegensatz zu der beschriebe-nen Expression von Nampt nach Myokardinfarkt kam es zu den genannten Zeitpunkten zu einer signifikanten Hochregulierung der miRNA-374. Dies konn-te erneut vor allem in endothelzellreichen Zellfraktion detektiert werden. Der beeinflussende Faktor der Hochregulation von miRNA-374 in vitro war erneut eine Behandlung der Zellen mit Hypoxie.Eine nachfolgend durchgeführte Überexpression von miRNA-374 führte zu ei-ner verminderten Proteinexpression von Nampt. Des Weiteren erwies sich die angiogene Eigenschaft von Endothelzellen, Gefäßsprosse zu bilden, unter die-sen Bedingungen als signifikant reduziert. Ein knock-down von miRNA-374 führte zu einer Hochregulation von Nampt, hatte allerdings keinen signifikanten Einfluss auf die angiogenen Eigenschaften von Endothelzellen. Im Gegensatz hierzu konnte unter dem Einfluss von Hypoxie nach miRNA-374 knock-down eine gesteigerte tube formation der Endothelzellen detektiert werden. Neben der Beeinflussung von Nampt durch miRNA-374, der damit verbundenen Möglichkeit der Förderung von Angiogenese und somit des Regenerationspo-tentials des durch Myokardinfarkt geschädigten Myokards wurde SIRT1 als ein potentielles target Molekül von Nampt näher charakterisiert. Auch SIRT1 erwies sich zu verschiedenen Zeitpunkten nach Myokardinfarkt sowohl auf mRNA- als auch auf Proteinebene als signifikant herunterreguliert, seine Aktivität als signi-fikant reduziert. Durch die Abhängigkeit der Deacetylierungsreaktion von SIRT1 von NAD+ als wichtigem Kofaktor kann Nampt durch eine vermehrte NAD+-Bereitstellung Einfluss auf die SIRT1-Aktivität ausüben. Eine vermehrte Nampt-Expression durch Inhibierung der miRNA-374 kann somit nicht nur direkt, son-dern auch über eine Beeinflussung der SIRT1-Aktivität protektiv wirken.Zusammenfassend kann festgestellt werden, dass sich durch die Erkenntnisse der vorliegenden Arbeit eine Möglichkeit gefunden hat, über die Inhibierung von miRNA-374 nach Myokardinfarkt die Expression von Nampt zu beeinflussen und somit zu einer Förderung der Angiogenese im Infarktareal und in der Folge einer verbesserten Regenerationsfähigkeit des Myokards beizutragen. Es ist nun weiterhin von Interesse, einen therapeutischen Effekt auf eine Gefäßneu-bildung im infarzierten Myokardareal und hiermit verbunden eine potentiell ver-besserte Pumpfunktion durch die Inhibierung von miRNA-374 in vivo weiterge-hend zu untersuchen. The Protein Nampt functions in a wide array of cellular processes, including pro-tection from apoptosis in cardiac myocytes. Furthermore an intravenous injec-tion of Nampt has been shown to result in a smaller area of myocardial infarc-tion after I/R in vivo. Nampt also seems to be critical for angiogenic activity in endothelial cells. And in addition it seems to influence the activity of the deace-tylase SIRT1 by providing NAD+ in stress situations. MiRNAs represent a new possibility to influence mRNA and protein expression either by degrading their target mRNA or inhibiting its translation. Therefore, in this project the influence of miRNA-374 on Nampt expression and the angiogenic activity of endothelial cells after myocardial infarction has been investigated. In a first step, myocardial infarction was induced by ligating the left coronary artery (LAD) of C57/Bl6 mice. Mice were euthanized and the ischemic myocardium was dissected for further evaluation 24, 48 and 72 h after myocar-dial infarction. At all time points, Nampt was significantly down-regulated at both the mRNA and protein level, and it could be verified, that this down-regulation primarily took place in the endothelial-enriched cell fraction isolated from the ischemic hearts. In a next step it has been investigated, which factor might cause the down-regulation of Nampt in human coronary artery endothelial cells (HCAEC) in vitro, and hypoxia was identified as the main trigger for Nampt-down-regulation. MiRNA-374 was identified to regulate Nampt at a post-trans-criptional level as a possible explanation for the decreased Nampt concentration and activity. In addition, miRNA-374 proved to be significantly up-regulated after myocardial infarction in vivo and after hypoxic treatment in vitro. The overexpression of miRNA-374 in ECs led to a significant down-regulation of Nampt protein expression in vitro. Tube formation of ECs was significantly re-duced after miRNA-374 overexpression as a sign of reduced angiogenic activity of these cells. A knock-down of miR-374 by a specific o-methylated miRNA-inhibitor in vitro resulted in an up-regulation of Nampt levels in ECs. However, tube formation was not affected under these conditions. In contrast, after re-peating the experiment under hypoxic conditions, tube formation activity of ECs was significantly increased after the knock-down of miRNA-374.Subsequently, SIRT1 expression - as a putative target molecule of Nampt - has been elucidated after myocardial infarction. SIRT1 mRNA- and protein expres-sion were significantly down-regulated and its activity significantly reduced after myocardial infarction in vivo. Because SIRT1 deacetylation activity is dependent of the availability of NAD+, Nampt is also able to influence the protective effects of SIRT1 by providing enough NAD+ for its action. These findings point out an-other possibility to protect the heart from ischemic damage.In summary, miRNA-374 awas identified as a key regulator of Nampt, which itself regulates angiogenesis and has the potential for myocardial regeneration following myocardial infarction. Further studies, however, are needed to deter-mine the role of miRNA-374 in vivo and whether it´s inhibition might increase the angiogenic activity and the regenerative potential of endothelial cells in the infracted myocardium.