Gesamtgenomscan bei nicht verwandten Warmblutpferden mit chronisch obstruktiver Bronchiolitis

Abstract

Es wurde ein Gesamtgenomscan bei bis in die Großelterngeneration nicht verwandten Warmblutpferden mit COB zur Identifizierung krankheitsrelevanter Genvarianten im Rahmen einer Fall-Kontrollstudie durchgeführt. Dazu wurden Proben in der Schweiz und in Deutschland gesammelt. Insgesamt 364 Pferde konnten in die Studie innerhalb von zwei Jahren eingeschlossen werden. Die Warmblüter wurden anhand der Auswertung eines standardisierten und validierten Fragebogens (RAMSEYER et al. 2007; LAUMEN et al. 2010) in Bezug auf ihren COB-Status in chronisch lungenkranke Fälle (n=186) und lungengesunde Kontrollen (n=178) eingeteilt. Zur semiquantitativen Auswertung der Besitzerangaben wurde ein Score-System entwickelt, welches eine differenziertere Bewertung der Schwere der Symptome ermöglicht. Aus EDTA-stabilisierten Blutproben erfolgte die DNA-Isolierung am Institut für Genetik der Vetsuisse-Fakultät Bern. Anschließend wurde am Department of Genetics des Animal Health Trust in Newmarket eine Genotypisierung durch Überprüfung von 54.602 SNPs mittels EquineSNP50 Genotyping Bead Chip (Illumina®, San Diego, USA) durchgeführt. Anhand der Berechnung von multidimensionalen Skalierungen konnte eine hohe genetische Ähnlichkeit innerhalb der Warmblutpopulation sowie zwischen Fällen und Kontrollen dargestellt werden. Durch Kombination der Genotypinformationen mit den Phänotypangaben wurden genomweite Assoziationsstudien berechnet. Im Gegensatz zum Nachweis von QTLs für COB auf Chromosom 13 und 15 durch einen Gesamtgenomscan von SWINEBURNE et al. (2009) bei direkten Nachkommen zweier Schweizer Warmbluthengsten konnten in der vorliegenden Arbeit bei den nicht verwandten Warmblütern nach Permutationsberechnung keine signifikanten Unterschiede zwischen Fällen und Kontrollen festgestellt werden. Durch Berechnung der genomweiten Assoziationen zur Fuchsfarbe in der eigenen Studienpopulation mit dem gleichen Material und mit derselben Methodik konnte eine hochsignifikante Assoziation (EMP2 = 0,001) zu Chromosom 3, auf dem das für die Fuchsfarbe verantwortliche Gen liegt, gezeigt werden. Somit konnte bestätigt werden, dass die Methodik geeignet ist um vorhandene Assoziationen aufzudecken.Es ist wahrscheinlich, dass zum einen die Probandenanzahl von 364 Warmblütern und zum anderen die Markerdichte des eingesetzten EquineSNP50 Genotyping Bead Chip noch zu gering waren, um mit der equinen COB assoziierte Genloci aufspüren zu können. Zur Aufdeckung von an der COB-Pathogenese beteiligten Genen wird eine weitere Erhöhung der Probandenzahl sowie eine Steigerung der Markerdichte pro SNP-Chip-Untersuchung weiterhin als sinnvoll erachtet. Erste vielversprechende Ergebnisse in dieser Richtung wurden u.a. unter Verwendung des eigenen Materials durch SHAKHSI-NIAEI et al. (2011) publiziert. Mittels QTL-Analyse auf Chromosom 13 konnte eine signifikante Assoziation des SNPs BIEC2-224511 bei nicht verwandten Warmblütern (n=646) zur COB gezeigt werden und das QTL bis auf 0,5 Mb eingegrenzt werden. Die Identifizierung beteiligter Gene wird als Grundlage zur Aufklärung der COB-Pathogenese und damit zur Entwicklung neuartiger Therapieansätze dienen, welche eventuell auch auf den Menschen oder andere Spezies übertragbar sind. In a case-control study with the aim to identify RAO associated genetic variants, a whole genome scan in Warmblood horses was undertaken. Horses were not related until three generations back. Samples were collected in Switzerland and in Germany. Overall 364 horses were included into the study within two years. They were graded into cases (n=186) and controls (n=176) according to their RAO status using a standardized and validated questionnaire (RAMSEYER et al. 2007; LAUMEN et al. 2010). A score-system was developed to semiquantitatively evaluate the information obtained from horse owners. This score allows a detailed assessment of the severity of the symptoms. DNA was isolated from EDTA-blood at the Institute of Genetics, Vetsuisse Faculty, University of Bern. For genotyping 54.602 SNPs were tested at the Department of Genetics, Animal Health Trust in Newmarket using the EquineSNP50 Genotyping Bead Chip (Illumina®, San Diego, USA). By calculating multidimensional scaling a high genetic resemblance was identified within the Warmblood population and between cases and controls. Genome-wide association studies (GWAS) were performed by combining genotype information and phenotype data. In contrast to earlier studies which showed evidence for QTLs for RAO on chromosome 13 and 15 in two Swiss halfsibling families, there were no significant differences between cases and controls after permutation testing within the unrelated Warmblood horses. GWAS for the chestnut coat colour in this population using the same material and the same method showed a highly significant association (EMP2 = 0,001) to chromosome 3. Inheritance of the chestnut phenotype is already known and the responsible gene is located on chromosome 3. The detection of this association confirmed the accuracy of the method used for this study.Presumably the number of 364 subjects and the SNP frequency of the EquineSNP50 Genotyping Bead Chip (Illumina®, San Diego, USA) used in the present study were too low to identify genetic loci associated with RAO. To discover genes involved in the RAO-pathogenesis an increased number of horses as well as genetic markers are still considered to be useful. First promising results are already published by SHAKHSI-NIAEI et al. (2011), who combined results from the study presented here as well as new material (n=646). They performed a QTL-analysis on chromosome 13 and the SNP BIEC2-224511 showed significant association to RAO in unrelated Warmblood horses. This association study allows further narrowing of the QTL interval to about 0.5 Mb. Identifying participating genes will provide a basis for clarification of RAO-pathogenesis and thereby support the development of new therapeutic strategies, which possibly are assignable to human beings or other species.