Membrantransporter für sulfatierte Steroidhormone im Hoden : die Bedeutung des Sodium-dependent Organic Anion Transporters (SOAT) im Reproduktionsgeschehen

Abstract

Sulfatierte Steroide sind aufgrund ihrer hydrophilen Eigenschaften im Gegensatz zu den unkonjugierten Steroiden nicht in der Lage, eigenständig die Zellmembran mittels Diffusion zu durchdringen. Sie sind daher auf Transportsysteme angewiesen, die sie in die Zielzelle hineinbringen. Innerhalb der Zelle können sie von der StS in freie, hormonell aktive Form überführt werden, über den spezifische Rezeptoren mit der DNA interagieren und eine hormonelle Zellantwort initieren und modulieren. Dieser sogenannte Sulfatase Pathway wird in der Literatur als alternativer Weg der Steroidhormonversorgung in intrakrinologisch aktiven Organen wie dem Hoden oder der Haut diskutiert und in den Zusammenhang mit pathologischen Befunden wie dem hormonabhängigen Mammakarzinom in Verbindung gebracht. In dieser Arbeit wurden der Sulfatase Pathway im Hoden untersucht. Hierzu wurden vier potentielle Kandidatentransporter (OATP6A1, OATP1C1, OSCP1 und SOAT) ausgewählt und in Expressionsanalysen und Transportstudien näher charakterisiert. Es zeigte sich, dass alle vier ausgewählten Transportproteine eine prädominante, oder im Fall des OATP1C1, dominante Expression im Hoden aufwiesen. Im Rahmen der funtionellen Charakterisierung stellte sich heraus, dass SOAT der vielversprechendste Kandidat für die Einbindung in den Sulfatase Pathway darstellte. Sowohl die beiden OATP-Proteine wie auch das OSCP1-Protein zeigten in den durchgeführten Transportstudien weder in stabil transfizierten HEK293-Zellen, noch im Xenopus laevis Oozyten-Expressionsmodell eine Transportaktivität für die sulfatierten Steroide DHEAS und E1S, so dass von einer weiteren Untersuchung dieser Proteine abgesehen wurde. SOAT hingegen transportiert eine Vielzahl sulfatierter Steroide. Um sein Substratspektrum zu erweitern, wurde in Kooperation mit der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. S. Wudy, Gießen, die LC-MS/MS für die Analyse sulfatierter Steroide aus Zelllysaten etabliert. Mit Hilfe dieser neuen analytischen Möglichkeit wurde erstmals gezeigt, dass SOAT intakte Steroidsulfate in HEK293-Zellen hineintransportiert. Ferner konnten mit E2S und Androstendiol-3-sulfat zwei neue Substrate des SOAT-Proteins identifiziert werden. Beim Einsatz von Steroidmixen, die E1S, PREGS und DHEAS in wechselnden Konzentrationen enthielten zeigte sich eine, von der Konzentration der Substanz in der Messlösung abhängige Aufnahme der Substrate. Die Aufnahme von E1S kann außerdem durch freies E1 gesteigert werden, wohingegen Testosteron keinen Einfluss auf die Aufnahmemenge der einzelnen Steroidsulfate zur Folge hatte. Diese Daten zeigen, dass sowohl E1S wie auch PREGS und DHEAS ago-allosterische Modulatoren des SOAT-Proteins darstellen. Die LC-MS/MS ermöglichte somit weitere Einblicke in das Transportverhalten des SOAT-Proteins unter physiologischen Bedingungen und stellt ein neues Analyse-Tool für die Identifizierung weiterer Substrate des SOATs dar. Neben der Untersuchung des SOAT-Wildtyp-Proteins erfolgte auch die Evaluierung verschiedener natürlich vorkommender SNPs im SLC10A6-Gen. Hierbei wurde beim SOAT-L204F-Polymorphismus eine signifikant erniedrigte maximale Aufnahmegeschwindigkeit im Vergleich zum SOAT-Wildtyp festgestellt, die vermutlich durch eine unzureichende Sortierung des polymorphen Proteins in die Zellmembran der untersuchten HEK293-Zellen hervorgerufen wird. Die Lokalisation der SOAT-Proteine erfolgte mit dem anti-SOAT311-377 Antikörper, der im Rahmen dieser Arbeit sowohl für den Western Blot als auch für die Immunfluoreszenz validiert wurde. Das membranständige SOAT-Protein wurde mit dem SOAT2-17 Antiserum detektiert und ermöglichte die Kontrolle des Sortierungsprozesses der SOAT-Varianten. Mit dieser Arbeit wurde gezeigt, dass SOAT ein breites Spektrum an intakten Steroidsulfaten Natrium-abhängig in die Zellen transportiert und auf Konzentrationsänderungen in Steroidgemischen mit einer Anpassung seines Transportverhaltens reagiert. Die Aufnahme der Steroidsulfate kann außerdem durch freie Steroide moduliert werden. In vorläufigen Experimenten konnte CS als weiteres potentielles Substrat identifiziert werden. Aufgrund der exklusiven Expression des SOATs im Hoden, die ausschließlich in den Keimzellen stattfindet, und seinem sehr selektives Substratspektrum ist von einer wichtigen physiologischen Funktion dieses Proteins im Hoden auszugehen. Hierfür spricht auch seine reduzierte Expression in verschiedenen Formen der gestörten Spermatogenese und das Auftreten funktionell veränderter SNPs. Seine deutliche Expression in der Haut deutet auch in diesem, intrakrinologisch aktivem Organ auf eine bedeutende Funktion im Rahmen der lokalen Steroidhormonversorgung hin. Um nun die physiologische und pathologische Bedeutung des SOATs final zu klären, wurde ein Slc10a6-Knockout-Maus-Modell generiert, was in weiterführenden Studien vor allem in Hinblick auf den Hoden, die Haut und den Steroidmetabolismus charakterisiert werden soll. SOAT hat das Potential zum Drug Target, was durch diese Arbeit bekräftigt werden konnte. Das Slc10a6-Knockout-Maus-Modell wird hierzu weitere Erkenntnisse liefern, die es ermöglichen SOAT als Drug Target zu nutzen. Free unbound steroids can penetrate the cell membrane by diffusion, bind to the nuclear receptor and initiate a cellular response. In contrast to that, sulfated steroid hormones rely on membrane uptake carriers, which import the sulfoconjugated steroids into the cell, where they can be (re)activated by the catalytic activity of the steroid sulfatase (StS). In the literature, the so called sulfatase pathway is discussed as an alternative way for the local supply of certain organs (testis and skin) with steroid hormones and to play a role in several diseases such as breast cancer or X-linked ichthyosis. The aim of the current study was to determine the role of the sulfatase pathway in the testis. OATP6A1, OATP1C1, OSCP1 and SOAT were selected as potential candidate carriers for steroid sulfate uptake and investigated by expression analyses and transport studies. OATP6A1, OSCP1 and SOAT were predominantly expressed in the human testis, whereas OATP1C1 showed highest expression in brain and a moderate expression in testis. Functional analyses revealed, that SOAT might be the most important steroid sulfate carrier in this study due to the fact that neither the OATPs nor the OSCP1 protein showed transport activity for sulfated steroids in the transport studies although two different expression systems (HEK293 cells and Xenopus laevis oocytes) were used for functional characterisation. In contrast to that, SOAT transported several sulfated steroids, thus further investigations concentrated on SOAT. To expand the substrate pattern of SOAT a novel LC-MS/MS procedure was established in cooperation with Prof. Dr. S. Wudy, Giessen, which is able to detect the cellular uptake of intact sulfoconjugated steroid molecules. With this new technique, E2S and androstenediol-3-sulfate were identified as novel substrates of SOAT. Furthermore steroid mixtures containing various concentrations of sulfated and free steroids were investigated using LC-MS/MS, showing that the uptake of SOAT substrates occurs in a substrate- and concentration-dependent manner. The studies ruled out that E1S, PREGS and DHEAS are all ago-alosteric modulators of SOAT. Additionally, the impact of free steroids on the uptake properties of SOAT was analysed. It was demonstrated that E1 is able to stimulate the E1S uptake whereas testosterone does not influence the transport activity of SOAT. These results confirmed that on one hand the LC-MS/MS technique is a useful tool to analyse simulated physiological conditions in the testis using various free and sulfated steroid hormones and on the other hand it enables the identification of novel substrates of SOAT without using radiolabelled compounds. In addition to the SOAT wild-type, several naturally occuring single nucleotide polymorphisms (SNPs) of the SLC10A6 gene were investigated. This part of the study showed, that the SOAT L204F mutant exhibited aberrant transport kinetics with a significantly reduced maximum velocity of the DHEAS uptake in contrast to SOAT wild-type and SOAT I114V mutant. Abnormal transport kinetics of the SOAT L204F mutant seem to be caused by a disturbed sorting process of the mutated protein. For localisation studies of wild-type and mutant proteins a newly validated antibody was used. The validation of the anti-SOAT3 11-377 antibody was done by western blot analyses, peptid matching studies and immunocytochemistry using immunofluorescent microscopy of the stably transfected SOAT-HEK293 cell lines containing the wild-type or mutant genes. Due to the exclusive expression of SOAT in germ cells of the human testis and its highly selective substrate pattern it can be considered that SOAT plays an important role in the physiology of the human testis. This suggestion is reinforced by the reduced expression of SOAT in different pictures of impaired spermatogenesis and the appearance of functional abnormal SNPs in the SLC10A6 gene. In addition to the testis, SOAT might have physiological significance in the skin, where it is also highly expressed. Considering earlier studies of SOAT function and localisation, SOAT seems to be a potential drug target which was confirmed by this study. In order to clarify the physiological and pathological role of SOAT in the human organism a Slc10a6-knockout mouse model was generated and will be further investigated with special focus on intracrine active organs like testis and skin and on the steroid metabolism of the knockout mice. The Slc10a6-knockout mouse model will help to determine the physiological role of SOAT in certain organs and will elucidate the suitability of SOAT as a drug target.