Untersuchungen zur Pathogenität, Replikationsfähigkeit und Fremdgenexpression rekombinanter porziner Coronaviren (r-TGEV)

Abstract

In der Literaturübersicht werden Vorkommen, pathologisch-morphologische und ultrastrukturelle Veränderungen sowie pathophysiologische Zusammenhänge bei der Transmissiblen Gastro-enteritis (TGE) der Schweine besprochen. Nach einem allgemeinen Überblick über das Transmissible Gastroeneteritis Virus (TGEV) werden seine molekularbiologischen Eigenschaften einschließlich der Morpho-genese und die Vorteile coronaviraler Vektorsysteme beschrieben. Die nach In-vitro-Kultur von PUR46MAD (TGEV) erhaltenen Virustiter lagen höher als bei den rekombinanten TGEV (r-TGEV) mit zusätzlichen Restriktionsendonuklease-Spaltstellen oder den Delta7-Deletionsmutanten. Des Weiteren besaßen die Plaques einen mittleren Durchmesser von 1 mm bei TGEV-PUR46MAD, während bei allen r-TGEV 3 mm beobachtet wurden. Nach oronasaler Inokulation mit r-TGEV-Sc11, als auch r-TGEV-Sc11 mit zusätzlichen Restriktionsendonuklease-Spaltstellen und den Delta7- Deletionsmutanten entwickelten Saugferkel das klinische und morphologische Bild einer TGE. Die Delta7-Deletionsmutanten replizierten sich vergleichsweise sehr gering in der Lunge. Offenbar beeinflusst deshalb das Gen 7 den Tropismus von TGEV. Trotz effizienter Replikation der Delta7-Deletionsmutante r-TGEV-Delta7 besitzt diese eine geringere Virulenz, die sich durch eine höhere Überlebensrate, fehlende hämatologische Veränderungen, geringere sekundäre bakterielle Besiedlung und eine raschere Erholung der Ferkel nach der Infektion äußerte. Die r-TGEV-Isolate kennzeichneten eine hohe Stabilität nach einmaliger Tierpassage. Die intestinalen M-Zellen des Dünndarms wurden immunhistologisch durch Markierung mit Zytokeratin 18 dargestellt. In Einzelfällen fand sich TGEV-Antigen in Anti-Zytokeratin 18-positiven Zellen des Follikel-assoziierten Epithels. Absatzferkel im Alter von 14 Tagen zeigten nach Inokulation mit 1 x 108 PFU von r-TGEV-Sc11-RS(6d) über 3 Wochen keine klinischen Symptome, während Saugferkel frühzeitig TGE entwickelten. Vielmehr bildeten die Absatzferkel Antikörper gegen TGEV. Mittels r-TGEV-Sc11 konnte nach Austausch der coronaviralen Nichtstrukturgene 3a und 3 b das Fremdgen VP1 des Maul- und Klauenseuche Virus (MKSV) in ST606-Zellkultur exprimiert und immunzytologisch nachgewiesen werden. In Saugferkeln war es jedoch nicht möglich, VP1 in den infizierten Darmabschnitten nachzuweisen. Weiterhin kam es nicht zu einer belastbaren Immunität gegenüber MKSV.

Occurrence, patho-morphological and ultra structural alterations as well as the clinicopathologic correlation of the Transmissible Gastroenteritis (TGE) are discussed in the literature chapter. After a general survey of the Transmissible Gastroenteritis Virus (TGEV) the molecular biological characteristics including morphogenesis and the advantages of coronaviral vectorsystems are described. The obtained virus titers of PUR46-MAD after in-vitro culture were higher than the virus titers of recombinant TGEV (r-TGEV) with additional restriction endonuclease sites or with delta7 deletionmutants. Furthermore TGEV PUR46-MAD produced a plaque size of 1 mm in diameter whereas a plaque size of 3 mm was observed in all r-TGEVs. The piglets developed clinical signs and morphologic lesions of TGE after oronasal inoculation with r-TGEV-Sc11, as well as with r-TGEV-Sc11 with restriction endonuclease sites and both delta7 deletionmutants. In contrast to the other r-TGEV-Sc11 mutants the deletionmutants delta7 replicated hardly in the lung tissue. Most likely gene 7 influences the tropism of TGEV. In spite of efficient replication in the intestine the deletionmutant r-TGEV-Sc11-delta7 exhibits a lesser virulence which is characterised by a higher survival rate, the absence of haematological alterations, a minor secondary bacterial load and a faster recovery of the piglets after infection. The different r-TGEV isolates are characterized by a high stability after one animal passage. The M-cells of the small intestines stained positively for cytokeratin 18 using immunhistochemistry. In particular cases TGEV-antigen was detected in cytokeratin 18 positive cells of the follicle associated dome epithelium. After inoculation with 1x108 PFU/ml of r-TGEV-Sc11-RS(6d) in 14-days-old piglets the animals showed no clinical symptoms over the time of three weeks, whereas three-days-old piglets showed TGE only one day after infection. The older piglets were able to develop antibodies against TGEV. It was possible to express and detect immuncytologically the foreign gene VP1 of Foot-and-Mouth Disease Virus (FMDV) in ST606-cells after exchange of coronaviral non-structural genes 3a and 3b using r-TGEV-Sc11. In contrast in piglets three days old it was impossible to demonstrate VP1 in infected segments of the intestine. Furthermore no protective immunity against FMDV was generated.