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dc.contributor.authorKocoski, Vladimir
dc.date.accessioned2023-03-08T17:40:54Z
dc.date.available2008-04-15T09:20:21Z
dc.date.available2023-03-08T17:40:54Z
dc.date.issued2008
dc.identifier.urihttp://nbn-resolving.de/urn:nbn:de:hebis:26-opus-57486
dc.identifier.urihttps://jlupub.ub.uni-giessen.de//handle/jlupub/12848
dc.identifier.urihttp://dx.doi.org/10.22029/jlupub-12231
dc.description.abstractBACKGROUND AND AIM OF THE STUDY: The dog represents the most important tumor patient in the veterinary medicine. Furthermore, the growing knowledge of tumor biology and immunology in dogs increases the interest of this species as a promising model in studies of tumor immunotherapy in human. Concerning the tumor treatment, one of the latest therapeutical approaches is the tumor immunotherapy, especially the adoptive immunotherapy, which is based on in vitro lymphocyte activation by cytokines. Among the cytokines showing very potent anti-tumor activity is the heterodimeric interleukin-12 (IL-12). However, in contrast to mice and human, detailed studies in dogs are lacking. In order to provide reliable sources for future investigations and applications on the field of cancer immunotherapy in dogs, we (1) constructed a canine single-chain IL-12 cDNA, which (2) was stably transfected into the baby hamster kidney (BHK)-Tet-On cell line and (3) confirmed and investigated the biological activities of the canine single-chain IL-12. METHODS: Both cDNA sequences coding for the canine IL-12 chains p35 and p40 were amplified by PCR. The cDNA fragments were ligated to encode a single chain IL-12 in Tet-On expression vector pTRE/luciferase. Following the transfection into a BHK-Tet-On cell line, an anti-luciferase antibody was used to screen for stably transfected cell clones. Additionally, with help of an anti-canine IL-12 polyclonal antibody the presence of the canine single-chain IL-12 protein in the cell clones was investigated by Western blot. Using canine interferon-gamma (IFN-gamma) ELISA, BrdU ELISA-based proliferation assay and cytotoxicity assay (Rose Bengal Assay), the bioactivity of the IL-12 containing supernatants was investigated. RESULTS: The anti-luciferase antibody showed transgene expression in almost 100 % of the cells of the obtained cell lines. Accordingly, these cell clones provide a uniform source of IL-12 for further investigations. Moreover, the single chain canine IL-12 protein was demonstrated by Western blot in the supernatants and in the cell lysates of the established clones. Canine IL-2 blasts incubated with the supernatant of the transfected clone showed significantly increased IFN-gamma production; the latter response was completely blocked by anti-canine IL-12 neutralizing monoclonal antibody. Further on, it was shown that the presence of IL-2 is necessary for the single-chain IL-12 to induce IFN-gamma production by the canine lymphoblasts. However, in contrast to the canine IL-2 lymphoblasts, the single-chain IL-12 did not induce IFN-gamma production in freshly isolated canine peripheral blood mononuclear cells. In canine IL-2 lymphoblasts the single chain IL-12 containing culture supernatant induced an increased cytolytic activity against canine thyroid adenocarcinomas (CTAC) target cell line. CONCLUSIONS: The established cell lines release canine single-chain IL-12 into the supernatant and when compared with commercially available canine IL-12 the recombinant protein produced by our cell lines displayed the full panel of bioactivities. Perspectively, the BHK cell clones carrying the canine IL-12 could be used for further investigation of IL-12 induced anti-tumor effects on canine lymphocytes, especially NK cells. Moreover, canine single-chain IL-12 cDNA can be tested in gene delivery studies, like intra-tumor application.en
dc.description.abstract1. In dieser Studie wurde eine neue Möglichkeit zur Herstellung von kaninemInterleukin-12 (IL-12) mit einer BHK Tet-On Zellinie geschaffen, welche mit einer für das kanine Einzelketten IL-12 kodierenden cDNA stabil transfiziert wurde. Für die Konstruktion dieser cDNA wurden die beiden einzelnen, für die IL-12 Untereinheiten p35 und p40 codierenden cDNAs ligiert, indem sie durch eine Nukleotid Sequenz verbunden wurden, welche für ein aus 2 bovinen Elastin- Motifs bestehendem Dekapeptid kodiert. Die so konstruierte cDNA wurde zusammen mit der für die Luciferase kodierenden cDNA in den pTRE Tet-On Vektor kloniert. Dieser Vektor wurde anschließend in die entsprechende BHK Tet-On Zelllinie transfiziert, welche nun die induzierbare IL-12 Produktion durch Zugabevon Doxyclin zum Zellkulturmedium ermöglicht. 2. Mit Hilfe des Luciferase Assays und der Immunfluoreszenz, durchgeführt mit einem polyklonalen Ziegen-anti-Luciferase Antikörper zum Nachweis des Reportergens in den transfizierten Zellklonen, wurden zwei Zelllinien als stabil transfizierte Zelllinien für die weiteren Untersuchungen ausgewählt. Jede dieser beiden Zelllinien wies einen Induktionsindex von über 200 sowie die Expression des Reporter-Gens in 100 % der Zellen auf. 3. Durch den IFN-g ELISA konnte die biologische Aktivität des in den Überständenenthaltenden rcscIL-12 nachgewiesen werden, was sowohl für die Doxycyclin-induzierten als auch für die nicht induzierten Zellen zutraf. Die gewonnenen Daten ließen nämlich erkennen, dass ein basaler Level der Gentranskription des eingebauten Plasmids vorhanden ist. Neutralisierungstests mit einem anti-kaninen IL12-Antikörper (R&D Systems) wiesen klar darauf hin, dass die erhöhte IFN-g Produktion von zuvor mit IL-2 induzierten Lymphoblasten,welche mit den Überstanden der transfizierten Zellen zuvor inkubiert worden waren, spezifisch auf die Anwesenheit des rcscIL-12 in den Überständen zurückzuführen ist. Darüber hinaus ergab der mit den Überständen und auch mit den Zelllysaten der induzierten Zellen durchgeführte Western Blot die erwartete Bande von annähernd 70 kDa. 4. Das kanine single-chain IL-12 wurde bezüglich stimulierender Einflüsse auf kanine PBMC geprüft, die aus heparinisiertem Blut des Hundes zuvor über einer PercollÒ-Gradient isoliert worden waren. Dabei wurden die Proliferationsrate, die IFN-g-Produktion und die zytotoxische Aktivität der PBMC gemessen. Diese Ergebnisse zeigten, dass das rcscIL-12 nur bei den mit dem IL-2 vorstimulierten, nicht aber bei naiven PBMC die IFN-g Produktion induzieren kann. Diese Ergebnisse zeigten weiterhin, dass die kaninen PBMC mit IL-2 vorstimuliert werden müssen, um eine signifikante Erhöhung der IFN-g Produktion durchrcscIL-12 zu induzieren, dass aber dann auch die anti-Tumorantwort der Effektorlymphozyten deutlich erhöht wird. Die mit IL-2 vorstimulierten Lymphoblasten zeigten allerdings nur eine sehr geringe und nicht signifikante Erhöhung ihrer Proliferationsrate nach der Inkubation mit IL-12, während ihre Steigerung der zytotoxischen Aktivität eine hohe individuelle Variationvon 2 - 75% zwischen den einzelnen Hunden aufwies. 5. Als Schlussfolgerung kann man feststellen, dass die konstruierten Zelllinien das biologisch aktive Einzelketten IL-12 dauerhaft exprimieren. Dem zu Folge können diese Zelllinien als eine definierte und etablierte Quelle von kaninem IL-12 zur in-vitro Stimulierung von Immuneffektorzellen, insbesondere der NK und der CD8+ zytotoxischen T Zellen als Lymphokin-aktivierte Killer- (LAK) Zellen in einer adoptiven Tumorimmuntherapie verwendet werden. Auf Grund der kontinuierlichen Sekretion des IL-12 kann eine dauerhaften Wirkung auf Effektorzellen in vitro erzielt werden, was den natürlichenBedingungen in vivo ähnlich ist. Zusätzlich könnte die für die Einzelketten IL-12 kodierende cDNA-Sequenz bei Tumorpatienten für eine Gentherapie sogar als nackter Plasmidvektor eingesetzt werden. Neueste Experimente haben nämlich gezeigt, dass Virusvektoren nicht notwendiger Weise für eine effektive Gentherapie herangezogen werden müssen.de_DE
dc.language.isoende_DE
dc.rightsIn Copyright*
dc.rights.urihttp://rightsstatements.org/page/InC/1.0/*
dc.subject.ddcddc:630de_DE
dc.titleConstruction and characterisation of a stably transfected BHK cell line permanently secreting the canine interleukin 12 as a source for adoptive cancer immunotherapy in dogsen
dc.title.alternativeTransfektion der BHK-Zelllinie mit dem kaninen IL-12 Gen zur kontinuierlichen Erzeugung von kaninem IL-12 für eine adoptive Tumorimmuntherapie beim Hundde_DE
dc.typedoctoralThesisde_DE
dcterms.dateAccepted2008-03-31
local.affiliationFB 10 - Veterinärmedizinde_DE
thesis.levelthesis.doctoralde_DE
local.opus.id5748
local.opus.instituteInstitut für Veterinär-Pathologiede_DE
local.opus.fachgebietVeterinärmedizinde_DE


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