Untersuchungen zur Rolle zellulärer Proteine bei der Prozessierung des pestiviralen Nichtstrukturproteins NS2-3 und dessen Bedeutung für Replikation und Virionmorphogenese

Abstract

Das positiv-strängige RNA-Genom des Pestivirus bovine viral diarrhea virus (BVDV) wird in ein Polyprotein translatiert, welches ko- und posttranslational durch zelluläre und Virus-kodierte Enzyme prozessiert wird. Eine Cystein-Autoprotease im Nichtstrukturprotein NS2 spaltet NS2-3 und setzt dadurch NS3 frei, welches essentieller Bestandteil des viralen Replikationskomplexes ist. Die Funktion des freien NS3 bei der pestiviralen RNA-Replikation kann nicht von NS2-3 übernommen werden. Letzteres hingegen wird für die Bildung infektiöser Viruspartikel benötigt. Die NS2-3 Spaltung von nicht zytopathogenem (nzp) BVDV ist auf die ersten Stunden nach Infektion beschränkt, so dass zu späteren Zeitpunkten die virale RNA-Replikation herunterreguliert wird und ein Wechsel zur Virionproduktion stattfindet. Demzufolge werden also Replikation und Virionmorphogenese von BVDV durch die Aktivität der NS2 Autoprotease reguliert. Um proteolytisch aktiv zu sein, benötigt die NS2 Protease stöchiometrische Mengen des zellulären Chaperons Jiv (J-domain protein interacting with viral protein) oder seines 90 Aminosäuren großen Fragments Jiv90 als Kofaktor. Der Verbrauch des zellulären Jiv-Vorrats führt zusammen mit der Beschränkung der NS2 Protease auf cis-Spaltung zur zeitlichen Regulation der NS2-3 Spaltung. Aufgrund von Mutationen sind zytopathogene (zp) BVDV Stämme unabhängig von der zellulären Jiv-Menge und spalten NS2-3 während des gesamten Infektionsverlaufs.Zur weiteren Untersuchung der Interaktion von NS2 und Jiv/Jiv90 und der physiologischen Funktion von Jiv in der Zelle wurden rekombinantes NS2 und Jiv-Fragmente in E. coli hergestellt. Um ein ausreichendes Expressionsniveau zu erlangen musste Jiv90 an den C-Terminus von Ubiquitin fusioniert werden. Eine Expression von NS2 war nur als C-terminale Fusion an das B. subtilis Protein Mistic möglich. Es wurden Protokolle zur Aufreinigung löslichen Proteins etabliert. Rekombinantes Jiv90 wurde zur Herstellung eines Jiv-spezifischen monoklonalen Antikörpers genutzt, welcher detailliert charakterisiert und in verschiedenen Assays eingesetzt wurde. Größere Jiv-Fragmente konnten durch Fusion an Trigger Factor und Ubiquitin gewonnen werden.Der zweite Teil dieser Arbeit beschäftigte sich mit der Funktion des ungespaltenen NS2-3 bei der Virionmorphogenese. Zu diesem Zweck wurde der zp BVDV Stamm Osloss als Modellvirus gewählt, da er eine Ubiquitin-Insertion zwischen NS2 und NS3 aufweist, die zu einer vermutlich kompletten Spaltung duch zelluläre Ubiquitin-spezifische Proteasen führt. Trotz des anzunehmenden Mangels an unprozessiertem NS2-3 repliziert Osloss zu hohen Virustitern.Chimäre cDNA-Klone, die auf dem nzp Stamm NCP7 basieren und Osloss Genabschnitte unterschiedlicher Größe enthalten, wurden auf die Bildung infektiöser Viren untersucht. Ein NCP7 Genom, das die Osloss Gene NS2 bis NS4A umfasst, führte nach Transfektion zu einem geringen Titer infektiöser Viren. In diesem Kontext konnte eine essentielle Rolle der NS2 Protease bei der Virionmorphogenese ebenso ausgeschlossen werden wie ein Einfluss der Mutation im Osloss-Ubiquitin auf die Virusproduktion. Durch Zellkulturpassage konnte ein chimäres Virus isoliert werden, das ohne im Western Blot nachweisbare Mengen an NS2-3 einen Titer von über 107 Viren/ml erreicht. Eine Konsensus-Sequenz des viralen Genoms offenbarte sieben Nukleotidaustausche, die zu Aminosäureaustauschen führen, und eine Mutation in der 3NTR. Wiedereinfügen der Austausche in den Ausgangs-cDNA-Klon verursachte einen drastischen Anstieg der Bildung infektiöser Viren, wenn eine Mutation in NS2 mit dem 3NTR Austausch kombiniert wurde. Wurden zusätzlich die Mutationen in Erns, E2 und p7 hinzugefügt, führte dies zu einem weiteren Anstieg des Virustiters bis auf das Niveau des Plaque-gereinigten Virus-Stocks.Es konnte also ein chimäres BVD Virus erzeugt werden, welches eigenständig zu hohen Titern repliziert, ohne nachweisbare Mengen ungespaltenen NS2-3 zu exprimieren. Ausserdem konnten Mutationen identifiziert werden, die für die Produktion infektiöser Viren entscheidend sind und welche in weiteren Untersuchungen analysiert werden sollen. The plus-strand RNA genome of the pestivirus bovine viral diarrhea virus (BVDV) is translated into one polyprotein which is processed co- and posttranslationally by cellular and virus-encoded proteases. A cysteine autoprotease in the viral nonstructural protein NS2 cleaves NS2-3 thereby releasing NS3 which is an essential component of the viral replication complex. While NS2-3 cannot functionally replace NS3 in pestiviral RNA replication it is strictly required for the production of infectious virus particles. NS2-3 cleavage of noncytopathogenic (ncp) BVDV is restricted to the first hours p.i. leading to downregulation of viral RNA replication and a shift to virion production at later time points. Accordingly, replication and virion morphogenesis of BVDV are regulated by the activity of the NS2 autoprotease. To be proteolytically active the NS2 protease needs stoichiometric amounts of the cellular chaperone Jiv (J-domain protein interacting with viral protein) or its 90 amino acids fragment Jiv90 as a cofactor. Consumption of the cellular Jiv pool and the restriction of the NS2 protease to cis cleavage result in the temporal regulation of NS2-3 cleavage. By acquisition of genome mutations cytopathogenic (cp) BVDV strains are independent of the cellular Jiv level and cleave NS2-3 during the whole course of the infection.To further investigate the interaction of NS2 and Jiv/Jiv90 and to elucidate the physiological function of Jiv in the cell, recombinant NS2 and fragments of Jiv were produced in E. coli. To obtain significant expression levels Jiv90 had to be fused to the C terminus of Ubiquitin; expression of NS2 was only achieved as a C-terminal fusion to the Bacillus subtilis protein Mistic. Protocols for purification of soluble protein were established. Recombinant Jiv90 was used to generate a Jiv specific monoclonal antibody which was characterised in detail and proved useful in several assays. Longer Jiv fragments could be purified by fusion to Trigger Factor and Ubiquitin followed by cleavage with the Tobacco Etch Virus (TEV) nuclear inclusion protease.The second part of this work focused on the function of uncleaved NS2-3 in virion morphogenesis. To this aim cp BVDV strain Osloss was chosen as a model virus since it contains an ubiquitin insertion between NS2 and NS3 leading to supposedly complete cleavage by cellular ubiquitin-specific proteases. Despite the assumed lack of unprocessed NS2-3, Osloss replicates to high titres.Chimeric cDNA clones based on ncp strain NCP7 containing Osloss gene segments of different sizes were tested for the production of infectious virus. A NCP7 genome encompassing the Osloss genes NS2 to NS4A led to infectious progeny virus at very low titres. In this context an essential role of the NS2 protease in virion morphogenesis as well as the importance of the Osloss ubiquitin mutation for virus production could be ruled out. After passaging infected cells a chimeric virus could be isolated showing a titre of about 107 viruses/ml without displaying any NS2-3 detectable by western blot. A consensus sequence of the viral genome revealed seven nucleotide changes leading to amino acid substitutions and one mutation in the 3UTR. Reintroduction into the original cDNA caused a drastic increase in infectious virus production if a mutation in NS2 was combined with the 3UTR exchange. Addition of the mutations in Erns, E2 and p7 into the backbone of the double-mutant virus led to a further increase in virus titres reaching the level of the plaque purified virus stock. In conclusion, a chimeric BVD virus was generated replicating autonomously to high titres without expressing detectable amounts of uncleaved NS2-3. Furthermore, several mutations could be identified that are essential for infectious virus production and have to be analysed in future studies.