Der Einfluss des bispezifischen GPVI-Fc-Aptamer Konstruktes auf die Adhäsion von murinen Progenitorzellen in einem Verletzungsmodell der Maus : Untersuchungen mit Hilfe der Intravitalmikroskopie

Abstract

Die Rekrutierung von endothelialen Progenitorzellen zu Gefäßwandverletzungen ist dieVoraussetzung für eine effiziente therapeutische Neovaskularisierung. Endothelverletzungenund die damit verbundene Freilegung der Kollagenmatrix können durch Stentimplantation,durch Ballondilatation oder durch Plaqueruptur infolge der Artherosklerose hervorgerufenwerden. Aufgrund dessen wurde ein Adhäsionsmolekül bestehend aus löslichem GPVI-Fc(Thrombozytenkollagenrezeptor) und einem Aptamer mit einer Bindungsstelle für murineendotheliale T17b-Progenitorzellen konstruiert. Dieses wurde für die Steigerung derRekrutierung von embryonalen endothelialen Progenitorzellen in vitro und in vivo eingesetzt.In der Flusskammer (in vitro) wurde die Bindungsaffinität von mit GPVI-Fc-Aptamer und alsKontrolle mit BSA-Aptamer vorinkubierten T17b-Progenitorzellen über einen Zeitraum von10 Minuten ermittelt. Hierbei zeigten die mit GPVI-Fc-Aptamer vorinkubierten T17b-Zellenim Gegensatz zur Kontrolle in den ersten 10 Minuten eine erhöhte und ansteigendeBindungsfähigkeit auf Kollagen. Außerdem wurde die Adhäsion von T17b-Zellen anunterschiedlichen Beschichtungen (an GPVI-Fc-Aptamer und seinen Einzelkomponenten) inder Flusskammer untersucht. Im Vergleich zu den Kontrollen konnte eine 10-fach erhöhteAdhäsion der T17b-Zellen nach Vorinkubation der Deckgläser mit dem GPVI-Fc-Aptamerbeobachtet werden. In einem weiteren Flusskammerversuch wurde das Bindungsverhalten derT17b-Zellen in Abhängigkeit von der GPVI-Fc-Aptamer-Konzentration von 10 µg/ml und 20µg/ml gegenübergestellt. Bei der Konzentration von 10 µg/ml haften im Gegensatz zu dereingesetzten Konzentration von 20 µg/ml ca. doppelt so viele T17b-Zellen, die mit GPVI-Fc-Aptamer vorinkubiert waren.In vivo im ligaturinduzierten Verletzungsmodell an der A. carotis der Maus mittels derMethode der intravitalen Fluoreszenzmikroskopie wurden zuerst in einem Vorversuch murineHerzendothelzellen (MHEC) im Vergleich zu murinen T17b-Progenitorzellen eingesetzt.Hierbei konnte eine erhöht Adhäsion der T17b-Zellen über einen Zeitraum von 60 Minutennach Ligatur am Gefäßendothel festgestellt werden. Im Weiteren wurde mit Hilfe der gleichenMethode die vermehrte Haftung der mit GPVI-Fc-Aptamer gegenüber der als Kontrolle mitNonsense-Aptamer vorinkubierten T17b-Zellen dargestellt.In dieser Arbeit konnte eine erhöhte Adhäsion der murinen T17b-Zellen durch dieVerwendung des chimären Konstrukts GPVI-Fc-Aptamer gezeigt werden. Durch diesenAnsatz könnte die Endothelialisierung beschleunigt und die Thrombusbildung reduziertwerden. Dies eröffnet neue Perspektiven für das Tissue-Engineering und die regenerativeMedizin dar. Recruitment of endothelial progenitor cells to vessel wall lesions is a prerequisite to efficienttherapeutic neovascularization. Endothelial injuries and associated exposure of the collagenmatrix can be caused by stentimplantation, by angioplasty or by plaque rupture followingartherosclerosis. To enhance recruitment of embryonic endothelial progenitor cells in vitro anin vivo, an adhesion molecule consisting of soluble GPVI-Fc (platelet collagen receptor) andan aptamer with a binding site for murine endothelial T17b progenitor cells was constructed.In the flow chamber (in vitro) the binding affinity was determined by T17b cells which wereincubated either with GPVI-Fc-aptamer or as control with BSA-aptamer, over a period of 10minutes. Here T17b cells incubated with GPVI-Fc-aptamer showed an increased and risingbonding capacity to collagen compared to control in the first 10 minutes. In addition, theadhesion of T17b cells was examined on different coatings (at GPVI-Fc- aptamer and itssingle components) in the flow chamber. Compared to controls a 10fold enhanced adhesion ofthe T17b cells could be observed after incubation of the coverslips with the GPVI-Fcaptamer.The binding behavior of the T17b cells in dependence of the GPVI-Fc-aptamerconcentration (10 µg/ml versus 20 µg/ml) was investigated in a further flow chamberexperiment. The number of adhering T17b cells incubated with GPVI-Fc-aptamer is increasedapprox. two-fold at an aptamer concentration of 20 µg/ml compared to the concentration of 10µg/ml.In vivo, in a mouse carotid artery ligature-induced injury model, the method of intravitalfluorescence microscopy was used, first to test adhesion of murine heart endothelial cells(MHEC) in contrast to murine T17b progenitor cells. An increased adhesion of T17b cells tothe endothelium could be determined during a period of 60 minutes after ligature. Using thesame method an increased adhesion of GPVI-Fc-aptamer incubated T17b cells was detectedcompared to control nonsense aptamer.In this dissertation an increased adhesion of murine T17b cells by using the chimericconstruct GPVI-Fc-aptamer could be demonstrated. This approach could accelerateendothelialisation and reduce thrombus formation. Thus it opens up a new perspective fortissue engineering and regenerative medicine.