Dichte- und Größenbestimmung des TT-Virus

Abstract

Aufgrund der Genomstruktur könnten TTV und verwandte Viren der Virusfamilie der Circoviridae zugerechnet werden. Für die Einteilung in die Familie der Circoviridae erscheint jedoch die in der bisherigen Literatur angegebene Größe von 30-50nm als sehr groß gegenüber anderen Circoviren mit Größen zwischen 12 und 26,5 nm. Die Dichte und der Stokessche Durchmesser von TTV wurden in dieser Arbeit eingehend untersucht. Zur Überprüfung der Dichte wurden mehrere Ultrazentrifugationen mit TTV-positivem Plasma durchgeführt und die DNA mittels einer vorher etablierten LightCycler PCR gemessen. Die dadurch erhaltene Cäsiumchloriddichte von 1,312 +/- 0,013 g/ml stimmt mit den Literaturwerten von 1,31 bis 1,35 g/ml überein. Circoviren haben jedoch mit 1,33 bis 1,37 g/ml höhere Dichten. Dies spricht für einen höheren Proteingehalt der TTV-Partikel, z.B. durch gebundene Antikörper.Mit Hilfe der Fraktionen, die nach Ultrazentrifugation die höchste TTV-DNA-Konzentration aufwiesen, wurde mittels Größenausschlußchromatographie (GAC) der Stokessche Durchmesser gemessen. Die Virus-Partikel wurden zum einen über ihr Genom durch die Light-Cycler PCR, und in einem zweiten Versuch über eine konventionelle PCR, gemessen. Die dabei ermittelten Werte von 37 bis 52 nm stimmten im ersten Versuch, dessen DNA mittels LightCycler PCR nachgewiesen wurde, mit den in der Literatur veröffentlichten Werten von 30-50 nm überein. Im zweiten Versuch, dessen DNA anhand der konventionellen PCR ermittelt wurde, konnte eine weitere Partikelart im Größenbereich zwischen 17 und 22 nm nachgewiesen werden, welche freien Circoviren entsprechen könnte. Es stellte sich demnach die Frage, ob der relativ große Durchmesser und die relativ große Dichte der TTV-Partikel durch das Vorhanden sein von gebundenen Antikörpern zu erklären seien. Um diese Frage zu beantworten wurde eine Immunpräzipitation mit Dyna-Beads durchgeführt, welche mit Antikörpern gegen den Fc-Teil humaner Antikörper beladen waren. Etwa die Hälfte der Partikel enthielt humanes IgG. Die Resultate dieser Arbeit wiesen darauf hin, daß TTV im menschlichen Serum zum großen Teil als Antigen-Antikörper-Komplexe vorliegen und die TTV-Partikel in freier Form einen Durchmesser von rund 20 nm haben, wie es für ein Mitglied der Circoviridae zu erwarten ist. Because of the structure of the genome TTV and related viruses could be divided into the family of circoviridae. With reference to the classification as circoviridae the size of the particles of 30 50 nm indicated in literature up to now seems to be very big compared to other circoviruses sized between 12 and 26.5 nm. This dissertation deals with the detailed investigation of the density and the Stokes diameter of TTV. For the scrutiny of the density several ultracentrifugations were made with TTV-positive plasmen and the DNA were measured by means of a LightCycler PCR established before. The density of 1.312 +/- 0.013 g/ml cesiumchloride measured in this way corresponded to that of the density reported in literature (1.31 to 1.35 g/ml). However Circoviruses have a higher density which is 1.33 to 1.37 g/ml. This indicates a higher concentration of proteins of the TTV-particles, for example because of connected antibodies. The Stokes diameter was measured by means of gel filtration chromatography in the ultracentrifugation fraction that had the highest concentration of TTV-DNA. The virusparticles were measured by LightCycler PCR in one investigation and by a conventional PCR in a second investigation. The values measured between 37 nm to 52 nm in the LightCycler PCR corresponded to the values reported in literature. In the second investigation where DNA was determined by conventional PCR, a further species of particles sized between 17 to 22 nm could be determined. This could be free circoviruses. Consequently it could be discussed if the big diameter and the big density of the TTV-particles indicated in literature could be explained as connected antibodies. To find an answer to this question an immunoprecipitation with dyna-beads was made. The dyna-beads were connected with antibodies which attach to the Fc-part of human antibodies. About half of the particles had human IgG. The results of this dissertation indicate that in the human serum TTV is mostly connected as antigen-antibody-complex and TTV-particles have a diameter of about 20 nm in the free form, as a member of the family of circoviridae is expected to have.