Impact of the epithelial hypoxia-inducible factor 2 alpha/fetal liver kinase-1 system on murine lung development

Abstract

In the present study, we hypothesized that the HIF 2 alpha/flk-1 system has a unique role in the pulmonary epithelial system, with further impact on lung development. This hypothesis was based on data by Compernolle et al. showing a severe respiratory distress syndrome upon global HIF 2 alpha deletion which could be overcome by the application of VEGF (Compernolle et al., 2002). However, key functions of the HIF 2 alpha/flk-1 system have been demonstrated to be restricted to the vascular system, to regulate physiological and pathological blood vessel formation. In contrast, reports by Brown et al. and Raoul et al. suggest a direct influence of the flk-1/VEGF system on pulmonary epithelial cell function (Brown et al., 2001; Raoul et al., 2004). Since flk-1 has been shown to be regulated by HIF 2 alpha (Elvert et al., 2003) it represents the functional target molecule of the HIF 2 alpha/flk-1 system. Accordingly, we characterized flk-1 expression from ED12.5 at daily intervals throughout lung development until postnatal stages. We found flk-1 expression, as previously described, in the early primitive vascular network. At the end of the pseudoglandular stage, at ED16.5 we found widespread epithelial expression of flk-1 which persisted until postnatal stages. Furthermore, we analyzed flk-1 expression and functional integrity in isolated adult (Ahlbrecht et al., 2008). To test our hypothesis of a direct functional impact of the HIF 2 alpha/flk-1 system on the pulmonary epithelial system, we analyzed isolated AEC for HIF 2 alpha expression, and found strong expression of HIF 2 alpha at the protein level. Thus, we demonstrated that the HIF 2 alpha/flk-1 system is not restricted to the endothelial system, and is present in the pulmonary alveolar epithelial system. To analyze the functional impact of this newly characterized pulmonary epithelial system, we generated an inducible in vivo pulmonary epithelial HIF 2 alpha deletion combining the SPCrtTA and Cre-loxP system. We succeeded in generating the epithelial HIF 2 alpha deletion which could be demonstrated at the protein level. But, in contrast to our hypothesis that the epithelial HIF 2 alpha/flk-1 system might have functional impact on lung development, epithelial HIF 2 alpha deletion did not lead to a disorder or phenotype. Even though flk-1 was strongly downregulated, no changes were observed regarding lung structure or AEC morphology and SPC expression respectively. This was unexpected. Thus we postulate that the epithelial HIF 2 alpha system works within a complex network. Upon HIF 2 alpha deletion, a compensatory system takes over the HIF 2 alpha-related functions to rescue the deletion to protect the process of lung development. This is highly speculative and further investigations are needed to characterize the different factors involved which were not addressed in the present study. Taken together our study demonstrates: Characterization of flk-1 expression at daily intervals throughout lung development with epithelial expression of flk-1 rising from ED16.5 and persisting at postnatal stages (Ahlbrecht et al., 2008). Furthermore HIF 2 alpha and flk-1 expression could be demonstrated in isolated AEC. Thus, we were able to demonstrate the existence of the epithelial HIF 2 alpha/flk-1 system. Analysis of the direct epithelial function of the newly characterized pulmonary epithelial system could be addressed by successful generation of an pulmonary epithelial-restricted HIF 2 alpha in vivo deletion using the SPCrtTA-tetO-Cre system. Surprisingly, characterization of the phenotype of pulmonary epithelial HIF 2 alpha knock-out mice did not show any disorders or phenotype, or changes in lung structure and epithelial cell development. These data may be basis for future studies elucidating the network of cooperating factors regulating pulmonary epithelial development. In der vorliegenden Arbeit wird die Hypothese untersucht, dass das HIF 2 alpha/flk-1 System eine eigenständige funktionelle Rolle in dem pulmonalen epithelialen System spielt und darüber Einfluss auf die Lungenentwicklung nimmt. Diese Hypothese basiert auf Untersuchungen von Compernolle et al. die ein akutes Lungenversagen als Folge einer globalen HIF 2 alpha Deletion beschreiben, welches durch Applikation von VEGF überwunden werden konnte (Compernolle et al., 2002). Bisher wurde die Regulation der physiologischen und pathologischen Blutgefäßentwicklung als die zentrale Funktion des HIF 2 alpha/flk-1 Systems beschrieben. Die Wirkungsweise schien somit auf das vasculäre System begrenzt zu sein. Demgegenüber deuten jedoch Daten von Brown et al. und Raoul et al. darauf hin, dass das flk-1/VEGF System auch direkten Einfluss auf die Funktion des pulmonalen epithelialen Systems zu nehmen scheint (Brown et al., 2001; Raoul et al., 2004). Flk-1 wird durch HIF 2 alpha reguliert (Elvert et al., 2003) und stellt somit das funktionelle Zielmolekül des HIF 2 alpha/flk-1 Systems dar. Diesbezüglich charakterisierten wir in dieser Arbeit zunächst die flk-1 Expression während der Lungenentwicklung täglich von ED12.5 bis hin zu postnatalen Stadien. Als Ergebnis zeigte sich in den frühen Stadien die flk-1 Expression wie bereits beschrieben in dem frühen primitiven vasculären Netzwerk. Am Ende der pseudoglandulären Phase zeigte sich eine großflächige epitheliale flk-1 Expression, die bis in die postnatalen Stadien zu finden war. Des Weiteren konnten wir in murinen isolierten alveolären Epithelzellen die flk-1 Expression und Aktivierung nachweisen (Ahlbrecht et al., 2008). Darüber hinaus zeigte sich eine starke Expression von HIF 2 alpha in diesen Zellen. Um die Funktion des nun neu charakterisierten pulmonalen epithelialen Systems zu analysieren, generierten wir eine in vivo pulmonal epithelzellspezifisches HIF 2 alpha Deletion mittels SPCrtTA- und tetO-Cre System in einem dreifach transgenen Mausmodel. Die erfolgreiche Deletion zeigte sich auf Proteinebene. Gegensätzlich zu der zu Grunde liegenden Hypothese einer spezifischen Funktion des epithelialen HIF 2 alpha/flk-1 Systems, zeigte sich jedoch kein pathologischer Phenotyp. Es zeigte sich eine stark reduzierte epitheliale flk-1 Expression, die sich jedoch nicht auf die Lungenstruktur, Epithelzellmorphologie oder SPC Expression auswirkte. Auf Grund dieser unerwarteten Ergebnisse postulieren wir, dass das HIF 2 alpha/flk-1 System in ein komplexes Netzwerk von Faktoren integriert ist, welches bei Deletion eines Faktors die Funktion übernehmen kann, um eine ungestörte Entwicklung zu ermöglichen. Das ist eine spekulative Vermutung, zu deren Klärung weitere Studien notwendig sind, um die unbekannten Faktoren des Netzwerkes zu untersuchen, die in der vorliegenden Arbeit nicht untersucht wurden. Zusammenfassend konnte die vorliegende Arbeit folgendes zeigen: Charakterisierung der flk-1 Expression während der Lungenentwicklung in täglichen Intervallen. Es zeigte sich eine epitheliale flk-1 Expression von ED16.5 beginnend und persistierend bis zu postnatalen Stadien (Ahlbrecht et al., 2008). Darüber hinaus konnte die epitheliale HIF 2 alpha Expression in isolierten alveolaren Epithelzellen (AEC) gezeigt werden, und so die Existenz eines epithelialen HIF 2 alpha/flk-1 Systems demonstriert werden. Als in vivo Model zur funktionellen Analyse des neu charakterisierten pulmonal epithelialen Systems konnte eine pulmonal epithelzellspezifische HIF 2 alpha Deletion mittels SPCrtTA-tetO-Cre Systems in einem dreifach transgenen Ansatz erzielt werden. Entgegen der Hypothese einer speziellen Funktion des epithelialen HIF 2 alpha/flk-1 Systems zeigte sich kein pathologischer Phenotyp unter der epithelspezifischen HIF 2 alpha Deletion bezüglich Lungenstruktur und Epithelzellentwicklung. Diese Daten können eine Basis für weitere Studien darstellen, die das Netzwerk der involvierten Faktoren der Lungenentwicklung und speziell der pulmonalen Epithelzellentwicklung weiter aufklären.