Bedeutung des Calcium-abhängigen Kaliumkanals mit hoher Leitfähigkeit (BKCa) für die Interleukin-1ß-induzierte Adhäsion von Monozyten an Endothelzellen

Abstract

Zahlreiche Veröffentlichungen der letzten Jahre weisen auf eine wesentliche Bedeutung des zellulären Inflammationsgeschehens bei der Entstehung der Arteriosklerose hin. Die Bildung von Radikalen und Einwanderung von Monozyten aus der Blutstrombahn in den subendothelialen Raum sind entscheidende Schritte. Das Zytokin Interleukin-1beta ist einer der Aktivatoren dieses Inflammationsgeschehens. Es führt zu einer vermehrten zellulären Radikalbildung und zur Expression von endothelialen Adhäsionsmolekülen, die das Einwandern der Monozyten ermöglichen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es, die Wirkung des Calcium-abhängigen Kaliumkanals mit hoher Leitfähigkeit (BKCa) auf Endothelzellen in diesem Geschehen herauszustellen. Durch eine Veränderung des elektrochemischen Gradienten über der Zellmembran beeinflusst er die intrazelluläre Calciumhomöostase.In einer DiBAC-Fluoreszenz-Messung wurde bei Stimulation von HUVEC (Endothelzellen aus humanen Nabelschnurvenen) mit Interleukin-1beta eine Hyperpolarisation der Zellmembran gemessen, die durch den selektiven BKCa -Inhibitor Iberiotoxin verringert wurde. In einer FURA-2AM-Messung wurde fluoreszenzmikroskopisch ein folgender Anstieg des intrazellulären Calciums nachgewiesen, der vom BKCa abhängig war. Auch wurde mit den Fluoreszenzfarbstoffen DCF und DAF ein Einfluss des Kanals auf die Interleukin-1beta-induzierte zelluläre NO-Synthese und Radikalbildung über die NADPH-Oxidase gezeigt. Der Anstieg des intrazellulären Calciums, der Radikalen und des NO führten zu einer vom BKCa abhängigen Adhäsionszunahme von U-937-Monozyten an HUVEC. Dies wurde in einem BCECF-Adhäsionsassay und einer Tritium-Thymidin-Uptake Untersuchung ermittelt. Durchflusszytometrisch konnte nachgewiesen werden, dass die zellulären Adhäsionsmoleküle I-CAM-1 und V-CAM-1 für die gesteigerte Adhäsion verantwortlich sind, auch dieses abhängig vom BKCa.Zusammenfassend wurde gezeigt, das Interleukin-1beta über den BKCa zu einer Hyperpolarisation von HUVEC führt. Dieser folgt über eine Veränderung des elektrochemischen Gradienten ein Anstieg des intrazellulären Calciums, das die Synthese von NO und Radikalen aktiviert. Eine über I-CAM-1 und V-CAM-1 vermittelte Adhäsion von Monozyten an Endothelzellen ist die Folge. Erstmalig wurde in dieser Arbeit die wesentliche Bedeutung des BKCa für diese Signalkaskade herausgestellt. Numerous publications in the last years show a considerable impact of inflammatory cellular action being involved in development of atherosclerosis. Determining steps are the synthesis of radicals and immigration of monocytes into the subendothelial layer. One of the main activators of inflammation is the cytokine Interleukin-1ß. It induces increase of cellular radicals and expression of endothelial adhesion molecules that permits adhesion and immigration of monocytes.Aim of this study was to investigate the effect of the calcium dependent potassium channel with large conductancy (BKCa) in Interleukin-1beta induced inflammation. The BKCa influences intracellular calcium homeostasis by changing the electrochemical gradient of the endothelial cell membrane.In a DiBAC-fluorescence assay I measured an Interleukin-1beta-induced hyperpolarisation of HUVEC (humban umbilical cord vein), that was decreased by the highly selective BKCa inhibitor Iberiotoxin. Subsequently a BKCa dependent increase of intracellular calcium was observed in a FURA-2AM fluorescence microscope assay. I also monitored an influence of the BKCa on the Interleukin-1beta-induced NO-synthesis and production of radicals by NADPH Oxidase. The increase of intracellular calcium, radicals and NO results in a BKCa dependent adhesion of U-937 monocytes to HUVEC. This was detected in BCECF-adhesions assay and a Tritium thymidine uptake. With a fluorescent activated cell sorter (FACS) I demonstrated that cellular adhesion molecules I-CAM-1 and V-CAM-1 are responsible for the BKCa dependent increase of adhesion. In conclusion it was shown that Interleukin-1beta induces a BKCa dependent hyperpolarisation of HUVEC. This is followed by an increase of intracellular calcium by a change of the electrochemical gradient. This again induces synthesis of NO and radicals. The result is an I-CAM-1 and V-CAM-1 induced adhesion of monocytes to the endothelial surface. This publication is the first showing the important role of BKCa for this signaling cascade.