Die postnatalen Veränderungen der Gesamt-Leptinserumkonzentration bei Lämmern innerhalb der ersten 24 Lebensstunden : Etablierung eines ovinen Gesamt-Leptin-Radioimmunoassays und Untersuchungen zur physiologischen Bedeutung

Abstract

Diese Untersuchung galt der Entwicklung eines spezifischen Radioimmunoassays (RIA) zur Bestimmung des (Gesamt)-Schafserumleptins und Betrachtung dessen physiologischen Zusammenhänge. Der verwendete Antikörper richtete sich gegen die Partialsequenz des Schafleptins der Aminosäuren 31-44. Der spezifische Tracer und die Standardreihe wurden durch rekombinantes Schafleptin hergestellt. Die Testdurchführung beinhaltete die Abtrennung von Bindungsproteinen und die Denaturierung des Serumleptins mit 0,04 mM DTT (Dithiothreitol), 0,001 % SDS (Natriumdodecylsulfat), 0,001 mM EDTA in einem Tris-HCl Puffer (pH 8) sowie die Erhitzung der Serumproben auf 90°C über 7 Minuten. Die Empfindlichkeit (Sensitivität) des RIAs lag bei 0,4 µg/l, Die Interassayvarianz konnte durchschnittlich mit 2,5% ermittelt werden, die Parallelitätsbestimmung (Intraassayvarianz) ergab eine mittlere Standardabweichung von 5,1 %. Die Spezifität lag bei 84%. Leptin wurde bei neugeborenen Lämmern zu sechs verschiedenen Zeitpunkten innerhalb von 24 Stunden bestimmt. Es ergaben sich deutlich höhere Leptinkonzentrationen im Vergleich zu den bisher berichteten Werten und innerhalb von 24 Stunden signifikant ansteigende Konzentrationen. Der Organismus des Lamms war somit in der frühen neonatalen Periode in der Lage, Leptin unabhängig von der Plazenta zu sezernieren und die Leptinserumkonzentration zu modifizieren. Desweiteren wurde neben Leptin auch folgenden Parameter erhoben und die Beziehung zum Leptin untersucht: Geschlecht, Wurfgröße, Körpergewicht, Umgebungs- und Körpertemperatur und die Stoffwechselparameter: Triglycerid-, Cholesterin-, Blutzucker- und beta-Hydroxybutyratkonzentrationen im Serum. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die gemessenen Leptinspiegeldifferenzen nicht vom Körpergewicht bzw. von der Fettzunahme abhängig waren. Auch war eine Abhängigkeit weder in Bezug auf das Geschlecht noch auf die Wurfgröße zu belegen. Die 74 Lämmer konnten aufgrund der Außentemperatur in vier verschiedene Gruppen eingeteilt werden, deren Leptinserumspiegel sich signifikant voneinander unterschieden. Der Einfluss der Stalltemperatur ließ sich ebenfalls direkt am Leptinspiegel unabhängig von der Gruppeneinteilung in der Korrelationsanalyse zeigen, und auch die Körpertemperatur als Konsequenz aus Umwelttemperatur und Thermogenese zeigte eine Korrelation zu den Serumleptinspiegeln. Daraus kann man auf eine Funktion des Leptins hinsichtlich der Thermoregulation bereits im frühen Neugeborenenalter schließen. Des Weiteren konnte diese Arbeit einen Zusammenhang zwischen den Leptinserumspiegeln und den Blutfetten Triglyceriden und Cholesterin aufzeigen, deren Konzentrationen ebenfalls eine Gruppenabhängigkeit aufwiesen. Erhöhte Serumtriglyceride stellen Energiespeicher dar, die erst durch einen hochregulierten (Gesamt)- eptinspiegel für die beta-Oxidation zur Energiegewinnung zur Verfügung stehen. Auch diese intakte Regulation konnte hiermit im frühen Alter bei neugeborenen Lämmern verdeutlicht werden. Ein weiterer lebenswichtiger Energieträger ist der Blutzucker. Eine direkte Regulation durch das Leptin ist durchaus denkbar, eine indirekte Regulation über Hormone wie das Insulin bereits bewiesen. Es zeigte sich beim Lamm eine signifikante positive Korrelation sechs Stunden postnatal. Wegen der Komplexität der Blutzuckerregulation konnte aber der Einfluss des Leptins zu allen anderen Zeitpunkten nicht verdeutlicht werden. Besonders die Stressregulation einer Hypoglykämie bei subthermoneutralen Temperaturen, die bei vielen der Lämmer postnatal vorlag, erfordert einen akuten nervös-hormonalen Synergismus mit einer höchstens modifizierenden Funktion des Leptins. Ein weiterer für die Notfallenergieversorgung wichtiger Träger ist das beta-Hydroxybutyrat, das ein Zeichen für einen Energiemangel darstellt und proportional dazu ansteigt. Bisher wurden nur wenige Untersuchungen hinsichtlich eines Zusammenhangs zum Leptin durchgeführt, aber die Hypothese über eine negative Korrelation zwischen der Leptin- und der beta-Hydroxybutyratkonzentration bestätigte sich zu den beiden gemessenen Zeitpunkten 12 und 24 Stunde postnatal. In this study a specific leptin radioimmunoassay (RIA) was established and we investigated the changes of serum leptin in the newborn lamb and possible physiological associations. An antiserum (rabbit) produced against a partial sequence of ovine leptin (31-44) was used. A specific tracer and standards were prepared with recombinant ovine leptin (DSL-Sinsheim). Before measurement, serum samples were denatured in a Tris-HCl buffer, pH 8.0, containing 0.04 mM dithiothreitol (DTT), 0.001 mM EDTA, and 0.001 % sodium dodecylsulfate (SDS). To dissociate leptin from leptin-binding protein and to unfold it, samples were heated to 90°C for 7 minutes. The sensitivity of the assay was 0.4 µg/L, specificity was 84%, intra- and interassay coefficients of variation were 5.1 % and 2.5 % respectively. Leptin was measured from 74 newborn lambs at six different times up to 24 hours postnatally. In comparison to other studies the measured values of leptin were higher. The change in log (leptin) during the first 24 h was highly significant (p<0.0001).We conclude that total leptin is regulated already in the very early postnatal phase. Furthermore other parameters were measured using standard methods: the number oft he litter, sex, bodyweight, environmental and body temperature, serum lipids, blood glucose and 3-beta-hydroxy-butyric acid.It was shown that leptin values did not depend on the bodyweight or the increase in weight. Neither was the sex or the number of the litter a determining factor concerning the leptin values. Due to the environmental temperature the 74 lambs were distributed into four different groups which showed significant differences in regard to the leptin values. The influence of the environmental temperatur also without the grouping and the body temperature on the leptin values could be shown in the analysis of correlation. Consequentual a function of leptin regarding the regulation of bodytemperature and therefore energyexpenditure may be present even in the early neonatal period. Furthermore a relationsship between leptin and serum lipids (triglycerides and cholesterol) was identified which showed that the regulation between triglycerides as an energy storage and leptin as an modulator of energy expenditure is present in newborn lambs. Another important energy source is blood glucose. A regulation directly via leptin is possible, an indirect pathway involving insulin is already proved. In this study a significant correlation six hours after birth between blood glucose and leptin was shown. Due to the complexity of the regulation of bloodglucose an influence of leptin on the blood glucose could not be illustrated at all the other points in time. Especcially the need of immediate regulation in case of hypoglycaemia at low temperatures requires acute nerval and hormonal interactions. Leptin probably only has at the most a modifying role in this circuit. Another important carrier of energy in case of emergency referring to an organism is 3-beta-hydroxy-butyric acid. It indicates a lack of energy and rises proportional. So far only a few studies investigated it´s relation to leptin but the hypothesis of a negativ correlation between them was confirmed in this study at 12 and 24 hours after birth.