Establishment of murine 3D bronchioalveolar lung organoids from adult somatic stem cells for organ development and disease modeling

Abstract

Organoid model systems derived from mouse and human stem cells have recently evolved as a powerful tool to study development and disease. A murine 3D bronchioalveolar lung organoid model was established based on FACS-sorting of a newly defined population of bronchioalveolar stem cells. Upon co culture with subsets of lung mesenchymal cells, which model the stem cell niche of the developing lung, these stem cells underwent clonal expansion, followed by branching morphogenesis and self-organization into complete lung organoids, while retaining their tissue-of-origin commitment and their potential to differentiate into functional cells. Of note, organoids closely reproduced the 3D structure and cellular composition of the bronchioalveolar compartment of the lung. In addition, the 3D bronchioalveolar organoid structure allowed seeding of tissue-resident macrophages into the alveolar compartment, providing the possibility to study the contribution of the resident myeloid cell pool to developmental and regeneration processes within the alveolar microenvironment. Moreover, lung organoids derived from gene deficient mice and selective inhibitor experiments revealed that the GM CSF/GM-CSFR axis was necessary for BALO growth, survival, and alveolarization. Organoids were suitable for FACS-based single cell analyses, and for genetic manipulation as demonstrated by successful knockdown of genes involved in lung development and targeting miR142-3p/beta-catenin signaling. Finally, organoids could be used to model lung infection, as demonstrated by use of reporter-tagged influenza viruses in conjunction with live cell imaging, gene expression and functional analyses. In summary, this is the first organoid model recapitulating the 3D structure and cellular composition of the bronchioalveolar lung compartment, opening up new avenues to model lung development, infection, and regeneration processes. In den letzten Jahren wurden zunehmend Organoid-Modelle beschrieben, die von murinen oder humanen Stammzellen ausgehen und Organe ex vivo simulieren. In der vorliegenden Arbeit wurde ein solches 3D Modellsystem für die murine Lunge etabliert, basierend auf FACS-Sortierung einer neu definierten Population bronchoalveolärer Stammzellen. Um die Stammzellnische einer sich entwickelnden Lunge zu rekapitulieren, wurden diese Zellen mit einer definierten Population mesenchymaler Zellen der Lunge ko-kultiviert. Unter diesen Bedingungen waren einzelne Lungenstammzellen in der Lage, klonal zu expandieren, und durch Selbstorganisation ein jeweils vollständiges Organoid der Lunge zu bilden. Von Bedeutung ist in diesem Zusammenhang, dass diese Organoide sowohl die drei dimensionale Struktur als auch die zelluläre Zusammensetzung des bronchoalveolären Kompartiments der Lunge vollständig widerspiegeln. Darüber hinaus gelang es, sich entwickelnde Alveolen der Organoide mit Alveolarmakrophagen zu besiedeln. Dies eröffnet die Möglichkeit, den Einfluss von Gewebe-ständigen myeloiden Zellen auf Entwicklungs- und Regenerationsprozesse in der Alveole zu untersuchen. Es besteht zudem die Möglichkeit, Organoide zu generieren, die von Gen-defizienten Zellen abstammen. Mit Hilfe solcher Organoide oder mittels Applikation von spezifischen Inhibitoren während der Organoid-entwicklung konnte gezeigt werden, dass die GM-CSF/GM-CSFR Achse für das Wachstum und die proximo-distale Spezifizierung von Lungenorganoiden von zentraler Bedeutung ist. Darüber hinaus konnten wir zeigen, dass Organoide sowohl das Ausschalten definierter Gene im epithelialen und mesenchymalen Kompartiment erlauben, als auch die Durchführung von Infektionsexperimenten mit Influenza Virus, was mittels Lebendzell-Imaging, Analyse der viralen Replikation, und der zellulären Immunantwort gezeigt werden konnte. Insgesamt beschreibt die vorliegende Arbeit das erste 3D-Modellsystem für die murine Lunge, das die Struktur und zelluläre Zusammensetzung des bronchioalveolären Kompartiments vollständig rekapituliert. Dadurch eröffnen sich vielfältige Möglichkeiten, zukünftig Entwicklungs-, Regenerations- sowie Infektionsprozesse in der Lunge hochauflösend und auf Einzelzell-Ebene zu analysieren.