Das synthetische Chaperon Phenyl-Butyric-Acid (PBA) verändert das Verteilungsmuster der HBV-Hüllproteine im Endoplasmatischen Retikulum von Hepatitis B-transgenen Mäusen und führt zu verstärkter Pathogenese

Abstract

Trotz effektiver Vakzinierung sowie antiviraler Medikamente gegen das Hepatitis B Virus beträgt die Zahl chronisch infizierter Menschen weltweit rund 250 bis 270 Millionen. Die Schädigung Hepatitis B Virus infizierter Hepatozyten durch immunvermittelte Prozesse ist gut charakterisiert. Dagegen ist wenig über die direkte zytotoxische Wirkung von HBV Proteinen bekannt. In HBV infizierten Hepatozyten bilden sich Proteinaggregate durch Überbelastung des Translations-und Proteinexport-apparates und führen zu ER-Stress. Zur Kompensation aktivieren Hepatozyten spezifische Signalkaskaden, die zur Erhöhung der Faltkapazität des ER, zum Translationsstopp und Abbau fehlgefalteter Proteine führen, der sogenannten unfolded protein response (UPR). Aktuell wird zunehmend nach Substanzen geforscht, die die Funktion des ER aufrechterhalten und ER-Stress mindern sollen. Chaperone erleichtern und beschleunigen die Proteinfaltung. PBA zählt zu den synthetischen Chaperonen und fand bereits Anwendung in der experimentellen Therapie von Proteinspeichererkrankungen.Das Ziel dieser Arbeit bestand darin zu klären, ob PBA eine therapeutische Wirkung im HBV-LHBs-transgenen Mausmodell zeigt. Die Leberpathologie wurde in Abhängigkeit von der Dauer der PBA-Behandlung analysiert. Die Tiere wurden über einen Zeitraum von einer und acht Wochen oral über das Trinkwasser mit PBA behandelt und im Alter von zwölf Wochen getötet. Die H&E-Färbung diente der Analyse von Lebermorphologie und -pathologie. Die allgemeine Leberintegrität wurde mittels der Messung der Lebertransaminasen im Serum untersucht. Die Immunhistochemie umfasste die Analyse HBsAg positiver Hepatozyten sowie Kernfärbungen des Apoptosemarkers CHOP. Die HBsAg Menge wurde auf RNA- und Proteinebene untersucht und die hepatische Genexpression mittels einer Microarray-Analyse auf auffällige Muster hin analysiert. ER-Stress und Leberentzündung wurden in Abhängigkeit von der PBA-Behandlung dargestellt.HBV-LHBs-transgene Mäuse exprimieren das große Hüllprotein (LHBs) in den Hepatozyten, was zur Akkumulation des LHBs im ER der Mäuse führte. Die Leberschnitte PBA-behandelter Mäuse zeigten ein verändertes intrazelluläres Aggregationsmuster mit konsekutiver Feinverteilung der durch Überexpression akkumulierenden HBV-Hüllproteine im ER. Nachfolgend kam es zu überwiegend inflammatorischen Stress-Reaktionen, gemessen durch den Anstieg der Akute-Phase-Proteine SAA1, SAA2, MT1 und MT2 sowie von inflammatorischen Zytokinen und Chemokinen (v.a. TNF-a, IL-1a, IL-1ß, G-CSF und BLC). ER-Stress wurde mittels Western-Blot-Analyse nach PBA-Behandlung vermehrt detektiert. Bei normwertigen Transaminasen und negativer Apoptose ergaben sich keine Hinweise auf Hepatotoxizität nach PBA-Behandlung. Es bestand eine Heterogenität der Geschlechter in der Akute-Phase-Reaktion. Die Behandlungszeit über eine Woche führte überwiegend zu stärkeren Veränderungen in der Leberpathologie als die Behandlung über acht Wochen.Schlussfolgerung: Das synthetische Chaperon PBA beeinflusst die hepatogene Zellphysiologie. Eine Auflösung und Feinverteilung der HBsAg-Aggregate nach PBA-Behandlung verstärkt die systemische Entzündung. Die Aggregation der zellfremden HBs Proteine im ER stellt vermutlich einen Schutzmechanismus der Zelle dar, der durch die Behandlung mit dem synthetischen Chaperon PBA durchbrochen wird. Es wird vermutet, dass das therapeutische Potential von PBA erst im Rahmen einer Langzeitbehandlung apparent werden kann. Despite an effective vaccination, as well as antiviral medications against the hepatitis B virus, the number of chronically infected human beings amounts to 250-270 million worldwide. The impairment of hepatocytes infected with hepatitis B by immune-mediated processes is well characterized. However, little is known about the direct cytotoxic effect of HBV proteins. In HBV infected hepatocytes, protein aggregates are formed by an overload of the translational apparatus and causes ER-stress. As a compensation, the cell activates specific signal cascades which lead to an increase of the folding capacity of the ER, to a translational stop and to a depletion of misfolded proteins, the so-called unfolded protein response (UPR). Currently, the search for substances that are supposed to maintain the functioning of the ER while reducing ER-stress increases. Chaperones represent a group of molecules that facilitate and accelerate the protein folding. PBA ranks amongst these synthetic chaperones and has already been applied in the experimental therapy of protein storage diseases.The overall aim of this thesis was to elucidate whether PBA shows a therapeutic effect in the transgenic mouse model. The hepatic pathology was examined as a function of the PBA treatment. Over a period of one and eight weeks, the animals were treated with PBA and killed at the age of twelve weeks. The general liver integrity was examined by means of a measurement of the activity of the liver transaminases in the serum. The H&E-staining yielded insights into the liver morphology and -pathology. The immunohistochemistry comprised the analyses of HBsAg positive hepatocytes as well as nuclear stainings of apoptosis markers. The HBsAg mass was examined on RNA- and protein level, and the hepatic gene expression was analysed concerning interesting patterns through a microarray analysis. ER-stress and hepatic inflammation were depicted as a function of the PBA-treatment. The liver sections of mice treated with PBA showed an altered intracellular aggregation pattern with a consecutive dispersion of the HBV-coating proteins that are accumulating due to overexpression in the ER. Subsequently, there were predominantly inflammatory stress reactions such as the increase in the acute-phase-proteins SAA1, SAA2, MT1 and MT2 as well as in inflammatory cytokines and chemokines (e.g. TNF-a, IL-1a, IL-1ß, G-CSF und BLC). ER-stress has increasingly been detected after the PBA treatment. With transaminases of standard value and a negative apoptosis, there was no indication of hepatotoxicity following the PBA treatment. There was a heterogeneity of sexes regarding the immune response. The one-week treatment lead to a stronger alteration of the hepatic pathology than the treatment over an eight-week course. Conclusion: The synthetic chaperon PBA has a high impact on the hepatogenic cell physiology. The dissolution and dispersion of the HBsAg aggregates reinforces the systemic inflammation. This leads to the conclusion that the aggregation of the viral HBs proteins in the ER represents a protective mechanism of the cell that is disrupted by the treatment with the synthetic chaperon PBA. It is assumed that the therapeutic potential of PBA will only become apparent in the course of a long-term treatment.