Etablierung eines indirekten Kokultursystems auf Kompartimentbasis zur Überprüfung der Biokompatibilität von Knochenersatzmaterialien

Abstract

Ziel der vorliegenden Arbeit war die Etablierung eines indirekten Kokultursystems zur Überprüfung der Biokompatibilität und Materialeigenschaften von Knochenersatzmaterialien (KEMs). Dazu wurden im Rahmen von drei Vorversuchen zunächst optimale Kultivierungsbedingungen für die aus Kalvarien von Wistarratten abgeleiteten mesenchymalen Stromazellen (SCs) und für osteoklastäre Vorläuferzellen (OCVs) – isoliert aus Femora und Tibiae von Wistarratten – etabliert. Im Anschluss wurde das indirekte Kokultursystem im Rahmen des Hauptversuchs hinsichtlich seiner Tauglichkeit überprüft, indem die Zellantworten nach Kokultivierung der Zellen mit KEMs unterschiedlicher chemischer Zusammensetzungen auf morphologischer und molekularbiologischer Ebene überprüft wurden. Das konzipierte indirekte Kokultursystem auf Kompartimentbasis bestand aus drei räumlich getrennten Kompartimenten, die über das Medium in Verbindung standen, um den Austausch löslicher Faktoren zu ermöglichen. Hinsichtlich der osteogenen Differenzierungskapazität der SCs wurden im Anschluss an die Kokultivierung mittels quantitativer real-time polymerase chain reaction (qPCR) die Genexpressionen von Runt-related transcription factor 2 (Runx2) und Connexin 43 (Cx43) ermittelt. Darüber hinaus wurden die Expressionen der Pannexine 1–3 (Panx1–3) untersucht. Bei den OCVs dienten die Expressionen der Tartrat-resistenten sauren Phosphatase (TRAP) und von Cathepsin K (CTSK) als Indikatoren der osteoklastären Aktivität. Die Berechnung der statistischen Signifikanz erfolgte mittels einfaktorieller Varianzanalyse (ANOVA) mit anschließendem Tukey-Test als post-hoc-Test. Morphologisch zeigten sich in Gegenwart aller KEMs vitale Zellen in den Kulturen. Die relativen Genexpressionen von Runx2, Cx43 sowie von Panx1-3 der SCs sowie der TRAP und von CTSK der OCVs unterschieden sich signifikant im Hinblick auf die chemisch unterschiedlich zusammengesetzten KEMs. So wiesen insbesondere Zellen, die in Gegenwart von Strontium-basierten KEMs kultiviert wurden, vergleichsweise hoch bis höchst signifikant niedrigere Expressionen aller untersuchten Gene auf. Mit Blick auf die Expression von Runx2 und Cx43 war dies vermutlich der fortgeschrittenen osteogenen Differenzierung der SCs geschuldet, während die TRAP- und CTSK-Expressionsmuster mit der supprimierten osteoklastären Aktivität einhergingen. Die festgestellten Profile von Panx1–3 der SCs legen eine funktionelle Bedeutung dieser Gene im Rahmen der osteogenen Differenzierung nahe.