Regulation der monopolaren Flagellenassemblierung in Shewanella putrefaciens CN-32

Abstract

Die am häufigsten vorkommende Fortbewegung bei Bakterien ist die durch Flagellen vermittelte Motilität. Flagellen sind Multiproteinkomplexe, deren Grundaufbau zwischen Bakterienarten sehr konserviert ist. Diese bestehen aus den drei strukturellen Einheiten: Basalkörper, Haken und Filament. Die Positionierung, Anzahl und Zusammenbau der Flagellen erfordert eine komplexe räumliche-zeitliche Kontrolle. In vielen polar flagellierten γ-Proteobakterien liegen der Expression, Produktion und dem Aufbau des Flagellums eine vierstufige Transkriptionshierarchie zugrunde. Die transkriptionellen Hierarchien werden durch mehrere Regulatoren vermittelt. Allerdings zeigten bisherige Untersuchungen von in silico- und Promotoranalysen eine abweichende Regulation in Shewanella oneidensis. In dieser Arbeit wurde die Regulation der Flagellengene in dem monopolar flagellierten Shewanella putrefaciens als allgemeiner Modellorganismus durch den RpoN (σ54)-abhängigen Hauptregulator FlrA und Sigmafaktor FliA (σ28) auf mRNA- und Proteinlevel untersucht. Der Hauptregulator FlrA und RpoN aktivieren die Transkription der Basalkörper-Bausteine und des Flagellen-spezifischen Typ-III-Sekretionssystems. Bemerkenswert ist, dass nur wenige der früh benötigten Flagellenkomponenten auf Proteinebene reguliert sind, während die meisten auch in Abwesenheit der Hauptregulatoren in normalen Mengen vorhanden sind. Mit Hilfe von Promotoranalysen konnten σ70-abhängige Promotoren identifiziert werden, die die konstitutive Expression einiger frühen Gene des Basalkörpers und der Regulatoren SRP-ähnliche GTPase FlhF, MinD-ähnliche ATPase FlhG und FliA ermöglichen. Dies deutet drauf hin, dass für den Aufbau der Flagelle nur wenige Schlüsselkomponenten auf Transkriptions- als auch auf Proteinebene streng kontrolliert werden. In vielen Bakterienarten ist die MinD-ähnliche ATPase FlhG ein zentraler Faktor für die numerische Kontrolle der Flagellen. Die Deletion von flhG in polar flagellierten Bakterien führt zu einer polaren Hyperflagellierung. Wir fanden heraus, dass ein konstantes Level an FlhG durch die σ70-abhängigen Promotoren für die monopolare Flagellierung in S. putrefaciens essenziell ist. Der genaue molekulare Mechanismus von FlhG war nicht verstanden und wurde mit biochemischen Analysen und entsprechenden Mutationsstämmen in S. putrefaciens untersucht. FlhG teilt die gleiche Bindungsstelle für die Interaktion mit dem C-Ring-Protein FliM und dem Hauptregulator FlrA. Das FlhG-Monomer wird von FliM an den Zellpol transportiert und nur das ATP-gebundene FlhG-Dimer ist in der Lage mit FlrA zu interagieren. Die Bindung von FlhG an FlrA führt zur Hemmung der FlrA-abhängigen Genexpression und durch diese negative Rückkopplung werden keine weiteren Flagellen produziert. Die Bindung von FlrA an FlhG stimuliert die ATPase-Aktivität, das zur Hydolyse von ATP sowie der Dissoziation des FlhG-Dimers führt und die Produktion eines polaren Flagellums starten kann. Bei Mutationen, die einen Einfluss auf das FlhG-Monomer haben, kann eine polare Hyperflagellierungen beobachtet werden. Überraschenderweise ändert sich der Phänotyp zu einer über den ganzen Zellkörper verteilten Hyperflagellierung, die einer peritrichen Flagellierung ähnelt, wenn Mutationen eingebracht wurden, die eine Rolle bei dem FlhG-Dimer spielen. Die delokalisierte Hyperflagellierung kommt vermutlich durch einen bisher unbekannten Faktor zustande, der die Flagellenassemblierung und Zellteilung synchronisieren könnte. Mögliche Faktoren wie MinD, eine Komponente des Min-Systems zur Zellteilung, zeigten allerdings keinen Einfluss auf FlhG als auch auf die Flagellenassemblierung. Der Transport von FlhG an den Zellpol sowie die anschließende Hemmung der FlrA Transkriptionsaktivität findet wahrscheinlich kontinuierlich statt. Daher wurden ebenfalls Transkriptionsaktivatoren bzw. -repressoren für den Promotor des Hauptregulators flrA versucht zu identifizieren, da diese das Gleichgewicht zwischen FlrA und FlhG verändern könnten und die Produktion des Flagellums induziert. Allerdings wurden Änderungen der flrA Promotoraktivität durch z. B. dem Zwei-Komponenten Transkriptionsregulator ArcA ermittelt, aber diese hatten keinen Einfluss auf die Flagellenassemblierung. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass nicht nur die zelluläre Kopienzahl von FlhG, sondern auch seine subzelluläre Lokalisierung entscheidend für seine Funktion bei der numerischen Regulation der Flagellen ist. Dies zeigt eine weitere Ebene der regulatorischen Komplexität, die der räumlich-numerischen Regulation der Biosynthese von Flagellen zugrunde liegt und deutet darauf hin, dass der Zusammenbau der Flagellen durch die Transkription sowie Produktion der ersten Flagellenbausteine reguliert wird.