Interaktion von Flotillin-2 mit desmosomalen Proteinen: Etablierung der BioID-Methode

Abstract

Pemphigus vulgaris ist eine schwere Autoimmunerkrankung, die durch eine Blasenbildung in der Haut und in den Schleimhäuten charakterisiert ist. Die Blasenbildung ist auf eine Akantholyse, d.h. eine Dissoziation des Epithelverbands, zurückzuführen. Diese wird durch Autoantikörper vom Typ IgG, auch PV-IgG genannt, ausgelöst, die vor allem gegen Desmoglein 3 gerichtet sind. Bei Desmogleinen handelt es sich um transmembranäre Glykoproteine, die speziell bei Desmosomen vorkommen. Man unterscheidet hier die Isoformen 1 bis 4. Letztendlich führt die Bindung der PV- IgG an das Desmoglein 3 zu einer Zerstörung von Desmosomen. Desmoglein 3 interagiert unter physiologischen Bedingungen im Rahmen der Funktion von Desmosomen zusammen mit Plakoglobin mit den Flotillinen. Die Flotillin-Familie besteht aus zwei Proteinen: Flotillin 1 und 2, wobei letzteres in dieser Arbeit untersucht wurde. Flotilline sind hochkonservierte und ubiquitär exprimierte Proteine. Durch Oligomerisierung und zusätzliche Palmitoyl- bzw. Myristoylreste sind sie in der Lage, an die Plasmamembran zu binden. Sie spielen beispielsweise eine Rolle im Signalweg des EGF-Rezeptors und der Clathrin- vermittelten Endozytose. Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, eine Methode zu etablieren, um das Interaktom von Flot2 darzustellen, sowie ein geeignetes Zellmodell für weitere Untersuchungen zu identifizieren. Mit Hilfe von Immunassays wurde zunächst die Klonierung und Expression von Flot2-Fusionsproteinen nachgewiesen; hierzu gehören Y163F-BirA* und Reg1-BirA*. Bei ersterem wurde ein Tyrosin an der 163. Stelle in der Aminosäuresequenz des Flot2 durch ein Phenylalanin ausgetauscht, letzteres stellt den Wildtyp von Flot2 dar. Y163 stellt im Flot2 eine wichtige Phosphorylierungstelle dar und ist damit für die Regulation seiner Funktion wichtig. Beide wurden mit einer bakteriellen Biotinligase fusioniert, wodurch Interaktionspartner von Flot2 anhand ihrer Biotinylierung identifiziert werden können. Unter Zuhilfenahme der Methodik der BioID konnte die Interaktion bei der Flot2-Mutanten mit Flotillin 1 in gleichem Ausmaß nachgewiesen werden wie zuvor mit der Methodik der Co-Immunpräzipiation. Damit eignet sich die BioID zur Untersuchung des gesamten Interaktoms. Außerdem wurde gezeigt, dass die Expression der Flot2 sowie dessen Interaktion mit endogenem Flotillin 1 in hTert Zellen unabhängig vom Calciumgehalt ist. Lediglich die Lokalisation von Flot2 ändert sich, sodass es bei intrazellulären Calciumspiegeln von 2 mmol/l vor allem an der Plasmamembran lokalisiert ist, während es bei Spiegeln von 0,05 mmol/l perinukleär lokalisiert ist. Darüber hinaus konnten die Zelllinien hTert, HaCaT sowie MCF7, als Flot2-Knockout Varianten, als die vielversprechendsten Zellmodelle für weitere Untersuchungen identifiziert werden.