L I S A K . W Ü R N E R E F F E C T S O F B R A D Y K I N I N O N I N T E S T I N A L F U N C T I O N S Lisa Katharina Würner Effects of the inflammatory mediator bradykinin on intestinal functions VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAG édition scientifique VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15 D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890 redaktion@doktorverlag.de www.doktorverlag.de VVB LAUFERSWEILER VERLAG édition scientifique 9 7 8 3 8 3 5 9 6 0 7 6 3 ISBN: 978-3-8359-6076-3 INAUGURAL DISSERTATION submitted to the Faculty of Veterinary Medicine in partial fulfilment of the requirements for the PhD-degree of the Faculties of Veterinary Medicine and Medicine of the Justus Liebig University Giessen, Germany Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzulässig. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch elektronische Systeme. 1. Auflage 2013 All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without the prior written permission of the Author or the Publishers. st1 Edition 2013 © 2013 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Printed in Germany VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890 email: redaktion@doktorverlag.de www.doktorverlag.de édition scientifique Effects of the inflammatory mediator bradykinin on intestinal functions       Inaugural Disseration   submitted to the   Faculty of Veterinary Medicine   in partial fulfilment of the requirements   for the PhD‐Degree   of the Faculties of Veterinary Medicine and Medicine   of the Justus Liebig University Giessen      by    Würner, Lisa Katharina  from   Rüsselsheim, Germany    Giessen, 2013  ii          From the Institute for Veterinary Physiology and Biochemistry  of the Faculty of Veterinary Medicine of the Justus Liebig University Giessen                First Supervisor and Referee: Prof. Dr. Martin Diener  Second Supervisor: Prof. Dr. Wolfgang Kummer  Second Referee: Prof. Dr. Henrik Sjövall  Examiner: Prof. Dr. Holger Hackstein  Head of the examination board: Prof. Dr. Heinz‐Jürgen Thiel,      Date of Doctoral Defence: August 7th, 2013                iii    Table of contents  Table of contents iii  List of abbreviations viii  1  Introduction 1  1.1  The enteric nervous system 1  1.1.1  Anatomy 1  1.1.2  Physiology 2  1.1.3  The myenteric plexus and the regulation of intestinal motility 5  1.2  Bradykinin 6  1.2.1  Production and degradation 6  1.2.2  Functions and receptors 7  1.3  Absorption and secretion at the colonic epithelium 9  1.3.1  The colonic epithelium 9  1.3.2  Absorption 10  1.3.3  Secretion 12  1.3.4  Regulation of ion transport 13  1.3.5  Bradykinin and ion secretion 14  1.3.6  Mucus secretion 14  1.4  Inflammatory bowel diseases 16  1.4.1  Genesis and symptoms 16  1.4.2  The involvement of bradykinin 16  1.5  Intestinal motility 19  1.5.1  The intestinal smooth muscle 19  1.5.2  Regulation of motility 21  1.5.3  The effect of bradykinin on smooth muscle cells 23  1.6  Aim of the study 24  2  Material and methods 25  2.1  Animals 25  iv    2.2  Human mucosa biopsies 25  2.3  Chemicals 26  2.4  Preparation 27  2.4.1  Solutions 27  2.4.2  Preparation of myenteric ganglionic cells and intestinal muscle cells 28  2.4.3  Preparation of the intestine for isometric contraction measurements and Ussing chamber experiments 29  2.4.4  The human colonic mucosa biopsies 31  2.5  Microelectrode arrays (MEAs) 33  2.5.1  Solutions for MEA measurements 33  2.5.2  A short history of the microelectrode arrays (MEAs) 33  2.5.3  The principle of MEA measurements 34  2.5.4  The standard microelectrode array 37  2.5.5  The procedure of MEA measurements 39  2.5.6  Analysis of the MEA experiments 40  2.5.7  Waveform analysis 41  2.6  Immunofluorescence analysis 42  2.6.1  Solutions for immunocytochemistry (ICC) and immunohistochemistry (IHC) 42  2.6.2  The principle of immunofluorescence analysis 43  2.6.3  Immunohistochemistry versus immunocytochemistry 44  2.6.4  Used antibodies 46  2.6.5  The procedure of the immunohistochemistry (IHC) and immunocytochemistry (ICC) 47  2.7  Ca2+-imaging 52  2.7.1  Solutions for Ca2+-imaging 52  2.7.2  The principle of Ca2+-imaging 52  2.7.3  The fluorescent dye fura-2 54  2.7.4  The setup for the imaging-experiments 55  2.7.5  The experimental chamber and the perfusion system 56  2.7.6  Procedure and analysis of fura-2 measurements 56  2.7.7  Manganese quenching 58  2.8  Polymerase-chain-reaction (PCR) 60  v    2.8.1  Solutions and kits 60  2.8.2  The principle of the PCR 61  2.8.3  The reverse transcription PCR (RT-PCR) 63  2.8.4  The standard PCR 65  2.8.5  The quantitative real time PCR (qPCR) 67  2.9  The Ussing chamber 70  2.9.1  Solutions 70  2.9.2  Structure of the Ussing chamber 70  2.9.3  The principle of the Ussing chamber 72  2.9.4  The procedure of the Ussing measurements 77  2.10  Isometric contraction measurements 79  2.10.1  Solutions 79  2.10.2  The principle of the isometric contraction measurements 79  2.10.3  The structure of the organ bath 80  2.10.4  The procedure of the organ bath 81  2.11  Statistics 82  3  Results 83  3.1  Evaluation of the method of microelectrode arrays (MEA) 83  3.1.1  Determination of the threshold for the detection of action potentials measured with microelectrode arrays 84  3.1.2  The influence of glia cells on the electrical activity of myenteric neurons 85  3.2  The effect of bradykinin on myenteric neurons 88  3.2.1  The effect of bradykinin on the frequency of action potentials 88  3.2.2  The changes in cytosolic Ca2+-concentration induced by bradykinin 91  3.2.3  The bradykinin receptors involved 93  3.2.4  The involvement of prostaglandins in the mediation of the bradykinin-induced effect on myenteric neurons 98  3.2.5  The signal transduction of the bradykinin receptors 101  3.3  The neuronal regulation in the bradykinin-induced increase in short-circuit current in the rat distal colon 105  3.4  The differences in bradykinin-induced chloride and mucus secretion between control and ulcerative colitis patients 109  vi    3.5  The effect of bradykinin on the contractility of the rat intestinal muscle 113  3.5.1  The segment-dependent effect of bradykinin on the contractility of the rat intestine 113  3.5.2  The involvement of the bradykinin receptors in the contractility of the colon 117  3.5.3  The mediation of the bradykinin-induced changes in contractility 124  3.5.4  The influence of the different layers of the rat colonic wall on the bradykinin-induced changes in contractility 128  4  Discussion 130  4.1  The effect of bradykinin on myenteric neurons 130  4.1.1  The biphasic effect of bradykinin 130  4.1.2  The bradykinin receptors involved 132  4.1.3  The signal transduction of the bradykinin receptors 135  4.2  The effect of bradykinin on the ion and mucus secretion in rat and human colon 137  4.2.1  Bradykinin-induced changes of the short-circuit currents in the rat colon 137  4.2.2  The comparison of the effect of bradykinin on the ion and mucus secretion between ulcerative colitis patients and control patients 139  4.3  The effect of bradykinin on the contractility of rat intestine 143  4.3.1  The segment-dependent effect of bradykinin on the contractility of the rat intestine 143  4.3.2  The involvement of the bradykinin receptors in the contractility of the colon 144  4.3.3  The mediation of the bradykinin-induced changes in contractility 146  4.3.4  The influence of the different layers of the rat colonic wall on the bradykinin-induced change in contractility 149  5  Summary 152  6  Zusammenfassung 154  7  References 156  8  Declaration 172  vii    9  Acknowledgements/Danksagung 173    viii    List of abbreviations  ADP  adenosine diphosphate  AM  acetoxymethyl ester  ATP  adenosine triphosphate  B1 and B2 receptor  bradykinin B1 and bradykinin B2 receptor  BK  bradykinin  BSA  bovine serum albumin  C  capacitance  cAMP  cyclic adenosine monophosphate  cDNA  complementary deoxyribonucleic acid  Ce  epithelial capacitance  CFTR  cystic fibrosis transmembrane conductance regulator  cGMP  cyclic guanosine monophsphate  CGRP  calcitonin gene‐related peptide DAB  Des‐arg9‐bradykinin DAG  diacylglycerol  DAMP  damage‐associated molecular pattern molecules  DAPI  4´,6‐diamidino‐2‐phenylindol dilactate  DEPC  diethylpyrocarbonat  DMEM/F12  advanced Dulbecco´s modified eagle medium/Ham´s F12  DNA  deoxyribonucleic acid  dNTP  deoxyribonucleotide  DTT  dithiothreitol  EDTA  ethylenediaminetetraacetic acid  ENaC  epithelial sodium channels  ENS  enteric nervous system  Fab  fragment antigen binding  Fc  fragment crystalisable  FCS  fetal calve serum  FET  field‐effect transistor  ix    FRET  fluorescence resonance energy transfer  Gt  tissue conductivity  HBSS  Hank´s balanced salt solution  HEPES  N‐(2‐hydroxyethyl)piperazine‐N´‐2‐ethanesulfonic acid  I  current  IBD  inflammatory bowel disease  ICC  immunocytochemistry  IgG  immunglobulin G  IHC  immunohistochemistry  IL  interleukin  IPAN  intrinsic primary afferent neuron  Isc  short‐circuit current  Kd  dissociation constant  MAP2  microtubule‐associated protein 2  MEA  microelectrode array  mRNA  messenger ribonucleic acid  PB  phosphate buffer  PBS  phosphate buffered saline  PBS‐T  phosphate buffer with Triton‐X  PCR  polymerase‐chain‐reaction  PD  potential difference  PFA  paraformaldehyde  PGP9.5  protein gene product 9.5  qPCR  quantitative real time PCR  R  resistance  Re  epithelial resistance  RNA  ribonucleic acid  ROI  region of interest  RQ  relative quantity  Rs  subepithelial resistance  Rt  transcellular resistance  x    RT‐PCR  reverse transcription polymerase‐chain‐reaction  SCFA  short‐chain fatty acid  t  time  TAE  tris‐acetate EDTA buffer  TNFα  tumor necrosis factor α  V  volt  v/v  volume per total volume  VIP  vasoactive intestinal peptide  w/v  weight per total volume  1  Introduction  1 Introduction  1.1 The enteric nervous system  1.1.1 Anatomy  The Enteric Nervous System (ENS) is, besides the sympathetic and the parasympathetic  system, part of  the autonomous nervous  system. The ENS plays a crucial  role  in  the  regulation of gastrointestinal  functions, such as motility, secretion and blood  flow.  In  1899, Bayliss and Starling (Bayliss & Starling 1899) described the characteristic of the  ENS  to be able  to control  the motility of  the gut without  involvement of  the central  nervous system. This feature as well as the enormous number of neurons in the ENS (2  –  1000 million,  depending  on  species  and  animal  size;  Furness  2006)  highlights  the  importance of the ENS for the regulation of gastrointestinal functions.  The enteric nervous system consists of two main plexuses located within the intestinal  wall  (Figure  1.1).  The myenteric or Auerbach´s plexus  can be  found  throughout  the  whole gastrointestinal  tract and  is  located between  the circular and  the  longitudinal  muscle  layer.  It consists of a network of ganglia, connected via  interganglionic  fibers  (Auerbach 1864). The  submucosal or Meissner´s plexus  is  located  in  the  submucosa,  i.e. between the circular muscle layer and the mucosa and can be found exclusively in  the intestine (Schemann 2000; Hansen 2003a). It also consists of ganglia connected via  interganglionic  fibers, but  the  ganglia  are  smaller and  contain  less neurons  (Furness  2006).  There  are  also  aganglionic  plexuses  within  the  intestinal  wall;  one  of  these  is  the  mucosal  plexus, which  either  consists  of  fibres  from  the  submucosal  plexus  or  can  contain neuronal somata in some intestinal segments (Mestres et al. 1992a, 1992b). If  present,  its  neurons  are  associated with  the muscularis mucosa  and  the  intestinal  glands (Kramer et al. 2011; Figure 1.1).   2  Introduction  Figure  1.1:  Schematic  picture  of  the  location  of  the myenteric,  the  submucosal  and  the  mucosal  plexus within the intestinal wall.   Modified from Rescigno (2008).  1.1.2 Physiology   1.1.2.1 Classification of neurons  Since the first description of the enteric nervous system by Bayliss and Starling (Bayliss  & Starling 1899), different classifications of the enteric neurons have been introduced.  As  first  author,  Dogiel  (Dogiel  1899)  categorised  neurons  according  to  their  shape.  Depending on their size, their surface and the number of their processes, the neurons  were defined as Dogiel  type  I,  II or  III neurons. However,  this classification does not  provide information about the functions of the neurons. Nevertheless, it is still widely  used for categorising enteric neurons from all species.  Another  way  of  classification  is  according  to  their  electrical  properties.  Hirst  and  McKirdy  (Hirst  & McKirdy  1974)  initially  proposed  to  classify  enteric  neurons  as  S  (synaptical)‐ and AH (after‐hyperpolarisation)‐neurons. S‐neurons are characterised by  a  fast  action  potential  followed  by  a  short  after‐hyperpolarisation,  whereas  AH‐ neurons exhibit an action potential with a  longer duration and  two phases of after‐ hyperpolarisation, an early and a late one.  3  Introduction  The third classification can be made according to the function of the neurons: motor  and secreto‐/vasomotor neurons,  interneurons and  intrinsic primary afferent neurons  (Lomax & Furness 2000; Michel et al. 2000; Pfannkuche et al. 1998; Schemann et al.  1995).   Motor  neurons  innervate  muscular  tissue,  most  importantly  the  circular  and  longitudinal  muscle  layers  of  the  muscularis  propria  and  the  muscularis  mucosae  (Schemann  2000). Most  of  the motor  neurons  projecting  to  the muscularis  propria  originate from the myenteric plexus, although it is known for the circular muscle of the  rat that some of the innervating neurons originate from the submucosal plexus as well  (Furness  2006).  The  secreto‐  and  vasomotor  neurons  project  from  the  submucosal  plexus  to  the mucosa  and  control  the blood  flow within  the  intestinal wall  and  the  secretion of the  intestinal epithelium. But also the myenteric plexus takes part  in the  control of the secretion of electrolytes. Jodal et al. (Jodal et al. 1993) and See and Bass  (See  &  Bass  1993)  showed  an  involvement  of  the  myenteric  plexus  in  the  fluid  secretion  induced by cholera‐toxin and glucose, respectively. The mucosal plexus has  inhibitory effects on the electrolyte secretion as well (Bridges et al. 1986).  The motor neurons can be subdivided into neurons with excitatory or inhibitory effects  on  the  target  cells.  In  the  myenteric  plexus,  approximately  half  of  the  myenteric  neurons release inhibitory neurotransmitters, the other half excitatory (Furness 2006;  Table 1.1). However,  there  is a  functional dominance of  inhibitory motor neurons  in  the myenteric plexus, as the overall, predominant action of the enteric nervous system  on gastrointestinal motility is an inhibitory one (Hansen 2003b), demonstrated e.g. by  the increase in intestinal motility after blockade of neuronal activity with tetrodotoxin  (Diener & Gabato 1994).  Intrinsic primary afferent neurons (IPANs) are responding to  stimuli,  such  as  distension,  luminal  chemistry  and mechanical  stimulation  (Furness  2006, Hansen 2003a). The  third class of enteric neurons are  the  interneurons. These  neurons are  involved  in secretomotor and motility reflexes (Schemann 2000, Furness  2006) and represent the connection between the sensory information gathered by the  intrinsic primary afferent neurons and  the effects caused by  the motor and  secreto‐  and vasomotor neurons in response to the sensory stimuli. This reflex circuitry enables  the  ENS  to work  independently  from  the  central  nervous  system  (Schemann  2000).  However, there  is a considerable modulating  influence by the central nervous system  4  Introduction  via the classical autonomous nervous system. It has been shown by Lister (Lister 1858)  that noradrenergic fibers ramify between myenteric neurons, but are very rarely found  in  the  muscle  itself.  Paton  and  Zar  (Paton  &  Zar  1968)  demonstrated  that  the  stimulation  of  sympathetic  nerves  as  well  as  the  exposure  of  the  intestine  to  noradrenaline  reduces  the  acetylcholine  release  from  enteric  neurons.  Hirst  and  McKirdy  (Hirst  & McKirdy  1974)  showed  that  this  effect  of  adrenergic  neurons  is  mediated via presynaptic inhibition. A similar effect can be seen on the secretion. The  sympathetic  nerves  have  an  inhibitory  effect  on  the  secretion,  by  innervating  the  submucosal plexus (Wright et al. 1940; Sjövall 1984)  An overview of the neuronal types, their functions and the neurotransmitters involved  is presented in Table 1.1.    Type of neurons Main transmitters Functions  Intrinsic primary afferent  neurons (IPANs)  Substance P, calcitonin gene‐related peptide  (CGRP), acetylcholine,  serotonin  Detection of stimuli, such  as distension, luminal  chemistry, and mechanical  stimulation  Interneurons  Acetylcholine, somatostatin,  serotonin, substance P,  dopamine  Activation of inhibitory and  excitatory neurones via  nicotinic (and partially  muscarinic) receptors  Excitatory motor neurons  Acetylcholine,  substance P  Contraction in myocytes  via muscarinic receptors  Inhibitory motor neurons  Nitric oxide (NO), vasoactive  intestinal peptide (VIP), ATP  Relaxation in myocytes Excitatory secretomotor  neurons  Acetylcholine, vasoactive  intestinal peptide (VIP)  Activation of secretory  cells in the mucosa  Inhibitory secretomotor  neurons  Neuropeptide Y,  somatostatin  Inhibition of secretory cells  in the mucosa  Vasomotor neurons  Vasoactive intestinal  peptide (VIP), acetylcholine,  NO  Relaxation of blood vessels Table 1.1: Overview of the subclasses of neurons, their neurotransmitters and the effects on  the intestine. Modified from Schemann 2000.  5  Introduction  1.1.3 The myenteric plexus and the regulation of intestinal motility  Although the general excitability of intestinal smooth muscle cells is generated by the  interstitial cells of Cajal  (see 1.5.2), the enteric nervous system plays a crucial role  in  regulating  and  adjusting  the  contractions  in  order  to  achieve  a  target‐oriented  peristalsis  (Schemann  2000).  There  are  three  stimuli,  which  can  induce  the  reflex  responses  necessary  to  cause  peristalsis:  distension,  mechanical  distortion  of  the  mucosa  and  changes  in  the  chemical  composition  of  the  luminal  content  (Kunze &  Furness  1999).  The  bowel  reacts  to  these  stimuli with  a  contraction  of  the  circular  muscle orally to the bolus and a relaxation at the aboral side of the bolus. This effect is  caused  by  excitatory  and  inhibitory  myenteric  neurons,  which  are  activated  by  interneurons  via  the  reflex  circuitry  described  above.  These motor  neurons  have  a  direct  impact  on  the  smooth muscle  cells,  but  also  influence  the  interstitial  cells  of  Cajal (Kunze & Furness 1999). Since the smooth muscle cells are electrically coupled to  each other, it is obvious that the motor neurons always influence the cells as a group  forming a motor unit with a  size of approximately 2  ‐ 3 mm. These motor units are  innervated by roughly 600  ‐ 900 excitatory and 800 – 1200  inhibitory motor neurons  (Kunze & Furness 1999).   Since  the myenteric plexus primarily projects  to  the  intestinal muscle, we  aimed  to  investigate the effect of bradykinin on the  intestinal motility. We particularly focused  on  the  question  if  bradykinin  has  effects  on  the  electrical  activity  of  myenteric  neurons, and how this stimulation  influences the contractility of the  intestinal muscle  in  comparison  to  a  direct  effect  of  bradykinin  on  the  muscle  cells  (see  1.5.3).  Furthermore,  we  aimed  to  find  out  if  the  stimulation  of  myenteric  neurons  with  bradykinin might also mediate changes in the intestinal ion secretion, as the myenteric  plexus has also been  found  to be  involved  in  the regulation of secretion  (Jodal et al.  1993; See & Bass 1993).  6  Introduction  1.2 Bradykinin  1.2.1 Production and degradation  Bradykinin is a nonapeptide, which is produced after tisssue injury and inflammation in  the blood plasma as well as in tissues. In the plasma bradykinin is produced from high‐ molecular‐weight  kininogen,  whereas  the  tissue‐originated  bradykinin  is  produced  from  low‐molecular‐weight  kininogen. The  latter  is  transformed  to  kallidin  and  then  converted to bradykinin by an aminopeptidase (Regoli & Barabe 1980) (Figure 1.2). The  transformation  of  kininogen  to  kallidin  (10  amino  acids)  and  bradykinin  (9  amino  acids), respectively, is carried out by the enzyme kallikrein, which is activated by tissue  injury, inflammation, toxins, but also by the blood coagulation system (Farmer & Burch  1992). Bradykinin and kallidin both are degraded by a carboxypeptidase  to des‐arg9‐ bradykinin and des‐arg10 kallidin, respectively (Regoli & Barabe 1980).      Figure 1.2: The production and metabolism of bradykinin.   The enzymes are written next to the arrows. Adapted from Avemary 2010.  7  Introduction  1.2.2 Functions and receptors  Bradykinin  has  various  functions  in  the  body,  most  of  them  being  related  to  inflammatory processes: it is involved in the development of pain, dilates blood vessels  and enhances  their permeability  (Farmer & Burch 1992; Regoli & Barabe 1980). This  holds also true  for the  intestine. Additionally, bradykinin  induces  ion secretion  in the  intestine,  by  directly  stimulating  epithelial  cells  or  by  activating  neurons,  primarily  submucosal  neurons  (Diener  et  al.  1988).  This  can  disturb  the  balance  between  secretion  and  absorption  and  thus  lead  to  a  secretory  diarrhoea.  Bradykinin  also  induces  contraction  and/or  relaxation  in  the  intestinal  muscle  and  stimulates  myenteric neurons, which might  lead  to  changes  in motility  and  to diarrhea  as well  (Murakami  et  al.  2007).  It  can  be  speculated  that  this  is  a  helpful  effect  for  the  organism during  inflammation, since an  increased motility causes a quick elimination  of potentially hazardous  agents. However,  the  loss of water  and electrolytes during  diarrhea can harm the organism due to dehydration. Bradykinin has also been found to  be involved in inflammatory bowel diseases (Devani et al. 2005; Stadnicki et al. 2003a),  which is described in more detail in 1.4.   Two  different  bradykinin‐receptors  have  been  described:  the  highly  regulated  B1  receptor and the constitutively expressed B2 receptor (Farmer & Burch 1992; Regoli &  Barabe 1980). Although the B1 receptor is constitutively expressed in some tissues, e.g.  rat  dorsal  root  ganglia  (Wotherspoon  & Winter  2000),  in  the majority  of  cells  an  upregulation  is  necessary.  In  vivo,  this  usually  occurs  after  tissue  injury  and/or  inflammation, and in vitro after tissue dissection or incubation (for review see Farmer  & Burch 1992; Leeb‐Lundberg 2005). This upregulation can be inhibited by blockers of  the  protein  synthesis  (Bouthillier  et  al.  1987),  demonstrating  a  de‐novo  protein  formation.  The B1  receptor has  a high  affinity  for  the  carboxypeptidase metabolites  des‐arg10‐kallidin and des‐arg9‐bradykinin (Farmer & Burch 1992; Leeb‐Lundberg 2005;  Figure 1.2), therefore the latter was used as a B1 agonist in my experiments.  The B2 receptor is constitutively expressed and can be found throughout the organism,  emphasising  the  importance  of  bradykinin  in  physiological  and  pathophysiological  processes. This receptor has –  in contrast to the B1 receptor ‐ a high affinity for hyp 3‐ bradykinin (Leeb‐Lundberg 2005), which was used as a B2 agonist in the present study.  8  Introduction  In most  tissues  the  activation  of  bradykinin  receptors  leads  to  a  stimulation  of  the  enzyme  phospholipase  C,  resulting  in  the  formation  of  inositol‐1,4,5‐trisphosphate  (IP3)  and  diacylglycerol  (DAG)  (Farmer  &  Burch  1992;  Leeb‐Lundberg  2005).  The  subsequent  increase  in  the  cytosolic  Ca2+  concentration  can  either  be  induced  by  a  release of Ca2+  from  intracellular  stores after binding of  IP3  to  its  receptor or by  an  influx of Ca2+ from the extracellular space.  In rat submucosal neurons the  increase  in  the  cytosolic  Ca2+  concentration  evoked  by  bradykinin  is  mediated  by  voltage‐ dependent Ca2+ channels, activated after depolarisation, which  is a result of a closure  of K+ channels (Avemary & Diener 2010a).  In the cell type  investigated  in the present  study  ‐  rat myenteric  neurons  ‐  it was  proposed  that  both  voltage‐dependent  Ca2+  channels  as well  as  non‐selective  cation  channels mediate  the  rise  in  cytosolic  Ca2+  concentration after receptor activation by bradykinin (Murakami et al. 2007). Another  characteristic of bradykinin receptors is the activation of the enzyme phospholipase A2.  Arachidonic  acid  produced  from membrane  phospholipids  by  this  phospholipase  is  rapidly  converted  to  eicosanoids  such  as  prostaglandins  (Farmer & Burch  1992). An  involvement of prostaglandins  in the bradykinin effect has been shown for myenteric  neurons as well (Gelperin et al. 1994; Murakami et al. 2007).  Another  difference  between  B1  and  B2  receptors  is  their  desensitisation  behaviour.  Whereas the B1 receptor is desensitised only to a small degree, the B2 receptor rapidly  loses sensitivity after agonist stimulation (Leeb‐Lundberg 2005).   9  Introduction  1.3 Absorption and secretion at the colonic epithelium   1.3.1 The colonic epithelium  The colon is part of the large intestine and can be divided into the proximal colon, the  transversal  colon  and  the  distal  colon.  The  function  of  the  colon  consists  in  the  transport of ingesta, in hosting bacteria fermenting structure carbohydrates for which  mammals do not express digestive enzymes,  in  immune defence,  in  the  secretion of  isotonic  fluid  containing  K+,  HCO3 ‐,  and  mucus,  and  –  most  importantly  –  in  the  absorption of water and electrolytes. Approximately 90 % of  the water entering  the  large  intestine  is absorbed  in  the colon;  that  is  ~1.5  l electrolyte‐rich  fluid per day  in  humans (Cooke 1991; Kunzelmann & Mall 2002). However, this system of absorption  and secretion  represents a highly‐controlled equilibrium, which can,  if getting out of  balance,  induce severe diarrhoea or constipation  (Binder et al. 1991; Field & Semrad  1993; Binder & Sandle 1994).  The colonic wall consists of the mucosa, the submucosa, the muscularis propria, and  the  serosa. The mucosa  is  composed of  the epithelium,  the  lamina propria, and  the  lamina  muscularis  mucosae.  The  epithelium  builds  intestinal  glands  (Potten  et  al.  1997), which are covered by  the columnar enterocytes with  their surface‐magnifying  microvilli  and,  in  a  smaller  amount,  by  the  mucus‐producing  goblet  cells,  which  together  represent  95  %  of  all  colonic  epithelial  cells.  The  other  5  %  are  the  enteroendocrine  cells,  which  produce  hormones,  such  as  glucagon,  serotonin,  somatostatin, and vasoactive intestinal peptide (VIP) (Specht 1977; Turnberg 1984).  The  epithelial  cells  of  the  intestinal  tract  are  constantly  replaced  by  new  cells.  The  average  length  of  survival  time  of  an  enterocyte  is  approximately  three  days. New  enterocytes  are  built  in  the  ground  of  the  intestinal  glands, moving  to  the  surface  while  maturating  (Barrett  &  Keely  2000).  Although  both  secretion  and  absorption  occur  in the surface epithelium as well as  in the crypts,  it  is hypothesised that young  enterocytes  in  the base of  the crypt have primarily  secreting  functions, whereas  the  mature surface enterocytes are mostly involved in absorptive processes (Kockerling &  Fromm 1993; Kunzelmann & Mall 2002).  10  Introduction  1.3.2 Absorption  The colon plays an important role in the absorption of water and ions, such as Na+, K+  and Cl‐. Sodium and chloride ions are absorbed via electroneutral processes in the rat  colon  (Figure  1.3).  This  differs  from  e.g.  the  human  or  rabbit  colon,  where  the  electrogenic  Na+  absorption  via  epithelial  Na+  channels  (ENaC‐channels)  plays  an  important role as well (Kunzelmann & Mall 2002).  The  apical membrane  is  provided with Na+‐H+‐exchangers  and  Cl‐‐HCO3 ‐‐exchangers,  which allow to absorb Na+ and Cl‐ ions and at the same time secret H+ ions and HCO3 ‐  ions  into  the  gut  lumen  (Figure  1.3).  Via  Na+‐K+‐ATPases  and  Cl‐  channels  on  the  basolateral  side,  the  ions  are  transported  out  of  the  cell  (Diener  et  al.  1992;  Kunzelmann & Mall 2002; Ikuma et al. 2003).  The absorption of K+  ions  is an ATP‐dependent process and occurs via K+‐H+‐ATPases.  Basolateral  K+  channels  enable  a  transport  of  the  absorbed  K+  out  of  the  cell,  (Kunzelmann & Mall 2002).  Water  is  absorbed  by  different  pathways:  it  follows  paracellularly  the  gradient  produced  by  the  ion  absorption  or  transcellularly  by  diffusion  via  water  channels  (aquaporines) (Barrett & Keely 2000; Kunzelmann & Mall 2002).  11  Introduction      Figure 1.3: Mechanisms of Na+, Cl‐ and K+ absorption.   By courtesy of M. Diener.  12  Introduction  1.3.3 Secretion  Colonic secretion and absorption is a balanced system. The purpose of the secretion is  the hydration and transport of the mucus out of the crypt (Kunzelmann & Mall 2002);  consequently the mucus secretion and ion secretion are activated in parallel (Halm et  al. 1995).  The colon  is able  to secrete  ions, primarily Cl‐. A basolaterally  located Na+‐K+‐ATPase  generates a high concentration of K+ and a low concentration of Na+ in the cell (Figure  1.4). This gradient enables  the Na+‐K+‐2Cl‐‐cotransporter  to accumulate Cl‐  inside  the  cytosol.  Potassium  ions  are  transported  out  of  the  cell  via  K+  channels. When  the  chloride  channels,  which  are  predominantly  CFTR‐channels  (cystic  fibrosis  transmembrane conductance regulator channels), in the apical membrane are opened,  chloride follows the electrochemical gradient and moves into the colonic lumen (Figure  1.4). A paracellular flux of Na+ balances the charge transfer (Kunzelmann & Mall 2002).      Figure 1.4: Mechanisms of Cl‐ secretion.   By courtesy of M. Diener.  13  Introduction  The colon  is also capable of secreting HCO3 ‐. Bicarbonate  is either absorbed from the  basolateral side of the cell via Na+‐dependent, electroneutral processes or is produced  in  the  cell  by  carboanhydrase(s).  The  secretion  occurs  via  CFTR‐channels,  apical  Cl‐‐ HCO3 ‐‐exchanger  or  SCFA‐(short‐chain  fatty  acid)‐HCO3 ‐  exchanger.  The  transport  is  paralleled with the Na+‐H+‐exchanger (Poulsen et al. 1994; Kunzelmann & Mall 2002).  1.3.4 Regulation of ion transport  The  regulation  of  the  absorption  and  secretion  is  dependent  on  a  large  variety  of  substances. Hormones, neurotransmitters, food components, biliary acids, or viral and  microbial toxins play an important role. But also the distension of the colonic wall can  induce secretion (Kunzelmann & Mall 2002).  To the group of secretagogues belongs e.g. VIP, acetylcholine or prostaglandins, which  activate the cell after receptor binding  (Kunzelmann & Mall 2002). This occurs either  via the formation of cyclic adenosine monophosphate (cAMP) catalysed by adenylate  cyclase(s)  or  via  the  production  of  cyclic  guanosine  monophosphate  (cGMP)  by  guanylate cyclase(s). These intracellular messengers change the driving forces for ions  and thus induce secretion.   Another second messenger system involved in the secretion is the IP3‐pathway (Abdel‐ Latif  1986;  Lindqvist  et  al.  1998).  After  receptor  activation  of  a  G‐protein  coupled  receptor,  the  formation  of  IP3  and  subsequent  binding  to  its  receptor  on  the  endoplasmic reticulum  leads to a release of  intracellular Ca2+  from this compartment  (more  detailed  description  in  1.2.2).  Ca2+  influx  from  the  extracellular  space  can  be  induced as well (Spassova et al. 2004). This increase in the cytosolic Ca2+ concentration  leads to the activation of Ca2+‐dependent K+ channels and thereby indirectly induces Cl‐  secretion via hyperpolarisation of the cell (Kunzelmann & Mall 2002).  Another part of the  intestine  is crucial for the regulation of absorption and secretion:  the enteric nervous system. Especially the submucosal plexus is provided with multiple  processes  innervating  the mucosa  (Furness  2006).  But  also  the myenteric  plexus  is  known to be involved in the regulation of absorption and secretion (Jodal et al. 1993;  See & Bass 1993) (see 1.1.2.1).  14  Introduction  1.3.5 Bradykinin and ion secretion  Bradykinin causes a chloride secretion  in  the  intestinal  tract, a  finding  that has been  described in rat colon, guinea pig ileum, rabbit ileum and colon and also human colon  (Musch et al. 1983; Cuthbert et al. 1984a, 1984b; Perkins et al. 1988; Phillips & Hoult  1988; Baird et al. 2008). All investigators demonstrated that the effect of bradykinin on  the  ion  secretion  is  dependent  on  the  synthesis  of  prostaglandins. Warhurst  et  al.  (Warhurst et al. 1987) as well as Phillips et al. (Phillips & Hoult 1988) hypothesised that  bradykinin  induces  the chloride secretion via  two pathways:  firstly,  the kinin directly  stimulates bradykinin receptors located on the epithelial cells and secondly, bradykinin  induces  a  release  of  prostaglandins  from  sub‐epithelial  cells,  which  then  cause  a  chloride secretion by binding to prostaglandin receptors on the epithelium.  Diener  et  al.  (Diener  et  al.  1988)  showed  that  bradykinin  has  direct  effects  on  the  epithelial  cells  causing  chloride  secretion, but  stated  that  there was also a neuronal  component,  since  the  neurotoxin  tetrodotoxin  reduced  the  bradykinin  effect  in  a  preparation,  in  which  the  submucosal  plexus  was  preserved,  whereas  in  a  purely  mucosal  preparation  tetrodotoxin  did  not  have  an  effect  on  the  bradykinin‐induced  chloride secretion.  Since  the  myenteric  plexus  has  been  shown  to  be  involved  in  the  secretory  mechanisms as well (see 1.1.2), I aimed to clarify the question whether bradykinin, by  stimulating myenteric neurons, alters the ion secretion in the rat colon.   1.3.6 Mucus secretion  Mucus  is an  important component of the  intestine building an adherent  layer, which  fulfils a barrier function and thus protects epithelial cells from abrasion and bacterial  invasion (Specian & Oliver 1991; Halm & Halm 2000). The mucus is released by goblet  cells  via  exocytosis. Goblet  cells  originate  from  progenitor  cells  in  the  depth  of  the  crypt and move upwards during maturation, similar as the enterocytes, to the surface  epithelium. The  life  span of  a  goblet  cell  is 2  ‐ 3 days  (Specian & Oliver 1991).  The  released  mucus  consists  of  a  heterogeneous  collection  of  high‐molecular‐weight  glycoproteins: the mucins (Specian & Oliver 1991).  In  the  intestinal  tract  there  is  a  basal  secretion  of mucus  (Specian & Oliver  1991),  which can be strongly augmented by secretagogues increasing either the cytosolic Ca2+  15  Introduction  concentration  or  the  intracellular  cAMP  level  (Kunzelmann & Mall  2002).  It  is well  known that the mucus properties critically depend on the secreted chloride and HCO3 ‐  (Grubb & Gabriel 1997; Garcia et al. 2009).  Whether  bradykinin  alters  the  mucus  secretion  in  the  intestine  has  been  rarely  investigated.  Stanley  et  al.  (Stanley  &  Phillips  1994)  demonstrated  that  bradykinin  induced a mucus release in HT29 cells (human colon adenocarcinoma grade II cell line).  Akiba  et  al.  found  by  in  vivo  experiments  that  bradykinin  increased  the mucus  gel  thickness in the rat duodenum (Akiba et al. 2001). In the respiratory tract Nagaki et al.  (Nagaki  et  al.  1996)  showed  that  bradykinin  caused  a mucus  release  from  human  isolated  submucosal  glands.  However,  no  studies  have  been  performed  so  far  investigating  the  effect  of  bradykinin  on  the  mucus  secretion  in  human  intestinal  mucosa, especially  in regard to an  involvement of this system  in  inflammatory bowel  diseases, for which an altered mucus release has been demonstrated (Gustafsson et al.  2012, see 1.4.2).  16  Introduction  1.4 Inflammatory bowel diseases  1.4.1 Genesis and symptoms   Two  diseases  fall  into  the  category  of  human  inflammatory  bowel  diseases  (IBD):  Crohn´s disease and ulcerative colitis. Both have similarities in the matter of symptoms  and genesis, but differ in location and nature of the pathological changes. In both cases  an  inflammation  of  the  intestine  leads  to  diarrhoea,  abdominal  pain  and  rectal  bleeding.  However,  Crohn´s  disease  can  affect  the  whole  gastrointestinal  tract,  whereas in ulcerative colitis ‐ the focus of the respective part of my study ‐ exclusively  the colon and rectum exhibit inflammatory changes (Strober et al. 2007).   During acute  inflammation, ulcerative  colitis patients have a  strongly altered  colonic  mucosa. Massive  infiltrations of  immune  cells, mucus  release by  the goblet  cells, as  well as changes in the crypt architecture dominate the histological examination (Lewis  et al. 2008). During remission, these histopathological alterations are mostly restored,  but  30  %  of  the  patients  still  suffer  from  symptoms  such  as  abdominal  pain  and  diarrhoea, despite a histologically  inconspicuous mucosa  (Isgar et al. 1983; Simren et  al. 2002). Gustafsson et al. (Gustafsson et al. 2012) showed that remissional patients  have an altered  responsiveness  to secretagogues  in  regard  to  ion  (as well as mucus)  secretion, which might be  involved  in  the pathogenesis of abdominal symptoms. But  also  the  consistent  influence  of  inflammatory mediators,  such  as  bradykinin, might  play a role.  1.4.2 The involvement of bradykinin  Since bradykinin is an important inflammatory mediator, it was hypothesised that this  peptide plays a  role  in  the pathophysiology of  IBD.  It has been shown  in  two animal  models  of  enterocolitis  (indomethacin  and  proteoglycan  polysaccharide‐induced  colitis)  in  genetically  susceptible  Lewis  rats  that during  acute phases of  the disease,  plasma  kallikrein  ‐  the  enzyme  transforming  high  molecular  weight  kininogen  to  bradykinin  (see  1.2.1)  ‐  is  activated  (Stadnicki  et  al.  1998a;  Stadnicki  et  al.  1998b).  Additionally,  the  application  of  a  plasma  kallikrein  inhibitor  attenuates  acute  and  chronic  enterocolitis  in  rats  (Sartor  et  al.  1996;  Stadnicki  et  al.  1996).  It  was  also  demonstrated that in rats being deficient of high‐ and low‐molecular‐weight kininogen,  17  Introduction  a  gross  gut  score  evaluating  intestinal  wall  thickening,  adhesions,  mesenteric  contractions and serosal nodules was reduced by 60 % (Isordia‐Salas et al. 2002).  In human  inflammatory bowel diseases the kallikrein‐kinin system has been  found to  be involved as well. Stadnicki et al. (Stadnicki et al. 2003a) showed that under healthy  and diseased conditions intestinal tissue kallikrein is located in the goblet cells. But in  colitis patients the amount of kallikrein  in the goblet cells was reduced, although the  mRNA  level  was  unchanged,  indicating  a  release  of  kallikrein  into  the  lumen.  Additionally,  a  natural  inhibitor  of  kallikrein,  kallistatin, was  decreased  in  intestinal  tissue from IBD patients, which led to the assumption that kallistatin binds to kallikrein  and  thus  is no  longer detectable  (Stadnicki et al. 2003a; Devani et al. 2005).  In a  rat  model of  enterocolitis,  intestinal  tissue  kallikrein was  also  found  in macrophages of  granulomas located in the submucosa (Stadnicki et al. 1998a). In consistency with that,  granulomas in tissue from IBD patients exhibited plasma cells containing high amounts  of tissue kallikrein as well (Stadnicki et al. 2005).  Another  finding  supporting  the  hypothesis  of  an  involvement  of  the  kallikrein‐kinin  system  in  IBD  is  that,  in  contrary  to patients  suffering  from diverticular disease,  the  inflamed colonic mucosa  from patients with ulcerative colitis contains kininogen,  the  precursor molecule for bradykinin (Zeitlin & Smith 1973). Furthermore Stadnicki et al.  (Stadnicki et al. 2005) showed an increased expression of the B1 receptor in the colonic  mucosa of patients suffering from inflammatory bowel disease (Stadnicki et al. 2005).  In  Crohn´s  disease  they  also  found  a  positive  staining  for  the  B1  receptor  in  macrophages forming granulomas (Stadnicki et al. 2005).   These  findings  strongly  suggest  an  involvement  of  bradykinin  in  the  genesis  and  symptoms of  IBD. However,  these  studies concentrated on a morphological proof of  the  involvement of the kallikrein‐kinin system, whereas the functional  involvement  in  human IBD has not been investigated yet, especially in regard to a consistent influence  of bradykinin on the symptoms observed in remissive ulcerative colitis patients.   Since  there  is  evidence  for  alterations  in  the mucus  secretion  in  ulcerative  colitis  patients  (Gustafsson  et  al.  2012),  and  as  Stadnicki  et  al.  (Stadnicki  et  al.  2003a)  demonstrated  a  kallikrein‐release  from  goblet  cells,  I  was  interested  if  bradykinin  induced  a mucus  release  from  the  human  colonic mucosa  and  whether  there  are  differences  between  ulcerative  colitis  patients  and  control  patients.  Furthermore,  I  18  Introduction  investigated whether bradykinin, which  is known  to  induce  chloride  secretion  in  the  colon of different  species  (see 1.3.5),  causes different  responses  in ulcerative  colitis  patients compared to control patients.  I therefore aimed to answer the following questions:  1) Does bradykinin induce ion and mucus secretion in human colonic biopsies?  2) Which receptors are involved in this effect?  3) Are there differences between control and ulcerative colitis patients?  4) Is there a neuronal involvement of the bradykinin‐induced effect?  19  Introduction  1.5 Intestinal motility  1.5.1 The intestinal smooth muscle  The muscularis propria of the intestine is arranged in two layers, an inner circular and  an  outer  longitudinal  layer.  The  interplay  between  the  vectors  of  the  two  forces  generated by these perpendicularly arranged muscles enables a coordinated peristaltic  movement, which is crucial for the target‐oriented transport of ingesta.  Smooth muscle cells are spindle‐shaped excitable cells, which contain myosin and actin  as contractile elements. Actin  is a globular protein, which  forms two‐stranded helical  filaments. Myosin consists of two heavy chains, each forming a head and a helical neck  and tail, and two  light chains, which are bound to the head region  (Figure 1.5). Each  head  contains  a  binding  site  for  actin  and  a  magnesium‐adenosine  triphosphate  molecule (Huber 2010).           Figure 1.5: The structure of actin and myosin.  By courtesy of M. Diener.      The smooth muscle cells are connected electrically via gap junctions, which facilitate a  propagation  of  excitation  and  thus  induce  coordinated  contraction.  The  intestinal  muscle  possesses  interstitial  cells  of  Cajal, which  serve  as  electrical  pacemakers  by  depolarising  spontaneously.  This  depolarisation  follows  a  phasic  pattern,  which  is  mirrored  by  the  phasic  contractions  in  the  intestinal  muscle,  called  slow  waves.  Depending on the segment of the gastrointestinal tract, these slow waves occur with a  frequency between 3 and 20 times per minute (Bowen 1996) and are essential for the  transport of food through the gastrointestinal tract.   Actin Myosin 20  Introduction  Classically,  a depolarisation of  a  smooth muscle  cell –  either  after propagation of  a  depolarisation from the neighbouring cell or after receptor activation by an agonist –  leads to an opening of voltage‐dependent Ca2+ channels and a subsequent Ca2+  influx  (Catterall 2005). The calcium ions build a complex with calmodulin, which activates the  myosin  light‐chain  kinase  (Figure  1.6).  This  enzyme  cleaves ATP  and  phosphorylates  myosin.  Furthermore  the Ca2+‐calmodulin  complex  activates  a protein  kinase, which  phosphorylates caldesmon – an inhibiting protein blocking the binding site for myosin  in its unphosphorylated state – and thus enables the phosphorylated myosin to bind to  the actin molecule. After  cleavage of  the phosphate  from  the myosin‐ADP  complex,  the myosin head performs a power stroke resulting in a shortening of the muscle cell.  There is an additional pathway for contraction: Ca2+‐independent kinases can activate  the myosin  light  chain  kinase,  but  they  play  a minor  role  in  the  contraction  under  physiological conditions (Sanders 2008).    Figure 1.6: Mechanism of contraction induced by Ca2+ in the smooth muscle cell.  21  Introduction    1.5.2 Regulation of motility  There are three main regulatory systems of the intestinal motility:  1) Interstitial cells of Cajal  2) Enteric motor neurons  3) Hormones, paracrine substances and inflammatory mediators    The basis  for  the  regulation of  intestinal motility  is  formed by  the  interstitial cells of  Cajal.  These  cells  belong  to  a  specialised  population  of  smooth muscle  cells.  They  contain  less  contractile  elements  compared  to  smooth muscle  cells, but  have more  mitochondria and larger endoplasmic reticula. Furthermore, they express a distinct set  of ion channels (Mostafa et al. 2010).   Interstitial  cells  of  Cajal  are  not  exclusively  located  in  the  intestinal  tract,  although  most  investigations  focused  on  this  organ.  They  are  also  important  regulators  of  motility in e.g. the bladder, the uterus or the vas deferens. 5 % of the smooth muscle  cells  in  the  intestinal muscularis propria  are  interstitial  cells of Cajal  (Mostafa  et al.  2010).  These  cells  are  responsible  for  the  resting  potential,  the  sensitivity  to  stretch,  the  responsiveness  to  neurotransmitters  and,  maybe  most  importantly,  they  have  pacemaker  activity  (Ehrlein  2010).  Interstitial  cells  produce  slow  waves,  i.e.  spontaneous  large amplitude transient depolarisations, which are primarily produced  by  Ca2+‐activated  Cl‐  channels.  These  depolarisations  are  conducted  to  the  smooth  muscle  cells  via  gap  junctions.  These  cells  respond  with  an  activation  of  voltage‐ dependent Ca2+  channels  (Koh et al. 2012). This  leads  to  large amplitude propulsive  contractions transporting the ingesta through the intestinal tract.   The  second  regulatory  system  consists of  the enteric motor neurons, most of  them  having  their  cell bodies  located  in  the myenteric plexus. They  regulate major motor  patterns, such as the amplitude or duration of contractions, and are able to respond to  stimuli  such as distension  (Wood 1994). But nevertheless,  the general excitability of  the smooth muscle cells is produced by the Cajal cells and the ENS only modulates the  resulting motor activity (for a detailed description see 1.1.3).  22  Introduction  The  third  factor  controlling  gastrointestinal  motility  are  hormones  and  paracrine  substances.  These  substances  act  mostly  via  receptor  binding,  which  results  in  a  change  in  ion conductance. This can occur via an  increased Ca2+  inward current or Cl‐  outward  current  causing  a  depolarisation  of  the  cell  and  a  subsequent  opening  of  voltage‐dependent Ca2+ channels  leading to a contraction. A relaxation can evolve via  an increased K+ outward current resulting in a hyperpolarisation and an inactivation of  the  voltage‐dependent  Ca2+  channels  (Sanders  2008).  Another  possible  action  of  hormones or other mediators  is  independent  from  ion  conductance  and  affects  the  myosin light chain phosphatase. This enzyme dephosphorylates the myosin light chain  subunits and therefore prevents a cross bridge cycling. By altering the activity of this  enzyme,  the  sensitivity  of  the  contractile  apparatus  to  Ca2+  can  be  decreased  or  increased (Sanders 2008).   The  excitability  of  the  intestinal  tract  shows  a  high  variability  depending  on  the  intestinal segment. The resting membrane potential varies along the intestine from ‐85  to  ‐40 mV. This  is due to a differential expression of  ion channels and their different  open probabilities. Especially K+ channels (there are 20 species known in the intestine)  play  a  crucial  role  in  the  development  of  the  resting membrane  potential  and  are  known  to  show  a  high  variability  in  expression  along  the  intestinal  tract  (Sanders  2008). This  is comprehensible when considering the segment‐dependent  functions  in  the intestine: whereas the small intestine is responsible for digestion and absorption of  nutrients, the  large  intestine  is essential  for the absorption of water and electrolytes  and mucus  secretion. Therefore,  the characteristic of  the  intestine  should always be  interpreted with regard to the specific segment.  23  Introduction  1.5.3 The effect of bradykinin on smooth muscle cells  Since  bradykinin  is  an  inflammatory  mediator  known  to  be  involved  in  the  development of  gastrointestinal diseases,  such  as  inflammatory bowel diseases  (see  1.4.2), several studies have been performed  investigating  the effect of bradykinin on  the intestinal muscle. In rat duodenum and colon (Elliott et al. 1960; Altinkurt & Ozturk  1990; Feres et al. 1992; Ozturk et al. 1993; Wassdal et al. 1999a; Wassdal et al. 1999b),  as well as guinea pig  ileum and colon  (Hall & Bonta 1973; Ozturk et al. 1993; Calixto  1995;  Zagorodnyuk  et  al.  1998),  it  was  shown  that  bradykinin  induces  a  biphasic  change  in  intestinal motility, with an  initial relaxation  followed by a contraction. This  characteristic  of  the  kinin  response  was  particularly  interesting  in  terms  of  the  mechanisms. Earlier studies hypothesised that this effect was due to the activation of  the two different receptors for bradykinin, the B1 and the B2 receptor (Boschcov et al.  1984; Paiva et al. 1989). But in regard to the expression of the B1 receptor, there were  quite  contradictory  results  (Boschcov et al. 1984; Hall & Morton 1991).  Later  it was  proposed that the relaxative part of the kinin response was caused by an opening of  Ca2+‐activated  K+  channels  with  a  subsequent  hyperpolarisation  of  the  cell  (Hall  &  Morton 1991; Griesbacher 1992; Zagorodnyuk et al. 1998; Wassdal et al. 1999a).  However,  in rat tissue most studies concentrated on the duodenum and there  is only  one scarce description of the changes induced in the rat colon (Elliott et al. 1960) and  none  for  the  other  intestinal  segments.  Due  to  this  instance  and  the  unsolved  questions  concerning  the  mechanisms  underlying  the  biphasic  response,  I  was  interested in the effect of bradykinin on the rat intestinal muscle, especially in regard  to:   1) The comparison of the different segments of the rat intestine  2) The receptors involved  3) The mechanisms underlying the biphasic response to bradykinin.  24  Introduction  1.6 Aim of the study  The following questions I aimed to answer in this study:  1) How does bradykinin influence the excitability of myenteric neurons and which  receptors are involved?  2) Is  there an  impact of  the myenteric neurons  stimulated by bradykinin on  the  ion secretion in the rat colon?  3) How does bradykinin alter the ion and mucus secretion in the human colon and  is there an involvement of this system in ulcerative colitis?  4) Which  effect  has  bradykinin  on  the  intestinal  smooth muscle,  in  regard  to  segment‐dependency, involvement of the bradykinin receptors, and mediation  of the effect? Are myenteric neurons being stimulated by bradykinin involved?  Do adjacent non‐muscle cells influence the bradykinin response?    25  Material and methods  2 Material and methods  2.1 Animals  The  experiments  were  carried  out  with Wistar  rats  bred  at  the  Institute  for  Veterinary  Physiology  and  Biochemistry  at  the  Justus‐Liebig‐University  in Giessen.  The  animals were  housed in small groups at stable room temperature of 22.5 °C, air humidity of 50 – 55 % and  12h:12h light dark cycle. They had full access to standard rat diet and water ad libitum.  The preparation of myenteric neurons and isolated muscle cells were carried out with male  and  female animals with an age of  five  to nine days. For Ussing  chamber and organ bath  experiments male and female rats with a weight of 150 ‐ 250 g were used (Schultheiss et al.  2002b).  2.2 Human mucosa biopsies  The experiments with human colonic biopsies were approved by  the ethical committee of  the Sahlgrenska University Hospital. Prior to the colonoscopy (see 2.4.4), the patients were  given full information and signed informed consent was taken.  26  Material and methods  2.3 Chemicals  Chemical  Source  4´,6‐diamidino‐2‐phenylindol dilactate (DAPI) Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Agar  Merck (Darmstadt, Germany)  Agarose  Peqlab (Erlangen, Germany)  Bovine serum albumin (BSA)  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Bradykinin  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Carbachol  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Cytosin‐β‐D‐arabinofuranoside  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Des(Arg10,Leu9)‐kallidin  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Des‐Arg9‐bradykinin Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Donkey serum  Millipore (Billerica, MA, USA)  Fetale calve serum (FCS)  PAA (Pasching, Austria)  Fura‐2 AM  Life Technologies (Darmstadt,  Germany)  Gelatin solution 1  Merck (Darmstadt, Germany)  Gelatin solution 2  Gelatine for human consumption Glacial acetic acid  Merck (Darmstadt, Germany)  Goat serum  Dianova (Hamburg, Germany)  HEPES (N‐(2‐hydroxyethyl)piperazine‐N´‐2‐ ethanesulfonic acid)  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) HOE 140  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Hyp3‐bradykinin  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Kresyl‐violet  Merck (Darmstadt, Germany)  Laminin  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Manganese chloride Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Nifedipine  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Paraformaldehyde Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Penicillin/Streptomycin  Biochrom (Berlin, Germany)  Pluronic acid  Life Technologies (Darmstadt,  Germany)  Poly‐D‐lysin  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Roti®‐safe gel stain ready‐to‐use  Roth (Karlsruhe, Germany)  Tetrodotoxin  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Triton‐X  Sigma‐Aldrich (Taufkirchen, Germany) Table 2.1: List of chemicals  27  Material and methods  2.4 Preparation  2.4.1 Solutions  Solution  Source  Purpose Concentration/supplements Hank´s balanced salt  solution (HBSS)  without Ca2+/Mg2+  Life  technologies,  Darmstadt,  Germany  Preparation of  myenteric ganglionic  cells and intestinal  muscle cells  20 mmol∙l‐1 HEPES  10.000 units∙ml‐1 penicillin  10 mg∙ml‐1 streptomycin  Neurobasal A  medium  Life  Technologies  Cell culture of  myenteric ganglionic  cells  10 % (v/v) foetal calve serum 10.000 units∙ml‐1 penicillin   10 mg∙ml‐1 streptomycin   0.5 mmol∙l‐1 glutamine  Advanced Dulbecco´s  modified eagle  medium/Ham´s F12  (DMEM/F12)  Life  Technologies  Cell culture of  intestinal muscle  cells/ in vitro  preincubation of  intestinal muscle  4% (v/v) foetal calve serum 10.000 units∙ml‐1 penicillin   10 mg∙ml‐1 streptomycin   Collagenase type II Biochrom,  Berlin,  Germany  Digestion of muscle  layer and adherent  tissue  stock solution 1 mg∙ml‐1 Poly‐L‐lysin  Sigma  Aldrich,  Taufkirchen,  Germany  Coating of coverslips  and MEAs  5 µg∙ml‐1  Laminin  Sigma Aldrich Coating of MEAs 1 mg∙ml‐1  Krebs‐solution    Transport of the  human mucosal  biopsies  In mmol∙l‐1: 116 NaCl; 1.3  CaCl2; 3.6 KCl; 1.4 KH2PO4; 23  NaHCO3; 1.2 MgSO4. Set to a  pH of 7.4 with NaOH/HCl.  Table 2.2: Solutions for the preparation  28  Material and methods  2.4.2 Preparation of myenteric ganglionic cells and intestinal muscle cells  The myenteric  ganglia  cells were  isolated  from  five  to nine days old  rats  as described by  Schäfer et al.  (Schäfer et al. 1999). The animals were  killed by decapitation  (approved by  Regierungspräsidium Giessen, Giessen, Germany) and the abdominal cavity was opened with  forceps  and  scissors  following  the  linea  alba.  Starting  from  the  anal  ending,  the  whole  intestine was removed using small scissors. The intestine was placed into Ca2+‐ and Mg2+‐free  Hank´s  balanced  salt  (HBSS)  solution.  Under  optical  control with  a  binocular microscope  (Olympus SZX9, Hamburg, Germany), the muscle layer was stripped off from the anal to the  oral  direction  using  two  fine  forceps.  The  muscle  layer  was  then  incubated  in  a  vial  containing 1 ml collagenase type II stock solution (1 mg∙ml‐1; Biochrom, Berlin, Germany) and  1 ml HBSS without Ca2+ and Mg2+ (end concentration of collagenase: 0.5 mg∙ml‐1) at 37 °C for  80 min.  After  the  incubation  period,  the  tissue  was  vortexed  for  10  ‐  15  s  in  order  to  dissociate  the pieces of  intestinal muscle  from  the myenteric ganglia. The  suspension was  diluted  1:11  with  HBSS  and  dispensed  into  35 mm  culture  dishes. With  the  use  of  the  binocular  microscope,  the  net‐like  myenteric  plexus  pieces  were  collected  with  a  micropipette  and placed  into warm  (37  °C) Neurobasal medium.  The  remaining  intestinal  muscle  cells were  centrifuged  and  the HBSS was  replaced with warm  (37  °C) DMEM/F12  medium.  Subsequently,  the muscle  cells were  further  dissociated with  a  syringe  and  two  different needles (0.8 mm and 0.4 mm external diameter).  Depending on further use, 10 µl of the ganglionic cell suspension was seeded either on 10  mm coverslips coated with poly‐L‐lysin (5 µg∙ml‐1) or microelectrode arrays coated with poly‐ L‐lysin (5 µg∙ml‐1) and laminin (1 mg∙ml‐1). 20 µl of the muscle cell suspension was seeded on  10 mm coverslips coated with poly‐L‐lysin  (5 µg∙ml‐1). The ganglionic cells were cultured  in  Flexiperm®  chambers  (28 mm2;  Greiner  Bio‐One,  Frickenhausen,  Germany), whereas  the  muscle cells were cultured in 4‐well‐plates.  After  45  ‐  60 minutes,  the  cells  had  settled  down, were  covered with  290 µl Neurobasal  medium (for the ganglionic cells) or 980 µl DMEM/F12 (for the muscle cells), and  incubated  at 37 °C in an atmosphere of  5 % (v/v) CO2 in 95 % (v/v) air for at least 16 h.  29  Material and methods  2.4.3 Preparation of the intestine for isometric contraction measurements and Ussing  chamber experiments  The  animals were  killed by  a blow on  the head  followed by exsanguination  (approved by  Regierungspräsidium  Giessen,  Giessen,  Germany).  The  abdominal  cavity  was  opened  following the  linea alba, with relieving  incisions along the costal arch. In order to bleed the  animal,  the heart was cut. Then  the colon was cut  through at  the distal end with scissors.  The rest of the colon was removed by a blunt preparation of the mesentery and transected  caudally  from  the  exit  of  the  caecum.  The  colon was  placed  into  ice‐cold  Parsons  buffer  gassed with 5 % (v/v) CO2/95 % (v/v) O2, which  led to a relaxation of the  intestinal muscle.  Then  the  lumen  was  cleaned  with  Parsons  buffer  using  a  syringe.  For  some  isometric  contraction  experiments  other  parts  of  the  intestine  were  removed  as  follows:  the  duodenum was  taken off directly behind  the pylorus,  the  jejunal part originated  from  the  approximate middle of the jejunum and the ileum was removed directly before the entrance  to the caecum.  For some colonic preparations the intestinal muscle had to be stripped off. For this purpose,  the colon was placed on a rod (diameter 5 mm). After a circular  incision near the anal end  with a blunt scalpel, the muscularis propria, together with the serosa, was stripped off  in a  proximal direction.  In order to remove other  layers of the  intestinal wall, the colon was opened  longitudinally  and spread on a glass plate moistened with Parsons buffer. Both endings of the tissue were  fixed with glass slides and stretched in order to achieve a certain strain. Then the particular  layers were removed:   Depending on the experiments, different preparations were performed (Figure 2.1).  For the isometric contraction measurements:  1) Full‐thickness preparation: the whole intestinal wall was used.  2) Muscle‐submucosa‐lamina  propria  preparation:  the  epithelium  was  scraped  off  carefully with  little  pressure  using  the  edge  of  a  glass  slide. Most  of  the  lamina  propria and the muscularis mucosae remained intact.  3) Muscle‐submucosa  preparation:  the mucosa was  removed.  The  tissue was  incised  with the sharp edge of a glass slide and then the mucosal layer was scraped off.  4) Muscle preparation:  the whole  intestinal muscle was  stripped off and used  for  the  isometric contraction measurements (see above).  30  Material and methods  For the Ussing chamber:  1) Full‐thickness preparation  2) Mucosa‐submucosa preparation: the  intestinal muscle was stripped off as described  above.  3) Mucosa preparation:  after  the  intestinal muscle was  stripped off,  the mucosa was  removed as described in the muscle‐submucosa preparation, with the difference that  more attention had to be paid to the  integrity of the mucosal  layer, since this  layer  was used  in  the experiment, whereas  for  the  isometric  contraction measurements  the mucosal layer was discarded.     In order to confirm the success of the preparational method, the preparations were at least  once stained with haematoxylin and eosin stain and microscopically examined.         Figure  2.1:  Illustration  of  the  different  layers  of  the  colon  and  the  usage  for  the  specific  preparations.  31  Material and methods  2.4.4 The human colonic mucosa biopsies   For  the  experiments with  human mucosal  biopsies  two  groups  of  patients were  chosen:  patients  with  ulcerative  colitis  and  control  patients  without  inflammatory  disease.  The  ulcerative colitis group consisted of patients who underwent colonoscopy as a part of  the  clinical surveillance programme due to increased risk for development of colon cancer (Table  2.3). All patients except for two had no or few clinical symptoms and were considered to be  in remission, whereas two patients showed activity according to the Mayo score (Lewis et al.  2008).   The control group consisted of patients who underwent colonoscopy for other reasons such  as unspecific bleeding or altered bowel habits, but where the mucosa was macroscopically  normal  (Table 2.4). Thus,  these control patients were  ‘disease controls’, because  they had  intestinal  symptoms but no  inflammatory disease. The heterogeneity of  the control group  can be considered as a disadvantage; on the other hand  it also reduces the risk of an error  produced by a common disease denominator.      Ulcerative colitis patients  Gender  Age  Mayo score  Female  22  0  Male  75  0  Male  33  1  Male  47  0  Male  40  0  Male  35  2  Female  35  0  Male  32  0  Male  30  0  Table 2.3: Ulcerative colitis patients  32  Material and methods    Control patients  Gender  Age  Reason for colonoscopy  Female  33  Unspecific bleeding  Female  51  Constipation  Female  42  Unspecific bleeding  Female  69  Unspecific bleeding  Male  76  Loose stool containing  mucus  Female  65  Unspecific bleeding  Table 2.4: Control patients  The evening before colonoscopy,  the patients drank 4  l of an osmotic  laxative  (Laxabon®;  BioPhausia,  Stockholm,  Sweden)  in  order  to  clean  the  intestine.  Just  prior  to  the  colonoscopy,  the  patients  were  administered  a  premedication,  consisting  of  1  ‐  2  mg  midazolam  (Dormicum®;  Roche,  Basel,  Switzerland)  and  50 mg  petidin  (Petidin®; Meda,  Solna, Sweden). During the whole procedure the heart rate and peripheral oxygenation was  monitored with a pulse oxymeter. As part of the clinical diagnostics, up to 16 biopsies were  taken  from  the  caecum  to  the  rectum  according  to  the  surveillance  programme  and  histologically investigated by a pathologist. For the present study, seven biopsies were taken  from the sigmoid colon and directly placed into oxygenated, ice‐cold Krebs solution.   During the colonoscopy, the ulcerative colitis patient´s inflammatory state was evaluated by  the gastroenterologist performing the procedure according to the Mayo score (Lewis et al.  2008). In the histological investigation, patients with a Mayo score of zero showed a normal  or only  slightly altered  crypt architecture and a  slight  increase  in  infiltrating  immune  cells  (eosinophils, neutrophils and plasma  cells). The biopsies of patients with a Mayo‐score of  1 ‐ 2 had an acute inflammation with altered crypt architecture, infiltration of immune cells  and cryptitis or crypt abscesses.  33  Material and methods  2.5 Microelectrode arrays (MEAs)  2.5.1 Solutions for MEA measurements  Solution  Source  Purpose Concentration/supplements Hank´s balanced salt  solution (HBSS) with  Ca2+/Mg2+  Life  technologies,  Darmstadt  MEA measurements 20 mmol∙l‐1 HEPES  10.000 units∙ml‐1 penicillin   10 mg∙ml‐1 streptomycin   Tergazyme solution Sigma Aldrich,  Taufkirchen,  Germany  Enzymatic cleaning  of the MEAs  10 mg∙ml‐1 in deionized water  Table 2.5: Solutions for MEA measurements  2.5.2 A short history of the microelectrode arrays (MEAs)  A microelectrode array (MEA) is a device that allows the measurement of action potentials in  an extracellular manner from multiple cells at the same time. The first MEA was invented by  Thomas  in  1972  (Thomas  et  al.  1972)  and was  intended  to  overcome  the  limitations  of  single‐cell  techniques,  such  as  patch‐clamping  or  intracellular measurements  with  single  electrodes (for review see Pine 2006). The chance to measure potentials from multiple sites  and  from  a  network  of  cells  opened  the  possibility  to  examine  spatial  and  temporal  propagation of action potentials and the interaction between neurons.  In  the early years, electrodes were  fabricated of gold,  sometimes platinized  to  reduce  the  impedance.  Different  insulation materials were  used,  such  as  photoresist,  thermosetting  polymers  and  silicon  dioxide  (Pine  2006).  The MEAs  were  used  for  measuring  cultured  excitable cells,  in the beginning chick myocytes and  isolated snail ganglia,  later dorsal root  ganglia and neurons of  the  cervical ganglion  (Pine 1980; Droge et al. 1986; Maroto et al.  2005).  In  the eighties,  further possibilities  for application were explored,  including other  types of  neurons, but also  the measurement of  slices, especially hippocampal  slices and  the  retina  (Jobling  et  al.  1981;  Droge  et  al.  1986; Wheeler  &  Novak  1986).  The MEAs  enabled  to  measure the propagation of action potentials along a slice or – especially after light exposure  – along  the  retina. The  invention of FET  transistor‐coupled electrodes  (Jobling et al. 1981)  made it even possible to stimulate these slices or cultured cells electrically via one or more  34  Material and methods  electrodes.  Long‐term  recordings  performed  with  cultured  cells  as  well  as  slices  in  organotypic  culture  for a period of  several days  (Welsh et al. 1995; Thiebaud et al. 1997)  extended  the  knowledge  about  the  plasticity  of  neural  connections  over  time,  with  or  without  repeated  stimulations.  Chien  and  Pine  (Chien &  Pine  1991)  combined  the MEA‐ technique with voltage‐sensitive dyes in order to measure not only action potentials but also  to investigate subthreshold potentials.   Starting in the nineties, a lot of effort was done to control the growth of neurons on the chip  and thus create artificial networks of neurons. Different kinds of coatings were applied and  three‐dimensional MEAs were built, with holes and tunnels  for the axons and dendrites to  grow into (Maher et al. 1999; Tooker et al. 2004; Marconi et al. 2012).  During the last decade, various types of MEAs were invented that allow using this technique  for  a  lot of  different  applications. Among  these,  there  are  special  thin MEAs  that  can be  examined with  high‐power  objectives,  high‐density MEAs with  265  electrodes  for  precise  measurements of conduction velocity or synaptic delays, or perforated MEAs used for slices,  that  allow  applying  a negative pressure  from below,  and  thus  fixing  the  slice  in  the  right  position.   2.5.3 The principle of MEA measurements  Excitable  cells  are  characterised  by  the  ability  of  depolarisation  induced  by  changes  in  membrane currents. The opening of  ion channels, which  is  tantamount  to  the  lowering of  the  membrane´s  resistance,  results  in  a  change  in  membrane  potential  which  can  be  measured by  intracellular  recordings. But  the extracellular  space has a  resistance as well,  and thus is conductive. Consequently, an action potential also leads to a change of voltage in  the  extracellular  space.  Although  this  change  is  very  low  compared  to  the  intracellular  voltage, it is still measureable and this can be performed with MEAs (Figure 2.2).   Well‐established  intracellular recording techniques, such as two‐electrode voltage‐clamp or  –  depending  on  the  configuration  ‐  patch‐clamping  enable  the  investigation  of  this  depolarisation in detail. However, there is a disadvantage of these techniques: since it is only  possible to investigate one cell at a time, the neuronal interactions cannot be examined in a  sufficient way.  To  some  extend  this  can  be  compensated  by  the  use  of  voltage‐sensitive  dyes.  These dyes  shift  their  spectral properties when being excited  and  thus  indicate  the  depolarisation  of  a  cell.  It  is  possible  to  measure  many  cells  at  the  same  time,  but  35  Material and methods  unfortunately  these dyes have  cytotoxic properties,  so  that  the  experimenter only  gets  a  short peek in a range of seconds or minutes until the cell dies.  These  handicaps  can  be  overcome by microelectrode  arrays. Because  of  the  extracellular  measurement with multiple electrodes, it is possible to receive information from many cells  at  the same  time and –  in contrast  to voltage‐sensitive dyes – over a  long period of  time.  Measurements can be performed  for minutes and hours and even  for days  if  the cells are  kept at constant pH and temperature conditions. Another advantage is the fact that the cells  are cultured directly on the MEA: it is possible to measure the cells repetitively, which saves  material and time.   Naturally, MEAs also have certain disadvantages.  It  is not possible to have a close view on  the  development  of  an  action  potential.  The  involvement  of  certain  channels  or  sub‐ threshold  potentials  cannot  be  investigated.  This  purpose  is  served  better  with  other  electrophysiological techniques.   In  intracellular measurements the amplitude of signals  is usually  in a mV‐range. The signal  detected with  a MEA  is  1000‐times  smaller  (µV‐range).  The  detection  of  this  small  signal  requires a strong amplification and a minimal signal‐to‐noise ratio. The amplifier used in this  study  is  the MEA1060  filter amplifier  (Multichannel Systems, Reutlingen, Germany), which  uses the SMD (Surface Mounted Devices) technology. It is very small and compact and does  not only represent the interface with the MEA‐probe, but also filters and amplifies the signal  (Figure  2.3).  The  obtained  data  is  transferred  to  the  computer,  digitized  by  MC  Card  (Multichannel Systems) and can be displayed and analysed by the software programme MC  Rack (Multichannel Systems).  The MEA‐amplifier  has  a  broad  bandwidth  ranging  from  0.1  Hz  to  10  kHz.  In  order  to  enhance the signal‐to‐noise ratio, the recorded raw data can be filtered with MC Rack. In this  study this was performed with a high‐pass filter of 20 Hz. The gain of the amplifier  is 1100  and is a fixed hardware property, meaning it cannot be changed by software controls.   The distance between the electrode and the cell is an important factor for the signal shape.  The closer the cell is located to the electrode the stronger the signal. The maximal distance  varies among the different cell types (Morin et al. 2005). Typically, the cell giving the signal is  located in a radius of 30 µm around the electrode (User manual MEA, Multichannel Systems,  Reutlingen, Germany).  36  Material and methods  Figure 2.2: Simplified circuit diagram of a MEA‐setup with an excitable cell  Vintra:  intracellular  potential;  Vextra:  extracellular  potential;  Rseal:  sealing  resistance;  Relec  and  Celec  resistance and capacitance of the recording electrode; Rref and Cref resistance and capacitance of the  reference electrode Zinput: input impedance of the amplifier; Rcell and Ccell resistance and capacitance  of the cell membrane.  Modified from Morin et al. 2005.       37  Material and methods    Figure 2.3: Illustration of a MEA‐setup    2.5.4 The standard microelectrode array  The  standard  MEA  used  in  this  study  is  a  glass  chip  with  60  electrodes  (Multichannel  Systems, Reutlingen, Germany; Figure 2.4). The electrodes are fabricated of titanium nitride  (TiN), which  is  an extremely hard  and  stable material.  It  forms  a microfold  structure  that  increases the surface area and improves the signal‐to‐noise ratio. The electrodes have a flat  and round shape and are embedded  into the glass chip (Figure 2.5). The  impedance ranges  from 20 to 400 k. The electrodes are connected to the contact pads via tracks, which are  also fabricated of titanium nitride and are insulated with silicon nitride (Si3N4). These contact  pads represent the connection between the MEA and the amplifier.  The  electrodes  have  a  diameter  of  30  µm  and  are  aligned  in  an  8  x  8  grid  with  an  interelectrode  distance  of  200  µm.  For  grounding  the  bathing  solution,  the  MEAs  are  equipped with an internal reference electrode.      38  Material and methods    Figure 2.4 A: Image of a standard MEA‐chip.  B: Microscopic picture of the measuring area of a MEA.  Shown are 48 of the 60 electrodes and myenteric ganglionic cells cultured on the MEA for 2 days.    Figure 2.5: Schematic picture of a MEA‐chip.  Exemplarily  shown  are  one  of  the  60  recording  electrodes  (right  side)  and  the  internal  reference  electrode (left side).    39  Material and methods  2.5.5 The procedure of MEA measurements  Prior to the preparation, the MEAs were coated with 10 µl poly‐L‐lysin solution, which was  left  for evaporation. After  this, 10 µl of  laminin solution was pipetted onto  the measuring  area of the MEA and left there for 30 minutes, then it was removed (as described by Medert  et al. 2013).  After the preparation, the cells were cultured for at least 12 hours. For measuring the MEAs,  they were placed onto  the microscopic  stage and  the amplifier plate was  fixed on  it. The  reference  electrode  was  chosen  (usually  number  15)  and  the  setting  information  was  downloaded  to  the amplifier using  the software MEA Select  (Multichannel Systems). After  this, the programme MC Rack was opened and the traces of the electrodes were displayed.  In case  there was  spontaneous activity  in at  least one electrode,  the culture medium was  replaced with the HBSS solution (see Table 2.5) using a pipette. This had to be done carefully  to prevent a loosening of the cells. After waiting three to four minutes, the excitation level,  which had been raised by the change of the medium, had returned to  its former  level and  the  recording was  started.  If  the MEA  showed no  spontaneously active electrodes,  it was  placed back into the incubator for further culture and measured again the next day.  After starting  the experiment,  the baseline was measured  for  three  to  four minutes. Then  the  substance was carefully and  softly administered using a pipette, without  touching  the  MEA or the amplifier. Experiments with different forms of perfusion systems did not turn out  to be successful because the increase in noise produced by the perfusion pump masked the  small signals of the neurons.  In general, myenteric neurons seem to produce rather small amplitudes of action potentials  compared  to other neuronal  cell  types. The maximal  signal  size was around  ‐40 µV, most  signals only reached values of ‐15 to ‐20 µV. Thus it was essential to hold the noise level as  low as possible (± 10 µV). After the administration of bradykinin, the response was measured  for 12 minutes. The application of antagonists was carried out one minute before bradykinin  was added.   After  the  experiments,  the  cells were washed with HBSS  in  order  to  remove  the  applied  drugs.  They were  covered with Neurobasal medium  and  placed  back  into  the  incubator.  After two to three hours, the cells had recovered and could be measured again. One MEA  was used maximally three times per day.   40  Material and methods  For cleaning, the MEAs were  incubated with the enzymatic solution Tergazyme  (Table 2.5)  overnight at room temperature.  2.5.6 Analysis of the MEA experiments  The obtained data was filtered and analysed with MC Rack. A high‐pass filter of 20 Hz was  applied  in order  to remove baseline  fluctuations  that might disturb  the analysis. The spike  rate was measured by counting those spikes passing a certain threshold. Due to differences  among the MEAs, the threshold was set  individually for each experiment. Depending  if the  electrode showed a negative or a positive spiking, the threshold was set 10 µV underneath  or above the lowest/highest value of the noise. Although in an extracellular measurement of  action  potentials,  the  spike  usually  is  negative,  it  is  possible  that  the  electrodes  show  positive  spiking  if  the  cell(s)  giving  the  signal  is  (are)  covering  the  recording  electrode  completely causing an ‘pseudo‐intracellular’ measurement.   The  baseline  was  measured  just  prior  to  the  administration  of  the  substance.  The  measurement of the response started 10 s after the administration, in order to exclude the  detection of the artefact induced by the pipette.   The spike rate was measured in intervals with duration of 30 seconds in order to depict the  course of  the  change  in  frequency  induced by  the  substance. Only  those electrodes were  analysed that either were spontaneously active or started to show action potentials later on.  A few electrodes showed a much higher spiking rate than the others. These were defined as  outliers and no longer considered for analysis, if the spike rates were higher than the 4‐fold  standard deviation of  the other electrodes. Results were presented as means ±  SEM of n  active electrodes.    41  Material and methods  2.5.7 Waveform analysis  In order  to distinguish  signals  from different neurons measured by  the  same electrode, a  waveform analysis was performed using the spike sorting function of MCRack. One electrode  is able to measure several cells in its surrounding area with each cell having another distance  from  the  electrode.  This  difference  in  distance  is  reflected  by  different  spike waveforms.  With the waveform analysis up to three different units per electrode can be separated from  each other and are considered as different neurons (Leibig et al. 2012). After administration  of bradykinin,  the percentage of  responding neurons  in  relation  to all active neurons was  calculated. All neurons with an  increase  in  frequency of action potentials higher  than  the  absolute value of 0.3 Hz in response to bradykinin were defined as ‘responding’.    Figure 2.6: A: Representative  tracing of  firing activity of one MEA‐electrode with different  spike  shapes being assigned to three different units (unit 1: red, unit 2: yellow, unit 3: purple).   B: Wave form analysis of the tracing seen in A.   Overlay of 50 spikes exceeding  the  threshold  (‐11 µV  for  this experiment). The vertical bars assign  every spike to a certain unit depending on their amplitude and time line.  42  Material and methods  2.6 Immunofluorescence analysis  2.6.1 Solutions for immunocytochemistry (ICC) and immunohistochemistry (IHC)  Solution  Purpose  Concentration/supplements  Phosphate buffer (PB)  IHC;  Rinsing of the tissue  80 Na2HPO4, 20 NaH2PO4 (in mmol∙l‐1); pH 7.4 (adjusted with NaOH/HCl)  Phosphate buffered  saline (PBS)  ICC;  Rinsing of the cells  10 sodium phosphate buffer, 120 NaCl  and 2.7 KCl (in mmol∙l‐1); pH 7.4  PBS Triton‐X (PBS‐T) ICC;  Rinsing of the cells  0.05 % (v/v) Triton‐X in PBS  Paraformaldehyde  (PFA)  Fixation of cells and tissue 4% (w/v) PFA in PB  Heated to 55°C during permanent  stirring; after complete dissolving of  the PFA, the solution was filtered and  placed on ice  Blocking and antibody  solution for ICC  Blocking of unspecific  binding sites;  dissolving of antibodies  10 % (v/v) donkey/goat serum  dissolved in PBS‐T  Blocking solution IHC  Blocking of unspecific  binding sites  0.2 % (v/v) Triton‐X, 1 % (w/v) bovine  serum albumin (BSA), 0.5 % (w/v) milk  powder, 1 % (v/v) donkey/goat serum  dissolved in PB  Antibody solution IHC  Dissolving of antibodies 0.2 % (v/v) Triton‐X, 1 % (w/v) BSA,  0.5 % (w/v) milk powder, 1 %  donkey/goat serum, dissolved in PB  DAPI solution  Nuclear staining 300 nmol∙l‐1; dissolved in PB.  Gelatin solution 1  Coating of the glass slides 5 g∙l‐1 aqua dest.; the solution was heated and mixed with 0.5 g∙l‐1  chromkaliumsulfate at 54°C, then  filtered  Gelatin solution 2  Embedding of the tissue 18 g dissolved in 180 ml aqua dest.; the  solution was heated to 37°C and  filtered  Kresyl‐violet  Inspection of the section  plane (cryosections)  1 g∙l‐1 kresyl‐violet acetate was  dissolved in aqua dest. under stirring  and warming; the solution was cooled  down and 2.5 ml∙l‐1 glacial acetic acid  was added; then filtered  Table 2.6: List of solutions used for immunofluorescence analysis    43  Material and methods  2.6.2 The principle of immunofluorescence analysis  The principle of the immunofluorescence analysis is based on the interaction of the epitopes  of  a  certain  antigen  with  the  paratopes  of  specific  antibodies.  This  interaction  can  be  visualised with  the  aid  of  fluorescent markers,  opening  the  possibility  to  investigate  the  presence and distribution of certain structures in tissue and cultured cells.  Most of the antibodies used are IgGs, either monoclonal or polyclonal. Polyclonal antibodies  are obtained from immunised animals, meaning that they are produced by various different  B‐cells. Consequently, these antibodies bind to different epitopes of the same antigen, which  results  in  a  good  sensitivity  of  these  polyclonal  antibodies.  But  at  the  same  time,  they  sometimes produce unspecific background staining due to the lower specificity. In contrast,  monoclonal antibodies are produced  in vitro  from a B‐cell  line, which has  its origin  in one  specific B‐cell. Thus the specificity of monoclonal antibodies is higher compared to polyclonal  antibodies.  The antibodies  consist of  two antigen‐binding  regions,  the Fab  (fragment antigen binding),  and a crystallisable region,  the Fc  (Figure 2.7). The Fab region binds specifically  to a certain  antigen,  creating  an  antigen‐antibody‐complex,  which  is  held  together  by multiple  non‐ covalent bindings (Harlow and Lane 1988). The antigen‐antibody complex  is visualised by a  secondary antibody carrying a fluorescent dye, called fluorochrome. It binds to the primary  antibody and can be investigated using a fluorescent microscope (Coons 1958).  Due to the availability of different secondary antibodies,  it  is possible to detect more than  one  antigen.  These  double  stainings  give  a  clue  about  the  localisation  and morphological  relation of different proteins. For  these stainings,  it  is  important  to pay attention  that  the  origin species of both primary antibodies differs, as well as the colour of the fluorochrome  carried by the secondary antibodies. In this study double stainings were performed in order  to investigate a possible co‐localisation of the bradykinin receptors with neuronal markers.   44  Material and methods  2.6.3 Immunohistochemistry versus immunocytochemistry  Different  protocols were  used  for  the  study  of  tissues  by  immunohistochemistry  (IHC)  or  isolated cells by immunocytochemistry (ICC) (see 2.6.5). Firstly, the thickness of the tissue in  the  IHC  compared  to  cells  requires an extended  fixation‐period with PFA  (12 hours vs. 15  minutes). Secondly, in the IHC the solutions need to have a higher penetrability than in the  ICC. That is why the amount of Triton‐X, a non‐ionic surfactant, is higher in the IHC‐solutions  compared  to  that of  the  ICC. And  thirdly, due  to  the various different  cells  types  in most  sections  compared  to  one  or  two  cell  types  in most  cell  cultures,  the  risk  of  unspecific  background staining  is much higher  in the IHC. This  is  improved by the addition of BSA and  milk powder, which coats all proteins in the sample and forces the antibody to compete for  the specific antigen.  In this study, both the  IHC and the  ICC were performed, the first with  cryosections of the whole colon and the  latter with cultured myenteric ganglionic cells and  with dissociated intestinal muscle cells.  45  Material and methods      Figure 2.7: Principle of the double staining by  indirect  immunofluorescence using the example of  the bradykinin B2 receptor located on a myenteric neuron.   The  primary  antibodies  bind with  their  Fab  region  to  the  epitopes  of  the  neuron‐specific  antigen  PGP9.5  and  the  bradykinin  B2‐receptor  antigen,  respectively.  The  secondary  antibodies  carrying  a  fluorochrom bind  to  the Fc region of  the primary antibodies. The antigen‐antibody‐complex can be  detected using a fluorescence microscope.  If performing double stainings,  it  is  important to ensure  that the different primary antibodies do originate from different host species and that the secondary  antibodies carry fluorochroms with different colours.    46  Material and methods  2.6.4 Used antibodies  2.6.4.1 Primary antibodies  Primary  antibody  Target structure  Host species  Dilution  Manufacturer  Anti bradykinin  B1 receptor  Bradykinin B1  receptor  Goat  1:50  Santa Cruz,  Heidelberg, Germany  Anti bradykinin  B2 receptor  Bradykinin B2  receptor  Mouse  1:200  Becton Dickinson,  Heidelberg, Germany  Anti bradykinin  B2 receptor  Bradykinin B2  receptor  Rabbit  1:20  Santa Cruz  Heidelberg, Germany  Anti‐PGP 9.5  Neurons  Rabbit  1:500  Millipore. Temecula, Canada  Anti‐MAP2  Neurons  Mouse  1:250  Sigma‐Aldrich,  Taufkirchen, Germany  Anti‐MAP2  Neurons  Rabbit  1:250  Sigma‐Aldrich,  Taufkirchen, Germany  Table 2.7: List of primary antibodies  2.6.4.2 Secondary antibodies  Primary  antibody  Target structure  Colour  Dilution  Manufacturer  Alexa‐488  donkey anti  goat  Primary antibodies  from the goat  Green  1:500  Invitrogen,  Karlsruhe, Germany  Alexa‐488 goat  anti mouse  Primary antibodies  from the mouse  Green  1:500  Invitrogen,  Karlsruhe, Germany  Cy3 donkey anti  rabbit  Primary antibodies  from the rabbit  Red  1:800  Dianova, Hamburg,  Germany  Cy3 goat anti  mouse  Primary antibodies  from the mouse  Red  1:800  Dianova, Hamburg,  Germany  Table 2.8: List of secondary antibodies  47  Material and methods  2.6.5 The procedure of the immunohistochemistry (IHC) and immunocytochemistry (ICC)  2.6.5.1 Fixation with paraformaldehyde (PFA)  For the purpose of conservation, the tissue was fixed in 4 % (w/v) PFA. This solution leads to  a cross‐linkage of tissue proteins and thus preserves cellular structures.  IHC: the colon was prepared as described in 2.4.3, but without stripping off the muscle layer.  Then the colon was cut  into pieces with a size of about 1.5 x 3 cm and glued to an acrylic  glass‐holder with cyanoacrylate adhesive. It was taken care that the tissue fully covered the  hole of the holder (Figure 2.8) (Schultheiss et al. 2002a). The holder with the tissue was kept  in  the PFA‐solution  for 12 hours at 4°C. After  this  incubation period,  the  tissue was rinsed  with PB three times for five minutes.  ICC:  after  the  preparation  and  culture  period  (2.4.2),  the medium  was  removed  with  a  pipette. The glass slips with the myenteric ganglionic cells were transferred to a 4‐well‐plate,  whereas the glass slips with the muscle cells were  left  in their 4‐well‐plate. The cells were  rinsed  with  PBS  and  then  500  µl  of  PFA  was  pipetted  into  each  chamber.  They  were  incubated  on  ice  for  15 minutes.  Then  the  PFA was  removed  and  the  cells were washed  three times for five minutes with 500 µl PBS. In contrary to the IHC, the washing steps were  not carried out on a shaker in order to prevent the cells from getting loose.     Figure 2.8: Illustration of the acrylic glass holder used for IHC.  2.6.5.2 Cryofixation (IHC)  The cryofixation was performed merely with the tissue  for the  IHC. After  fixation with PFA  and  rinsing  (2.6.5.1),  the  holder  with  the  colon  tissue  was  embedded  in  a  glass  dish  containing  liquid gelatine  (2.6.1).  It was  taken care  that  the holder was  fully covered with  48  Material and methods  gelatine,  with  a  0.5  cm  gelatine  layer  underneath  and  above  the  tissue.  After  the  solidification of the gelatine, the glass dish was placed on  ice and the gelatine‐tissue block  was  removed  by  cutting  along  the  oval  opening  of  the  holder with  a  sharp  scalpel.  The  removed tissue block was glued on a piece of cork with the embedding medium Tissue Tec®  (Leica  Instruments,  Nussloch,  Deutschland)  and  dunked  for  two minutes  into  isopentan,  which has been cooled down with the aid of  liquid nitrogen (temperature  liquid nitrogen: ‐ 160  °C;  temperature  isopentan:  ca.  ‐80  °C).  The  tissue  blocks were  stored  at  ‐70  °C  until  further use.  2.6.5.3 Cryosections (IHC)  For  the  IHC,  the  tissue‐gelatine‐blocks were  cryosectioned  in  a  cryostat with  a  chamber‐ temperature  of  ‐18  °C  (Leica  CM  3050S;  Leica  Instruments,  Nussloch,  Deutschland).  The  frozen tissue‐gelatine blocks were glued onto a movable holder with Tissue Tec® and cut into  sections with  a  thickness of 4 µm. The  sections were placed on  the gelatine‐coated  glass  slides.  In order  to confirm  the  section plane,  the  first  sections were  stained with a kresyl‐ violet  solution  for one minute and  investigated under a microscope.  If  the  sections plane  turned out to be correct, more sections were produced and kept in the cooled chamber until  further use.   2.6.5.4 Procedure of IHC  The  cryosections were  produced  as  described  in  2.6.5.3.  After  this,  the  glass  slides were  transferred  to  a  slide  rack  and  placed  into  a  plastic  cuvette  filled  with  200  ml  PB  for  rehydration. The cuvette was placed on a shaker for five minutes. This process was repeated  with fresh PB two more times.  The next  step was  the blocking of unspecific binding  sites, which was performed with  the  blocking  solution  as  described  in  2.6.1.  The  serum  in  the  blocking  solution  contained  antibodies  binding  to  reactive  sites  and  preventing  the  secondary  antibody  to  bind  unspecifically.  The  serum  should  come  from  the  very  species,  from which  the  secondary  antibody originated.  For the blocking step, the slides were placed upside down on an acrylic glass plate with two  stripes of adhesive tapes serving as spacers. The short endings of the slides were placed on  the  tapes  in order  to get a capillary gap between  the section and  the plate. 200 µl of  the  49  Material and methods  blocking  solution was  pipetted  into  this  gap,  and  via  capillary  force  the  solution  spread  underneath the whole slide. The slides were then incubated at room temperature in a metal  chamber laid out with moist paper tissue for 1 hour. After this, the slides were transferred to  a fresh acrylic glass plate, and the primary antibody was pipetted underneath the slides with  the same technique. The metal chamber was incubated at 4 °C for 12 hours. Then the slides  were transferred to a slide rack and washed in PB as described in the rehydration step. The  secondary  antibody was  applied  in  the  same manner  as  the  primary  antibody, with  the  difference that this antibody had to be protected from  light  in order to prevent a fading of  the  fluorescent  colour.  All  the  following  steps were  performed  in  the  dark  as well.  The  incubation with the secondary antibody was carried out  in a moist metal chamber  for two  hours at room temperature.  Then  the slides were rinsed  three times with PB again, and  the nuclear staining with DAPI  was  performed,  which  is  important  for  a  better  orientation  in  the  tissue  during  the  microscopic examination. DAPI intercalates mostly in adenosine‐ and thymine‐rich regions of  the DNA double helix and marks  the nuclei of cells with a blue  fluorescence  if  stimulated  with  ultraviolet  light  (Tanious  et  al.  1992).  For  this  staining,  the  rack with  the  slides was  transferred  into a cuvette filled with DAPI and placed onto a shaker for five minutes. Then  the slides were rinsed three times with PB again.  The  last  step was  the  covering  of  the  slides.  This was  performed  by  placing  one  drop  of  Hydromount® (National diagnostics, Atlanta, Georgia, USA) on each section and covering  it  with a glass slip. The slip was fixed on the slide with a drop of clear nail polish and  left for  drying.   2.6.5.5 Procedure of ICC  After the fixation with PFA and the washing step described in 2.6.5.1, the unspecific binding  sites were blocked. For this purpose, 500 µl of the blocking solution was pipetted  into the  wells and the plate was placed into a moist metal chamber for one hour. The administration  of  the  antibodies  and  the washing  steps were  comparable  to  those  of  the  IHC, with  the  difference that the solutions had a different composition  (Table 2.6), and that all solutions  were pipetted directly into the wells.  50  Material and methods  In the end, the coverslips were removed from the wells, placed upside down on a glass slide,  which was equipped with a drop of Hydromount, and  fixed with a small drop of clear nail  polish.   2.6.5.6 Negative controls  In the  IHC as well as  in the  ICC, negative controls were  important to control the success of  the  immunofluorescent  staining.  For  this  purpose,  for  each  slide  a  control  slide  was  prepared,  which  was  treated  in  exactly  the  same  manner  with  the  difference  that  the  primary  antibody  was  omitted.  These  negative  controls  should  show  no  signal,  when  stimulated with  the  same wave  length  and  exposure  time,  in  order  to  confirm  that  the  secondary antibody did not bind unspecifically. If there was a signal in the negative control,  the IHC or ICC was discarded and repeated.  2.6.5.7 Microscoscopy  The  analysis  of  the  immunofluorescent  staining  was  carried  out  with  an  Eclipse  80i  microscope  (Nikon,  Düsselsdorf,  Germany).  The  fluorochromes  were  stimulated  with  changeable light filters: the Cy3‐fluorochromes were stimulated with a wave length of 510 ‐  530 nm and emitted  light at a wave  length of 630  ‐ 660 nm. The Alexa‐488‐fluorochromes  were stimulated with 450 ‐ 490 nm and emitted at 510 ‐ 530 nm. The nuclear staining DAPI  was stimulated with 348 nm and emitted at 461 nm. The pictures were taken with a black  and white  camera  (S/W  camera  Digital  Slight  DS  2 M  BWc,  Nikon). With  the  aid  of  the  software programme NIS‐elements 2.30 (Nikon), the pictu