Alters-abhängige, kardiale Adaptation an Diät-induzierte Lipidüberlast in Wildtyp-Mäusen Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Humanbiologie des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen vorgelegt von Aurich, Anne-Cathleen aus Karl-Marx-Stadt (jetzt Chemnitz) Gießen 2015 Aus dem Physiologischen Institut des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Giessen Gutachter: Frau Prof. Dr. med. Susanne Rohrbach Gutachter: PD Dr. med. Thomas Karrasch Tag der Disputation: 26.07.2016 Inhaltsverzeichnis i 1 Inhaltsverzeichnis 1 Inhaltsverzeichnis ............................................................................................ i 2 Einleitung ........................................................................................................ 1 2.1 Mitochondrien ........................................................................................................ 2 2.2 Herzstoffwechsel ................................................................................................... 4 2.2.1 Der Herzstoffwechsel und seine Substrate .......................................................... 4 2.2.2 Die Regulation des Herzstoffwechsels ................................................................. 6 2.2.3 Der veränderte Herzstoffwechsel ......................................................................... 7 2.2.4 Tiermodelle ........................................................................................................... 9 2.3 Herzinsuffizienz ................................................................................................... 10 2.4 Altersherz (Charakteristika) ............................................................................... 11 2.4.1 Veränderung an Myozyten ................................................................................. 12 2.4.2 Stoffwechsel ....................................................................................................... 13 2.5 Zielstellung der Arbeit ........................................................................................ 14 3 Material und Methoden ................................................................................. 17 3.1 Material ................................................................................................................. 17 3.1.1 Chemikalien allgemein ....................................................................................... 17 3.1.2 Chemikalien Zellkultur ........................................................................................ 19 3.1.3 Testsubstanzen / Fettesäuren ............................................................................ 19 3.1.4 Molekulargewichtsmarker .................................................................................. 19 3.1.5 Enzyme .............................................................................................................. 20 3.1.6 Kits / Färbereagenzien / sonstiges ..................................................................... 20 3.1.7 Geräte ................................................................................................................ 21 3.2 Molekularbiologische Methoden ....................................................................... 22 3.2.1 Isolation von RNA aus Gewebe und Zellen ....................................................... 22 3.2.1.1 Gewebe ........................................................................................................... 22 3.2.1.2 Zellen ............................................................................................................... 22 3.2.2 cDNA Synthese (Reverse Transkription – RT-PCR) ......................................... 22 3.2.3 Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction – PCR) ...................... 23 3.2.4 Klonierung von DNA ........................................................................................... 25 3.2.4.1 Klonierung alpha2AMPK ................................................................................. 25 3.2.5 Vektoren ............................................................................................................. 26 3.2.5.1 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli Zellen ......................................... 26 3.2.5.2 Sequenzierung doppelsträngiger DNA ............................................................ 27 3.2.5.3 Präparation von Plasmid-DNA (DNA-Minipräparation / Midipräparation) ....... 27 3.2.6 Isolation von Proteinen aus Gewebe ................................................................. 28 3.2.6.1 Gewebe ........................................................................................................... 28 3.2.6.2 Zellen ............................................................................................................... 29 3.2.7 Proteinanalyse .................................................................................................... 29 3.2.7.1 SDS-Polyacrylamid-Gelektrophoreses (SDS-PAGE) ..................................... 29 3.2.7.2 Western-Blotting und Antikörperfärbung ......................................................... 30 3.2.8 Bestimmung von Fettsäure- und Triglycerid-Gehalt .......................................... 31 3.2.9 Bestimmung des Serumgehaltes von Adiponektin, Leptin und Insulin .............. 32 3.2.9.1 Adiponektin-ELISA .......................................................................................... 32 3.2.9.2 Insulin-ELISA ................................................................................................... 32 3.2.9.3 Leptin-ELISA ................................................................................................... 32 3.3 Tiermodell im Versuch ........................................................................................ 32 3.3.1 Mausstamm ........................................................................................................ 33 3.3.2 Einfluss fettreicher Nahrung ............................................................................... 33 3.3.3 Untersuchung der kardialen Funktion mittels transthorakaler Echokardiographie ............................................................................................................................ 34 3.3.3.1 Methoden der Echokardiographie ................................................................... 34 3.3.4 Histologie ............................................................................................................ 36 Inhaltsverzeichnis ii 3.3.4.1 Färbung von Fetteinlagerungen im Herzgewebe ............................................ 36 3.3.4.2 Zellmembran-Färbung von Kardiomyozyten mit Lectin .................................. 37 3.3.4.3 Kollagen-Färbung von Kardiomyozyten mit Sirusrot nach Puchtler ............... 37 3.3.5 Messung der Aktivität der Mittelketten-Acyl-CoA-Dehydrogenase (Medium Chain Acyl CoA Dehydrogenase – MCAD) ........................................................ 37 3.4 Zellkultur .............................................................................................................. 38 3.4.1 Zelllinien ............................................................................................................. 38 3.4.2 Kultivierung und Passagieren der Zellinien ........................................................ 38 3.4.3 Transfektion von HEK 293 und TRex HeLa ....................................................... 38 3.4.4 Behandlung von HEK 293 und TRex HeLa mit Fettsäuren ............................... 39 3.5 Statistische Auswertungen ................................................................................ 39 4 Ergebnisse .................................................................................................... 40 4.1 Einfluss Fütterung fettreicher Nahrung auf Körper- und Organgewicht ....... 40 4.2 Nachweis der Triglyceride und freien Fettsäuren ............................................ 44 4.3 Charakterisierung der ventrikulären Funktion ................................................. 47 4.3.1 Bestimmung der zellulären Hypertrophie (cross sectional area) ....................... 52 4.4 Stoffwechselanalyse ........................................................................................... 53 4.4.1 Peroxisome-proliferator-activated receptor  (PPARalpha) – Target-Gene ...... 54 4.4.1.1 Acyl-CoA-Thioesterasen ................................................................................. 56 4.4.1.2 Schlüsselenzyme des Fettstoffwechsels......................................................... 57 4.4.1.3 Ergebnisse der MCAD-Aktivität-Messung ....................................................... 58 4.4.1.4 Stearoyl-CoA-Desaturase ............................................................................... 58 4.4.2 Adiponektin-vermittelte AMPK-Aktivierung ........................................................ 59 4.4.2.1 Untersuchung des Serums .............................................................................. 59 4.4.2.2 Expressionsanalysen von Adiponektin im Fettgewebe ................................... 61 4.4.2.3 Adiponektin-Rezeptoren .................................................................................. 61 4.4.2.4 Expression der Adiponektinparaloge C1q/TNFa-related proteins (CTRP) ..... 62 4.4.2.5 Expressionsanalysen von AMP-aktivierter Protein-Kinase (AMPK) ............... 63 4.4.2.6 Charakterisierung des Aktivierungszustandes der AMPK .............................. 64 4.4.3 Mitochondriale Funktion und Biogenese ............................................................ 65 4.4.3.1 Expressionsanalysen Atmungskettenkomplexe .............................................. 66 4.5 Fettsäurebehandlung von HEK293 Zellen ........................................................ 69 4.5.1 Fettsäure-Behandlung untransfizierter HEK293-Zellen ..................................... 70 4.5.1.1 Behandlung untransfizierter Zellen mit Palmitat ............................................. 70 4.5.1.2 Behandlung untransfizierter Zellen mit Oleat .................................................. 70 4.5.1.3 Behandlung untransfizierter Zellen mit DHA ................................................... 71 4.5.2 Fettsäure-Behandlung transfizierter (a2AMPK-überexprimierender)- HEK293- Zellen .................................................................................................................. 72 4.5.2.1 Behandlung transfizierter Zellen mit Palmitat ................................................. 72 4.5.2.2 Behandlung transfizierter Zellen mit Oleat ...................................................... 73 4.5.2.3 Behandlung transfizierter Zellen mit einer Kombination von Oleat und Palmitat ......................................................................................................................... 74 5 Diskussion ..................................................................................................... 76 5.1 Tierversuch .......................................................................................................... 77 5.1.1 Einfluss Fütterung fettreicher Nahrung auf Körper- und Organgewicht ............. 77 5.1.1.1 Körper- und Organgewichte ............................................................................ 77 5.1.1.2 Lipideinlagerung und Analyse der Serum-Triglycerid- und Fettsäurespiegel . 78 5.1.2 Charakterisierung der ventrikulären Funktion .................................................... 79 5.1.3 Stoffwechselanalyse........................................................................................... 81 5.1.3.1 PPARalpha und seine Target-Gene ................................................................ 81 5.1.3.2 ACO, ACC2 und MCAD – Schlüsselenzyme des Fettstoffwechsels .............. 83 5.1.3.3 SCD1, SCD4 ................................................................................................... 84 5.1.4 Adiponektin-vermittelte AMPK-Aktivierung ........................................................ 85 5.1.4.1 Expressionsanalysen und Charakterisierung der Aktivierungszustandes der AMPK .............................................................................................................. 88 Inhaltsverzeichnis iii 5.1.5 Mitochondriale Biogenese und Funktion ............................................................ 89 5.2 Zellversuche ........................................................................................................ 90 5.3 Schlussfolgerung ................................................................................................ 93 6 Zusammenfassung ....................................................................................... 95 7 Summary ....................................................................................................... 96 8 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................ 97 9 Abbildungsverzeichnis ............................................................................... 100 10 Tabellenverzeichnis .................................................................................... 102 11 Literaturverzeichnis .................................................................................... 103 12 Anhang ........................................................................................................ 115 12.1 Diäten................................................................................................................ 116 12.1.1 Low Fat Diät und High Fat Diät ...................................................................... 116 12.1.2 Kontroll-Diät .................................................................................................... 117 12.2 Publikationen ................................................................................................... 118 12.3 Abstract ............................................................................................................ 118 12.4 Erklärung .......................................................................................................... 119 12.5 Danksagung ..................................................................................................... 120 Einleitung 1 2 Einleitung Alterung. Wie genau definiert man diesen Begriff? Man findet verschiedenste Formulierungen und doch gibt es keine allgemein verbindliche Definition in der wissenschaftlichen Literatur. Alle Aussagen zu diesem Thema vereinen und zeigen, dass das Altern ein individueller Vorgang ist, der den verschiedensten biologischen Prozessen und Regulationen unterliegt. Das biologische Alter des Menschen ist primär genetisch verankert und wird auf maximal 130 Jahre geschätzt. Sekundäre Faktoren, wie z. B. Umwelt, Ernährung, Lebenstil, Aktivität und Krankheiten, wirken zudem auf diesen biologischen Prozess. Sehr gut analysiert am Alterungsprozess sind der Einfluss und die Wirkung freier Radikale (ROS) im Organismus, die beständig während des Stoffwechsels gebildet werden und eine stetig ansteigende Konzentration mit zunehmendem Alter aufweisen. Die sogenannte „Theorie der freien Radikale“ wurde im Laufe der Zeit verfeinert, da es sich herausstellte, dass Mitochondrien gleichzeitig Quelle und Wirkungsort der ROS darstellen (Meissner 2007). Die gebildeten reaktiven Sauerstoffspezies führen zu Schädigungen an DNA, Proteinen, Kohlenhydraten oder Membranlipiden was starke funktionelle Veränderungen zur Folge hat. Verschiedenste Reparaturmechanismen in der Zelle sind ständig im Einsatz, um den entstehenden Schaden an den Zellen so gering wie möglich zu halten. Dennoch kann man mit zunehmendem Alter in den „Kraftwerken“ der Zelle des Organismus einen Anstieg von Defekten beobachten, die auf Dauer nicht ausgeglichen werden können. Zelluläre Dysfunktion bis hin zur Apoptose ist die Folge. Gewebe, welche wie das Herz einen hohen Sauerstoffumsatz haben und somit eine hohe Mitochondriendichte aufweisen, sind daher besonders gefährdet für oxidative Schäden. Folgen der oxidativen Schäden im alternden Gewebe sind beispielsweise eine verminderte Fähigkeit der ATP- Produktion durch oxidative Phosphorylierung. Dabei stellt nicht der verringerte Mitochondriengehalt mit zunehmendem Alter, sondern eine selektive Verminderung der Aktivität der Komplexe I und IV der Atmungskette eine Ursache der Dysfunktion dar (Kumaran et al. 2004). Dysfunktionelle Mitochondrien charakterisiert neben einem verringerten Membranpotential, ein erhöhter Gehalt an oxidativ veränderten Phospholipiden, Proteinen und DNA, was wiederrum zu einer Vergrößerung und erhöhten Fragilität der Organellen führt (Navarro and Boveris 2007). Die Theorie der mitochondrialen Alterung berücksichtigt, dass Mitochondrien Hauptproduzenten von Oxidantien sind (Tsutsui et al. 2011) und stellt eine Erweiterung der „free radical theorie of aging“ dar. Da mitochondrialer DNA schützende Histonkomplexe fehlen und nur eine geringe Reparaturaktivität nachgewiesen wurde (Bohr 2002), ist sie durch die unmittelbare Nähe zur ROS-Quelle besonders durch oxidative Schädigung gefährdet. Einleitung 2 Mutationen der mitochondrialen DNA, welche für 13 Polypeptide der Atmungskette kodiert, können zu einer veränderten Kopplung des Elektronentransports und Änderungen der ATP-Produktion führen. Dies wiederum führt zu einer gesteigerten Produktion an Radikalen und somit zu einem Kreislauf ansteigender mitochondrialer Dysfunktion und oxidativer Schädigung mit zunehmendem Alter (Hagen et al. 2002; Lenaz et al. 2002). In verschiedensten Versuchsansätzen konnte gezeigt werden, dass kalorische Restriktion, verstärkte neurologische Aktivität und moderate körperliche Betätigung der mitochondrialen Dysfunktion in gealtertem Leber- und Gehirngewebe entgegenwirken (Navarro and Boveris 2007). Kalorische Restriktion wirkt sich jedoch auch positiv auf stark von apoptotischen Veränderungen gezeichnete mitochondrienreiche Gewebe, wie Herz- und Skelettmuskel, aus (Hepple et al. 2006). Einerseits werden ROS- verursachte endogene DNA Schäden (Barja 2002) sowie oxidativ veränderte Proteine durch Reaktivierung von Peroxisomen nach nur 2-monatiger kalorischer Restriktion seneszenter Nager reduziert (Takahashi and Goto 2002). Andererseits wirkt sich die Expressionsinduktion antiapoptotischer Gene (Rohrbach et al. 2006) und die Aktivierung mitochondrialer Biogenese (Nisoli et al. 2003; Nisoli et al. 2004; Nisoli et al. 2005) unter kalorischer Restriktion zusätzlich positiv auf Gewebestruktur und –funktion aus. Kalorische Restriktion ist auch die einzige Möglichkeit, nachweislich die Lebensspanne zu verlängern und die oxidativen Schäden zu verringern (Walsh et al. 2014) 2.1 Mitochondrien Mitochondrien sind von einer Doppelmembran umschlossene Zellorganellen und werden als „Kraftwerke der Zelle“ bezeichnet (Abb. 2-1 A). Die äußere Membran ist durchlässig für kleine Moleküle und Ionen, welche durch Transmembrankanäle (Porine) ins Innere gelangen. Spannungsabhängige Anionen-Kanäle erlauben den Metabolitaustausch zwischen Mitochondrien und Cytosol. (Navarro and Boveris 2007). Über energieabhängige Transporter werden Moleküle und Ionen über die innere Membran in die Mitochondrien transportiert. Für Protonen ist die innere Membran dagegen durchlässig, was die Grundlage für die mitochondriale Energietransduktion bildet. Die mitochondriale Energietransduktion bzw. oxidative Phosphorylierung beschreibt einen schrittweisen Transport von anfangs Wasserstoff und später von Elektronen über die Atmungskettenkomplexe I-IV (Abb. 2-1 B). Die Elektronen werden über den Komplex I in Form von NADH in die Atmungskette eingeschleust. Daraufhin werden diese schrittweise transportiert und dabei die Redoxenergie stufenweise vermindert, Einleitung 3 was zur Entstehung eines Protonengradienten führt. Dieser bildet die Grundlage für die ATP-Synthese. Wasser entsteht als Nebenprodukt durch Übertragung von Elektronen auf Sauerstoff. Abbildung 2-1 Mitochondrien - Kraftwerke der Zelle: A – Mitochondrium innere und äußere Membran (Abb. verändert; Quellen: http://www.zytologie-online.net/mitochondrium.php; http://www.rhinobeam.ch); B - schematische Darstellung der Atmungskette (Abb. verändert nach (Bundy et al. 2008)) Neben dieser wichtigen biochemischen Funktion der Energiebereitstellung findet in den Mitochondrien der Abbau von Fettsäuren (-Oxidation) und Pyruvat (Citratzyklus) statt. Des Weiteren sind sie beteiligt am programmierten Zelltod und fungieren aufgrund ihrer Fähigkeit, Calcium-Ionen aufzunehmen und abzugeben, als Kalzium-Speicher und greifen in die Kalzium-Homöostase der Zellen ein. Mitochondrien besitzen ein eigenes Genom (Chondriom), lokalisiert in der mitochondrialen Matrix. Es besitzt in den meisten Säugern eine durchschnittliche Größe von 16 kb und codiert für etwa 1% der gesamten genetischen Information beim Menschen, wobei 37 Gene die Synthese von 13 Proteinen kodieren. Das Chondriom enthält Gene, die für die Produktion der rRNAs A B http://www.zytologie-online.net/mitochondrium.php http://www.rhinobeam.ch/ Einleitung 4 und tRNAs verwendet werden und codiert einen Teil der für die Funktionsfähigkeit der Atmungskette notwendigen Proteine. Beim Menschen kontrollieren 37 mitochondriale Gene die Synthese von ca. 13 der 80 Proteinuntereinheiten der Komplexe I, III, IV und V der Atmungskette. Komplex II besteht ausschließlich aus kerncodierten Proteinen. Die Koordination der Kern- und mtDNA-Expression wird in Säuger-Zellen vorwiegend durch den mitochondrialen Transkriptionsfaktor A (mtTFA) vermittelt. Mit zunehmendem Alter zeigen Mitochondrien eine verminderte Genexpression, insbesondere Untereinheiten (z. B. Untereinheiten NADH und COX, cyt b, ATPase 6) der Komplexe I, III, IV und V der mitochondrialen Atmungskette (Manczak et al. 2005), was folglich zu einer sinkenden ATP-Produktion der Zelle führt (Wong et al. 2010). Das Myokard stellt ein besonders mitochondrienreiches Gewebe dar, dass zwei biochemisch verschiedene Arten Mitochondrien aufweist (Rosca and Hoppel 2010). Unterschieden wird in die unter der Plasmamembran liegenden subsarkolemmalen (SSM) und die interfibrillären Mitochondrien (IFM), welche, in parallelen Reihen angeordnet, zwischen den Myofribrillen liegen (Rosca and Hoppel 2010). Die IFM lassen sich aufgrund einer erhöhten Citratsynthase- und Succinat-Dehydrogenase- Aktivität von den SSM biochemisch unterscheiden. Das kardiale Gewebe, als ein mitochondrienreiches Gewebe, ist besonders betroffen von der schädigenden Wirkung reaktiver Stoffwechselprodukte. Neben Boveris und Chance identifizierten auch andere Arbeitsgruppen aus Herz und Leber isolierte Mitochondrien als aktive Quelle von H2O2 und NO (Richter et al. 1997; Giulivi et al. 1998). 2.2 Herzstoffwechsel 2.2.1 Der Herzstoffwechsel und seine Substrate Das Myokard, bestehend aus regelmäßig angeordneten quergestreiften Muskelfasern, stellt mit seinem hohen Energiebedarf eines der mitochondrienreichsten Gewebe dar. Das adulte postnatale Säugerherz ist auf langkettige Fettsäuren als Hauptsubstrat für die ATP-Produktion angewiesen (Okere et al. 2006). Unter normalen Bedingungen sind die meisten der in die kardialen Myozyten transportierten Fettsäuren oxidiert, da die Speicherung von Fetten im Herz limitiert ist. 70-90% der eingeschleusten Fettsäuren werden der Fettsäureoxidation zugeführt (Stanley et al. 2005). Den Hauptanteil freier Fettsäuren bildet die im Blut reichlich vorkommende Ölsäure (Lopaschuk et al. 2010). Langkettige Fettsäuren werden mittels zweier Fettsäuretransporter in die Myozyten transportiert, FATP (fatty acid transport protein) und FAT (fatty acid translocase, CD36) (Brinkmann et al. 2002). Über CPT1 (Carnitine palmitoyltransferase 1) werden diese durch Transveresterung in den mitochondrialen Intermembranraum aktiv Einleitung 5 eingeschleust. Eine Translokation mit Hilfe von Carnitin/Acylcarnitin-Translokasen durch die innere Mitochondrienmembran in die Matrix führt die Fettsäuren der Beta- Oxidation zu. Im normalen, nicht dysfunktionalen Herz wird bei einem Überangebot an Fettsäuren und Lipiden der Stoffwechsel auf eine verstärkte Fettsäureoxidation, bei gleichzeitiger Hemmung der Glucose-Oxidation, umgestellt (Hue and Taegtmeyer 2009). Neben Fettsäuren werden im Myokard auch Glucose und Laktat verstoffwechselt. Glucose wird über spezifische Transporter in die Zelle eingeschleust, nach vorrübergehendem Einbau in Glykogen sofort zu Pyruvat verstoffwechselt und vollständig verbrannt. Neben Glucose bzw. Pyruvat werden die in der Leber gebildeten Ketonkörper (Beta-Hydroxybutyrat u Azetazetat) ebenfalls als Acetyl-CoA in den Citratzyklus eingeschleust und verstoffwechselt. Das gesunde, junge Herz ist dabei in der Lage den myokardialen Verbrauch entsprechend der Substrate anzupassen (Saks et al. 2006; Abel 2007). Bei körperlicher Arbeit nutzt das Myokard als Hauptenergiequelle (zu 60%) das vermehrt im Skelettmuskel gebildete Laktat. Da Ketonkörper und angereichertes Laktat bei vermehrter Bildung und somit hoher Konzentration im Körper zu einer Hemmung der Glucose- und Fettsäure-Aufnahme in die Myozyten führen können, stellt die Verstoffwechselung im Myokard eine Art protektiven Mechanismus dar. Im ruhenden Muskel dagegen werden die Substrate (Glucose, freie Fettsäuren, Laktat) meist zu etwa je 1/3 verstoffwechselt. Der Herzmuskel ist außerdem in der Lage je nach Substratangebot den Stoffwechsel entsprechend zu regulieren (Stanley et al. 2005). Damit wird deutlich, dass die Zusammensetzung der Nahrung offensichtlich einen großen Einfluss auf metabolische Änderungen der Kardiomyozyten besitzt. (Okere et al. 2006). Einleitung 6 Abbildung 2-2 Übersicht myokardialer Stoffwechsel [Abb. nach (Murray et al. 2007), verändert] Mit zunehmender Alterung des Myokards kommt es zur Umstellung auf eine vorrangig glykolytische Energiegewinnung (McMillin et al. 1993). Die fehlende Verstoffwechselung von Fettsäuren kann zu einem Überschuss dieser und einer Akkumulation in Form von Triglyceriden in verschiedensten Geweben führen. 2.2.2 Die Regulation des Herzstoffwechsels Die Familie der Peroxisom-Proliferator-Aktivierten Rezeptoren (PPAR) und die AMP- aktivierte Proteinkinase (AMPK) stellen wichtige Sensoren im Herzstoffwechsel dar. Der vorwiegend im Herz exprimierte PPARalpha-Rezeptor wird durch Bindung langkettiger Fettsäuren aktiviert (Panagia et al. 2005). PPAR bindet neben gesättigten auch langkettige ungesättigte Fettsäuren, sowie Eicosanoide und fungiert als Schalter für die Induktion verschiedenster Signalkaskaden (Desvergne and Wahli 1999). Dies bewirkt eine Aktivierung der Expression verschiedener Schlüsselgene des Fettstoffwechsels, wie beispielsweise der o. g. Fettsäuretransporter, wodurch die Fett- Glucose I II e III Q IV C F o F 1 UCP CPT1 Trans - lokase CPT2 ß - Oxidation ANT Pyruvat - transporter Mono - carboxylat - transporter CD36 / FATP Lactat - transporter GLUT4 Citrat - Zyklus Acetyl - CoA Pyruvat Pyruvat Lactat Glucose ADP ATP Keton - körper CO 2 NADH Freie Fettsäuren Tri - glyceride NADH NAD Succinat Fumarat FADH 2 e O 2 H 2 O P i ADP ATP ADP ATP Muskel - arbeit Mitochondrium Cytosol H + H + H + H + H +  µH + Einleitung 7 säuren vermehrt der ß-Oxidation in den Mitochondrien zugeführt werden und so das Myokard vor Lipotoxischen Auswirkungen schützen (Barger and Kelly 2000). PPAR wurde in verschiedenen Knockout- und Überexpressionsstudien eine zentrale, regulierende Funktion in der Lipidhomöostase zugeschrieben. So zeigt die Überexpression von PPAReine gesteigerte Fettsäureaufnahme und -oxidation (Finck and Kelly 2002; Hopkins et al. 2003), sowie eine Erhöhung des mitochondrialen Elektronentransports, der oxidativen Phosphorylierung und eine verstärkte Expression von Genen der mitochondrialen Biogenese (Lehmann et al. 2000). Die AMP-aktivierte Proteinkinase (AMPK) als zentraler Energiesensor (Kahn et al. 2005) fungiert dagegen als metabolischer Schalter zwischen Fett- und Glucosestoffwechsel in unterschiedlichen peripheren Geweben (Long and Zierath 2006). Neben der Aktivierung der Fettsäure-Oxidation, Glucose-Aufnahme, mitochondrialen Biogenese und Kontrolle der Insulinsensitivität im Skelettmuskel, wirkt die AMPK auch regulierend auf die Gluconeogenese, Lipogenese und Cholesterinsynthese im Lebergewebe sowie im Hypothalamus induzierend auf die Aufnahme von Nahrung (Long and Zierath 2006). Aktivatoren dieses Enzyms sind vorrangig hohe AMP-Konzentrationen (Minokoshi et al. 2002; Hardie et al. 2006)). In der Folge kann man allgemein von einer Hochregulation der katabolen (ATP- produzierenden) und einer Herabregulation der anabolen (ATP-verbrauchenden) Stoffwechselwege sprechen. Hohe Konzentrationen an ATP wiederum inhibieren die Aktivierung von AMPK (Long and Zierath 2006). Yamauchi et al. und Minokoshi et al. konnten außerdem den aktivierenden Einfluss von Adiponektin und Leptin auf die AMPK und einer damit verbundenen Induktion der Fettsäureoxidation und Glucose- Aufnahme im Skelettmuskel nachweisen (Minokoshi et al. 2002; Yamauchi et al. 2002). Wie Minokoshi et al. beschreiben, wirkt Leptin dabei einerseits direkt auf die AMPK und andererseits im Hypothalamus über alpha-adrenerge Mechanismen (Minokoshi et al. 2012). Im weiteren Verlauf wird die Acyl-CoA-Carboxylase durch die aktivierte AMPK phosphoryliert und führt somit zur Hemmung der Synthese von Malonyl-CoA, was wiederum einen gesteigerten Fettsäureimport über CPT1 begünstigt und so die Fettsäuren zur Verstoffwechselung in die Mitochondrien schleust (Lane et al. 2008). Die Verringerung der MalonylCoA-Konzentration bewirkt zudem ein Anschalten der Fettsäure-Oxidation (Woods et al. 2000). 2.2.3 Der veränderte Herzstoffwechsel Metabolische und strukturelle Veränderungen resultieren oft in kardialer Dysfunktion. So wiesen Christoffersen et al. einen Zusammenhang zwischen Lipidakkumulation und Einleitung 8 diastolischer Dysfunktion bei Untersuchungen von ob/ob-Mäusen nach (Christoffersen et al. 2003) und Untersuchungen beim Menschen bestätigten, dass eine Lipidakkumulation im Myokard eine linksventrikuläre Hypertrophie und eine eingeschränkte Kammerkontraktilität zur Folge hat (Szczepaniak et al. 2003; Rijzewijk et al. 2008). Aus diesen Ergebnissen entstand die Theorie der Lipotoxizität bzw. der lipotoxischen Kardiomyopathie und rückte damit den Fettstoffwechsel in den Mittelpunkt des Interesses bezüglich der Aufklärung von Herz-Kreislauf-Erkrankungen. Die hierbei auftretende Akkumulation von Lipidtröpfchen (Intramyozelluläre Lipidtröpfchen - IMCL) in den Zellen und exzessive Speicherung von Fetten im Gewebe führt zu Zell-Dysfunktion und auch Zelltod (Unger and Orci 2001; Schaffer 2003). Diese, den gesamten Organismus betreffende Erkrankung wird auch als metabolisches Syndrom bezeichnet. Folge davon ist, dass es zur Akkumulation von Fetten im Cytoplasma kommt, was normalerweise durch erhöhte Expression von Genen, die zur Verwertung der Fette wichtige Proteine und Enzyme codieren, kompensiert wird (Bishop-Bailey 2000). Die in diesem Zustand auftretenden hohen Konzentrationen an freien Fettsäuren im Zytoplasma führen zur Inhibierung der Carnitin-Palmitoyl-Transferase (CPT1) und zur Hemmung des Fettsäureimports in die Mitochondrien (Rasmussen et al. 2002). Eine weitere Folge ist eine myokardiale Insulinresistenz, welche durch eine eingeschränkte metabolische Flexibilität gekennzeichnet ist und zum Aufbrauchen der Glykogenvorräte führt, was wiederum zu einer eingeschränkten Arbeitskapazität führen kann (Petersen and Shulman 2006; Delarue and Magnan 2007). Die aus der Verstoffwechselung der freigesetzten Glucose entstehenden Malonyl-CoA-Moleküle hemmen ebenfalls die CPT1. Damit wird der überwiegende Teil der Fettsäuren zu Triglyceriden verestert (Folmes and Lopaschuk 2007). Dieser lipotoxische Zustand wird zusätzlich über Mediatoren wie Ceramide, reaktive Sauerstoffmoleküle (ROS), Fettsäuren oder ein Adiponektindefzit verstärkt. Ceramide beispielsweise, gebildet aus überschüssigen gesättigten Fettsäuren, vermitteln durch Aktivierung proapoptotischer Caspasen zytotoxische Wirkungen im Myokard. Chiu et al. bezeichneten den Vorgang als fettsäureinduzierte Apoptose (Chiu et al. 2001) und Listenberger et al. bestätigten diesen Vorgang an isolierten neonatalen Kardiomyozyten mit Palmitat (Listenberger et al. 2003), welches von Okere et al. als Ausgangssubstrat der de-novo Synthese von Ceramiden identifiziert wurde (Okere et al. 2006). Okere et al. wiesen dies auch in Fütterungsversuchen von Ratten nach, wobei Sie zeigen konnten, dass eine Diät reich an Palmitat hohe Konzentrationen an Ceramiden im Herzmuskel zur Folge hat (Okere et al. 2006). Rennison et al. schlussfolgerten daraus, dass Lipidakkumulationen außerhalb des Fettgewebes und hohe zirkulierende Konzentrationen an Fettsäuren im Einleitung 9 Plasma eine große Rolle bei der Ausbildung von Herzinsuffizienzen, Adipositas und Diabetes spielen (Rennison et al. 2008). Bereits Chiu et al. und Finck et al. führten die resultierende kardiale Dysfunktion auf vermutlich toxische Effekte der Lipideinlagerung oder auf Schädigungen durch freie Radikale zurück (Chiu et al. 2001; Finck and Kelly 2002). Auf all diese Vorgänge wirkt sich ein zusätzliches Adiponektindefizit negativ aus und kann letztendlich die Entstehung von Hypertrophie, Kardiomyopathien und systolischen Dysfunktionen durch direkten Einfluss der Kardiomyozyten bedingen (Goldstein et al. 2009). Aber auch eine Aktivierung von PPAR steht im Verdacht, kardiale Dysfunktionen zu verursachen. So zeigte eine Überexpression des herzspezifischen PPAR in Mäusen unter Fütterung einer fettreichen Diät die Induktion kardialer Dysfunktion (Finck et al. 2003). Durch Bindung langkettiger Fettsäuren wird PPAR aktiviert und führt zur intrazellulären Akkumulation von Lipiden (Finck and Kelly 2002), welche wiederum verstärkt zur Bildung reaktiver Oxygenspezies führen und somit myozytäre Hypertrophie und Dysfunktion gefördert werden (Finck et al. 2003). Folgen der PPAR- Aktivierung sind außerdem eine Verminderung des Glucosestoffwechsels, sowie die Induktion der Expression von UCP2 und UCP3, welche eine mitochondriale Entkopplung verursachen (Young et al. 2001; Boudina et al. 2005; Okere et al. 2007). Neben den Tiermodellen deuten auch Studien mit Patienten auf eine Involvierung von PPAR in Herzerkrankungen hin. So wiesen Schupp et al. in Patienten mit dilatativer Kardiomyopathie einen erhöhten Gehalt an PPAR im linken Ventrikel nach (Schupp et al. 2006). Neben den negativen Wirkungen der PPAR-Überexpression zeigen aber auch Untersuchungen in PPAR -/- - Mäusen sowie Patienten mit Herzerkrankungen (2000 Barger Kelly), dass eine Deaktivierung von PPAR ebenfalls negative Auswirkungen hat. So konnte gezeigt werden, dass in PPAR -/- - Mäusen Störungen im Redox- System, hinsichtlich einer Verminderung von Catalase, Superoxid-Dismutase und Glutathion Peroxidase mit dem Ergebnis der Anreicherung von reaktiven Oxygen- und Nitrogenspezies, vorliegen (Lecarpentier et al. 2010). Gleichzeitig kommt es zu strukturellen Veränderungen des Myokards, gekennzeichnet durch kardiale Fibrose, abnormale Myofibrillen und Mitochondrien, sowie kardialer Hypertrophie (Lecarpentier et al. 2010). 2.2.4 Tiermodelle Um metabolische Veränderungen im Myokard besser verstehen zu können, bedient sich die Forschung u. a. verschiedenster genetischer Adipositasmodelle (ob/ob-Maus, Einleitung 10 db/db-Maus, Zucker-Diabetes-Ratten). Das Modell des diätinduzierten Typ-2-Diabetes, beschrieben erstmals von Surwit et al., findet vor allem in Forschungsbereichen wie Diabetes oder Herzkreislauferkrankungen Anwendung (Surwit et al. 1988). Durch Fütterung, stark mit vor allem gesättigten Fetten angereicherter Nahrung (bis zu 60 kcal%), entwickeln die Tiere einen typischen adipösen Phänotyp. Schon nach kurzer Zeit lassen sich eine starke Gewichtszunahme und Folgeerkrankungen wie Diabetes, Hyperglykämie, Hyperinsulinämie (Surwit et al. 1988; Surwit et al. 1995) und Bluthochdruck (Mills et al. 1993), sowie einen Anstieg von LDL-Cholesterin im Plasma (Dietschy 1998) bei den Tieren beobachten. Die Modelle stellen somit einen geeigneten Hintergrund zur Untersuchung von Alterungserscheinungen aufgrund metabolischer Veränderungen im Myokard dar. 2.3 Herzinsuffizienz In Europa ist die Herzinsuffizienz eine der häufigsten internistischen Erkrankungen mit geschätzt mehr als 28 Mio. Betroffenen (Quelle: www.heartfailurematters.org). Die Herzinsuffizienz bezeichnet eine verminderte Leistungsfähigkeit des Myokards, bei der grundlegend die systolische Herzinsuffizient mit verminderter Pumpfunktion von der diastolischen Herzinsuffizienz mit gestörter kardialer Relaxation unterschieden wird, welche sowohl den linken als auch den rechten Ventrikel betreffen kann. Am häufigsten findet man eine Insuffizienz des linken Ventrikels (Linksherzinsuffizienz). Ursachen für die Entstehung von linksseitiger Herzinsuffizienz können neben langjähriger arterieller Hypertonie, KHK, Myokarditis, auch Aorten- oder Mitralklappenerkrankungen sein. Für die Diagnostik einer Herzinsuffizienz kann neben der in der Alltagsroutine verwendeten Echokardiographie die Plasmakonzentration des Brain Natriuretic Peptide (BNP bzw. NTproBNP) bestimmt werden. BNP wird im Herz in den Ventrikeln exprimiert als Reaktion auf die Dehnung der Herzwand, bei hypertropher Kardiomyopathie, diastolischer Dysfunktion und LV Hypertrophie. In diesem Zusammenhang korrelieren die Plasmalevel von BNP mit dem myokardialen Masseindex sowie der interventrikulären und posterioren Wanddicke. Im Fall von akuter Herzinsuffizienz sind sehr hohe Plasma-Konzentrationen an BNP im Patienten nachweisbar (Palazzuoli et al. 2010). Kennzeichnend für das insuffiziente Herz sind ebenfalls Abweichungen in der oxidativen Kapazität, eine veränderte Mitochondrienzahl sowie die Bevorzugung bestimmter Substrate, was auf metabolische Veränderungen hindeutet. Zusätzlich findet man im humanen und murinen insuffizienten Herz eine niedrige Phosphokreatin/ATP-Ratio (Hardy et al. 1991; Neubauer et al. 1995). Ursachen hierfür sind Defekte des Kreatin-Kinase-Energie-Transport-Systems, welche auf einer Einleitung 11 verminderten Aktivität der Kreatinin-Kinase und ihrer mitochondrialen Isoform beruhen. Dies wurde im insuffizienten humanen Myokard und bei verschiedenen Mausmodellen für Herzschwäche nachgewiesen (Lygate et al. 2007). Eine gesteigerte Sympathikusaktivierung bei chronischer Herzinsuffizienz verursacht zudem eine erhöhte Lipolyse im Fettgewebe und führt somit zu veränderten Konzentrationen der freien Fettsäuren im Plasma, welche wiederum die Aufnahme von Fettsäuren in das Myokard stark determiniert (Lionetti et al. 2011). Folgeerscheinungen, wie beispielsweise eine verminderte systolische Kontraktionskraft, oder eine verzögerte diastolische Relaxation, können auf Änderungen im Ca2+-Ionen-Austausch der Mitochondrien zurückgeführt werden. Aufgrund einer verringerten Expression der sarkoplasmatischen Ca-ATPase (SERCA2) kommt es zu einer Abschwächung der Freisetzung von Ca2+-Ionen und einem Anstieg dieser im Cytosol aufgrund einer verminderten Wiederaufnahme ins sarkoplasmatische Retikulum. Diese Folgeerscheinungen stellen gleichzeitig die Ursache für eine weitere Verschlechterung der Herzfunktion dar. Verschiedene Studien zeigen, dass reaktive Stoffwechselprodukte, beispielsweise reaktive Oxygen- und Nitrogenspezies (ROS, RNS), wie Superoxidanionen, Hydroxylradikale und Peroxide, ebenfalls zu einer Verschlechterung der kardialen Funktion führen. ROS und RNS entstehen bei einer Vielzahl zellulärer Prozesse, aber vor allem beim mitochondrialen Elektronentransport. Hier vermutlich aufgrund eines Elektronenverlustes durch die Komplexe I und II der Atmungskette (Leak) (Tsutsui 2006). Mit der Entkopplung der Atmungskette schalten NO-Synthasen auf die Bildung reaktiver Sauerstoffmoleküle um. Auch Enzyme des kardialen Stoffwechsels, wie Xanthine- und Monoamin-Oxidasen, bilden Peroxid (H2O2), sowie hochreaktive Sauerstoffspezies (Burgoyne et al. 2012). NADPH-Oxidasen (Nox2; Nox4), welche in ihrer Funktion Elektronen auf Flavin- und Hämgruppen übertragen, katalysieren ebenfalls die Bildung von ROS (Burgoyne et al. 2012). Anhaltender oxidativer Stress im geschwächten Myokard resultiert in einer Schädigung der mtDNA und somit in weiterer ROS-Produktion, was zu zellulären Schäden und zunehmender Verschlechterung der Funktion führt. Die verstärkt gebildeten ROS verursachen eine weitere Freisetzung reaktiver Moleküle und führen letztendlich zu einer Herzinsuffizienz mit kontraktiler Dysfunktion (Burgoyne et al. 2012). 2.4 Altersherz (Charakteristika) Zu typischen altersbedingten Veränderungen des Herzmuskels zählen transmurale Fibrosen und Nekrosen, eine diastolische Dysfunktion, sowie Verkalkungen der Aortenklappe und des Mitralklappenringes. Auch die herznahen Gefäße sind Einleitung 12 zunehmend versteift und weniger elastisch und begünstigen so die Entstehung einer arteriellen Hypertonie (Najjar et al. 2005). Die mit steigendem Alter auftretenden Veränderungen beeinflussen zunehmend die Funktion des Herzens. Ergebnisse sind erhöhter Blutdruck und eine linksventrikuläre Hypertrophie (Wessells and Bodmer 2007). Das hypertrophierte Gewebe nimmt an Gewicht mit zunehmendem Alter zu und weist vergrößerte Zellen bei verringerter Zellzahl auf (Biernacka and Frangogiannis 2011). In Kardiomyozyten von alten Nagern wurden zudem vergrößerte Mitochondrien nachgewiesen, welche weniger Cristae aufweisen als Mitochondrien im Gewebe junger Vergleichstiere (Rosca and Hoppel 2010). Dies resultiert in einer verminderten ATP- Produktion pro Zelle (Wong et al. 2010) im Alter und führt zu einem Funktionsverlust. So beschrieben Karavidas et al. mit zunehmendem Alter von über 60-jährigen eine Verminderung der aeroben Kapazität (Karavidas et al. 2010) sowie ein verringertes Herzzeitvolumen unter Belastung. Bekannte Risikofaktoren für Herzkreislauferkrankungen, wie fettreiche Ernährung, Rauchen und genetische Prädisposition, beschleunigen diese Alterungsvorgänge (Yarnell et al. 2003; Kratz 2005; Kuller 2006; Menotti et al. 2006). 2.4.1 Veränderung an Myozyten Morphologische Veränderungen des Myokards und der Gefäße im Alter bilden den Ausgangspunkt für kardiovaskuläre Erkrankungen. Sklerotische Veränderungen der Gefäße, Verkalkungen des Mitralklappenringes und der Aortenklappen sowie eine Amyloidose des Herzmuskels stellen die häufigsten Ursachen für beispielsweise Herzinfarkte, Myokardiopathien oder Rhythmusstörungen dar (Quelle: Handbuch der internistischen Geriatrie; Karl Heinz Tragl, Springer Verlag). Gekennzeichnet ist das alternde Myokard vor allem durch einen Rückgang an Myozyten aufgrund apoptotischer und nekrotischer Vorgänge (Kwak 2013). Gleichzeitig vergrößern sich die verbleibenden Myozyten (Hypertrophie) und der Anteil der extrazellulären Matrix steigt. Strukturelle Veränderungen der extrazellulären Matrix sind insbesondere die verstärkte Einlagerung, der verringerte Abbau und die stärkere Vernetzung von Kollagenen und somit die Entstehung fibrotischen Gewebes. Trotz Rückgang der Muskelmasse mit fortschreitendem Alter zeigt die Ventrikelwandstärke keine Unterschiede aufgrund verstärkter Einlagerungen (Olivetti et al. 1991). Konsequenz dieser strukturellen Veränderungen ist eine eingeschränkte kontraktile Funktion, die in systolischen und / oder diastolischen Dysfunktionen resultiert (Kwak 2013). Zusätzlich bedingt die zunehmende Versteifung und Verdickung des vergrößerten Herzmuskels aufgrund von Einlagerungen im Gewebe (Gates et al. 2003; Najjar et al. 2005) eine verminderte Relaxationsgeschwindigkeit. Dies führt zu einer Einleitung 13 verzögerten frühdiastolischen Füllung des Ventrikels und bedingt die diastolische Funktionseinschränkung, welche zunächst durch eine verstärkte atriale Füllung ausgeglichen wird (Lakatta 1990). Da der Ventrikel bei Öffnen der Mitralklappe in der frühdiastolischen Phase des Füllens versteift bleibt, sinkt das Enddiastolische Volumen und verursacht einen Anstieg des linksventrikulären Füllungsdruckes (Lakatta 1990). Der ansteigende Druck im linken Herzen führt zu einer nachlastbedingten kompensatorischen Hypertrophie mit Dehnung des linken Vorhofs und linken Ventrikels (Strait and Lakatta 2012). Die Drucksteigerung im Vorhof führt zu einer verbesserten Füllung des Ventrikels, ist aber verbunden mit einer erhöhten Fibrosierung des Gewebes. Diese altersabhängigen Veränderungen betreffen auch das Reizleitungssystem. So geht die Zahl der myozytären Schrittmacherzellen im Sinusknoten mit zunehmendem Alter zurück und wird durch Bindegewebe und Fettzellen ersetzt (Yanni et al. 2010). Als Ursache für die auftretende Relaxationsverzögerung ist neben einer Versteifung des Gewebes auch eine Störung der Kalzium-Homöostase zu nennen. Ein charakteristisches Merkmal des alternden Herzens ist beispielsweise die Verlangsamung der zellulären Kalzium-Transportprozesse. Die sich daraus ergebende intrazelluläre Kalzium-Überladung kann zu diastolischen Nachdepolarisationen und Tachyarrhythmien führen (Lakatta and Sollott 2002). Die geringere extrazelluläre Ca- Konzentration führt zur verminderten Kontraktionskraft aufgrund fehlender Aktivierung kontraktiler Proteine (Hasenfuss et al. 1994). 2.4.2 Stoffwechsel Das adulte Myokard ist durch einen hohen aeroben Stoffwechsel gekennzeichnet. Dabei deckt die Verstoffwechselung von Fettsäuren nahezu 70% des ATP-Bedarfs (Hue and Taegtmeyer 2009). Jedoch kann man mit zunehmendem Alter eine Verschiebung des Substratmetabolismus beobachten. Dies wurde bei der Untersuchung alter Mäuse und Ratten beobachtet (McMillin et al. 1993). Wie Odiet et al. in Versuchen mit Mäusen zeigen konnten, resultiert der Substratswitch vermutlich aus einer altersassoziierten Verminderung der Aktivität des Fettsäuretransporters CPT1 (Odiet et al. 1995). Einige Jahre später wiesen Kates et al. einen myokardialen Substratshift auch in alten (67 ± 5 Jahre) gegenüber jungen Patienten (26 ± 5 Jahre) nach (Kates et al. 2003). In diesem Zusammenhang wiesen Kates et al. nach, dass im Myokard gealterter Individuen sowohl der Fettsäureverbrauch als auch die Fettsäureoxidation reduziert sind, was sie aber weder auf altersbedingte Stoffwechselveränderungen noch einen verminderten Transport der Fettsäuren in die Mitochondrien zurückführen konnten (Kates et al. 2003). Die dadurch hohe Einleitung 14 Konzentration an freien Fettsäuren im Plasma wurde bereits von einigen Autoren als typische Ausgangssituation für die Entwicklung einer Insulinresistenz beschrieben (Shulman 2000; Eckel et al. 2005). Insulinresistenz wiederum wurde in späteren Untersuchungen mit einem erhöhten Risiko kardiovaskulärer Erkrankungen in Verbindung gebracht (Marwick 2008). Einhergehend mit einem gesteigerten Glucose-Stoffwechsel beschrieben Ozaki et al. mit zunehmendem Alter eine verstärkte Expression des Glucose-Transporters GLUT4 im Myokard von Mäusen (Ozaki et al. 1996). Dagegen beobachteten Cartee et al. im Myokard der Ratte einen Rückgang der GLUT4-Expression (Cartee 1993). Mit zunehmendem Alter ließ sich eine ansteigende oxidative Schädigung in nahezu allen Geweben, einschließlich des Herzmuskels, beobachten (Barja and Herrero 2000). Krishnan et al. vermuten, dass eine Akkumulation genetisch veränderter mtDNA- Moleküle eine fehlerhafte oxidative Phosphorylierung bedingt und zur Anreicherung von reaktiven Oxidantien führt. Nach der Theorie der mitochondrialen Alterung ist damit die hohe Dichte an Mitochondrien in den Kardiomyozyten eine Quelle reaktiver Sauerstoffspezies und die Ursache für eine verstärkte Alterung des Herzgewebes (Krishnan et al. 2007). 2.5 Zielstellung der Arbeit Bisher standen arteriosklerotische Gefässveränderungen im alternden Herz im Mittelpunkt wissenschaftlicher Untersuchungen, wohingegen altersabhängige metabolische Veränderungen an Kardiomyozyten selbst bei erhöhter exogener Zufuhr von Fetten noch nicht genau definiert sind. Ausgehend von metabolischen Veränderungen des gesamten Organismus gewann das Fettgewebe in seiner Funktion als endokrines Organ auch in diesem Zusammenhang mehr und mehr an Bedeutung. So ist in den letzten Jahren vor allem die Wirkung von Lipiden und Fettgewebshormonen auf das Myokard in den Fokus wissenschaftlicher Untersuchungen gerückt. Ausgehend von diesen Erkenntnissen stellt sich die Frage nach dem Einfluss von Lipiden und Adipokinen auf kardiovaskuläre Alterungsvorgänge. Fette und Fettsäuren können an verschiedenen Stellen des Metabolismus negativ in die komplexen Stoffwechselabläufe eingreifen. Schädigungen der mitochondrialen DNA führen zu Veränderungen der Genexpression, was einerseits Auswirkungen auf den Stoffwechsel hat, andererseits Disproportionalitäten der Atmungskette verursacht. Sowohl die erhöhte Stoffwechselaktivität als auch die veränderte mitochondriale Atmung führen verstärkt zur Bildung von ROS (Hebert et al. 2010). Vor allem Proteine, Lipide und Nukleinsäuren werden nachweislich durch die freigesetzten ROS geschädigt und verursachen weitere Beeinträchtigungen der mitochondrialen Atmung Einleitung 15 sowie eine verstärkte Apoptose der Kardiomyozyten (Longo 2004). Dieser sich verstärkende Kreislauf wird auch als Circulus viciosus (Abb. 2-3) bezeichnet (Brunk et al. 1992). In der vorliegenden Arbeit bildet dieser die grundlegende zentrale Hypothese mit Ansatzpunkten für Einflüsse von Fettsäuren und Lipiden. Mitochondriale Atmung + O2-Bildung Veränderte mitochondriale Genexpression Schädigung mt-DNA Disproportionalität der Atmungskette Apoptose de novo Ceramid- Synthese FFA FFA ß-Oxidation NADH2/FADH2 Triglyceride / FFA Adiponectin / AMPK PPAR UCP Lipidperoxide AMPK Leptin Circulus Viciosus Abbildung 2-3 Circulus viciosus – Arbeitsmodell einschließlich dem Einfluss von Fettsäuren (FFA) und Lipiden (Triglyceride) an verschiedenen Stellen des Kreislaufes Neben der bereits erwähnten de-novo Synthese von Ceramiden und Lipidperoxiden aus Fettsäuren kann die Verstoffwechselung von Fettsäuren zu einem Überangebot von Reduktionsäquivalenten (NADH/FADH) in der Zelle führen und ebenfalls eine Disproportionalität der Atmungskette bedingen. Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung lipidinduzierter kardialer Veränderungen in Abhängigkeit vom Lebensalter unter Verwendung eines Tiermodells. Im Mittelpunkt steht dabei die Fragestellung, inwiefern man durch fettreiche Diät Zeichen vorzeitiger kardialer Alterung in jungen Tieren induzieren kann. Ein weiterer Aspekt der Arbeit besteht in der Untersuchung der Wirkung einzelner Fettsäuren und in Kombination in vitro auf den zellulären Metabolismus sowie beteiligter Signalwege. Einleitung 16 Die folgenden Fragestellungen wurden untersucht: 1. Sind Anzeichen vorzeitiger Alterung auf Ebene der Genexpression in jungen Tieren durch fettreiche Diät induzierbar? 2. Ist im Myokard junger Tiere ein Funktionsverlust aufgrund mitochondrialer Dysfunktion durch den Einfluss fettreicher Diät vorzeitig nachweisbar? 3. Bewirkt eine Fütterung seneszenter Tiere mit fettreicher Diät einen beschleunigten kardialen Funktionsverlust? 4. Wie wirken gesättigte/ ungesättigte Fettsäuren auf den Metabolismus? 5. Wird AMPK als zentraler Stoffwechselregulator durch fettreiche Diät beeinflusst? 6. Wie wirken einzelne Fettsäure-Derivate auf den Aktivierungszustand der AMPK? Material und Methoden 17 3 Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1 Chemikalien allgemein Tabelle 3-1 Übersicht zu verwendeten Chemikalien allgemein Chemikalie Hersteller Acetyl-CoA Acrylamid Agarose Albumin, Bovine BSA Albumin H2 Ammoniumazetat Ampliqon Taq®-Polymerase Antimyzin A APS Borsäure Bromphenolblau Butanol BCIP Chloroform Coenzym Q Coumarsäure Cytochrom c Decylubichinol 2,6-Dichlorophenolindophenol (DCPIP) Dimethylformamid Dimethylsulfid Dithiothreitol DTNB EDTA Essigsäure Ethanol abs Ethidiumbromid Formaldehyd Glutathion Glycerol Glycin HEPES Isoamylalkohol Kaliumazetat Kaliumchlorid Sigma-Aldrich, St. Louis Serva Electrophoresis GmbH, Heidelberg Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis, Carl Roth GmbH + CO. KG AppliChem GmbH, Darmstadt Amersham Pharmacia Biotech Inc. Biomol GmbH Sigma-Aldrich, St. Louis Merck KGaG, Darmstadt Carl Roth GmbH + CO. KG Sigma-Aldrich, St. Louis Carl Roth GmbH + CO. KG AppliChem GmbH, Darmstadt Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Merck KGaA, Darmstadt AppliChem GmbH, Darmstadt Carl Roth GmbH + CO. KG Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis, Carl Roth GmbH + CO. KG Carl Roth GmbH + CO. KG Carl Roth GmbH + CO. KG Sigma-Aldrich, St. Louis Carl Roth GmbH + CO. KG Carl Roth GmbH + CO. KG Carl Roth GmbH + CO. KG Carl Roth GmbH + CO. KG Sigma-Aldrich, St. Louis, Carl Roth GmbH + CO. KG Carl Roth GmbH + CO. KG Carl Roth GmbH + CO. KG Sigma-Aldrich, St. Louis Material und Methoden 18 Chemikalie Hersteller KCN LB-Medium LB-Agar Luminol Magnesiumazetat Magnesiumchlorid 2-Mercaptoethanol Magermilchpulver Methanol Methylalkohol Methylenblau NADH Natriumazid Natriumchlorid Natriumdodecylsulfat (SDS) Natriumhydroxid NBT (Nitroblue Tetrazolium) Nonidet P40 OCT Oxalacetat p-Coumarsäure Phenazinmethosulfat (PMS) Phosphatase-Inhibitor-Cocktail Protease-Inhibitor Ponceau S 2-Propanol RNase A Rotenon Salzsäure Saponin Succinat Sucrose Tert-Butylalkohol Tetramethylendiamin (TEMED) TRI-Reagent Tris Triton X-100 Tween 20 Wasserstoffperoxid X-Gal Merck KGaA, Darmstadt, Carl Roth GmbH + CO. KG Carl Roth GmbH + CO. KG Carl Roth GmbH + CO. KG AppliChem GmbH, Darmstadt Sigma-Aldrich, St. Louis Merck KGaA, Darmstadt Carl Roth GmbH + CO. KG Milbona, AppliChem GmbH, Darmstadt Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Carl Roth GmbH + CO. KG Carl Roth GmbH + CO. KG Merck KGaA, Darmstadt AppliChem GmbH, Darmstadt Sigma-Aldrich, St. Louis Sakura Finetek Europe B.V. Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis AppliChem GmbH, Darmstadt Sigma-Aldrich, St. Louis Boehringer Mannheim Sigma-Aldrich, St. Louis Merck KGaA, Darmstadt Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Carl Roth GmbH + CO. KG Fluka Chemie AG Sigma, PeqLab Carl Roth GmbH + CO. KG Sigma-Aldrich, St. Louis Sigma-Aldrich, St. Louis Merck KGaA, Darmstadt AppliChem GmbH, Darmstadt Material und Methoden 19 3.1.2 Chemikalien Zellkultur Tabelle 3-2 Übersicht zu verwendeten Chemikalien in der Zellkultur Chemikalie Hersteller DMEM PAA Laboratories GmbH FBS Biochrom AG Natrium-Pyruvat PAA Laboratories GmbH Glutamat PAA Laboratories GmbH Penicillin/Streptomycin PAA Laboratories GmbH Blasticidin PAA Laboratories GmbH PBS Tablets GIBCO™ Invitrogen Corporation Trypsin / EDTA PAA Laboratories GmbH Trypan-Blau Sigma-Aldrich, St. Louis DMSO AppliChem GmbH, Darmstadt Lipifectamin PlusTM Invitrogen Lipofectamin 2000TM Invitrogen Opti-MEM®I GIBCO™ Invitrogen Corporation 3.1.3 Testsubstanzen / Fettesäuren Tabelle 3-3 Übersicht der verwendeten Fettsäuren für die Zellversuche Fettsäure Hersteller Palmitat Sigma-Aldrich, St. Louis Stearat Sigma-Aldrich, St. Louis Oleat Sigma-Aldrich, St. Louis DHA Sigma-Aldrich, St. Louis 3.1.4 Molekulargewichtsmarker Tabelle 3-4 Übersicht zu den verwendeten Maolekularmarkern Molekulargewichtsmarker Hersteller SM #1811 PageRuler™ Prestained Protein Ladder Plus Fermentas #SM0321 GeneRulerTM 100bpDNA Ladder Plus Fermentas #SM0311 GeneRulerTM 1kbDNA Ladder Fermentas #SM0371 GeneRulerTM 50bp DNA Ladder Fermentas Material und Methoden 20 3.1.5 Enzyme Tabelle 3-5 Übersicht zu verwendeten Enzymen Enzym Hersteller Alkalische Phosphatase Promega, Heidelberg GoTaqPolymerase Flexi® Promega, Heidelberg Pfu DNA Polymerase Promega, Heidelberg Proteinase K Merck, Darmstadt Restriktionendonukleasen New England Biolabs; Jena Bioscience, Jena RNase A AppliChem, Darmstadt Rnasin® Promega, Heidelberg Super Script™ II Reverse Transcriptase Invitrogen, Karlsruhe T4 DNA Ligase Promega, Heidelberg 3.1.6 Kits / Färbereagenzien / sonstiges Tabelle 3-6 Übersicht zu verwendeten Kits, Färbereagenzien sowie sonstiger Materialien Bezeichnung Hersteller Nitrocellulosemembran Kisker Hyperfilm ECL Amersham Biosciences Mouse Tail Kit Gentra, Peqlab Midi Kit Promega Gelextraktionskit Genomed, Qiagen BCA Protein Assay Kit Pierce NEFA C Wako Chemicals, Neuss Triglyceride Determination Kit Sigma Aldrich, ELISA Mouse and Rat Leptin ELISA Bivendor Mouse Insulin Assay ELISA Mercodia Assay Max Human Adiponektin (Acrp30) ELISA Kit Assay Pro Lectin-TRITC labeled von Tritium vulgare (#L5266) Sigma Vector VECTASHIELD H-1000 (Einbettmedium) Vector Laboratories Oil Red-O, O-9755 Sigma-Aldrich, St. Louis DAPI Sigma-Aldrich, St. Louis Siriusrot F3BA Sigma-Aldrich, St. Louis Entellan7Neu (Schnelleindeckmittel) Merck, Darmstadt Material und Methoden 21 Bezeichnung Hersteller BigDye Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit Applied Biosystems 3.1.7 Geräte Tabelle 3-7 Übersicht aller verwendeten Geräte Gerät Hersteller Bakterienschüttler, Thermoshake Gerhardt Brutschrank (Bakterien) VWR Zellkulturschrank Memmert (Inco2), Nunc (Cellstar) Labsonic, Ultraschall B.Braun Tisch- und Kühlzentrifugen Eppendorf Power Supply Consort Refridgerated Superspeed Zentrifuge RC-5B Sorvall, Newton USA UV Transilluminator Bioview Spektralphotometer 50 Scan Varian Photometer Ultrospec 2000 Pharmacia Biotech Präzisionswaage, Feinwaage Sartorius Oxygraph/ Oxygraph-2k OROBROS Ultra Turrax T8 IKA-Werke Proteingelelektrophorese Mini-Protean II BioRad PCR-Cycler Biometra Sequenzer ABI 3100 Genetic AnalyzerC Applied Biosystems Material und Methoden 22 3.2 Molekularbiologische Methoden 3.2.1 Isolation von RNA aus Gewebe und Zellen 3.2.1.1 Gewebe Zur RNA-Isolation wurden 25 - 50mg tiefgefrorenen Gewebes mechanisch zerkleinert, in einem entsprechenden Vol (Herstellerangaben) TRI-Reagenz (Sigma) aufgenommen und mittels Ultraturrax homogenisiert. Das Homogenat kann nach diesem Schritt bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C eingefroren werden. Die Zugabe von 1/5 Vol an eingesetztem TRI-Reagenz Chloroform und eine kurze Durchmischung auf dem Vortexer, gefolgt von 2 - 15’ min Inkubation bei RT, ermöglichte die Extraktion der RNA. Nach Zentrifugation (15’ bei 14.000 rpm) wurde die wässrige Oberphase in ein neues Tube überführt. Die Fällung der RNA erfolgte durch Zugabe von ½ Vol (eingesetztem TRI) Isopropanol für 5 - 10’ bei RT nach kurzem Vortexen. Die RNA wurde bei 4 °C und 14.000 rpm für 15’ sedimentiert und nach Dekantieren des Überstandes mit mindestens 500 µl 70%igem EtOH gewaschen. Nach erneuter Zentrifugation (15’ bei 14.000 rpm, 4 °C) wurde das RNA-Pellet bei RT kurz getrocknet und anschließend in einem adäquaten Vol DEPC-Wasser aufgenommen. Zur besseren Lösung der RNA wurde diese 1 h auf Eis stehen gelassen und anschliessend bis zur weiteren Verwendung bei –80 °C gelagert. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte am Nanodrop durch Doppelbestimmung. 3.2.1.2 Zellen Im ersten Schritt der Isolation von RNA wurden diese 1 x mit PBS gewaschen und nach Zugabe von TRI-Reagenz mit Hilfe eines kleinen Schabers von der Schale gelöst. Die weiteren Schritte erfolgten analog der unter 3.2.1.1 beschriebenen Methode bei der Isolation aus Gewebe. 3.2.2 cDNA Synthese (Reverse Transkription – RT-PCR) Die isolierte RNA wurde verdünnt, nochmals die Konzentration bestimmt und 500 ng RNA bei der reversen Transkription eingesetzt. Nach Denaturierung dieser bei 72 °C für 3’ wurde der Reaktionsansatz zugegeben: Material und Methoden 23 Substanz Volumen in µl 30 µg/ml random Primer 3.0 12.5 mM dNTP 1.0 40 U/µl RNase out (Ribonuclease inhibitor) 0.25 200 U/µl Reverse Transkriptase 0.25 DEPC dH2O 5.5 Reaktionsbedingungen (42 °C 30’; 95 C 1’; 4 °C Pause) Die fertige cDNA wurde 1:1 mit Aqua bidest verdünnt und zur weiteren Verwendung bei -20 °C eingelagert für semiquantitative und quantitative Analysen. 3.2.3 Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction – PCR) Die PCR-Reaktion erfolgte für semiquantitative Analysen in einem 25 µl-Ansatz. Hierfür wurde folgender Ansatz pipettiert: Substanz Volumen in µl cDNA 20 ng 10x GoTaq FlexiPuffer 2.5 25 mM MgCl2 0.75 100 pmol dNTP je 0.5 GoTaq Flexi Polymerase 0.25 DEPC dH2O 18.5 Reaktionsbedingungen (95 °C 2’; X Zyklen x [95 °C 30“, x °C 30“, 72 °C 30“], 72 °C 2’, 4 °C Pause) Das PCR-Programm wurde nur hinsichtlich Annealing-Temperatur und Expressionsstärke der jeweiligen Primer angepasst. Die Kontrolle der Amplifikate erfolgte durch Auftragen dieser auf 1 - 2%igen TBE-Agarose-Gelen und Auswertung mittels Geldokumentations-Gerät und Software (Biostep, ArgusX1, Total Lab, SigmaStat, SigmaPlot) TBE (89 mM Tris, 89 mM Borsäure, 2 mM EDTA ph 8,0) 6x Probenpuffer (DNA) (50% (v/v) Glycerol, 0,5 M Tris pH 8,0, 1 Spatelspitze Bromphenolblau) Eine Übersicht der verwendeten Primer ist in der folgenden Tabelle zusammen gestellt. Material und Methoden 24 Tabelle 3-8 Übersicht aller verwendeten Primer Gen sense antisense AcCoACarb1 TCTGATTTGGGGATCTCTGG GAGCAGTTCTGGGAGTTTCG AcCoACarb2 ACAGGGTCATAGAGAAGGTGCT CAGGGTAAGGTTGGGATTTG AcCoAOx ACCTTCACTTGGGCATGTTC GGCATGTAACCCGTAGCACT AR1 ACGTTGGAGAGTCATCCCGTAT CTCTGTGTGGATGCGGAAGAT AR2 GCCCATCATGCTATGGAACG CTAGGAGATGTGTCCAAATGTTGC Adiponektin GCAGAGATGGCACTCCTGGA CCCTTCAGCTCCTGTCATTCC Alpha1AMPK CCCCTATTATTTGCGTGTGC ACTTCTGAGGGCTTTCCTTGA Alpha2AMPK AGCATCGATGATGAGGTGGT CAACGGGCTAAAGCAGTGAT ANP ATGGGCTCCTTCTCCATC GTGTTGGACACCGCACTGTA Beta1AMPK ACCGTATTTCGATGGACAGG CCCGTGTCCTTGTTCAAGAT Beta2AMPK TTCTTTGTGGACGGACAGTG TCTTGTAGCGATGGGTTGC Beta-Actin mouse TGTTACCAACTGGGACGACA CCATCACAATGCCTGTGGTA Bcl-xL/S MAus neu(#3)_qPCR_s GGATGGCCACCTATCTGAAT BNP CTGAAGGTGCTGTCCCAGAT CCTTGGTCCTTCAAGAGCTG CD36 GCAAAGAAGGAAAGCCTGTG TCTACCATGCCAAGGAGCTT COL1A1 ACCCGAGGTATGCTTGATCT CCTCGACTCCTACATCTTCT COL1A3 AACCTGGAAGGGATGGAAAC ATGCCATTAGAGCCACGTTC COX1 GGAGCCCCAGATATAGCATTC TGTGTTTAGGTTGCGGTCTG COX3 CGTGAAGGAACCTACCAAGG TTCTGAAGCTTGGAGGATGG CPT1 CACGAAGCCCTCAAACAGAT CCAGAGCCCTGTACCAAAGA CTRP2 ATACCGCATTCGGACTTTTG GAAGAGGCCATTCTGCTCTG CTRP7 CCTTGCTGGTGAGAAAGGAG TATCCGGTACTGCCCATTGT EDN1 ACTTCTGCCACCTGGACATC ACTTTGGGCCCTGAGTTCTT FAS AAGTTGCCCGAGTCAGAGAA GGAGTGAGGCTGGGTTGATA FIAF GCATGGCTGCCTGTGGTAAC AAGAGTTCCTGGCAGTCCCG Gamma1AMPK ACGAACTGGAGGAGCACAAG CAAAGTAGTGGGACCGATGC Gamma2AMPK TTCCAGGAGGAAGAAGACTCAG ATTCACCAAAGGCTTGAAGGT Gamma3AMPK AGTCTCCATCTCTCCCAATGA TACAGCCAAATCTCGGAATG GLUT4 TCATTCTTGGACGGTTCCTC ATTGGACGCTCTCTCTCCAA IMR 1151/1152 (Leptin- Genotypisierung) TGTCCAAGATGGACCAGACTC ACTGGTCTGAGGCAGGGAGCA Leptin TTCACACACGCAGTCGGTAT CCACCACCTCTGTGGAGTAGA MKP1 AAGGATGCTGGAGGGAGAGT AAGCTGAAGTTCGGGGAGAT MMP8 TCAACCAGGCCAAGGTATTG TTGGATGGGGTTGTCTGAAG MMP9 AGCACAACAGCTGACTACGA GACAGAAACCCCACTTCTTG ND1 CTCCTCGTCCCCATTCTAATC TGAAATTGTTTGGGCTACGG ND5 TGGCAGACGAACAAGACATC TTGTGAGGACTGGAATGCTG ND6 TGGTTTTAGGGTTTGGTGGA GCTACCCCAATCCCTCCTT NRF1 GCACCTTTGGAGAATGTGGT GGTGGCCTGAGTTTGTGTTT pcDNA3.1_HIII+1bp fw_b TACCGAGCTCAGGATCCA pcDNA3.1_HIII+2bp fw_a TACCGAGCTCAAGGATCCACTA pcDNA3.1_HIII+2bp fw_c TACCGAGCTCGGATCCACTAAA pcDNA3.1_HIII+2bp fw_d TACCGAGCTCGGATCCACTAA Material und Methoden 25 Gen sense antisense pcDNA3.1 rev_e CAACAGATGGCTGGCAACTA PDK4 AAAGATGCTCTGCGACCAGT GAGACGAGAAATTGGCAAGC SCD1 CTGACCTGAAAGCCGAGAAG TAGTCGAAGGGGAAGGTGTG SCD4 GCCACCGAACCTATAAAGCA TACCAGTGTGGGCAGAATGA SERCA2 GCCTCTACAGCAACCTTCAGC CGACAGACCGTGCATGTAG tCAD TACCCAACTGTGGCTGAGGT TGAGGAGAGAGAAGAGCAGCA TNFalpha ACGGCATGGATCTCAAAGAC CGGACTCCGCAAAGTCTAAG pcDNA4/3.1_muta_sense /antisense 07/07 CTTTAGCCCGTGGATCTGTCTCTAGT AAGGGCG CGCCCTTACTAGAGACAGATCCACGGGCTAA AG 3.2.4 Klonierung von DNA Für die Klonierung wurden die DNA-Fragmente mittels Proofreading Polymerase amplifiziert. 3.2.4.1 Klonierung alpha2AMPK Die cDNA des humanen alpha2AMPK wurde in die Vektoren pcDNA3.1/V5-HIS-TOPO (vgl. Abb. 3-1) und pcDNA4/TO/myc-HIS (ohne Abb.) unter Verwendung der T4-Ligase von Fermentas kloniert. Die Ligation erfolgte über Nacht bei 4°C gemäß dem Ansatz: Substanz Volumen in µl 5 x ligase buffer 2.0 Template (Vektor/2ng) x alpha2AMPK cDNA (30ng) x T4-Ligase (1 Weissunit) 1.0 DEPC dH2O ad 10 µl Zur Expression des Proteins mit angehangenem Tag musste das Stopcodon der cDNA mutiert werden. Dies erfolgte mittels Stratagene Quickchange Site Directed Mutagenesis Kit. Folgender Ansatz wurde pipettiert: Substanz Volumen in µl 10 x reaction buffer 2.5 Template (Midipräparation) 1.0 100 pmol Primer je 0.5 dNTP Mix 0.5 Quick solution (XL-Kit) 1.5 Pfu Ultra High Fidelity Polymerase 0.25 DEPC dH2O 18.5 Reaktionsbedingungen (95 °C 2’,18 x [95 °C 50’’, 60 °C 50’’, 68 °C 2,5’/1 kb], 68 °C 7’, 4 °C Pause) Material und Methoden 26 3.2.5 Vektoren Tabelle 3-9 Übersicht zu verwendeten Vektoren zur Klonierung und Überexpression Vektor Hersteller pcDNA 3.1 V5-His-TOPO Invitrogen pGEMT Promega pcDNA 3.1(+) Invitrogen pcDNA 6 / TR Invitrogen 3.2.5.1 Transformation von Plasmid-DNA in E. coli Zellen 1 µl des Ligationsansatzes wurde nach Denaturierung (10’ bei 68 °C) in elektrokompetente TOP10-E.coli transformiert. Nach 30-minütiger Inkubation auf dem Schüttler wurden die transformierten Bakterien auf LB-Agar mit entsprechendem Selektionsagenz ausplattiert. Bakterienstamm Zur Transformation wurden elektrokompetente Bakterien von Invitrogen verwendet: TOP10 Electrocomp™ (C644) - F- mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) φ80lacZΔM15 ΔlacX74 recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1 nupG Abbildung 3-1 Klonierungsvektor - pcDNA 3.1 nV5 Material und Methoden 27 3.2.5.2 Sequenzierung doppelsträngiger DNA 200 - 300 ng der isolierten DNA wurden nach der Ketten-Abbruchmethode nach Sanger sequenziert. Die Sequenzierung wurde mit BigDye® Terminator v1.1 Cycle Sequencing Kit (ABI) durchgeführt und folgender Ansatz pipettiert: Substanz Volumen in µl 5 x reaction buffer 2 Template (Midipräparation) 200 – 300 ng 10 pmol Primer 1.0 Sequenzierpremix 4 Reaktionsbedingungen (96 °C 1’,30x [96 °C 30’’, 58 °C 15’’, 60 °C 4’], 4 °C Pause) Tabelle 3-10 Übersicht zu verwendeten Sequenzierprimern Gen sense antisense Alpha2AMPK AGCATCGATGATGAGGTGGT CAACGGGCTAAAGCAGTGAT pcDNA3.1 fw GTAAAACGACGGCCAG - T7 TAATACGACTCACTATAGGG - SP6 - ATTTAGGTGACACTATAG Die Sequenzierung erfolgte in einem Sequenzer der Firma Applied Biosystems ABI 3100 Genetic AnalyzerC. Die Auswertung der erhaltenen Sequenz erfolgte mittels VectorNTI6.0-Programm und http://www.ncbi.nlm.nih.gov/. 3.2.5.3 Präparation von Plasmid-DNA (DNA-Minipräparation / Midipräparation) 2 ml einer 3 ml-Übernachtkultur wurden 10’ bei 6.000 rpm sedimentiert, das Bakterienpellet in 200 µl P1 resuspendiert und nach Zugabe von 200 µl P2 kurz bei Raumtemperatur inkubiert. Die Fällung der Proteine erfolgte anschließend durch Zugabe von 200 µl P3 und kurzem Vortexen. Die so lysierten Bakterien wurden bei RT 30’ bei 14.000 rpm zentrifugiert und der Überstand in einen neuen Tube überführt. Die Zugabe von 600 µl Isopropanol, mehrmaligem Invertieren und die nachfolgende Zentrifugation für 10’ bei 14.000 rpm fällte die Plasmid-DNA. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit mindestens 500 µl 70%igem EtOH gewaschen. Nach vorsichtigem Dekantieren des Überstandes und kurzem Trocknen der Plasmid-DNA erfolgte die Resupendierung in einem entsprechenden Vol TE-Puffer oder Aqua-bidest. Zur Kontrolle wurden 500 ng-1 µg mit entsprechenden Restriktionsenzymen verdaut oder 200 - 300 ng zur Sequenzierung eingesetzt. Von dem so ermittelten korrekten Klon diente der Rest der Übernachtkultur zum Animpfen einer Midi-Kultur (100-200ml). Am nächsten Tag, bei Erreichen einer OD von http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ Material und Methoden 28 0,5 wurden Glycerol-Stocks der Bakterienkultur angefertigt. Hierfür wurden 500 µl der Bakterienkultur mit 500 µl sterilem 30%-igem Glycerol versetzt und nach 15’ Inkubation bei RT bei –80 °C zur weiteren Verwendung gelagert. Die restliche Bakterienkultur wurde bei 6000 g für 15 min bei 4 °C sedimentiert und die Plasmid-DNA im Anschluss mittels des QIAGEN® Plasmid Plus Midi Kit isoliert. Der Aufschluss der Bakterien und die Fällung der Proteine erfolgten gemäß Herstellerangaben. Der Überstand wurde auf eine Säule überführt, wo die Plasmid- DNA an die in der Säule befindlichen Partikel gebunden und im Anschluss mit Waschpuffer gereinigt wurde. Die Elution der Plasmid-DNA erfolgte entweder mit dem im Kit enthaltenen Elutionspuffer oder Aqua bidest (500 µl). Die mit Hilfe der Plasmid- Präparationskits isolierten Plasmide sind endotoxinfrei und somit für Transfektion in Zellkulturlinien einsetzbar. Plasmid-Präparation P1 10 mM EDTA, 50 mM Tris, pH 8,0, 100 µg/ml RNaseA P2 0,2 M NaOH, 1% SDS P3 3 M KAz pH 5,5 TE-Puffer 10 mM Tris/HCl, 1 mM EDTA, pH 8,0 3.2.6 Isolation von Proteinen aus Gewebe Zur Isolation von Proteinen wurden folgende Puffer verwendet: Sucrose-Puffer zur Proteinisolierung aus tierischem Gewebe und SDS-Lysis-Puffer für Zellen. Beiden Puffern wurden direkt vor Verwendung Protease- und Phosphatase-Inhibitoren zugesetzt (je 1 : 200). Sucrose-Puffer (0,32 mM Sucrose, 10 mM Tris pH 8,0, 3 mM CaCl2, 2 mM MgAz, 0,1 mM EDTA, 0,5 % (v/v) NP-40, 1 mM DTT; direkt vor Verwendung frisch zugeben: Protease-Inhibitor 1 : 200, Phosphatase-Inhibitor Cocktail 1 : 200, 50µg/ml Saponin) SDS-Lysis-Puffer (50 mM Tris (pH 8,3); 1 % SDS; 2 mM EDTA; 6x SDS-Probenpuffer (120 mM DTT, 70 mM Tris pH 6,8, 2 % (w/v) SDS, 6 % (v/v) Glycerol, 1 Spatelspitze Bromphenolblau) 3.2.6.1 Gewebe Das tiefgefrorene Gewebe wurde mechanisch zerkleinert, in 10 Vol Sucrose-Puffer (vgl. 3.1.2) an eingesetztem Gewicht aufgenommen und mittels Ultraturrax Material und Methoden 29 homogenisiert. Nach 30-minütiger Inkubation auf Eis folgte ein Zentrifugationsschritt der Proben von 20’ bei 14.000 rpm und 4 °C. Der die Proteine enthaltende Überstand wurde in ein neues Tube überführt. Zur Bestimmung der Proteinkonzentration wurden die Proben 1 : 20 verdünnt und mittels BCATM Protein AssayKit (Pierce USA) als Doppelbestimmung vermessen. 45 - 100 µg wurden in SDS-Probenpuffer denaturiert und auf einem 7,5 - 12,5%igen Gel aufgetrennt. 3.2.6.2 Zellen Das Ablösen der Zellen erfolgte unter Verwendung kleiner Schaber und 150 µl SDS- Lysis-Puffer je Well einer 6-Well–Platte bzw. 300 µl je 60 mm-Schalen (vgl. 3.1.2). Die Zellen wurden anschließend mittels Ultraschall aufgeschlossen und danach für 30’ auf Eis inkubiert. Die nachfolgende Zentrifugation für 5’ bei 14.000 rpm und 4 °C war erforderlich um den Überstand ohne Zelltrümmer in einen neuen Tube zu überführen. Die Messung der Proteinkonzentration erfolgte adäquat zu den Zellen. Die Proben wurden dafür 1 : 10 verdünnt vermessen, zur weiteren Verwendung in SDS- Probenpuffer aufgenommen, denaturiert und auf einem 7,5 - 12,5%igen Gel aufgetrennt. 3.2.7 Proteinanalyse 3.2.7.1 SDS-Polyacrylamid-Gelektrophoreses (SDS-PAGE) Die in SDS-Probenpuffer aufgenommenen Proteine wurden 5 min bei 95 °C denaturiert. Zur Analyse wurden zwischen 20 µg und 100 µg Protein auf ein Gel aufgetragen und elektrophoretisch getrennt. Die Konzentration des Laufgels richtete sich nach der Größe der aufzutrennenden Proteine (z. B. alpha2AMPK mittels 10 % SDS Laufgel) Verwendet wurden Mini-Protean II - Gelapparaturen der Firma Bio-Rad. Die Auftrennung der Proteine erfolgte im Sammelgel bei 15 - 20mA/Gel und im Laufgel bei 30 - 40 mA/Gel. Zusammensetzung der Gele Laufgel Sammelgel Konzentration 10 % 12,5 % 5 % Aqua bidest 4,30 ml 3,55 ml 2,95 ml 40 % Acrylamid 3,00 ml 3,75 ml 0,50 ml Puffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8) 4,50 ml 4,50 ml - Puffer (1 M Tris-HCl, pH 6,8) - - 0,50 ml 10 % SDS 120 µl 120 µl 40 µl 10 x APS 100 µl 100 µl 25 µl TEMED 10 µl 10 µl 5 µl Material und Methoden 30 3.2.7.2 Western-Blotting und Antikörperfärbung Für die anschließende Antikörperfärbung mussten die Proteine auf Nitrocellulosemembran (vgl. 3.1.6.) übertragen werden. Hierfür wurden die separierten Proteine mittels Nass-Blot-Verfahrens vom Gel auf eine Nitrocellulose-Membran mit einer Porung von 0,45 µm übertragen. Der Transfer der Proteine erfolgte über 60 - 80 min bei 100 - 120 V bei einer Temperatur von 4 °C, um ein Überhitzen der Proteine zu verhindern. Zum Nachweis der gebundenen Proteine auf der Membran wurde diese 5 - 10’ mit PonceauS reversibel gefärbt. Die Aufhebung der reversiblen Färbung geschah durch Benetzen der Membran mit Wasser. Anschließend zur Absättigung freier Bereiche, wurde die Membran mit 5 % Trockenmilch 1 h bei RT unter leichtem Schwenken inkubiert. Die Immunfärbung erfolgte mittels proteinspezifischer Antikörper 1 h bei RT oder über Nacht ebenfalls unter leichtem Schwenken. Danach wurde die Membran 3 x 10’ bei RT mit 1 x TBST gewaschen. Zur Detektion des primären Antikörpers wurde ein sekundärer Antikörper auf die Membran gegeben und 1h bei RT inkubiert. Im Anschluß, nach erneutem 3 maligem waschen, erfolgte die Färbung der Membran je nach Art des sekundären Antikörpers. Bei Verwendung der HRP wurde frisch hergestellte Chemilumineszenz-Reagenz (ECL-Reagenz) aufgetragen, 1 min inkubiert und anschließend ein Lumineszenz-Film aufgelegt. Die Filme wurden mit Kodak D-19 Developer entwickelt, kurz in Wasser gewaschen und mit Kodak GBX fixer/replenisher fixiert. Bei Immunfärbungen mittels Alkalischer Phosphatase erfolgte der Nachweis direkt auf der Membran. Dafür wurde ein Gemisch aus BCIP und NBT aufgetragen und nach erfolgreicher Färbung durch Benetzen der Membran mit Wasser fixiert. Die Auswertung der Blots war nach Einscannen mittels Argus-X1 Software (Biostep) und Totallab Software möglich. Die verwendeten Antikörper mit entsprechender Konzentration sind in Tabelle 3-11 zusammengefasst. Laufgelpuffer (1,5 M Tris-HCl, pH 8,8) Sammelgelpuffer (1 M Tris-HCl, pH 6,8) 6 x Probenpuffer (Protein) (120 mM DTT, 70 mM Tris pH 6,8, 2 % (w/v) SDS, 6 % (v/v) Glycerol, 1 Spatelspitze Bromphenolblau) 10 x Laufpuffer (250 mM Tris, 2 M Glycin, 35 mM SDS) Coomassie-Faerbepuffer (2 g Coomassie Brilliant Blue R250, 0,7 % Ethanol, 8,6 % Methanol, 17, 3 % Essigsäure) Entfärbepuffer (20 % Methanol, 10 % Essigsäure) Blotpuffer (25 mM Tris, 192 mM Glycin, 0,02 % / 0,05 % (w/v) Material und Methoden 31 SDS, 20 % (v/v) Methanol) 10 x TBS (1 M NaCl, 100 mM Tris) 1 x TBST (100 mM NaCl, 10 mM Tris, 0,2 % Tween 20) Ponceau S (0,5 g Ponceau S, 1 % Essigsäure) AP-Lösung (AP-Puffer: 100 mM Tris-HC, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl2 x 6 H2O; Reaktionsansatz: AP-Puffer, 0,33 mg/ml NBT in 70 % DMF, 0,165 mg/ml BCIP in 100 % DMF) ECL-Lösung (100 mM Tris-HCL (pH 8,5), 0,225 mM p-Coumarsäure, 1,25 mM Luminol, 0,009 % H2O2) Verwendete Antikörper Tabelle 3-11 Übersicht zu verwendeten Antikörpern für Western-Analysen mit Angabe der eingesetzten Konzentration Antikörper Hersteller Spezies Eingesetzte Verdünnung GAPDH Cell Signaling Technology, Inc. Mouse, monoclonal 1 : 2000 pACC (Ser79) Cell Signaling Technology, Inc. Rabbit, polyclonal 1 : 1000 alphaAMPK Cell Signaling Technology, Inc. Rabbit, polyclonal 1 : 1000 alpha2AMPK Cell Signaling Technology, Inc. Rabbit, polyclonal 1 : 1000 phosphoAMPKalpha (Thr 172) Santa Cruz Biotechnology, Inc. Rabbit, polyclonal 1 : 1000 Anti-rabbit IgG / HRP-linked Santa Cruz Biotechnology, Inc rabbit 1 : 5000 Anti-rabbit IgG / AP-linked Santa Cruz Biotechnology, Inc rabbit 1 : 5000 Anti-mouse IgG / HRP-linked Santa Cruz Biotechnology, Inc mouse 1 : 5000 Anti-mouse IgG / AP-linked Santa Cruz Biotechnology, Inc mouse 1 : 5000 3.2.8 Bestimmung von Fettsäure- und Triglycerid-Gehalt Zur Bestimmung des Gehaltes an freien Fettsäuren und Triglyceriden in Gewebe und Serum wurden folgende Kits verwendet: TRI-Serum Triglyceride Determination Kit von Sigma und der NEFA C-ACS-ACOD-Methode enzymatischer Farbtest von WAKO. Durchgeführt wurde die Messung wie in dem vom Hersteller angegebenen Protokoll. Die Auswertung erfolgte mittels ELISA. Lesegerät (Dynatech MR 5000; Dynatech Laboratories, Chantilly, USA) und unter Abgleich der Messwerte auf den Proteingehalt. Material und Methoden 32 3.2.9 Bestimmung des Serumgehaltes von Adiponektin, Leptin und Insulin 3.2.9.1 Adiponektin-ELISA Verwendet wurde der ELISA Kit von Assay Pro für Humanes Insulin (Acrp30), mit welchem laut Hersteller auch die Detektion von murinem Adiponektin möglich ist. Die Serumproben wurden 1 : 500 mit der im Kit enthaltenen Lösung verdünnt und je 50 µl im Doppelansatz auf den Gehalt an Adiponektin entsprechend der Herstelleranweisung untersucht. Der Assay wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISA-Lesegerät (Dynatech MR 5000; Dynatech Laboratories, Chantilly, USA) bei 450 nm und unter Abgleich der Messwerte auf den Proteingehalt. 3.2.9.2 Insulin-ELISA Verwendet wurde der ELISA Kit von Mercodia für die Detektion von Maus Insulin. Die Serumproben wurden unverdünnt zu je 25 µl im Doppelansatz auf den Gehalt an Insulin entsprechend der Herstelleranweisung untersucht. Die Serumproben sollten vor der Verwendung nicht mehrfach aufgetaut und wieder eingefroren werden. Der Assay wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISA-Lesegerät (Dynatech MR 5000; Dynatech Laboratories, Chantilly, USA) bei 450 nm und unter Abgleich der Messwerte auf den Proteingehalt. 3.2.9.3 Leptin-ELISA Verwendet wurde der ELISA Kit von Biovendor für die Detektion von murinem Leptin. Die Serumproben wurden 1 : 20 verdünnt und zu je 100 µl im Doppelansatz auf den Gehalt an Leptin entsprechend der Herstelleranweisung untersucht. Bei der Verdünnung der Serumproben sollte darauf geachtet werden, dass es beim Vortexen nicht zu Schaumbildung kommt. Der Assay wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Die Auswertung erfolgte mittels ELISA-Lesegerät (Dynatech MR 5000; Dynatech Laboratories, Chantilly, USA) bei 450 nm und unter Abgleich der Messwerte auf den Proteingehalt. 3.3 Tiermodell im Versuch Für den Versuch wurden männliche Tiere des Stammes C57BL/6 ausgewählt. Die Durchführung der Versuche entsprach den Bestimmungen des Tierschutzgesetzes und den Richtlinien zur Durchführung von Tierversuchen nach Antrag (2-666-MLU) sowie ausreichender Prüfung. Material und Methoden 33 Die Tiere wurden unter standardisierten Bedingungen (12 h Tag/12 h Nacht; 23 °C) gehalten, ad libitum gefüttert (in Haltung) und ständiger Zugang zu frischem Wasser gewährleistet. Während des Versuches waren die Tiere einzeln in Käfigen untergebracht. Aufgrund einer 14tägigen Analyse der täglichen Futteraufnahme wurde im Verlauf des Versuchs das Futter individuell für jedes Tier eingewogen und verabreicht. Die Tiere erhielten eine tägliche Futterration und es wurde die tägliche kcal-Aufnahme sowie wöchentlich das Gewicht der Tiere dokumentiert. 3.3.1 Mausstamm C57BL/6J (Quelle Bild: The Jackson Laboratory, USA) C57BL/6 sind resistent gegen audiogen verursachte Anfälle, besitzen eine relativ geringe Knochendichte und entwickeln mit zunehmendem Alter einen Gehörverlust. Der Stamm ist homozygot für Cdh23ahl, die Mutation für altersassoziierten Gehörverlust. Die Tiere entwickeln ab einem Alter von durchschnittlich 10 Monaten einen progressiven Verlust des Gehörs. Für die Durchführung des Fütterungsversuches wurden männliche Tiere im Alter von 3 (Gruppe juvenil) bzw. 18 Monaten (Gruppe adult) ausgewählt. 3.3.2 Einfluss fettreicher Nahrung Tabelle 3-12 verabreichte Diät, Organentnahme, Histologie Diät High Fat (Resaerch Diets) [HF] 4730 kcal Haltungsdiät (Altromin) [HD] 2500 kcal Organentnahme LV, RV, Atria, M.gastrocnemius, M. quadriceps, Leber, Fettgewebe subcutan und visceral Einbettung für histologische Untersuchungen (Kryoeinbettung) LV, M. quadriceps, Fettgewebe subcutan und visceral Dabei erhielten die Tiere unter fettreicher Fütterung ihren täglichen kcal-Bedarf aus den speziellen Diäten, wobei z. B. bei fettreicher Diät der Hauptteil der kcal aus Schweineschmalz besteht. Material und Methoden 34 Für den Versuch wurden juvenile und adulte Tiere 6 bzw. 14 Wochen mit den verschiedenen Diäten gefüttert. Die adulten Tiere wurden in 4 Gruppen eingeteilt: HF / HD 6 Wochen Fütterung (n = 7) HF / HD 14 Wochen Fütterung (n = 8) Die juvenilen Tiere wurden in 6 Gruppen eingeteilt: HF / HD 6 Wochen Fütterung (n = 6) HF / HD 14 Wochen Fütterung (n = 6) Das Gewicht wurde wöchentlich notiert und am Ende des Versuchs wurde die Herzfunktion mittels transthorakaler Echokardiographie dokumentiert. Hierfür wurden die Tiere mit Isofluran während der Untersuchung narkotisiert. 3.3.3 Untersuchung der kardialen Funktion mittels transthorakaler Echokardiographie 3.3.3.1 Methoden der Echokardiographie  M-Mode Über die linksparasternale Längsachse wurden die Wanddicken bzw. Durchmesser des Interventrikularseptums (IVS), des linken Ventrikels (LVD) und der linksventrikulären Hinterwand (LVPW) in der Diastole (IVSd, LVDd, LVPWd) und in der Systole (IVSs, LVDs, LVPWs). LVEF u FS [%] aus dieser Messung abgeleitet. Die linksventrikuläre Auswurffraktion (LVEF) wurde automatisch nach der Formel von Teichholz: EF = EDV – ESV / EDV über den integrierten Rechner des Ultraschallgerätes berechnet. Außerdem wurde noch die Verkürzungsfraktion (FS % - fractional shortening) erfasst. Beim fractional shortening handelt es sich um einen berechneten relativen Wert, der die Verkürzung des Herzens während des Pumpvorganges beschreibt. Berechnet wird dieser aus dem größten und kleinsten Durchmesser der linken Herzkammer: (LVEDd-LVESd)/LVEDd Material und Methoden 35 Abbildung 3-2 A Linksparasternale Längsachse - Schematische Darstellung rechts (1 – linker Ventrikel Vorderwand; 2 – Aorta und Artenklappe; 3 - Mitralklappe; 4 - linkes Atrium; 5 – Papillarmuskel; 6 – linker Ventrikel Hinterwand) Abbildung 3-2 B Messung im M-Mode (linksparasternale Längsachse linker Ventrikel) - Schematische Darstellung rechts (1 - Mitralklappensegel; 2 / 5 - linker Ventrikel Vorderwand; 3 / 6 - linker Ventrikel; 4 / 7 - linker Ventrikel Hinterwand) Abbildung 3-2 C Messung im M-Mode (linksparasternale Längsachse Aorta/Aortenklappe und linker Vorhof) - Schematische Darstellung rechts (1 - Aorta; 2 - linker Vorhof diastolisch; 3 – linker Vorhof systolisch; 4 – Aortenklappe offen; 5 – Aortenklappe geschlossen)  Doppler-Verfahren Im apikalen Vier-Kammer-Blick wurde mittels Doppler-Verfahren das transmitrale Flussprofil erstellt. Die sogenannte E-Welle entsteht durch den passiven Einstrom des Bluts in den linken Ventrikel im Rahmen der Entspannung des ventrikulären Myokards. Material und Methoden 36 Die Berechnung des Verhältnisses der frühen (early) zur atrialen linksventrikulären Füllung (E/A) erfolgte über den integrierten Rechner des Gerätes. Die sogenannte E- Welle entsteht durch den passiven Einstrom des Bluts in den linken Ventrikel im Rahmen der Entspannung des ventrikulären Myokards. Die A-Welle stellt die Kontraktion des Vorhofes dar. Im Normallfall ist der passive Einstrom größer als die Pumpleistung des Vorhofs, so dass die Ratio (E/A) beim gesunden menschlichen Herzen zwischen 1,0 und 1,5 liegt. Die Dauer der A-Welle nimmt mit zunehmendem diastolischem Druck im linken Ventrikel ab. Die Ergebnisse der Messung zum Ende des Versuchs wurden als Mittelwert ± Stan- dardabweichung berechnet nach One-Way Anova bzw. t-test dargestellt. Abbildung 3-3 schematische Darstellung der Dopplermessung des transmitralen Durchflusses Schematische Darstellung (1 - Emax passiver früher (early) Einstrom; 2 - Amax später (atrial) Einstrom) 3.3.4 Histologie 3.3.4.1 Färbung von Fetteinlagerungen im Herzgewebe Öl-Rot-O-Stammlösung (300 mg Oil Red-O, 100 ml Isopropanol gut mischen; bei RT max 3 Monate haltbar) Öl-Rot-O-Arbeitslösung (24 ml Oil Red-O Stammlösung, 16 ml Aqua dest mischen, 10 min stehen lassen, filtrieren; max 3 h haltbar) Die Kryoschnitte der Proben sollten eine maximale Dicke von 8 µm aufweisen. Zunächst wurden die Schnitte 10 min in 3,7 % Formaldehyd/PBS fixiert und anschließend mit PBS gewaschen. Die Färbung der so vorbereiteten Proben erfolgte für 10 min-1 h in der Öl-Rot-O-Arbeitslösung. Nach erneutem Waschen mit PBS wurde eine Gegenfärbung der Kerne mit DAPI (1 : 5000) durchgeführt. Die Schnitte wurden mit PBS gewaschen und anschließend mit Glycerin-Gelatine eingebettet. Nach Aufsetzen des Deckgläschens wurde dieses luftdicht mit Nagellack abgedichtet. Material und Methoden 37 3.3.4.2 Zellmembran-Färbung von Kardiomyozyten mit Lectin Färbung: Lectin-TRITC labeled von Tritium vulgaris Fixierung: Vector VECTASHIELD Die Kryoschnitte der Proben sollten eine maximale Dicke von 10 µm aufweisen. Zunächst wurden die Schnitte 10 min in 3,7 % Formaldehyd/PBS fixiert und anschließend mit PBS (2 x 2 min) und Wasser (5 min) gewaschen. Im Anschluss daran wurde das TRITC markierte Lectin 1 : 8 verdünnt mit 1 mM Tris pH 7,4 auf die Schnitte aufgetropft und für 1 h bei Raumtemperatur abgedunkelt inkubiert. Die Schnitte wurden mit PBS kurz gewaschen (2 x 2 min) und anschließend mit DAPI die Zellkerne gegengefärbt (2 min). Nach einem weiteren Waschschritt mit PBS (1 min) wurden die Schnitte mit Vector VECTASHIELD eingebettet. Die Zellgrößen wurden mittels Fluoreszensmikroskop und dem Programm Image J ausgewertet. 3.3.4.3 Kollagen-Färbung von Kardiomyozyten mit Sirusrot nach Puchtler Färbung: 0,1%ige Pikro-Siriusrot (F3BA)-Lösung Fixierung: 0,01 N HCl-Lösung Die Kryoschnitte der Proben sollten eine maximale Dicke von 5 µm aufweisen. Die Schnitte wurden 20 min an der Luft getrocknet. Anschließend wurden die Gewebeschnitte ähnlich Paraffin-Schnitten behandelt, um Hintergrund-Färbungen der Kardiomyozyten zu entfernen. Hierzu wurden die Schnitte 10 min bei RT in Xylol inkubiert und über eine absteigende Ethanol-Reihe (100 %, 96 %, 80 %, 70 %) in Wasser übertragen. Anschließend wurden die Gewebeschnitte mit 0,1%iger Siriusrot- Pikrinsäure-Lösung über 1 h bei 25 °C gefärbt. Im Anschluss daran wurden die gefärbten Schnitte 2 min in 0,01 N HCl-Lösung gewaschen. Mittels aufsteigender Ethanol-Reihe (70 %, 80 %, 96 %, 100 %) wurden die Gewebeschnitte anschließend dehydriert und 2 x 10 min abschließend in Xylol getaucht. Die Einbettung der gefärbten Schnitte erfolgte mit Entellan-Medium. 3.3.5 Messung der Aktivität der Mittelketten-Acyl-CoA-Dehydrogenase (Medium Chain Acyl CoA Dehydrogenase – MCAD) Zur Messung der Enzymaktivitäten wurden zunächst Muskelhomogenate der in flüssigem Stickstoff gelagerten Proben hergestellt. Hierfür wurden etwa 30 mg kryokonserviertes Gewebe des linken Ventrikels sofort in eiskalten Chappel-Perry- Puffer (1/30 Gewicht/Volumen) überführt und auf Eis über 7 Minuten homogenisiert. 40 µl des Homogenates wurden für den Test nach Lehmann et al. eingesetzt (Lehman et al. 1990). Als Substrat wurde Octanoyl-CoA eingesetzt. Aufgrund des Substratabbaus wird Ferriceniumhexafluorophosphat durch die ß-Oxidation zu Ferrocen reduziert. Material und Methoden 38 Diese Reduktion in Form einer Extinktionsabnahme ist bei 300 nm und einer Temperatur von 25 °C an einem Spektralphotometer messbar. Nach Zugabe des Substrats und der Ferriceniumhexafluorophosphats wurden die Proben auf Eis gelagert und mussten innerhalb einer Stunde gemessen werden. 3.4 Zellkultur 3.4.1 Zelllinien Tabelle 3-13 Übersicht zu verwendeten Zelllinien Zelllinie Quelle Beschreibung C2C12 Mus musculus Myoblasten (Skelettmuskel) H9C2 Rattus norvegicus Kardiomyoblasten HEK 293 Embryonale Nierentumorzellen Homo sapiens human embryonic kidney”-Zellen 3.4.2 Kultivierung und Passagieren der Zellinien Medium folgender Zusammensetzung wurde zur Kultivierung der verschiedenen Zelllinien (Tab. 3-2) verwendet: DME-Medium (4,5 g/l Glucose, mit 10 % FBS, 1 mM Natrium-Pyruvat, 4 mM Glutamat und 100 U/ml Penicillin/Streptomycin). Das Passagieren der Zellen war bei Erreichen einer 60-80%igen Konfluenz erforderlich. Hierfür wurde das Kulturmedium abgesaugt, die Zellen mit warmem PBS gewaschen und mit 0,05 % Trypsin / 0,02 % EDTA-Lösung überschichtet. Nach einer 5-minütigen Inkubation bei 37 °C löste sich der Zellrasen vom Boden der Schale ab. Zur Inaktivierung des Trypsins wurde die doppelte Menge an vorgewärmtem Medium zugegeben. Die Zellsuspension wurde bei 1500 rpm 3 min zentrifugiert und das Zellpellet anschließend in 1 ml Medium resuspendiert. Nach Bestimmung der Zellzahl (Trypan-Blau und Neubauer-Zählkammer) erfolgte die Aussaat der Zellen in entsprechender Zahl auf neue Kulturschalen. Für eine langfristige Lagerung der Zellen in Stickstoff wurden diese in Medium resuspendiert, das 10 % DMSO enthielt. Über Nacht wurden die so vorbereiteten Zellen bei –80 °C gelagert und danach in Stickstoff eingefroren. Zum Auftauen der Zellen wurden die Röhrchen im warmen Wasserbad aufgewärmt und zügig in Kulturmedium aufgenommen und auf der Schale verteilt. Am folgenden Tag sollte das Medium nochmals gewechselt werden. 3.4.3 Transfektion von HEK 293 und TRex HeLa Die Transfektion der DNA erfolgte mittels Lipofektion. Entsprechend den Herstellerangaben wurde das Plasmid in Transfektionsmedium, Opti-MEM®I (proteinarm – höhere Transfektionsraten), verdünnt und anschließend mit den Material und Methoden 39 Liposomen (Lipofectamin) gemischt. Nach 20-minütiger Inkubation bei RT wurde das DNA-Liposomen-Gemisch auf die Zellen gegeben und nach 4 - 6h durch Kulturmedium ersetzt. 3.4.4 Behandlung von HEK 293 und TRex HeLa mit Fettsäuren Zur Durchführung der verschiedenen Zellversuche wurden ausschließlich transient transfizierte und untransfizierte Zellen eingesetzt. Die Transfektion erfolgte dem in Kapitel 3.4.3 beschriebenen Vorgehen. 24 h vor Behandlung der Zellen wurde die entsprechende Fettsäure in absolutem, 5 - 10 min mit Stickstoff durchgastem EtOH, gelöst. Die so gelöste Fettsäure wurde unter Rühren und unter ständiger Stickstoffbegasung zu einer 12,5%igen fettsäurefreien Albuminlösung tröpfchenweise zugegeben. Die Fettsäurebindung an das Albumin erfolgte während der anschließenden Inkubation der Lösung für 16 - 24 h bei 37 °C auf dem Schüttler. Ölsäure wurde bereits fertig gelöst geliefert. Zur Herstellung einer 100 mM Stammlösung wurde die Fettsäure in DMSO verdünnt und anschließend die Arbeitskonzentration/en mittels Kulturmedium eingestellt und den Zellen zugegeben. Nach einer Inkubationszeit von 16 - 24h wurden die Zellen von der Schale abgeschabt und Proteine bzw. RNA isoliert. Der zur Extraktion der Proteine eingesetzte SDS- Lysispuffer enthielt Phosphatase- und Protease-Inhibitor in 200-facher Verdünnung. Zur Kontrolle wurden Zellen mit einer adäquaten Menge DMSO behandelt. 3.5 Statistische Auswertungen Die statistische Auswertung der Daten erfolgte mit Hilfe der Sigma Stat Software V 1.3 (Sigma Stat Software Inc., Chicago USA). Zur Berechnung wurde der Student’s T-Test sowie One-Way-Anova verwendet. Die Ergebnisse werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. Ein ermittelter Wert von P < 0,05 (*) und P < 0,01 (**) ist als statistisch signifikant und P < 0,001 (***) statistisch hochsignifikant zu werten. Ergebnisse 40 4 Ergebnisse 4.1 Einfluss Fütterung fettreicher Nahrung auf Körper- und Organgewicht Während einer Eingewöhnungsphase wurde der tägliche Futterbedarf jedes Tieres ermittelt. Im Anschluss daran erhielten die 4 und 18 Monate alten Tiere über eine Dauer von 6 und 14 Wochen eine Haltungs- (im Folgenden als HD oder Kontrolle bezeichnet) oder eine fettreiche Diät (HF). Bei der HD handelt es sich um eine Standarddiät mit 2500 kcal/kg (Zusammensetzung siehe Anhang), die unter Haltungsbedingungen verabreicht wird. Die fettreiche Diät, auch als Western-Diät (Wilson et al. 2007) bezeichnet, besitzt mit 45 kcal% einen Fettanteil der mit dem durchschnittlichen Anteil der Fette in der Nahrung der westlichen Industrienationen vergleichbar ist. Der hohe Fettanteil entstammte dabei Schweineschmalz. Bereits ab der 1. Woche zeigten die Tiere mit HF-Diät eine deutliche kontinuierliche Gewichtszunahme, die sich nach 14 Wochen bei den alten Tieren auf 10 % des Ausgangsgewichtes steigerte und bei den jungen Tieren eine mehr als 20%ige Zunahme ausmachte (Abb. 4-3). Die Gewichtszunahme war phänotypisch nach 6 Wochen kaum zu erkennen. In Abb. 4-1 sind repräsentative Tiere der jeweiligen Gruppen nach einem Zeitraum von 14 Wochen Versuchsdauer dargestellt. Deutlich ist hier die starke Gewichtszunahme in den HF-Gruppen zu sehen (Abb. 4-1). Abbildung 4-1 ausgewählte Tiere der einzelnen Gruppen nach 14 Wochen Fütterung der fettreichen Diät ; A –HD jung, B – HF jung, C - HD alt, D – HF alt Um Unterschiede in der täglichen kcal-Aufnahme als Ursache der Gewichtszunahme nachweisen zu können, wurde die aufgenommene Futtermenge täglich notiert und die Tiere wöchentlich gewogen. In Abb. 4-2 ist vergleichend der Gewichtsverlauf jeweils der Gruppe junger (Abb. 4-2 A) und alter (seneszenter) Tiere (Abb. 4-2 B) wöchentlich für den gesamten Versuchszeitraum dargestellt. Da die aufgenommene kcal-Menge A B C D Ergebnisse 41 nur geringfügig mit dem Fettanteil in der Nahrung auf durchschnittlich 1,5 - 2 kcal/d zunahm (nicht dargestellt), ist diese als Ursache für die Gewichtszunahme auszuschließen. Abbildung 4-2 zeitlicher Verlauf des Körpergewichtes der Gruppen HD und HF A – junge Tiere; B – alte Tiere Eingerechnet sind sowohl die Daten der 6 als auch der 14 Wochen analysierten Tiere (bis Woche 6 n = 15 (alt) und n = 12 (jung); ab der 7. Woche n = 8 (alt) und n = 6 (jung)) Bei den alten Kontrolltieren (HD) beobachteten wir während des Versuchszeitraumes einen Verlust von nahezu 5 % des Ausgangsgewichts. Diese rückläufige Gewichtsentwicklung ab einem Alter von ca. 16 - 18 Monaten ist als normale Alterungserscheinung aus der Literatur bekannt (Hamrick et al. 2006). Auch die alten Tiere der HF-Gruppe zeigten nach 14 Wochen der fettreichen Fütterung und einem Alter von 19 Monaten eine Stagnation hinsichtlich ihres Gewichtes. Entsprechend ihres Alters wiesen die jungen Tiere sowohl der HD- als auch der HF-Gruppe eine ihrer Wachstumsphase entsprechende konstante Zunahme an Gewicht auf (Abb. 4-2). In der Gruppe der jungen Tiere (6 - 8 Monate zum Studienende) lag die aufgenommene Ergebnisse 42 kcal-Menge der Kontrollgruppe bei 9,94 ± 0,32 kcal und bei den Tieren der HF-Gruppe bei 11,97 ± 0,47 kcal. Die seneszenten Tiere (22 Monate zum Studienende) der Kontrollgruppe nahmen durchschnittlich 11,19 ± 0,70 kcal und die der HF-Gruppe 14,96 ± 0,32 kcal auf. Anhand des wöchentlichen Mittels der aufgenommenen Kalorienmenge (nicht gezeigt) wird deutlich, dass die Zunahme an Körpergewicht auf den gesteigerten Fettanteil der Nahrung und nicht auf eine gesteigerte kcal-Aufnahme zurückzuführen ist. Abbildung 4-3 Vergleich der durchschnittlichen Endgewichte der einzelnen Gruppen: dargestellt als prozentuale Änderung bezogen auf das Ausgangsgewicht (alte Tiere n = 7 (6 Wochen) und n = 8 (14 Wochen); junge Tiere n = 6 (6 und 14 Wochen)) In Abb. 4-3 sind die Änderungen des Gewichtes der Tiere als prozentualer Anteil, bezogen auf das Ausgangsgewicht, dargestellt. Alte wie junge Tiere der HD-Gruppen zeigten nach 6 Wochen Versuchsverlauf eine negative Gewichtsentwicklung. Dieser Gewichtsverlust der Tiere ist möglicherweise durch den Wechsel der Haltungsbedingungen zu erklären. Um für jedes einzelne Tier eine exakte Bestimmung der Futtermenge über den gesamten Versuch zu ermöglichen, wurden die Tiere zu Ergebnisse 43 Beginn des Versuchs aus Gemeinschaftshaltung in Einzelhaltung überführt. Nach 14 Wochen unter fettreicher Diät hatten die alten Tiere ihr Gewicht um 10,9 ± 2,28 % und die jungen Tiere um 21,73 ± 1,71 % gesteigert. Als Folgen der Lipidbelastung vermuteten wir eine gesteigerte Akkumulation von Triglyceriden in den Organen. Das Gewicht der einzelnen Organe ist in Tab. 4-1 aufgeführt. Tabelle 4-1 durchschnittliche Organgewichte nach 6 und 14 Wochen unter fettreicher Diät; statistische Signifikanzen angegeben als (*) < 0,05; (**) < 0,01; (***) < 0,001 jung vs. alte Tiere der entsprechenden Gruppe (6 bzw. 14 Wochen) (#) < 0,05; (##) < 0,01; (###) < 0,001 HD- Gruppe vs. HF-Gruppe gleichen Alters (KG – Körpergewicht) 6 Wochen HD jung HF jung HD alt HF alt Linker Ventrikel [mg] 101,33 ± 3,51 100,33 ± 5,17 124,43 ± 4,49 ** 121,00 ± 2,51 ** Linker Ventrikel [mg] /KG [g] 3,74 ±