Aus dem Institut für Lebensmittelchemie und Lebensmittelbiotechnologie der Justus Liebig Universität Gießen Biotechnologische Gewinnung von Cyathan-Diterpenoiden Dissertation zur Erlangung des Naturwissenschaftlichen Doktorgrades - Dr. rer. nat. - des Fachbereichs Biologie und Chemie der Justus-Liebig-Universität Gießen vorgelegt von Dipl.-Ing. Tian Shen geboren am 29. März 1982 in Hangzhou, Zhejiang Gießen, Juni 2013 1. Gutachter: Prof. Dr. Holger Zorn 2. Gutachter: Prof. Dr. Marc Stadler Prüfer: Prof. Dr. Gertrud Morlock Prüfer: Prof. Dr. Richard Göttlich Ich erkläre hiermit: Ich habe die vorgelegte Dissertation selbständig und ohne unerlaubte fremde Hilfe und nur mit den Hilfen angefertigt, die ich in der Dissertation angegeben habe. Alle Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen, sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir durchgeführten und in der Dissertation erwähnten Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis, wie sie in der „Satzung der Justus- Liebig-Universität Gießen zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis“ niedergelegt sind, eingehalten. Gießen, Juni 2013 ------------------------------------------------ Tian Shen Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich von Herzen bei all denjenigen bedanken, die dazu beigetragen haben, dass ich das Projekt „Promotion“ in Angriff genommen, durchgeführt und jetzt auch zu Ende gebracht habe. Mein besonderer Dank gilt …meinem Doktorvater Herrn Prof. Dr. Holger Zorn für die Bereitstellung des Themas. Vielen Dank für Deine Geduld, Deine umsichtigen, konstruktiven und wertvollen Ratschläge und Deinen immerwährenden Optimismus, mit dem Du mich immer wieder motiviert hast. …Herrn Prof. Dr. Marc Stadler für die fachspezifische Unterstützung und viele anregende Diskussionen, seine persönliche Betreuung meiner Laborarbeit während meines Aufenthalts in Dortmund und die schnelle Rückmeldung bei den vielen kleinen Fragen drumherum. …Frau Prof. Dr. Gertrud Morlock für ihre freundliche Betreuung und Hilfsbereit- schaft bei allen Arbeiten rund um die HPTLC. …Herrn Prof. Dr. Richard Göttlich für den Beitritt zur Prüfungskommission. …Frau Dr. Heike Hausmann am Institut für Organische Chemie für die NMR- Analysen und Herrn Dr. Andreas Römpp und Herrn Dhaka Ram Bhandari aus der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. Bernhard Spengler (Analytische Chemie) für ihre Hilfe bei der massenspektrometrischen Analyse meiner Proben. …den Mitarbeiter/innen der Firma InterMed Discovery, besonders Frau Bärbel Köpcke, Frau Jana Moldenhauer, Herrn Stefan Heke, Frau Beata Schmieschek und Herrn Jens Bitzer sowie der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr.-Ing. Gerhard Schembecker (TU Dortmund) für die gute Kooperation innerhalb des gemein- samen Forschungsprojektes. …meinen Kolleginnen und Kollegen Dr. Stephanie Riemer, Katharina Schmidt, Dr. Andrea Bosse, Dr. Katrin Kunkel, Falk Amelung, Christiane Lauber, Alexander Heuger und Prof. Dr. Martin Rühl, die mir während meiner praktischen Arbeiten vielseitig geholfen und mich immer unterstützt haben. …allen fleißigen Korrekturlesern Dr. Siegrun Mohring, Dr. Astrid Spielmeyer, Dr. Klaus Ermel, Marina Rusch, Theresia Schindler und Niklas Wolters für die vielen wertvollen Tipps bei der Anfertigung meiner Dissertation. …dem BMBF (Bundesministeriums für Bildung und Forschung) und CLIB2021 (Cluster industrielle Biotechnologie) für die finanzielle Unterstützung meines Forschungsprojektes (FKZ 0315404C). …der „Mensatruppe“, besonders Adrian Imami, Ilya Galperin, Yanyan Zhang für die tolle Zeit während der gemeinsamen Mittagspausen. …natürlich meiner lieben Familie, für eure Geduld, Zuflucht und Unterstützung in guten und schlechten Zeiten. 将最诚挚的谢意送给我亲爱的家人，没有你们的耐心、支持与鼓舞， 就没有今天的我！ Tagungsbeiträge M. Stadler, J. Bitzer, B. Köpcke, S. Adelmann, G. Schembecker, T. Shen, H. Zorn (2010) Fermentation, Downstream Processing and Isolation of Biologically Active Terpenoids from Cultures of Cyathus and Hericium sp. (Basidiomycota). Workshop „Rote und Weiße Biotechnologie: Herstellung von Substanzen mittels Fermentationsverfahren, deren Aufarbeitung und Reinigung“ Materials Valley, Hanau, Deutschland T. Shen, M. Stadler, H. Zorn (2011) Optimierung von Fermentationsverfahren für Basidiomyceten. Biotechnica, Hannover, Deutschland T. Shen, M. Stadler, G. Morlock, G. Schembecker, H. Zorn (2012) Discovery of New Cyathane Diterpenoids and Other Secondary Metabolites from Cultures of Hericium and Cyathus species. The 18th Congress of the International Society for Mushroom Science, Peking, China Zusammenfassung Basidiomyceten produzieren vielfältige biologisch aktive Sekundärmetabolite, unter anderem seltene niedermolekulare Terpenoide, welche ein enormes Potenzial in der pharmazeutischen Industrie besitzen. In der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zu Cyathan-Diterpenoiden aus den Basidiomyceten- Arten Cyathus striatus (FU04405) und Hericium erinaceus (FU70034) durch- geführt. Letzterer ist als Produzent von verschiedenen Erinacinen bekannt. Die Erinacin C-Produktion war bei dem verwendeten Stamm stark substratabhängig. Das ZM1/2-Medium mit 0,5 g L-1 Edamin® K erwies sich dafür als am besten geeignet. Die maximale Konzentration an Erinacin C betrug ca. 257 mg L-1 Medium mit einer Kultivierungsdauer von 9 Tagen. Die Produktion von Erinacin P war stark zeitabhängig. Die maximale Konzentration von 184 mg L-1 Medium wurde am Tag 3 erreicht. Eine UV-A-Bestrahlung während der Kultivierung wirkte sich sowohl auf das Biomassewachstum, als auch auf die Bildung der Erinacine negativ aus. Des Weiteren wurden die Striatale A/B/C/D und die Striatine A/B aus Submers- kulturen von C. striatus isoliert. Aus Submerskulturen von H. erinaceus wurden die Erinacine C/F/P, 4-Chlor-3,5-dimethoxybenzoesäure (neu entdeckter Metabolit), eine unbekannte Substanz mit der Summenformel C18H21NO5 und vier unbekannte Meroterpenoide C27H29NO7, C42H50N2O12, C24H31NO7 und C23H29NO7 (neu entdeckte Metaboliten) isoliert. Aus den Fruchtkörpern von H. erinaceus wurden Hericenon B und Hericerin isoliert. Mittels MALDI-MS-Imaging konnte nachgewiesen werden, dass die Striatale und Erinacine innerhalb eines Pellets lokalisiert sind. Durch den Einsatz einer kontinuierlich arbeitenden Rührwerkskugelmühle zum Zellaufschluss konnten die Produktausbeuten um 89% (Striatale A und B) bzw. um 53% (Erinacin C) gesteigert werden. Für die untersuchten Basidiomyceten erwies sich damit der Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle zur Freisetzung der Sekundär- metabolite als hocheffizient. Darüber hinaus wurde ein indirekt kompetitiver ELISA zum Nachweis der Cyathan- Diterpenoide entwickelt. Verschiedene Einflussfaktoren auf den Assay wie pH-Wert, Temperatur, Dauer der Beschichtung sowie die Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln wurden untersucht. Die Kreuzreaktivitäten der Striatale A/C/D, der Striatine A/B und der Erinacine C/P gegen Striatal B wurden ebenfalls ermittelt. Zusätzlich wurde der hier etablierte ELISA in biologischen Proben zum Screening nach Cyathan-Derivaten eingesetzt. Dabei wurden Kreuz- reaktivitäten in den Rohextrakten der Kulturüberstände aus Submerskulturen von H. erinaceus nachgewiesen. Im Gegensatz dazu zeigte ein Rohextrakt aus Fruchtkörpern von H. erinaceus keine signifikante Antigen-Antikörper-Reaktion. Anhand der Wiederfindungsrate konnte eine hohe Sensitivität, eine ausreichende Genauigkeit und eine gute Korrelation des ELISA mit den HPLC-DAD-Messungen aufgezeigt werden. Mittels HPTLC wurden vergleichbare Ergebnisse bezüglich Produktbildungskinetik wie mit Hilfe der HPLC erzielt. Die HPTLC bietet zusätzlich die Möglichkeit, die Sekundärmetabolite über die Bioautographie auf Bioaktivität zu überprüfen. Abstract Fungi of the phylum Basidiomycota are well known to form a broad spectrum of biologically active secondary metabolites, especially low molecular weight compounds such as terpenoids. In the present work, two species, Cyathus striatus (FU04405) and Hericium erinaceus (FU70034), were studied, focusing on the rare cyathane diterpenoids formed in submerged cultures. H. erinaceus is a known producer of various erinacines. It was shown that the production of erinacine C strongly depended on the culture substrates. ZM1/2-medium with 0.5 g L-1 Edamin® K proved to be the best medium for erinacine C production. The highest concentration was obtained on the 9th culture day (approximately 257 mg L-1). The production of erinacine P was strongly time dependent. While the concentration of erinacine P was decreasing, the erinacine C concentration increased steadily. The application of UV-A light showed negative effects on both, mycelium growth and secondary metabolite production. Furthermore, secondary metabolites such as the striatals A, B, C, and D, and striatins A and B from submerged cultures of C. striatus, the erinacines C, F and P, 4-chloro-3,5-dimethoxy benzoic acid (novel natural product), an unknown metabolite with a sum formula of C18H21NO5, and four unknown meroterpenoids with sum formulas of C27H29NO7, C42H50N2O12, C24H31NO7 and C23H29NO7 (novel natural products) from submerged cultures of H. erinaceus could be purified by preparative HPLC. Regarding the localization of the low molecular secondary metabolites in basidiomycetes, MALDI-MS-Imaging and different cell disruption techniques were applied. Thus it could be shown that cyathane diterpenoids are located within the mycelial pellets. The use of a glass bead mill for releasing secondary metabolites from basidiomycetes proved to be highly efficient. With this technique, the yields of striatals were increased up to 89% and of erinacine C up to 53%. Additionally, an indirect competitive ELISA was developed for the detection of cyathane diterpenoids. Different factors influencing the ELISA were studied (e.g. pH, temperature, time of coating, tolerance of organic solvents). The cross reactivities of the striatals A, C and D, the striatins A and B, and the erinacines C and P against striatal B were determined. The presence of cyathane diterpenoids in submerged cultures of H. erinaceus was proved by means of the developed indirect competitive ELISA. In contrast, it did not show cross reactivity with extracts from fruiting bodies, which implied the absence or the presence of only trace amounts of erinacines in fruiting bodies. A good correlation between data from the ELISA and the HPLC-DAD measurements could be shown. Similar results for product formation kinetics, maximal UV absorption and mass spectrometric data could be obtained via HPTLC and HPLC-DAD. HPTLC allowed the additional analysis of biological activity of the analytes if combined with bioautographic techniques. Inhaltsverzeichnis Seite I Inhaltsverzeichnis Abkürzungs- und Symbolverzeichnis VI Abbildungsverzeichnis XI Tabellenverzeichnis XIX 1 Einleitung 23 1.1 Naturstoffe ................................................................................................ 23 1.2 Zielsetzung ............................................................................................... 28 2 Ergebnisse 29 2.1 Sekundärmetabolite aus Cyathus striatus ................................................ 29 2.1.1 Isolierung und Charakterisierung der Sekundärmetabolite aus Submerskultur .................................................................................. 29 2.1.1.1 Striatale .................................................................................. 29 2.1.1.2 Striatine .................................................................................. 30 2.2 Sekundärmetabolite aus Hericium erinaceus ........................................... 36 2.2.1 Optimierung der Bildung von Erinacin C .......................................... 36 2.2.1.1 Weglassversuche ................................................................... 36 2.2.1.2 Einfluss des Hafermehls ........................................................ 37 2.2.1.3 Einfluss von UV-A-Bestrahlung auf die Kultivierung .............. 38 2.2.2 Isolierung und Charakterisierung der nicht-flüchtigen Sekundärmetabolite aus H. erinaceus ............................................. 42 2.2.2.1 Identifizierte Sekundärmetabolite aus der Submerskultur ...... 42 2.2.2.2 Identifizierte Sekundärmetabolite aus Fruchtkörpern von H. erinaceus ........................................................................... 46 2.2.2.3 Produktbildungskinetik ........................................................... 48 2.2.2.4 UV/Vis-Spektren .................................................................... 51 Inhaltsverzeichnis Seite II 2.2.2.5 Bioaktivität ............................................................................. 51 2.2.2.6 Derivatisierung ....................................................................... 53 2.2.2.7 HPTLC-MS/HPTLC-NMR ...................................................... 55 2.2.3 Untersuchung flüchtiger Inhaltsstoffe aus Submerskultur von H. erinaceus ..................................................................................... 56 2.3 Lokalisierung der Sekundärmetabolite ..................................................... 58 2.3.1 MALDI-MS-Imaging zur Lokalisierung der Sekundärmetabolite ....... 58 2.3.1.1 Striatale in Submerskulturen aus C. striatus .......................... 58 2.3.1.2 Sekundärmetabolite aus Submerskulturen von H. erinaceus 61 2.3.1.3 Sekundärmetabolite aus Fruchtkörpern von H. erinaceus ..... 62 2.3.1.4 Zusammenfassung ................................................................ 65 2.3.2 Zellaufschluss – C. striatus als Modellsystem .................................. 67 2.3.2.1 Aufschlussmedium ................................................................. 68 2.3.2.2 Zellaufschluss mittels Ultra-Turrax ......................................... 69 2.3.2.3 Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle......................... 71 2.3.2.4 Lichtmikroskopie .................................................................... 75 2.3.3 Übertragung der optimierten Zellaufschlussbedingungen auf H. erinaceus ..................................................................................... 76 2.4 Entwicklung eines ELISA zum Nachweis von Cyathan-Diterpenoiden ..... 77 2.4.1 Produktion von Antikörpern .............................................................. 77 2.4.2 Stabilität der Striatale ....................................................................... 78 2.4.3 Optimierung der Beschichtungsbedingungen .................................. 79 2.4.4 Optimierung der Blockierung ............................................................ 83 2.4.5 Checkerboard -Titerbestimmung ...................................................... 84 2.4.6 Zusammenfassung der optimierten ELISA-Bedingungen ................ 86 2.4.7 Lagerstabilität der beschichteten und blockierten Mikrotiterplatten .. 86 2.4.8 Indirekter kompetitiver ELISA ........................................................... 87 2.4.8.1 Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln im kompetitiven ELISA ................................................................ 87 2.4.8.2 Spezifität des Assays / Kreuzreaktivitäten ............................. 88 Inhaltsverzeichnis Seite III 2.4.8.3 Linearität des ELISA .............................................................. 90 2.4.8.4 Wiederfindung und Vergleich zur HPLC ................................ 91 2.4.8.5 Reproduzierbarkeit ................................................................. 93 2.4.8.6 Analyse von Kulturüberständen und Kulturextrakten ............. 94 2.4.8.7 Analyse eines Rohextraktes aus Fruchtkörpern von H. erinaceus ........................................................................... 97 2.4.9 Zusammenfassung des ELISA ......................................................... 98 2.5 Molekularphylogenetische Charakterisierung von H. erinaceus ............... 99 3 Diskussion 103 3.1 Biosyntheseweg ..................................................................................... 108 3.1.1 Natürliche Terpenoide .................................................................... 108 3.1.2 Biosynthetische Intermediate der Cyathan-Diterpenoide ............... 111 3.2 Produktion von Cyathan-Diterpenoiden .................................................. 114 3.2.1 Chemische Synthese ..................................................................... 114 3.2.2 Biotechnologische Produktion ........................................................ 115 3.3 UV-A-Bestrahlung während der Submerskultivierung ............................ 118 3.4 Lokalisierung der Metabolite ................................................................... 120 3.4.1 MALDI-MS-Imaging von Basidiomyceten ....................................... 120 3.4.2 Zellaufschluss ................................................................................ 124 3.5 HPTLC vs. HPLC-DAD ........................................................................... 127 3.6 ELISA ..................................................................................................... 130 3.7 Sekundärmetabolite aus H. erinaceus .................................................... 139 3.8 Molekularphylogenetische Charakterisierung von H. erinaceus ............. 140 4 Experimenteller Teil 141 4.1 Mikroorganismen .................................................................................... 141 4.2 Chemikalien ............................................................................................ 141 4.3 Geräte und sonstige Hilfsmittel ............................................................... 146 4.4 Kultivierung von Basidiomyceten ............................................................ 152 4.4.1 Nährmedienzusammensetzung ..................................................... 152 Inhaltsverzeichnis Seite IV 4.4.2 Kulturführung ................................................................................. 156 4.5 Bestimmung der Kulturparameter ........................................................... 158 4.5.1 Biofeuchtmasse und Biotrockenmasse .......................................... 158 4.5.2 pH-Wert .......................................................................................... 158 4.5.3 Proteingehalt – photometrisch ....................................................... 159 4.6 Probenvorbereitung für die Chromatographie ........................................ 160 4.6.1 Extraktion der nicht-flüchtigen Inhaltsstoffe .................................... 160 4.6.2 Extraktion der flüchtigen Inhaltsstoffe ............................................ 162 4.7 Zellaufschlussmethoden ......................................................................... 163 4.7.1 Aufschlussmedium ......................................................................... 163 4.7.2 Ultra-Turrax .................................................................................... 164 4.7.3 Rührwerkskugelmühle .................................................................... 164 4.7.4 Übertragung des Zellaufschlusses auf H. erinaceus ...................... 166 4.8 Analytische Methoden ............................................................................ 167 4.8.1 Analytische HPLC .......................................................................... 167 4.8.1.1 Nachweis der Striatale A und B und Erstellung der Kalibriergeraden ................................................................... 167 4.8.1.2 Nachweis der Erinacine C und P und Erstellung der Kalibriergeraden ................................................................... 169 4.8.2 Präparative HPLC .......................................................................... 171 4.8.2.1 Inhaltsstoffe von C. striatus .................................................. 171 4.8.2.2 Inhaltsstoffe von H. erinaceus .............................................. 173 4.8.3 Massenspektrometrie ..................................................................... 174 4.8.4 HPLC-NMR .................................................................................... 176 4.8.5 HPTLC ........................................................................................... 176 4.8.6 MALDI-Imaging .............................................................................. 184 4.8.7 Gaschromatographie...................................................................... 188 4.9 ELISA ..................................................................................................... 190 4.9.1 Zusammensetzung von Puffern und Lösungen .............................. 190 Inhaltsverzeichnis Seite V 4.9.2 Produktion der Antikörper .............................................................. 192 4.9.3 Stabilität von Striatal B in verschiedenen Pufferlösungen .............. 193 4.9.4 Durchführung des ELISA ............................................................... 195 4.9.5 Lagerstabilität der beschichteten und blockierten Mikrotiterplatten 196 4.9.6 Toleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln in einem kompetitiven ELISA ........................................................................ 197 4.9.7 Spezifität / Kreuzreaktivität ............................................................. 197 4.9.8 Wiederfindung ................................................................................ 198 4.9.9 Analyse der Kulturüberstände von H. erinaceus ............................ 199 4.9.10 Analyse der Extrakte aus Fruchtkörpern von H. erinaceus ............ 200 4.10 Sequenzierung genomischer DNA ......................................................... 201 4.10.1 Isolierung genomischer DNA ......................................................... 201 4.10.2 Polymerasekettenreaktion (PCR) ................................................... 201 4.10.3 Agarose-Gelelektrophorese ........................................................... 202 4.10.4 Extraktion der genomischen DNA .................................................. 203 5 Ausblick 205 6 Literaturverzeichnis 207 7 Anhang 225 7.1 NMR-Analyse ......................................................................................... 225 7.2 HPLC-Chromatogramme ........................................................................ 240 Abkürzungs- und Symbolverzeichnis VI Abkürzungs- und Symbolverzeichnis Zeichen Bezeichnung ACN Acetonitril ADP Adenosindiphosphat A-OH Antioxidantien ATP Adenosintriphosphat BFM Biofeuchtmasse BLAST Basic Local Alignment Search Tool BSA Albumin Fraktion V aus Rinderserum BTM Biotrockenmasse BW Blindwert COSY Zweidimensionale NMR-Spektroskopie DAD Dioden-Array-Detektor E Extinktionsdifferenz DHB 2,5-Dihydroxybenzoesäure DMAPP Dimethylallylpyrophosphat DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonukleinsäure DOXP 1-Desoxy-D-xylulose-5-phosphat-Weg DPA Diphenylamin DPPH 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl DSP Downstreaming Prozess EDTA Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat http://de.wikipedia.org/wiki/Adenosintriphosphat Abkürzungs- und Symbolverzeichnis VII ELISA Enzyme Linked Immunosorbent Assay ESI Electro Spray Ionisation g Erdbeschleunigung GC-FID Gaschromatograph mit Flammenionisationsdetektor GC-MS Gaschromatograph mit massenselektivem Detektor GGPP Geranylgeranylpyrophosphat GPP Geranylpyrophosphat HER Hericium erinaceus HMG-CoA 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie HPTLC Hochleistungsdünnschichtchromatographie hRF Das 100-fache des Retentionsfaktors HSA Human Serum Albumin ID Innendurchmesser IPP Isopentenylpyrophosphat kDa Kilodalton KOAc Kaliumacetat KI Kováts-Index KÜ Kulturüberstand LC-MS Flüssigchromatographie mit Massenspektrometrie-Kopplung MALDI Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation MeOH Methanol MEP Methylerythritol-4-phosphat-Weg MS Massenspektrometrie MVA Mevalonsäure-Weg Abkürzungs- und Symbolverzeichnis VIII m/z Masse-zu-Ladung-Verhältnis NaOH Natriumhydroxid NGF Nervenwachstumsfaktor NK Negativkontrolle p- para- PAK Primärantikörper PBS Phosphatgepufferte Salzlösung PBST Phosphatgepufferte Salzlösung mit Tween 20 PCR Polymerase-Kettenreaktion PEG Polyethylenglykol RKM Rührwerkskugelmühle rpm revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute) RW Referenzwert SAK Sekundärantikörper SNL Standard-Nähr-Lösung SP Soja-Pepton-Medium sp. Spezies TMB 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin TOF Time of Flight Tris Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan U Enzymeinheit (Unit) U min-1 Umdrehungen pro Minute UV Ultraviolett VE-Wasser Vollentsalztes Wasser Vis Visible: sichtbares Licht Abkürzungs- und Symbolverzeichnis IX v/v Volumenverhältnis w/v Gewicht zu Volumen-Verhältnis YM Hefe-Malz-Medium ZM1/2-Medium Zucker-Melasse-Medium Abkürzungs- und Symbolverzeichnis X Abbildungsverzeichnis XI Abbildungsverzeichnis Abbildung 1.1: Struktur des Farbstoffes Indigo. ........................................................................... 24 Abbildung 2.1: Beispielchromatogramm der präp. HPLC zur Isolierung der Striatale, die in der Reihenfolge Striatal C, D, B und A eluieren. Detektionswellenlänge: 210 nm und 254 nm. ............................................................................................ 29 Abbildung 2.2: HPLC-DAD-Analyse des MeOH-Rohextraktes von C. striatus. Vergleich der Retentionszeiten mit den Referenzverbindungen Striatal A und Striatal B. .......................................................................................................................... 31 Abbildung 2.3: Vergleich der UV-Spektren der Substanzen im MeOH-Rohextrakt mit denen der Standards Striatal A und Striatal B mittels HPLC-DAD. ..................... 32 Abbildung 2.4: Vergleich der UV-Spektren der Striatale und Striatine mittels HPLC-DAD. ......... 32 Abbildung 2.5: Vergleich des MeOH-Rohextraktes vor (schwarz) und nach dem Rühren (rot) mit MeOH für 40 h. ....................................................................................... 33 Abbildung 2.6: Trennung der Striatine mittels präparativer HPLC. .............................................. 34 Abbildung 2.7: Einfluss der Medienzusammensetzung auf die Erinacin C-Konzentration und Biofeuchtmasse bei Kulturabbruch (Tag 27). ............................................... 37 Abbildung 2.8: Erinacin C-Bildung im Medium 6 (mit Hafermehl) und Medium 7 (ohne Hafermehl)............................................................................................................ 38 Abbildung 2.9: Biotrockenmassen der Kulturen unter Lichtausschluss und mit UV-A- Bestrahlung. ......................................................................................................... 40 Abbildung 2.10: pH-Verlauf der Kulturen unter Lichtausschluss und mit UV-A-Bestrahlung. ........ 40 Abbildung 2.11: Erinacin C-Produktion in den Kulturen unter Lichtausschluss. ............................ 41 Abbildung 2.12: Zusammenstellung der Erinacin C-Produktion und der Biotrockenmasse in den Kulturen unter Lichtausschluss. .................................................................... 41 Abbildung 2.13: 4-Chlor-3,5-dimethoxybenzoesäure (C9H9ClO4). ................................................. 43 Abbildung 2.14: Struktur des isolierten Naturstoffs mit der Summenformel C18H21NO5. ............... 43 Abbildung 2.15: Untersuchung der Produktbildungskinetik mittels HPTLC. Rohextrakte der Kulturüberstände im Medium 6 von Tag 1 bis Tag 9 (T1 - T9). Dokumentation des Chromatogramms bei 254 nm (a) und 366 nm (b). ............. 49 Abbildungsverzeichnis XII Abbildung 2.16: Produktbildungskinetik der Erinacine P und C im Kulturüberstand im Medium 6 über neun Kulturtage mittels HPLC-DAD bei 210 nm. ........................ 50 Abbildung 2.17: Bildung und Abbau von Substanz 2 (hRF = 34) im Kulturüberstand im Medium 6 (HPTLC). ............................................................................................. 50 Abbildung 2.18: UV/Vis-Spektren. A: Substanz 2, HPTLC. B: Erinacin P, HPLC-DAD. ................ 51 Abbildung 2.19: Bioaktivität der Sekundärmetabolite gegenüber Vibrio fischeri in 3- minütigen Aufnahmeintervallen. Tag 1 bis Tag 9 (1 bis 9), jeweils Doppelbestimmung. ............................................................................................. 52 Abbildung 2.20: HPTLC-Bioaktivitätsdetektion von Substanz 2 nach Inkubation mit Vibrio fischeri (links) und dokumentiert bei 254 nm (rechts). ......................................... 53 Abbildung 2.21: HPTLC-Bioaktivitätsdetektion von Substanz 3 nach Inkubation mit Vibrio fischeri (links) und dokumentiert bei 366 nm (rechts). ......................................... 53 Abbildung 2.22: HPTLC-Chromatogramme nach verschiedenen post-chromatographischen Derivatisierungen. Oben: Extrakt der Submerskultur (Tag 4). Rote Linie markiert Substanzen 2 und 3. Unten: Kontroll-Chromatogramme des Extrakts des Kulturmediums ohne Pilz. Extrakte vor den Derivatisierungen dokumentiert bei 254 nm, 366 nm und Weißlicht (Vis). ....................................... 54 Abbildung 2.23: MS-Spektren (ESI + ) der Substanz mit hRF = 34 aus HPTLC-Platte. A: H. erinaceus (HER) Mycel-Rohextrakt an Kulturtag 4. B: Referenzsubstanz Erinacin P. m/z 515,2 für [M+Na] + und 455,1 für [M+Na- CH3COOH] + . ......................................................................................................... 55 Abbildung 2.24: Gaschromatogramm des Extrakts einer Submerskultur von H. erinaceus in SNL-Medium (DB-5-Säule). ................................................................................. 56 Abbildung 2.25: Massenspektren der halogenierten Substanz mit KI = 1641 aus der Submerskultur von H. erinaceus (oben) und des Standards 2-Chlor-4,5- dimethoxybenzaldehyd mit KI = 1620 (unten). .................................................... 57 Abbildung 2.26: Strukturvorschlag für den halogenierten Sekundärmetaboliten aus der Submerskultur von H. erinaceus: 4-Chlor-3,5-dimethoxybenzaldehyd. .............. 57 Abbildung 2.27: Links: Pellets von C. striatus aus einer Submerskultur; rechts: Mikroskopische Aufnahme eines Pelletausschnittes. .......................................... 59 Abbildung 2.28: Verteilungsbilder der Striatale A, B, C und D in einem Pellet aus Submerskultur von C. striatus dargestellt mittels MALDI-MS-Imaging. Links [M+H] + , Mitte [M+Na] + und rechts [M+K] + . Alle Angaben weisen eine Massengenauigkeit < 2 ppm und eine Pixelauflösung von 15 µm auf. ............... 60 Abbildung 2.29: Ausschnitt eines Pellets (20 µm dick) aus Submerskultur von H. erinaceus unter dem Lichtmikroskop. ................................................................................... 61 Abbildungsverzeichnis XIII Abbildung 2.30: MALDI-MS-Imaging Verteilungsbilder der Erinacine in einem Pellet aus Submerskultur von H. erinaceus. Alle Angaben weisen eine Massengenauigkeit < 2 ppm und eine Pixelauflösung von 12 µm auf. ............... 62 Abbildung 2.31: MALDI-MS-Imaging Verteilungsbilder der Sekundärmetabolite, die im Fruchtkörper von H. erinaceus vorkommen, in einem Pellet aus Submerskultur von H. erinaceus. Alle Angaben weisen eine Massengenauigkeit < 2 ppm und eine Pixelauflösung von 12 µm auf. ............... 62 Abbildung 2.32: Lichtmikroskopische Aufnahme eines Fruchtkörperausschnittes von H. erinaceus. Der rot markierte Bereich (10,0 mm x 7,5 mm) wurde analysiert. ............................................................................................................. 63 Abbildung 2.33: Verteilungsbilder der Metabolite im Fruchtkörper von H. erinaceus mittels MALDI-MS-Imaging. Alle Angaben weisen eine Massengenauigkeit < 2 ppm und eine Pixelauflösung von 50 µm auf. ................................................ 64 Abbildung 2.34: Verteilungsbilder der Erinacine im Fruchtkörper von H. erinaceus mittels MALDI-MS-Imaging. Alle Angaben weisen eine Massengenauigkeit < 2 ppm und eine Pixelauflösung von 50 µm auf. ............... 65 Abbildung 2.35: Aufarbeitungsschema zum Zellaufschluss. .......................................................... 67 Abbildung 2.36: Striatal (A+B)-Konzentrationen nach Zellaufschluss. Vorhomogenisierung der Probe mittels Ultra-Turrax (15% BFM-Anteil, 15.000 rpm, 10 min) und anschließendem Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle (15% BFM- Anteil, 3.500 U min -1 , 10 min, Glasperlen-Ø 0,5 mm) in Puffer und in Kulturüberstand (KÜ). Referenzwert: RW, direkte Extraktion nach Ernte. Kulturtag 12. ......................................................................................................... 68 Abbildung 2.37: Proteinkonzentrationen vor und nach dem Zellaufschluss. Vorhomogenisierung der Probe mittels Ultra-Turrax (15% BFM-Anteil, 15.000 rpm, 10 min) und anschließendem Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle (15% BFM-Anteil, 3.500 U min -1 , 10 min, Glasperlen-Ø 0,5 mm) in Puffer und in Kulturüberstand. Blau: Referenzwerte, direkte Extraktion nach Ernte. Kulturtag 12. ............................... 69 Abbildung 2.38: Striatal (A+B)-Konzentrationen nach dem Zellaufschluss mittels Ultra- Turrax bei verschiedenen BFM-Anteilen (15.000 rpm, 15 min). Kulturtag 28. ........................................................................................................................ 70 Abbildung 2.39: Proteinkonzentrationen im Puffer vor und nach dem Zellaufschluss mittels Ultra-Turrax bei verschiedenen BFM-Anteilen (15.000 rpm, 15 min). Kulturtag 28. ......................................................................................................... 70 Abbildung 2.40: Striatal (A+B)- und Proteinkonzentrationen nach dem Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle in Abhängigkeit von verschiedenen Aufschlusszeiten (BFM: 6,3%, 3.500 U min -1 , Glasperlen-Ø 0,5 mm). RW: nach Zellaufschluss mittels Ultra-Turrax (BFM: 6,3%, 15.000 rpm, 15 min), jedoch vor Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle. Kulturtag 28. .............. 72 Abbildungsverzeichnis XIV Abbildung 2.41: Striatal (A+B)- und Proteinkonzentrationen nach dem Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle bei verschiedenen Drehzahlen (BFM: 5,5%, 20 min, Glasperlen-Ø 0,5 mm). RW: nach dem Zellaufschluss mittels Ultra-Turrax (BFM: 5,5%, 15.000 rpm, 15 min), jedoch vor dem Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle. Kulturtag 28. ................................................................... 73 Abbildung 2.42: Striatal (A+B)- und Proteinkonzentrationen nach dem Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle (RKM) bei verschiedenen BFM-Anteilen (3.500 U min -1 , Glasperlen-Ø 0,5 mm, 20 min). Referenzwerte, nach dem Zellaufschluss mittels Ultra-Turrax (15.000 rpm, 15 min), jedoch vor dem Zellaufschluss mittels RKM. Kulturtag 28. ........................................................... 74 Abbildung 2.43: 20-fache Vergrößerung von aufgeschlossenem Mycel von C. striatus. Links: nach 5-minütiger Behandlung mittels Ultra-Turrax; Mitte: nach 15-minütiger Behandlung mittels Ultra-Turrax; rechts: nach 10-minütiger Behandlung mittels Rührwerkskugelmühle. ............................................................................. 75 Abbildung 2.44: Wirksamkeit der angewendeten Zellaufschlussmethoden auf H. erinaceus. RW: direkte Extraktion nach Ernte. Ultra-Turrax: 15% BFM-Anteil, 15.000 rpm, 15 min. Rührwerkskugelmühle (RKM): 15% BFM-Anteil, 3.500 U min -1 , Glasperlen-Ø 0,5 mm. Kulturtag 20. ............................................. 76 Abbildung 2.45: MALDI-TOF-Massenspektren. Freies BSA (Trägerprotein) mit m/z = 67 kDa vor der Konjugatherstellung (links) und Striatal A/B-BSA- Konjugat mit m/z = 75 kDa nach der Konjugatherstellung (rechts). .................... 77 Abbildung 2.46: Wiederfindung von Striatal B in DMSO/Puffer (1/1, v/v) mittels HPLC-DAD. ...... 78 Abbildung 2.47: Auswahl des Beschichtungspuffers. Plattenmaterial: Maxisorp. NK: Negativkontrolle (Serum vor der Immunisierung). Temperatur: 24°C. Beschichtungsdauer: 16 h. Verdünnung der Primärantikörper: 1:100. Extinktion: Extinktionsdifferenz zwischen 450 nm und 630 nm. ........................ 79 Abbildung 2.48: Auswahl des Plattenmaterials. Beschichtungspuffer: PBS. NK: Negativkontrolle (Serum vor der Immunisierung). Temperatur: 24°C. Beschichtungsdauer: 16 h. Verdünnung der Primärantikörper: 1:100. Extinktion: Extinktionsdifferenz zwischen 450 nm und 630 nm. ........................ 80 Abbildung 2.49: Einfluss der Beschichtungstemperatur. Plattenmaterial: Maxisorp. Beschichtungspuffer: PBS. NK: Negativkontrolle (Serum vor der Immunisierung). Beschichtungsdauer: 16 h. Verdünnung der Primärantikörper: 1:100. Extinktion: Extinktionsdifferenz zwischen 450 nm und 630 nm. ......................................................................................................... 81 Abbildung 2.50: Einfluss der Beschichtungsdauer. Plattenmaterial: Maxisorp. Beschichtungspuffer: PBS. NK: Negativkontrolle (Serum vor der Immunisierung). Temperatur: 24°C. Verdünnung der Primärantikörper: 1:100. Extinktion: Extinktionsdifferenz zwischen 450 nm und 630 nm. ............. 82 Abbildung 2.51: Auswahl des Blockierungsproteins. Plattenmaterial: Maxisorp. Beschichtungspuffer: PBS. Temperatur: 24°C. Beschichtungsdauer: 16 h. NK: Negativkontrolle (Serum vor der Immunisierung). Verdünnung der Abbildungsverzeichnis XV Primärantikörper: 1:100. Extinktion: Extinktionsdifferenz zwischen 450 nm und 630 nm. ......................................................................................................... 83 Abbildung 2.52: Titerbestimmung mittels Checkerboard-Titration. Dargestellt sind die Mittelwerte einer Doppelbestimmung abzüglich der Negativkontrolle. Plattenmaterial: Maxisorp. Beschichtungspuffer: PBS. Temperatur: 24°C. Beschichtungsdauer: 16 h. Blockierungsprotein: 1%ige Gelatine. Extinktion: Extinktionsdifferenz zwischen 450 nm und 630 nm. ........................ 85 Abbildung 2.53: Lagerstabilität der beschichteten und blockierten Mikrotiterplatten. Dargestellt sind die Mittelwerte abzüglich der Negativkontrolle. Plattenmaterial: Maxisorp. Beschichtungspuffer: PBS. Temperatur: 24°C. Beschichtungsdauer: 16 h. Blockierungsprotein: 1%ige Gelatine. Lagerung bei 4°C im Dunkeln. Extinktion: Extinktionsdifferenz zwischen 450 nm und 630 nm. ................................................................................................................ 87 Abbildung 2.54: Einfluss von Dimethylsulfoxid (DMSO), Acetonitril (ACN) und Methanol (MeOH) auf die Antigen-Antikörper-Reaktion.Extinktion: Extinktionsdifferenz zwischen 450 nm und 630 nm. ............................................ 88 Abbildung 2.55: Beispiel für die Erstellsung einer Kalibrierfunktion für Striatal B. A. Sigmoide Kurve. B. Linearisierung der sigmoiden Kurve durch eine Logit Funktion. y = -0,745 ln(x) – 2,4068, R² = 0,9908, IC50 = 39,5 ng mL -1 . ............... 89 Abbildung 2.56: Korrelation der ermittelten Striatal B-Konzentrationen in der Probenmatrix mittels ELISA (x-Achse) und HPLC-DAD (y-Achse). R² = 0,9942. ...................... 92 Abbildung 2.57: Screening von Kulturüberständen von Submerskulturen von H. erinaceus im indirekten kompetitiven ELISA. Kontrolle: Kulturmedium ohne H. erinaceus; Tag 1 bis Tag 9: Kulturmedium mit H. erinaceus .......................... 94 Abbildung 2.58: Screening von extrahierten Kulturüberständen aus Submerskulturen von H. erinaceus im indirekten kompetitiven ELISA. Kontrolle: Kulturmedium ohne H. erinaceus; Tag 1 bis Tag 9: Kulturmedium mit H. erinaceus. ................ 95 Abbildung 2.59: Analyse der Produktbildung mittels ELISA (berechnet aus Kalibrierung für Striatal B).............................................................................................................. 96 Abbildung 2.60: %B/B0-Werte der Rohextrakte aus Fruchtkörpern von H. erinaceus in Abhängigkeit von der Konzentration im indirekten kompetitiven ELISA. Blank: ohne Fruchtkörper-Rohextrakt. ................................................................. 97 Abbildung 2.61: DNA-Sequenz der 5,8S ribosomalen Untereinheit mit flankierendem ITS- Bereich von H. erinaceus Fruchtkörpern. ............................................................ 99 Abbildung 2.62: DNA-Teilsequenz der 5,8S ribosomalen Untereinheit mit flankierendem ITS-Bereich von H. erinaceus (FU70034) Submerskultur (IMD). ...................... 100 Abbildung 3.1: Cyathan-Grundgerüst (Enquist und Stoltz, 2009). ............................................. 103 Abbildungsverzeichnis XVI Abbildung 3.2: Die ersten Cyathan-Diterpenoide: Cyathin A3 und Allocyathin B3 (Allbutt et al., 1971). ....................................................................................................... 104 Abbildung 3.3: Konversion von Striatalen zu Striatinen (Anke et al., 2002). .............................. 105 Abbildung 3.4: Bisher charakterisierte Erinacine aus H. erinaceus, modifiziert nach den im Text genannten Literaturquellen. ....................................................................... 107 Abbildung 3.5: Beteiligte Stoffwechselwege zur Bereitstellung der Bausteine für die Striatalsynthese, modifiziert nach Rabe (1989). GGPP: Geranylgeranyl- Pyrophosphat. .................................................................................................... 110 Abbildung 3.6: Biogenese der Erinacine, modifiziert nach Kenmoku et al., 2000, Kenmoku et al., 2001 und Kenmoku et al., 2002. .............................................................. 113 Abbildung 3.7: Massenspektren. Links: Natriumaddukt von Striatal C (m/z = 469,21973) und Kaliumaddukt von Striatal D (m/z = 469,19843) mit Δm/z = 0,02130 Da; Rechts: Kaliumaddukt von Striatal A (m/z = 511,20920) und Natriumaddukt von Striatal B (m/z = 511,23032) mit Δm/z = 0,02112 Da. ................................ 122 Abbildung 3.8: Prinzipschema des indirekten ELISA. ................................................................ 130 Abbildung 4.1: Kalibriergerade zur Proteinbestimmung nach Bradford (y = 0,0226x + 0,4495; R 2 = 0,9966). ......................................................................................... 159 Abbildung 4.2: Kalibriergerade für Striatal A. ............................................................................. 168 Abbildung 4.3: Kalibriergerade für Striatal B. ............................................................................. 169 Abbildung 4.4: Kalibriergerade für Erinacin C. ........................................................................... 170 Abbildung 4.5: Kalibriergerade für Erinacin P. ........................................................................... 171 Abbildung 4.6: Reaktion von 2,2-Diphenyl-1-picrylhydrazyl mit Antioxidantien (A-OH). ............ 178 Abbildung 4.7: Reaktion von Aldohexosen und Ketohexosen mit Aminen und Diphenylamin. .................................................................................................... 179 Abbildung 4.8: Strukturformel von Primulin. ............................................................................... 180 Abbildung 4.9: Kupplung von Echtblausalz B mit Phenolderivaten. .......................................... 181 Abbildung 4.10: Reaktion eines Flavonoids mit Aluminiumchlorid unter Bildung eines fluoreszierenden Komplexes. ............................................................................. 182 Abbildung 4.11: Reaktion von Ninhydrin mit einem primären Amin. ............................................ 182 Abbildung 4.12: Reaktion von Flavonol mit NEU’s- Reagenz zu farbigem Komplex. .................. 183 Abbildungsverzeichnis XVII Abbildung 7.1: Striatal A, 1 H. ...................................................................................................... 225 Abbildung 7.2: Striatal A, 13 C. ..................................................................................................... 226 Abbildung 7.3: Striatal A, COSY. ................................................................................................ 226 Abbildung 7.4: Striatal B, 1 H. ...................................................................................................... 227 Abbildung 7.5: Striatal B, 13 C. ..................................................................................................... 228 Abbildung 7.6: Striatal B, COSY. ................................................................................................ 228 Abbildung 7.7: Striatal C, 1 H. ...................................................................................................... 229 Abbildung 7.8: Striatal C, 13 C...................................................................................................... 230 Abbildung 7.9: Striatal C, COSY. ............................................................................................... 231 Abbildung 7.10: Striatal D, 1 H. ...................................................................................................... 232 Abbildung 7.11: Striatal D, 13 C. .................................................................................................... 232 Abbildung 7.12: Striatal D, COSY. ............................................................................................... 233 Abbildung 7.13: Striatin A, 1 H. ...................................................................................................... 234 Abbildung 7.14: Striatin A, 13 C. ..................................................................................................... 234 Abbildung 7.15: Striatin A, COSY. ................................................................................................ 235 Abbildung 7.16: Striatin B, 1 H. ...................................................................................................... 236 Abbildung 7.17: Striatin B, 13 C. ..................................................................................................... 236 Abbildung 7.18: Striatin B, COSY. ................................................................................................ 237 Abbildung 7.19: Erinacin P, 1 H. .................................................................................................... 238 Abbildung 7.20: Erinacin P, 13 C. ................................................................................................... 238 Abbildung 7.21: Erinacin P, COSY. .............................................................................................. 239 Abbildung 7.22: HPLC-Chromatogramme (Offset 20%) zur Produktbildungskinetik. Ethylacetat-Rohextrakte aus Kulturüberständen von H. erinaceus (Tag 1 bis Tag 9). .......................................................................................................... 240 Abbildungsverzeichnis XVIII Tabellenverzeichnis XIX Tabellenverzeichnis Tabelle 2.1: Identifizierte Striatale A, B, C und D. .................................................................... 30 Tabelle 2.2: Identifizierte Strukturen der Striatine A und B. ..................................................... 35 Tabelle 2.3: Identifizierte Substanzen aus Submerskulturen von H. erinaceus im Medium 6.............................................................................................................. 44 Tabelle 2.4: Identifizierte Substanzen aus H. erinaceus in YM6,3-Medium. ............................ 46 Tabelle 2.5: Isolierte Substanzen aus Fruchtkörpern von H. erinaceus. ................................. 47 Tabelle 2.6: Substanzen aus den Fruchtkörpern von H. erinaceus mit Strukturvorschlag. ..... 48 Tabelle 2.7: m/z-Verhältnisse der Standards Striatal A und B bei der Analyse mittels MALDI-MS. ........................................................................................................... 59 Tabelle 2.8: Mittels MALDI-MS-Imaging nachgewiesene Sekundärmetabolite in Submerskultur und Fruchtkörpern von H. erinaceus. .......................................... 66 Tabelle 2.9: Titerbestimmung mittels Checkerboard-Titration. Dargestellt sind die Mittelwerte einer Doppelbestimmung von Extinktionen (Extinktionsdifferenz zwischen 450 nm und 630 nm). PAK: Primärantikörper. Blau: Extinktion ≈ 1; Rot: ausgewählte Titerbedingungen. ................................................................................................ 84 Tabelle 2.10: Assayparameter ELISA. ....................................................................................... 86 Tabelle 2.11: Kreuzreaktivitäten der strukturverwandten Substanzen. ...................................... 90 Tabelle 2.12: Linearitätsprüfung des ELISA. .............................................................................. 90 Tabelle 2.13: Aufstockung und Wiederfindung. ......................................................................... 91 Tabelle 2.14: Intra- und Interassay-Reproduzierbarkeit. ............................................................ 93 Tabelle 2.15: Auswahl von Homologien der DNA-Sequenz der 5,8S Untereinheit mit flankierendem ITS-Bereich der Fruchtkörper zu verschiedenen Stämmen von H. erinaceus (Park et al., 2004; Lu et al., 2002; Brock et al., 2009). .......... 100 Tabelle 2.16: Auswahl von Homologien der DNA-Sequenz der 5,8S Untereinheit mit flankierendem ITS-Bereich vom Stamm FU70034 zu verschiedenen Stämmen von H. erinaceus (Park et al., 2004; Lu et al., 2002; Brock et al., 2009). ................................................................................................................. 101 Tabellenverzeichnis XX Tabelle 3.1: Biosyntheseweg der Terpenoide von verschiedenen Pilzen und Pflanzen. ...... 109 Tabelle 3.2: Biotechnologische Gewinnung von Cyathan-Diterpenoiden. ............................. 116 Tabelle 3.3: HPTLC vs. HPLC-DAD am Beispiel von Rohextrakten aus H. erinaceus. ........ 129 Tabelle 3.4: Beispiele zur Vorbehandlung der Mikrotiterplatte zur Gewährleistung direkter Bindung von Haptenen. ........................................................................ 132 Tabelle 3.5: Beispiele zu Anwendungstoleranz gegenüber organischen Lösungsmitteln im ELISA. ........................................................................................................... 136 Tabelle 4.1: Untersuchte Basidiomyceten. ............................................................................. 141 Tabelle 4.2: Verwendete Chemikalien. ................................................................................... 141 Tabelle 4.3: Verwendete Geräte. ........................................................................................... 146 Tabelle 4.4: Verwendete Trennsäulen. .................................................................................. 151 Tabelle 4.5: Standardnährlösung (SNL) modifiziert nach Sprecher und Hanssen (1982). .... 152 Tabelle 4.6: Malzextrakt-Agar. ............................................................................................... 152 Tabelle 4.7: Hefemalz-Medium (YM6,3). ................................................................................ 153 Tabelle 4.8: Sojapepton-Nährlösung (SP).............................................................................. 153 Tabelle 4.9: Medienscreening zur Produktion von Erinacin C. .............................................. 154 Tabelle 4.10: ZM1/2-Medium mit Edamin ® S (Medium 0). ....................................................... 154 Tabelle 4.11: Medien für Weglassversuche. ............................................................................ 155 Tabelle 4.12: Spurenelementlösung für Nährmedien. .............................................................. 155 Tabelle 4.13: 50 mM Kaliumphosphat-Puffer, pH = 7,4. .......................................................... 163 Tabelle 4.14: Übersicht über die untersuchten Parameter für den Zellaufschluss mittels Rührwerkskugelmühle. ....................................................................................... 165 Tabelle 4.15: Systemparameter der MERCK HPLC-Anlage zur Striatal-Analytik.................... 167 Tabelle 4.16: Gradient der MERCK HPLC zur Striatale-Analytik. ............................................ 168 Tabelle 4.17: Gradient der MERCK HPLC zur Erinacine-Analytik. .......................................... 170 Tabellenverzeichnis XXI Tabelle 4.18: Methodenparameter zur Auftrennung der Inhaltsstoffe aus dem Ethylacetat-Rohextrakt von C. striatus. .............................................................. 172 Tabelle 4.19: Gradient zur Auftrennung der Inhaltsstoffe aus dem Ethylacetat-Rohextrakt von C. striatus. ................................................................................................... 172 Tabelle 4.20: Gradient zur Auftrennung der Inhaltsstoffe aus dem MeOH-Rohextrakt von C. striatus. .......................................................................................................... 173 Tabelle 4.21: Methodenparameter zur Auftrennung der Inhaltsstoffe aus H. erinaceus. ........ 174 Tabelle 4.22: Gradient zur Auftrennung der Inhaltsstoffe aus H. erinaceus. ........................... 174 Tabelle 4.23: Methodenparameter zur Reinheitsüberprüfung bei IMD. ................................... 175 Tabelle 4.24: Gradient zur Reinheitsüberprüfung sowie einer Massenbestimmung. .............. 175 Tabelle 4.25: Berechnete theoretisch exakte Massen der Standards. .................................... 185 Tabelle 4.26: Cyathan-Diterpenoide mit den theoretisch berechneten exakten Massen. ....... 186 Tabelle 4.27: Sekundärmetabolite im Fruchtkörper von H. erinaceus mit den theoretisch berechneten exakten Massen. ........................................................................... 187 Tabelle 4.28: Geräteparameter GC-FID. .................................................................................. 188 Tabelle 4.29: Geräteparameter GC-MS. .................................................................................. 189 Tabelle 4.30: 0,1 M Kaliumacetat-Puffer (KOAc), pH 4,0. ....................................................... 190 Tabelle 4.31: 10 mM Phosphat gepufferte Salzlösung (PBS) pH 7,4. ..................................... 190 Tabelle 4.32: 0,1 M Natriumcarbonat-Puffer pH 9,5. ............................................................... 190 Tabelle 4.33: Waschpuffer, 10 mM PBST, pH 7,4. .................................................................. 191 Tabelle 4.34: Blockierungsproteinlösung, 1%ige Gelatine. ...................................................... 191 Tabelle 4.35: Blockierungsproteinlösung, 5%iges Milchpulver. ............................................... 191 Tabelle 4.36: 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidin (TMB)-Stammlösung. .......................................... 191 Tabelle 4.37: Färbelösung. ....................................................................................................... 192 Tabelle 4.38: Rinderserumalbumin (BSA)-Stammlösung. ....................................................... 192 Tabellenverzeichnis XXII Tabelle 4.39: Ablauf der Immunisierung................................................................................... 193 Tabelle 4.40: pH-Werte der Pufferlösungen vor und nach Zugabe von DMSO. ...................... 194 Tabelle 4.41: Pipettierschema für eine Probe zur Präinkubation (1 mL Ansatz). .................... 200 Tabelle 4.42: ITS-Primer zur Amplifizierung der 5,8S ribosomalen Untereinheit mit ITS- Bereich. .............................................................................................................. 202 Einleitung 23 1 Einleitung 1.1 Naturstoffe Der Begriff Naturstoffe beschreibt organisch-chemische Verbindungen mit biologischem Ursprung. Naturstoffe werden in allen lebenden Organismen, wie z. B. Tieren, Pflanzen, Pilzen und Mikroorganismen, aufgebaut oder ineinander umgewandelt. In Bezug auf ihre Funktionen können im Wesentlichen zwei Gruppen von Naturstoffen unterschieden werden. Die eine Gruppe kommt ubiquitär vor, also sowohl in Tieren, Pflanzen, Pilzen als auch in Mikroorganismen. Es handelt sich um sog. primäre Metabolite, die im Rahmen des Primär- oder Grundstoffwechsels gebildet werden und für den Organismus zur Lebenserhaltung und zum Wachstum benötigt werden. Dazu gehören bestimmte Carbonsäuren, Aminosäuren, Proteine und Nukleinsäuren sowie deren Bausteine, Kohlenhydrate und Lipide. Die zweite Gruppe, die sog. sekundären Metabolite, umfasst Verbindungen, die nur in bestimmten Organismengruppen oder gar nur in wenigen Arten aufgefunden werden. Diese sekundären Metabolite werden im Rahmen des Sekundärstoffwechsels gebildet und haben keine direkte Rolle in der Ökonomie der lebenden Zellen. Sie unterteilen sich in einzelne Substanzgruppen, deren wichtigste nachfolgend aufgeführt sind (Nuhn, 2006): - Farbstoffe (Flavonoide, Anthocyanine, Betalaine) und Duftstoffe (ätherische Öle) der Blüten, mit der Funktion Insekten anzulocken, - Polysaccharide (Cellulose, Chitin, Peptidoglykane), die als Zellwandbestand- teile (Bakterien, Pflanzen, Pilze) oder Exogerüste (Insekten, Krebse, Pflanzen) einen mechanischen Schutz gewähren, - Terpene, Steroide, Alkaloide oder Stoffwechselprodukte der Fettsäuren, die als Hormone oder Pheromone zur Regulation innerhalb des Organismus oder zwischen den Organismen (Sexualverhalten, Kommunikation) beitragen, Einleitung 24 - Toxine, die Tiere zur Abwehr oder zum Angriff einsetzen bzw. Pflanzen oder Pilze ungenießbar machen oder antimikrobielle Abwehrstoffe, die von Pflanzen nach einer Infektion gebildet werden. Einer der bekanntesten Farbstoffe ist Indigo (Abbildung 1.1), der blaue Farbstoff der Indigosträucher (Indigofera). Marco Polo (1254-1324) beschrieb als Erster die Herstellung von Indigo aus der Indigopflanze in Indien. 1897 stellte man so 6000 Tonnen natürlichen Indigos her (Schaefer, 2007). Mit natürlichem Indigo gefärbte Kleider waren sehr beliebt und früher ein Privileg der Obrigkeit. Heute wird Indigo hauptsächlich chemisch synthetisiert und gehört zu einem unverzichtbaren Farbstoff für „Blue Jeans“. N H N H O O Abbildung 1.1: Struktur des Farbstoffes Indigo. Naturstoffe haben den Menschen auf Grund ihrer vielseitigen biologischen Wirksamkeiten seit ältesten Zeiten interessiert. Als erstes Alkaloid konnte das Morphin, eines der stärksten bekannten natürlichen Schmerzmittel, aus dem Opium von dem Paderborner Apotheker Friedrich Wilhelm Sertürner 1805 isoliert werden. In den 1820er Jahren wurde Morphin als erster industriell hergestellter Naturstoff mit einem für die damalige Zeit außergewöhnlichen Reinheitsgrad von Merck (Darmstadt) produziert und kommerziell vermarktet (Habermehl et al., 2008). Mit der Entdeckung der Penicilline aus dem Schimmelpilz Penicillium chrysogenum (früher als Penicillium notatum bekannt) durch Sir Alexander Fleming (1929) begann die Erschließung der Mikroorganismen als Quelle für neue Wirkstoffe und zugleich das Zeitalter der Antibiotika, welches in der zweiten Hälfte des zwanzigsten Jahrhunderts seinen Höhepunkt erreichte. So wurde 1941 die Einleitung 25 fermentative Produktion von Penicillin in den USA und in kleinerem Umfang 1943 in Deutschland, in den Farbwerken Hoechst, begonnen. Das Penicillin löste eine Revolution in der antibakteriellen Chemotherapie aus. Im Laufe der Jahre entdeckte man auch, dass die Natur eine ganze Reihe verschiedener Penicilline hervorbringt, die sich lediglich in den Seitenketten unterschieden. Sie dienten als Ausgangsstoffe für eine Vielzahl semisynthetischer Derivate. Spätestens seitdem sind Naturstoffe zu einer wichtigen Quelle für Leitstrukturen pharmazeutischer Wirkstoffe geworden (Bud, 2007; Schaefer, 2007). Eine ganze Reihe von Wirkstoffen leiten sich heute von Naturstoffen ab. Ein Beispiel hierfür sind die als Medikamente weltweit meistverkauften Statine, welche das Enzym 3-Hydroxy-3-methylglutaryl-Coenzym A-Reduktase (HMG-CoA- Reduktase) inhibieren und zur Senkung des Blut-Cholesterinspiegels beitragen. Atorvastatin (erster Hersteller Pfizer 1986, vertrieben als Lipitor® oder Sortis®) erreichte im Jahr 2011 auf dem US-Markt einen Umsatz von 7,7 Milliarden Dollar und stand bis 2011 schon mehrere Jahre auf Platz 1 der Top 200 Drogen (Bartholow, 2012). Wichtige Vertreter der Statin-Derivate sind z. B. Mevastatin, Lovastatin, Simvastatin, Pravastatin, Fluvastatin und Cerivastatin. Mevastatin (früher Compactin), wurde in den 70er Jahren aus Penicillium citrinum isoliert und war das Erste aller entdeckten Statine (Endo et al., 1976a, b). Lovastatin (früher Mevinolin) wurde im Jahr 1980 aus Aspergillus terreus isoliert und später in Monascus ruber gefunden (Alberts et al., 1980; Alberts, 1988; Manzoni et al., 1999). Die industrielle Produktion begann 1980 bei Merck durch Fermentation eines Stamms von A. terreus. Durch weitere Optimierung und den Einsatz der Mutagenesetechnik konnte 1997 die Lovastatin-Konzentration auf 7 bis 8 g L-1 erhöht werden. Weiterhin erfolgte die Produktion von z. B. Pravastatin durch Biotransformation des Mevastatins durch Streptomyces carbophilus. Simvastatin, das zweitmeist verkaufte Statin, wird durch einen semisynthetischen Prozess mit einer chemischen Modifikation der Seitenkette vom Naturstoff Lovastatin gewonnen. Atorvastatin und Fluvastatin werden vollsynthetisch hergestellt (Manzoni und Rollini, 2002). Außer in Aspergillus sp., Penicillum sp. und Monascus sp. wurde auch im Basidiomyceten (Ständerpilz) Pleurotus ostreatus Einleitung 26 die Produktion der Statine beobachtet (Alarcon et al., 2003; Alarcon und Aguila, 2006). Das Phylum der Basidiomyceten umfasst die am höchsten entwickelten Pilze und stellt eine ergiebige Quelle für Naturstoffe mit hohem Anwendungspotential in der Weißen Biotechnologie dar. Bisher sind ca. 30.000 Arten von Basidiomyceten bekannt (Kirk et al., 2008). Sie sind in der Lage, auf komplexen Substraten, wie z. B. Holz, eine Vielzahl sekundärer Metabolite zu produzieren. Einerseits haben Basidiomyceten eine bemerkenswerte Fähigkeit, hochmolekulare Substanzen, unterschiedliche Enzyme, wie z. B. Laccasen, Lipasen, Peroxidasen, Peptidasen und Oxygenasen zu produzieren (Perez et al., 2002; Erjavec et al., 2012). Diese einzigartigen extrazellulären Enzyme können Anwendung als Bio- katalysatoren oder als Zusatzstoffe in der Kosmetik-, der Lebensmittel-, der Chemie- und der Pharma-Industrie finden. Ein Beispiel hierfür ist die neuartige Oxygenase aus Pleurotus sapidus, die das Sesquiterpen (+)-Valencen zu (+)-Nootkaton oxidiert (Fraatz et al., 2009a, b). Die von Basidiomyceten produzierten Polysaccharide, wie z B. β-1,3-Glucane und β-1,6-Glucane, wurden intensiv als Immunmodulatoren oder Antitumorstoffe von vielen Wissenschaftlern untersucht (Roupas et al., 2012; Paterson, 2006; Yang und Zhang, 2009; Zhang et al., 2007; Lindequist et al., 2005). Andererseits sind Basidiomyceten in der Lage, niedermolekulare Naturstoffe, wie z. B. Aromen, zu produzieren. Aus Nidula niveo-tomentosa konnte das Himbeer- keton gewonnen werden (Böker et al., 2001). Das blumige Aroma β-Ionon konnte durch Mycetinis scorodonius (früher Marasmius scorodonius) und Trametes versicolor aus β-Carotin gebildet werden (Zorn et al., 2003). Basidiomyceten sind potentielle Quellen zur Gewinnung von natürlichen Aromen und haben besondere Bedeutung für die Lebensmittelindustrie (Lomascolo et al., 1999). Gegenüber den chemisch synthetisierten Aromen hat dies wesentliche Vorteile: Die Herstellungs- prozesse sind umweltfreundlicher und es wird auf natürlich nachwachsende Rohstoffe zurückgegriffen. Diese Produkte werden vom Verbraucher bevorzugt. Einleitung 27 Neben den natürlichen Aromen sind die Basidiomyceten ebenfalls „Fabriken“ von verschiedenen Terpenoiden (Ayer und Browne, 1981; Schüffler und Anke, 2009). Die breiten biologischen Eigenschaften natürlicher Terpenoide und das Potential, in der pharmazeutischen Industrie zum Einsatz zu kommen (Antibiotika, Immun- Suppressiva, Enzym-Inhibitoren, antitumorale und antivirale Wirkstoffe etc.), haben dazu geführt, dass ein großes Interesse an diesen Verbindungen in der Forschung besteht. Aus Clitocybe illudens können z. B. die Sesquiterpenoide Illudin A und B, aus Coprinopsis episcopalis die Illudine I, I2 und J2, isoliert werden, welche antibakterielle und antitumorale Aktivität zeigen (Arnone et al., 1991; Gonzalez Del Val et al., 2003). Aus Pleurotus multilus und Clitopilus (Pleurotus) passeckerianus wurde bereits Anfang der 1950er Jahre der Wirkstoff Pleuromutilin mit antibakterieller Aktivität gegen grampositive Erreger isoliert (Kavanagh et al., 1951). Die Herstellung von semisynthetischen Derivaten aus diesem trizyklischen Diterpen erlaubte eine Entwicklung als Arzneimittel. Retapamulin (vertrieben als AltargoTM) ist der erste Wirkstoff dieser Gruppe, der in der Humanmedizin zur Kurzzeitbehandlung von oberflächlichen Hautinfektionen wie Impetigo 1 angewendet wird (Daum et al., 2007; Jacobs, 2007). Aus Hericium erinaceus (Bull.) Pers. wurden eine Reihe von Diterpenoiden aus der Gruppe der Erinacine isoliert, wie z. B. Erinacin A, B und C. Von diesen ist bekannt, dass sie die Synthese des Nerve Growth Factor (NGF) stimulieren (Kawagishi et al., 1994). Alle biologisch aktiven Terpenoide verfügen potentiell über eine große marktwirtschaftliche Bedeutung. 1 Eine hochinfektiöse bakterielle Hauterkrankung mit einem Häufigkeitsgipfel bei Kindern und Neugeborenen. Einleitung 28 1.2 Zielsetzung Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit zwei Basidiomyceten: Cyathus striatus (Huds.) Willd. und Hericium erinaceus (Bull.) Pers.. Bei C. striatus sollten die Sekundärmetabolite vom Striatal-Typus, sog. Cyathan- Diterpenoide, aus Submerskulturen isoliert werden. Die isolierten Reinstoffe sollten als Standardsubstanzen für eine quantitative Analytik sowie für die Etablierung eines Enzyme Linked Immunosorbent Assays (ELISA) dienen. Die gegen Striatal A/B (1/1) hergestellten polyklonalen Antikörper sollten bezüglich ihrer Kreuzreaktivitäten und zur Detektion strukturverwandter Substanzen (u. a. Striatal C/D, Striatin A/B und Erinacin C/P) getestet werden. Bei H. erinaceus sollten die Sekundärmetabolite sowohl aus Submerskultur, als auch aus Fruchtkörpern untersucht werden. Zum einen sollte die Produkt- konzentration von Erinacin C aus Submerskultur optimiert werden. Zum anderen sollten die Sekundärmetabolite chromatographisch isoliert und charakterisiert werden. Die Produktbildungskinetik über den Kulturverlauf hinweg sollte mittels HPLC, HPTLC sowie ELISA ermittelt und miteinander verglichen werden. In Erweiterung dieser Arbeiten sollte noch die Einsatzbarkeit einer HPTLC-NMR- Kopplung zur Strukturaufklärung eines Naturstoffes überprüft werden. Zur Optimierung von Downstreaming Prozessen (DSP) und damit der Zugäng- lichkeit im industriellen Maßstab sollte die Lokalisierung der Sekundärmetabolite aus Basidiomyceten am Beispiel von H. erinaceus und C. striatus untersucht werden. Ergebnisse 29 2 Ergebnisse 2.1 Sekundärmetabolite aus Cyathus striatus 2.1.1 Isolierung und Charakterisierung der Sekundärmetabolite aus Submerskultur 2.1.1.1 Striatale Die Isolierung der Inhaltsstoffe aus C. striatus wurde während eines Aufenthalts bei InterMed Discovery (IMD, Dortmund) durchgeführt. Aus 2,2 L Schüttelkolbenkultur (Kulturtag 12) wurden 4,3 g Rohextrakt aus 179,4 g Biofeuchtmasse (BFM) gewonnen (4.6.1). Die Trennung der Inhaltsstoffe erfolgte mittels präparativer HPLC (4.8.2.1). In Abbildung 2.1 ist ein Beispielchromato- gramm der präparativen Trennung dargestellt. Abbildung 2.1: Beispielchromatogramm der präp. HPLC zur Isolierung der Striatale, die in der Reihenfolge Striatal C, D, B und A eluieren. Detektionswellenlänge: 210 nm und 254 nm. Striatal A und B wurden mit einer Reinheit von > 95% gewonnen und anhand der Referenzsubstanzen eindeutig identifiziert. Für Striatal C und D wurde wegen der Ergebnisse 30 nicht ausreichenden Reinheit (ca. 80%) eine weitere Aufreinigung mittels präparativer HPLC durchgeführt. Da für die Striatale C und D keine Referenz- substanzen zur Verfügung standen, wurden die beiden isolierten Substanzen mittels NMR identifiziert. Die gewonnenen Substanzen (Tabelle 2.1) wurden zum einen als Standardsubstanzen für andere Projektpartner bereitgestellt, zum anderen als Antigene (Striatale A und B) für die Produktion von Antikörpern verwendet (4.9.2). Tabelle 2.1: Identifizierte Striatale A, B, C und D. Substanz Summenformel Molekulargewicht [g mol-1] Menge [mg] Striatal A C27H36O7 472,57 90,8 Striatal B C27H36O8 488,57 94,2 Striatal C C25H34O7 446,53 530,5 Striatal D C25H34O6 430,53 281,1 OH O O O OR 2 H CHO H H R 1 Striatal A: R1 = H, R2 = COCH3 Striatal B: R1 = OH, R2 = COCH3 Striatal C: R1 = OH, R2 = H Striatal D: R1 = R2 = H 2.1.1.2 Striatine Es ist bekannt, dass Striatale in Anwesenheit von Methanol (MeOH) in Striatine umgewandelt werden (Anke et al., 2002). Aus diesem Grund wurde die Biomasse des Pilzes C. striatus mit MeOH extrahiert. Aus 1,6 L Schüttelkolbenkultur von C. striatus (14 Kulturtage) wurden ca. 250 g Biofeuchtmasse gewonnen, die mit 750 mL Methanol für 18 h extrahiert wurden. Nach der Abtrennung des Mycels und dem Entfernen des Lösungsmittels konnten Ergebnisse 31 6,8 g Rohextrakt gewonnen werden. Die Messung mittels HPLC-DAD ergab jedoch, dass im Rohextrakt trotz der Extraktion mit MeOH Striatale und nicht die gewünschten Striatine vorlagen. Die Retentionszeiten der Peaks bei 13,0 min und 14,9 min im MeOH-Rohextrakt stimmten exakt mit denen der Standardsubstanzen Striatal A und B überein (Abbildung 2.2). Außerdem entsprachen die UV-Spektren der Peaks den Spektren der Standards (Abbildung 2.3) und unterscheiden sich von denen der Striatine (Abbildung 2.4). Abbildung 2.2: HPLC-DAD-Analyse des MeOH-Rohextraktes von C. striatus. Vergleich der Retentionszeiten mit den Referenzverbindungen Striatal A und Striatal B. 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 0,25 6 8 10 12 14 16 18 E x ti n k ti o n [ 2 1 0 n m ] Zeit [min] MeOH-Rohextrakt Striatal A in ACN Striatal B in ACN Striatal B Striatal A Ergebnisse 32 Abbildung 2.3: Vergleich der UV-Spektren der Substanzen im MeOH-Rohextrakt mit denen der Standards Striatal A und Striatal B mittels HPLC-DAD. Abbildung 2.4: Vergleich der UV-Spektren der Striatale und Striatine mittels HPLC-DAD. 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 200 250 300 350 400 E x ti n k ti o n Wellenlänge [nm] Striatal A MeOH-Rohextrakt Standard Striatal A Striatal B MeOH-Rohextrakt Standard Striatal B 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 200 250 300 350 400 E x ti n k ti o n Wellenlänge [nm] Striatin A Striatin B Striatal A Striatal B Ergebnisse 33 Die Bildung von Striatinen aus Striatalen ist reversibel. Der Wasseranteil der Bio- feuchtmasse sowie andere Sekundärmetabolite, die zu einem Absinken des pH- Wertes führen, könnten eine Ursache dafür sein, dass es in MeOH nicht zu der gewünschten Striatin-Bildung kam. Wurde der bis zur Trockne eingeengte Rohextrakt erneut mit MeOH versetzt (40 h Rühren), wies das HPLC-Chromatogramm ein anderes Profil auf (Abbildung 2.5). Striatin A coeluierte mit Striatal B, wobei die eindeutige Zuordnung durch den Vergleich des UV-Spektrums der jeweiligen Peaks gewährleistet werden konnte. Abbildung 2.5: Vergleich des MeOH-Rohextraktes vor (schwarz) und nach dem Rühren (rot) mit MeOH für 40 h. 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 4 6 8 10 12 14 16 18 E x ti n k ti o n [ 2 1 0 n m ] Zeit [min] MeOH-Rohextrakt Rohextrakt in MeOH unter Rühren nach 40 h Striatal A Striatal B Striatin A Ergebnisse 34 Der Rohextrakt (64,0 mg) wurde nach der zweiten MeOH-Behandlung mittels präparativer HPLC aufgetrennt (Abbildung 2.6). Abbildung 2.6: Trennung der Striatine mittels präparativer HPLC. Es wurden drei Fraktionen mit einer hohen Reinheit isoliert. Die Massen wurden mit Hilfe des ESI-positiv-Modus (MicroTOF) ermittelt und die Strukturen wurden mittels NMR (in Kooperation mit dem Institut für organische Chemie der Justus- Liebig-Universität Gießen) aufgeklärt. Die NMR-Analytik wurde zunächst in CDCl3 durchgeführt und ergab die Verbindungen Striatal A, C und D (1H- und 13C-NMR- Verschiebungsdaten sowie NMR-Spektren siehe Anhang 7.1). Wurde die Analyse in MeOH-d4 durchgeführt, konnte die Striatin-Form nach- gewiesen werden. Striatin A lag mit einer ausreichenden Reinheit vor, um die Ergebnisse 35 Struktur eindeutig aufzuklären. Beim Striatin C wurden mehrere Substanzsignale detektiert, wodurch eine klare Strukturaufklärung nicht möglich war. Das in 2.1.1.1 isolierte Striatal B wurde für 24 h mit MeOH versetzt und anschließend lyophilisiert. Bei der NMR-Analyse in MeOH-d4 wurde Striatin B nachgewiesen. Die 1H- und 13C-NMR-Verschiebungsdaten sowie die zugehörigen NMR-Spektren der jeweiligen Substanzen sind im Anhang 7.1 aufgeführt. Die Strukturen der Striatine A und B sind in der Tabelle 2.2 dargestellt. Die Substanzen Striatine A und B wurden als Standardsubstanzen für die Bestimmung der Kreuzreaktivität im indirekten kompetitiven ELISA verwendet. Tabelle 2.2: Identifizierte Strukturen der Striatine A und B. Substanz Summenformel Molekulargewicht [g mol-1] Menge [mg] Striatin A C28H40O8 504,61 1,9 Striatin B C28H40O9 520,61 1,5 OH O O O OR 2 H H H R 1 OH O Striatin A: R1 = H, R2 = COCH3 Striatin B: R1 = OH, R2 = COCH3 Ergebnisse 36 2.2 Sekundärmetabolite aus Hericium erinaceus 2.2.1 Optimierung der Bildung von Erinacin C Hericium erinaceus wurde in verschiedenen Medien (Tabelle 4.5 bis Tabelle 4.10) kultiviert, um die Konzentration der Zielsubstanz Erinacin C zu optimieren. Das einzige Medium, in dem Erinacin C nachweisbar war, war das ZM1/2-Medium mit Edamin® S (Medium 0). Aus diesem Grund wurde dieses Medium als Referenz- medium für die weitere Optimierung verwendet. Alle Werte resultieren aus zwei separat kultivierten Kolben. 2.2.1.1 Weglassversuche Ziel dieses Versuchs war es, den Einfluss der einzelnen Kohlenstoffquellen auf die Erinacin C-Bildung zu untersuchen. Im Medium 0 (Tabelle 4.10) dienten nicht nur Zucker wie Glucose und Saccharose als Kohlenstoffquellen, sondern auch Melasse, Mannit und Hafermehl. Die in diesem Versuch verwendeten Medien sind in Tabelle 4.11 aufgeführt. Medium 0 wurde als Referenzmedium betrachtet. In den Medien 1 bis 5 wurde die jeweilige Kohlenstoffquelle einzeln weggelassen. In Medium 6 wurde Edamin® K anstelle von Edamin® S benutzt, um den Unterschied zwischen den beiden Edamin®-Qualitäten zu ermitteln. Diese Versuche erfolgten in 250 mL-Erlenmeyerkolben mit 100 mL Nährmedium. Die Kultivierungsdauer betrug jeweils 27 Tage. In Abbildung 2.7 sind die Erinacin C-Konzentrationen und Biofeuchtmassen für alle verwendeten Medien zusammengefasst. Im Medium ohne Hafermehl wurde kein Erinacin C gebildet, d. h. Hafermehl spielt bei der Biosynthese des Erinacins C eine wichtige Rolle. Allerdings dient das Hafermehl nicht nur als Kohlenstoffquelle, sondern auch als eine wichtige Stickstoffquelle. Eine signifikante Erhöhung der Konzentration an Erinacin C wurde im Medium 6, das mit Edamin® K versetzt wurde, erreicht. Die Konzentration betrug 172,4 mg L-1, was fast die 8,5-fache Menge im Vergleich zu der im Referenzmedium (20,4 mg L-1) gebildeten Menge darstellte. In Medium 6 wurde eine vergleichs- Ergebnisse 37 weise geringe Biofeuchtmasse (22,0 g L-1) gebildet, allerdings konnte hier eine hohe Erinacin C-Konzentration erzielt werden. Abbildung 2.7: Einfluss der Medienzusammensetzung auf die Erinacin C-Konzentration und Biofeuchtmasse bei Kulturabbruch (Tag 27). 2.2.1.2 Einfluss des Hafermehls Basierend auf dem Ergebnis aus 2.2.1.1 wurde in einem weiteren Weglassversuch der Einfluss von Hafermehl im Medium 6 überprüft. Hier wurden die Medien 6 (mit Hafermehl) und 7 (ohne Hafermehl) verwendet (Tabelle 4.11). Die Bildung von Erinacin C wurde von Tag 1 bis Tag 9 mittels HPLC-DAD analysiert (4.8.5, Produktbildungskinetik). Erinacin C wurde trotz Abwesenheit des Hafermehls im Medium 7 gebildet. Allerdings wurde Erinacin C über die gesamte Kulturdauer von neun Tagen im Medium 6 mit Hafermehl in einer höheren Konzentration detektiert (Abbildung 2.8). Ab dem 3. Kulturtag nahm die Bildung von Erinacin C im Medium 6 signifikant zu. Ergebnisse 38 Während die Erinacin C-Konzentration im Medium 7 bereits an Tag 6 ihr Maximum (ca. 85 mg L-1) erreichte, stieg sie im Medium 6 weiter an. Bei Kulturabbruch am Tag 9 betrug die Erinacin C-Konzentration 257 mg L-1. Dies entsprach im Vergleich zum Medium 7 etwa der 3-fachen Menge. Deshalb wurde Medium 6 als das effektivste Medium zur Produktion von Erinacin C in späteren Versuchen eingesetzt. Abbildung 2.8: Erinacin C-Bildung im Medium 6 (mit Hafermehl) und Medium 7 (ohne Hafermehl). 2.2.1.3 Einfluss von UV-A-Bestrahlung auf die Kultivierung Bei Nidula niveo-tomentosa konnten Böker et al. (2001) und Taupp et al. (2008) mit einem Sojapepton-Medium und bei einem 10 Stunden Licht / 14 Stunden Dunkel-Rhythmus eine mehrfache Steigerung der Metabolitkonzentration erreichen. Daher wurde untersucht, ob sich eine Ultraviolett (UV)-Bestrahlung positiv auf die gewünschte Erinacin C-Bildung auswirkt. H. erinaceus wurde in 100 mL-Erlenmeyerkolben mit 40 mL Medium 6 inkubiert. Über den Kulturverlauf 0 100 200 300 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 E ri n a c in C i m K u lt u rü b e rs ta n d [ m g L -1 ] Kulturdauer [Tag] Medium 6 (mit Hafermehl) Medium 7 (ohne Hafermehl) Ergebnisse 39 hinweg wurden in definierten Zeitabständen Proben entnommen (jeweils zwei parallel kultivierte Kolben). Die Entwicklung der Biotrockenmasse, des pH-Werts sowie die Summe des gebildeten Erinacins C im Mycel und im Kulturüberstand sind in Abbildung 2.9 bis Abbildung 2.12 dargestellt. Aus Abbildung 2.9 wird deutlich, dass die UV-A-Bestrahlung das Wachstum von H. erinaceus negativ beeinflusste. So betrug die Biotrockenmasse der mit UV-A- Bestrahlung belichteten Kulturen nach 18 Tagen etwa die Hälfte der Kulturen, die im Dunkeln inkubiert wurden. Der pH-Wert zeigte in den Kulturen mit UV-A-Bestrahlung und unter Licht- ausschluss einen gegensätzlichen Verlauf (Abbildung 2.10). In den belichteten Kulturen stieg der pH-Wert langsam an. In den Kulturen, die unter Lichtausschluss geführt wurden, nahm der pH-Wert bis zum Kulturtag 18 stetig ab, um dann wieder anzusteigen. Bei der Dunkelkultivierung wurde am 12. Kulturtag eine Erinacin C-Konzentration von 125,6 mg L-1 Medium (entspricht 29,9 mg g-1 Biotrockenmasse) detektiert (Abbildung 2.11). Danach schwankte die Produktkonzentration um einen Wert von 120 mg L-1. An Tag 26 erreichte die Erinacin C-Konzentration einen Wert von ca. 135 mg L-1 Medium. Das entsprach 21 mg g-1 Biotrockenmasse, was auf die höhere Biotrockenmasse im Vergleich zum Tag 12 zurückzuführen ist (Abbildung 2.12). Bei den Kulturen unter UV-A-Bestrahlung wurde die Produktion der Wirkstoffe sehr stark unterdrückt. Mittels HPLC-Analyse wurde kein Erinacin C nach- gewiesen. Aus diesem Grund wurde in späteren Versuchen auf eine UV-A- Bestrahlung der Kulturen verzichtet. Ergebnisse 40 Abbildung 2.9: Biotrockenmassen der Kulturen unter Lichtausschluss und mit UV-A- Bestrahlung. Abbildung 2.10: pH-Verlauf der Kulturen unter Lichtausschluss und mit UV-A-Bestrahlung. Ergebnisse 41 Abbildung 2.11: Erinacin C-Produktion in den Kulturen unter Lichtausschluss. Abbildung 2.12: Zusammenstellung der Erinacin C-Produktion und der Biotrockenmasse in den Kulturen unter Lichtausschluss. Ergebnisse 42 2.2.2 Isolierung und Charakterisierung der nicht-flüchtigen Sekundärmetabolite aus H. erinaceus Die Inhaltsstoffe von H. erinaceus wurden aus einer Submerskultur sowie aus den Fruchtkörpern extrahiert und mittels präparativer HPLC bzw. HPTLC analysiert und isoliert. Die isolierten Substanzen, die mit einer ausreichenden Reinheit vorlagen, wurden mittels NMR hinsichtlich ihrer Strukturen aufgeklärt. Die Eigenschaften (z. B. Produktbildungskinetik, UV/Vis-Spektren, Bioaktivität) der Sekundärmetabolite wurden mittels HPTLC und HPLC-DAD charakterisiert. 2.2.2.1 Identifizierte Sekundärmetabolite aus der Submerskultur Im Medium 6 gebildete Sekundärmetabolite: Aus 2,2 L Submerskultur von H. erinaceus im Medium 6 (Kulturtag 18) wurden 66,9 g Biofeuchtmasse gewonnen, die nach 4.7.4 und 4.6.1 aufgearbeitet und deren Rohextrakt (583 mg) nach 4.8.2.2 aufgetrennt wurde. Aus dem Rohextrakt konnten 47,8 mg Erinacin C (C25H38O6) mit einer Reinheit von > 95% isoliert werden (Tabelle 2.3). Dieses wurde für die biologische Charakterisierung (durchgeführt von IMD) verwendet und als Standard für weitere Fermentationsexperimente und für die Fast Centrifugal Partition Chromatography (FCPC) an der TU Dortmund bereitgestellt. Des Weiteren konnten aus dem Rohextrakt 3,4 mg Erinacin F (C25H36O6) mit einer Reinheit von > 95% isoliert werden. Darüber hinaus gelang es, den neuen, noch nicht in der Literatur beschriebenen Naturstoff 4-Chlor-3,5-dimethoxybenzoesäure (C9H9ClO4) zu isolieren (5,6 mg), welcher nicht zu den Striatalen oder Erinacinen gehört (Abbildung 2.13). Diese Verbindung besitzt ein Molekulargewicht von 216,62 g mol-1. Ergebnisse 43 Abbildung 2.13: 4-Chlor-3,5-dimethoxybenzoesäure (C9H9ClO4). Eine weitere Substanz (56,0 mg) mit der Summenformel C18H21NO5 konnte aus der Submerskultur mit hoher Reinheit isoliert und identifiziert werden (Abbildung 2.14). Sie hat ein Molekulargewicht von 331,36 g mol-1. Abbildung 2.14: Struktur des isolierten Naturstoffs mit der Summenformel C18H21NO5. Aus 1 L Submerskultur von H. erinaceus im Medium 6 (Kulturtag 4) wurden 253,0 mg Rohextrakt aus 28,3 g Biofeuchtmasse gewonnen. Erinacin P konnte mittels präparativer HPLC isoliert werden (ca. 1 mg Erinacin P aus 30 mg Rohextrakt). Die Struktur wurde mittels NMR (in Kooperation mit dem Institut für organische Chemie der Justus-Liebig-Universität Gießen) aufgeklärt. Die Verschiebungsdaten aus den 1H- und 13C-Messungen sind im Anhang 7.1 dargestellt. Ergebnisse 44 Zusammenfassend wurden folgende Substanzen aus Submerskulturen von H. erinaceus im Medium 6 identifiziert (Tabelle 2.3). Tabelle 2.3: Identifizierte Substanzen aus Submerskulturen von H. erinaceus im Medium 6. Struktur Molekular- gewicht [g mol-1] Summenformel m/z ESI + m/z ESI - 331,36 C18H21NO5 a 332,26 b 663,58 c 330,27 O O H O OH OH OH 434,56 C25H38O6 (Erinacin C) b 869,65 d 479,44 H O OH OH OHOH OH H 432,55 C25H36O6 (Erinacin F) b 865,85 c 431,42 d 477,43 O O H OH OH OH H O O O 492,27 C27H40O8 (Erinacin P) e 515,26 - 216,62 C9H9ClO4 (4-Chlor-3,5- dimethoxy- benzoesäure) - c 215,04 a: [M+H] + ; b: [2M+H] + ; c: [M-H] - ; d: [M+Formiat-H] - ; e: [M+Na] + Ergebnisse 45 Im YM6,3-Medium gebildete Sekundärmetabolite: Aus 1,6 L Submerskultur von H. erinaceus im YM6,3-Medium (Kulturtag 7) wurden 28,4 g Biofeuchtmasse gewonnen, die ohne vorherigen Zellaufschluss über Nacht mit Aceton extrahiert wurden. Des Weiteren wurde wie in 4.6.1 beschrieben verfahren. Insgesamt wurden 339,3 mg Rohextrakt aus der Biomasse und 471,2 mg Rohextrakt aus dem Kulturüberstand gewonnen. Daraus wurden folgende Substanzen isoliert und identifiziert (Tabelle 2.4). Alle vier Verbindungen gehören zur Substanzklasse der Meroterpenoide und weisen eine Isoindoleinheit auf. Die Substanzen sind in der Datenbank Dictionary of Natural Products (DNP, Version 18:1 und 19:1) und aus anderen Literaturquellen bisher nicht bekannt. In diesen beiden Rohextrakten konnten mittels LC-MS keine Erinacine nachgewiesen werden. Ergebnisse 46 Tabelle 2.4: Identifizierte Substanzen aus H. erinaceus in YM6,3-Medium. Struktur Molekular- gewicht [g mol -1 ] Summenformel m/z ESI + m/z ESI - 774,85 C42H50N2O12 a 775,71 c 773,71 445,51 C24H31NO7 a 446,41 b 891,94 c 444,41 479,52 C27H29NO7 a 480,44 c 478,43 431,48 C23H29NO7 a 432,58 b 863,83 c 430,37 d 861,85 a: [M+H] + ; b: [2M+H] + ; c: [M-H] - ; d: [2M-H] - 2.2.2.2 Identifizierte Sekundärmetabolite aus Fruchtkörpern von H. erinaceus Die Fruchtkörper wurden wie in 4.6.1 beschrieben aufgearbeitet. Aus 162,44 g Fruchtkörpern, die mit Aceton und Ethylacetat extrahiert wurden, wurden insgesamt 1,12 g (entsprechend 0,69% w/w der Fruchtkörper) Rohextrakt gewonnen. Leider waren alle Fraktionen aus der präparativen HPLC entweder nicht rein genug oder wiesen zu wenig Substanz auf, um damit eine NMR-Analyse durchzuführen. Aus einem zweiten Ansatz (156,84 g Fruchtkörper), der mit Aceton und Dichlormethan extrahiert wurde, wurden 0,93 g (entsprechend ca. 0,59% w/w der Fruchtkörper) Rohextrakt gewonnen. In diesem Rohextrakt wurden 2,8 mg Hericenon B und 19,8 mg Hericerin identifiziert (Tabelle 2.5). Ergebnisse 47 Tabelle 2.5: Isolierte Substanzen aus Fruchtkörpern von H. erinaceus. Struktur Molekular- gewicht [g mol -1 ] Summenformel m/z ESI + m/z ESI - 433,54 C27H31NO4 (Hericenon B) a 434,62 b 867,84 c 432,39 d 865,87 419,56 C27H33NO3 (Hericerin) a 420,42 c 418,40 a: [M+H] + ; b: [2M+H] + ; c: [M-H] - ; d: [2M-H] - Für die Fraktionen, die auf Grund nicht ausreichender Reinheit bzw. geringer Mengen nicht mittels NMR analysiert werden konnten, wurden anhand der MS- Daten und der Datenbank DNP folgende Strukturen vorgeschlagen (Tabelle 2.6). Mit einem m/z-Verhältnis von 571,69 im ESI-positiv-Modus sowie einem m/z- Verhältnis von 569,67 im ESI-negativ-Modus waren die Isomeren Hericenon C und F massenspektrometrisch nicht zu unterscheiden. Ebenso weisen Hericenon D und G die gleiche Summenformel mit einem Molekulargewicht von 598,9 g mol-1 auf. Die Molekülionen wurden bei m/z 599,71 im ESI-positiv-Modus und m/z 597,70 im ESI-negativ-Modus detektiert. Ergebnisse 48 Tabelle 2.6: Substanzen aus den Fruchtkörpern von H. erinaceus mit Strukturvorschlag. Struktur Molekulargewicht [Da] Summenformel 570,80 C35H54O6 (Hericenon C) 570,84 C35H54O6 (Hericenon F) 598,85 C37H58O6 (Hericenon D) 598,90 C37H58O6 (Hericenon G) 2.2.2.3 Produktbildungskinetik In den Kulturen von H. erinaceus in Medium 6 (400 mL Kulturmedium + 40 mL Innokulum in 1 L Erlenmeyerkolben) wurde die Produktbildungskinetik von Tag 1 bis Tag 9 mittels HPTLC (4.8.5) sowie HPLC-DAD (4.8.1.2) analysiert. Die Konzentrationen der Substanzen mit einem Retentionsfaktor (hRF) von 16 (Substanz 1), 34 (Substanz 2), und 49 (Substanz 3) wiesen eine deutliche Zeitabhängigkeit auf (Abbildung 2.15). Die Konzentrationen der Substanzen 1 und 3 stiegen während der Kultivierung stetig an. Die Konzentration der Substanz 2 erreichte ihr Maximum am dritten Kulturtag. Ergebnisse 49 (a) (b) Abbildung 2.15: Untersuchung der Produktbildungskinetik mittels HPTLC. Rohextrakte der Kulturüberstände im Medium 6 von Tag 1 bis Tag 9 (T1 - T9). Dokumentation des Chromatogramms bei 254 nm (a) und 366 nm (b). Mittels HPLC-DAD wurde festgestellt, dass Erinacin P in den ersten drei Tagen gebildet und danach schnell abgebaut wurde. Mit dem Abbau einhergehend war ein Anstieg der Konzentration von Erinacin C zu beobachten (Abbildung 2.16). Substanz 2 mit hRF = 34 in der HPTLC könnte demnach Erinacin P entsprechen (Abbildung 2.17). Substanz 2 wurde als Zielsubstanz weiter untersucht, da sie eventuell eine Vorstufe von Erinacin C darstellt. Ergebnisse 50 Abbildung 2.16: Produktbildungskinetik der Erinacine P und C im Kulturüberstand im Medium 6 über neun Kulturtage mittels HPLC-DAD bei 210 nm. Abbildung 2.17: Bildung und Abbau von Substanz 2 (hRF = 34) im Kulturüberstand im Medium 6 (HPTLC). 0 50 100 150 200 250 300 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 K o n z e n tr a ti o n [ m g L -1 ] Kulturdauer [Tag] Erinacin P Erinacin C 0 2000 4000 6000 8000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 S ig n a ls tä rk e [ 2 1 0 n m ] Kulturdauer [Tag] Ergebnisse 51 2.2.2.4 UV/Vis-Spektren Das HPTLC-UV/Vis-Spektrum der Substanz 2 wurde aufgenommen und mit dem HPLC-DAD-Spektrum von Erinacin P verglichen (Abbildung 2.18). Dabei wies Substanz 2 ein sehr ähnliches Spektrum mit einem Absorptionsmaximum von 233 nm auf. Abbildung 2.18: UV/Vis-Spektren. A: Substanz 2, HPTLC. B: Erinacin P, HPLC-DAD. 2.2.2.5 Bioaktivität Zur Untersuchung der Bioaktivität der Metabolite aus H. erinaceus wurde das biolumineszierende gramnegative Bakterium Vibrio fischeri eingesetzt (4.8.5). Die Substanzen mit hemmender bzw. toxischer Wirkung gegen das Bakterium erscheinen als dunkle Zonen auf dem lumineszierenden Plattenhintergrund. Alle 3 min wurde über einen Zeitraum von 30 min ein Foto von der Platte aufgenommen. Damit konnte die Zeitabhängigkeit der Bioaktivität bestimmt Ergebnisse 52 werden. Ein Überblick über die bioaktiven Substanzen aus H. erinaceus ist Abbildung 2.19 zu entnehmen. Abbildung 2.19: Bioaktivität der Sekundärmetabolite gegenüber Vibrio fischeri in 3- minütigen Aufnahmeintervallen. Tag 1 bis Tag 9 (1 bis 9), jeweils Doppel- bestimmung. Die dunklen Zonen zeigen eine deutliche Bioaktivität gegen V. fischeri. Einige Zonen (z. B. unterer Plattenbereich von Tag 6 bis Tag 9) wurden mit längerer Inkubationszeit dunkler. Die Substanzen 2 und 3 (hRF 34 und 49) sind von besonderem Interesse (Abbildung 2.20 und Abbildung 2.21), da diese nicht nur eine zeitabhängige Biosynthese zeigen (Abbildung 2.15), sondern auch bioaktiv Ergebnisse 53 sind. Allerdings konnte kein vergleichbarer Peak für Substanz 3 (blau fluo- reszierend) mittels HPLC-UV-Detektion identifiziert werden. Abbildung 2.20: HPTLC-Bioaktivitätsdetektion von Substanz 2 nach Inkubation mit Vibrio fischeri (links) und dokumentiert bei 254 nm (rechts). Abbildung 2.21: HPTLC-Bioaktivitätsdetektion von Substanz 3 nach Inkubation mit Vibrio fischeri (links) und dokumentiert bei 366 nm (rechts). 2.2.2.6 Derivatisierung Um das Ermitteln einer Summenformel zu erleichtern, wurden die entwickelten Dünnschichtplatten mit verschiedenen Reagenzien derivatisiert (4.8.5). Die Visualisierung der derivatisierten Dünnschichtplatten sowie eines Blindwertes sind in Abbildung 2.22 dargestellt. Substanz 3 wies keine mit DPPH-Radikal-Reagenz detektierbaren antioxidativen Eigenschaften auf, könnte jedoch ein Glykosid sein (Gelbfärbung mit Diphenylamin-Anillin-Reagenz (DPA)). Substanz 3 reagierte nicht mit Primulin- Reagenz, welches lipophilere Verbindungen wie Phosphoglycerolipide oder Glyceroglycolipide indiziert. Aufgrund der leicht blauen Fluoreszenz beim Reagenz nach Neu könnte eine flavonoide Struktur vorliegen. Mit dem Ninhydrin-Reagenz konnten keine primären Aminogruppen oder eine peptidartige Struktur nachgewiesen werden. Ergebnisse 54 Substanz 2 zeigte lediglich beim Zuckernachweis eine gelbliche Färbung, d.h. hier handelt es sich nicht um Glucose oder Saccharose. Weiter konnte gezeigt werden, dass Substanz 2 keine primären Aminogruppen enthält oder eine peptidartige Struktur aufweist. Abbildung 2.22: HPTLC-Chromatogramme nach verschiedenen post-chromatographi- schen Derivatisierungen. Oben: Extrakt der Submerskultur (Tag 4). Rote Linie markiert Substanzen 2 und 3. Unten: Kontroll-Chromatogramme des Extrakts des Kulturmediums ohne Pilz. Extrakte vor den Derivatisierungen dokumentiert bei 254 nm, 366 nm und Weißlicht (Vis). Ergebnisse 55 2.2.2.7 HPTLC-MS/HPTLC-NMR Das mittels präparativer HPLC isolierte Erinacin P sowie der Rohextrakt aus der Submerskultur (Kulturtag 4) von H. erinaceus wurden mittels HPTLC-MS analysiert. Die durch HPTLC-MS ermittelten Molekülionen m/z im ESI+ - Modus der Standardsubstanz Erinacin P waren m/z 515,2 [M+Na]+ und m/z 455,1 [M+Na- CH3COOH]+. Für Substanz 2 wurden die gleichen Massen detektiert (Abbildung 2.23). Abbildung 2.23: MS-Spektren (ESI+) der Substanz mit hRF = 34 aus HPTLC-Platte. A: H. erinaceus (HER) Mycel-Rohextrakt an Kulturtag 4. B: Referenzsubstanz Erinacin P. m/z 515,2 für [M+Na]+ und 455,1 für [M+Na-CH3COOH]+. Mit Hilfe des TLC-MS-Interfaces wurde die Substanz 2 aus der HPTLC-Platte isoliert. Eine anschließende Analyse mittels NMR stellte sich als schwierig heraus. Eine Strukturabsicherung von Substanz 2 sowie vom Erinacin P-Standard aus der HPTLC-Platte war wegen zu geringer Substanzmenge nicht möglich. Ergebnisse 56 2.2.3 Untersuchung flüchtiger Inhaltsstoffe aus Submerskultur von H. erinaceus In Submerskulturen von H. erinaceus im Medium 6 wurde mittels GC-MS eine halogenierte Substanz detektiert. Für den Peak mit einem Kováts-Index (KI)-Wert von 1641 wurde von der Datenbank die Struktur 2-Chlor-4,5-dimethoxy- benzaldehyd (C9H9ClO3) vorgeschlagen (Abbildung 2.24). Das Massenspektrum der Standardsubstanz 2-Chlor-4,5-dimethoxybenzaldehyd (KI = 1620) wies allerdings leichte Unterschiede zum Massenspektrum der Probe auf (Abbildung 2.25). Da 4-Chlor-3,5-dimethoxybenzoesäure als ein Metabolit in der Submerskultur von H. erinaceus mittels NMR identifiziert wurde (Abbildung 2.13), könnte es sich in der Probe um das Isomer 4-Chlor-3,5-dimethoxybenzaldehyd handeln (Abbildung 2.26). Abbildung 2.24: Gaschromatogramm des Extrakts einer Submerskultur von H. erinaceus in SNL-Medium (DB-5-Säule). 0 50 100 150 200 5 10 15 20 25 30 35 A b u n d a n c e Zeit [min] Thymol KI = 1291 * Halogenierter Metabolit KI = 1641 * Ergebnisse 57 Abbildung 2.25: Massenspektren der halogenierten Substanz mit KI = 1641 aus der Submerskultur von H. erinaceus (oben) und des Standards 2-Chlor-4,5- dimethoxybenzaldehyd mit KI = 1620 (unten). Abbildung 2.26: Strukturvorschlag für den halogenierten Sekundärmetaboliten aus der Submerskultur von H. erinaceus: 4-Chlor-3,5-dimethoxybenzaldehyd. Sekundärmetabolit aus H. erinaceus Standard: 2-Chlor-4,5-dimethoxybenzaldehyd Ergebnisse 58 2.3 Lokalisierung der Sekundärmetabolite Um einen Anhaltspunkt für den industriellen Downstreaming Prozess geben zu können, wurde die Lokalisierung der Sekundärmetabolite in der Basidiomyceten- kultur am Beispiel von C. striatus und H. erinaceus mittels MALDI (Matrix- unterstützte Laser-Desorption/Ionisation)-MS-Imaging und verschiedener Zell- aufschlussmethoden untersucht. 2.3.1 MALDI-MS-Imaging zur Lokalisierung der Sekundär- metabolite MALDI (Matrix-Assisted-Laser-Desorption-Ionisation)-MS-Imaging ist eine bild- gebende massenspektrometrische Technik zur Analyse strukturierter biologischer und technischer Oberflächen wie Zelloberflächen und Gewebeproben. Die Informationen zur detektierten Substanz werden dabei als zweidimensionale Verteilungsbilder dargestellt. Diese Technik wurde angewendet, um die Lokalisierung der von den Basidiomyceten C. striatus und H. erinaceus gebildeten Sekundärmetabolite zu ermitteln. Alle dargestellten Verteilungsbilder haben ein Massenfenster von m/z = 0,01 und eine Massengenauigkeit < 2 ppm. 2.3.1.1 Striatale in Submerskulturen aus C. striatus Zunächst wurden die Standardsubstanzen Striatal A und B analysiert, um die entsprechenden m/z-Verhältnisse zu bestimmen. Die Standardsubstanzen von Striatal A und B zeigten folgende Molekülionen bei der MALDI-MS (Tabelle 2.7). Diese Zielmassen wurden später in biologischem Material (z. B. Ausschnitt eines Pellets aus Submerskultur) gezielt detektiert, um ihre Verteilungsbilder darzustellen. Ergebnisse 59 Tabelle 2.7: m/z-Verhältnisse der Standards Striatal A und B bei der Analyse mittels MALDI-MS. Standard [M+H]+ [M+Na]+ [M+K]+ Striatal A 473,25338 495,23532 511,20926 Striatal B 489,24829 511,23024 527,20417 Abbildung 2.27 zeigt ein für die MALDI-MS-Messung verwendetes Pellet von C. striatus. Die Verteilung der Striatale A und B im Pellet ist in der Abbildung 2.28 dargestellt. Die Produkte Striatal A und B sind innerhalb des Pellets lokalisiert und fast homogen verteilt. Die Striatale C und D konnten ebenfalls detektiert werden (m/z-Verhältnisse basierend auf den theoretisch berechneten Werten, Tabelle 4.26); diese verteilen sich ebenfalls nahezu homogen innerhalb des Pellets. Da d