Multiplex Polymerasekettenreaktion mit fluoreszenzoptischer Produktdetektion durch den Einsatz von Primern mit „primerintegrierten Reportersequenzen“ Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen vorgelegt von Nikola Weigand aus Grossen-Linden Gießen 2008 I Aus dem Medizinischen Zentrum für Kinderheilkunde und Jugendmedizin des Universitätsklinikums Gießen und Marburg GmbH, Standort Gießen, Abteilung Allgemeine Pädiatrie und Neonatologie Leiter: Prof. Dr. Klaus-Peter Zimmer Gutachter: Prof. Dr. R. Repp Gutachter: PD Dr. K.H. Reuner Tag der Disputation: 07.07.2009 II Meinen Eltern III Ich erkläre: Ich habe die vorgelegte Dissertation selbstständig, ohne unerlaubte fremde Hilfe und nur mit den Hilfen angefertigt, die ich in der Dissertation angegeben habe. Alle Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus veröffentlichten oder nicht veröffentlichten Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen Auskünften beruhen, sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir durchgeführten und in der Dissertation erwähnten Untersuchungen habe ich die Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis, wie sie in der „Satzung der Justus-Liebig-Universität Gießen zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis“ niedergelegt sind, eingehalten. Inhaltsverzeichnis IV INHALTSVERZEICHNIS 1. Einleitung 1 - 2 2. Literaturübersicht 3 - 23 2.1 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) 3 - 9 2.2 Störfaktoren der Polymerase-Kettenreaktion 9 - 12 2.3 Die Realtime-Polymerase-Kettenreaktion 12 - 15 2.4 Quantitative PCR mit lumineszenzoptischer Produktdetektion 16 - 17 2.5 Die Multiplex-PCR 17 - 18 2.6 Mögliche Anwendungen unterschiedlicher PCR-Formen und ihre Bedeutung 18 - 23 2.6.1 Diagnostik von Infektionen mittels Polymerase-Kettenreaktion 19 - 20 2.6.2 Diagnostik von Leukämien mittels Polymerase-Kettenreaktion 21 – 23 3. Fragestellung 24 4. Methoden 25 - 34 4.1 Kultivierung der Zellen 25 4.2 RNA-Extraktion 26 - 27 4.2.1 RNA-Extraktion aus Vollblut 26 4.2.2 RNA-Extraktion aus Zellkulturen 26 - 27 4.3 Agarose-Gelelektrophorese 27 - 28 4.4 Reverse Transkription 28 - 29 4.5 Reinigung von PCR-Produkten 29 - 30 4.5.1 DNA-Isolierung mit dem QIAquick PCR Purification Kit 29 4.5.2 DNA-Isolierung aus Agarosegelen mit Glasmilch 30 4.6 Polymerase-Kettenreaktion 30 - 31 4.7 Nested-PCR 31 - 32 4.8 Realtime-PCR 33 4.9 Auswahl von Primersequenzen für die PCR 33 – 34 Inhaltsverzeichnis V 5. Ergebnisse 35 - 48 5.1 Testung des HANDS-PCR-Prinzips an einem konstitutiv exprimierten Gen („Housekeeping“ Gen) 35 - 39 5.1.1 Herstellung eines Standards 35 - 36 5.1.2 Optimierung der PCR-Bedingungen für den Einsatz des HANDS-Primers 37 - 38 5.1.3 Optimierung der Sondenkonzentration für die Realtime-PCR 38 - 39 5.2 Optimierung der PCR-Bedingungen zum Nachweis chromosomaler Translokationen kindlicher Leukämien 39 - 44 5.2.1 Auswahl der geeigneten Primer zur Detektion prognostisch relevanter chromosomaler Translokationen 40 - 42 5.2.2 Optimierung der PCR-Bedingungen für die Realtime-PCR 42 - 44 5.3 Automatisierter Nachweis chromosomaler Translokationen kindlicher Leukämien mit Hilfe der Multiplex-Realtime-PCR mit primerintegrierten Reportersequenzen 44 – 48 6. Diskussion 49 - 54 6.1 Entwicklung einer Multiplex-Realtime-PCR mit fluoreszenzoptischer Produktdetektion über primerintegrierte Reportersequenzen (PIRS) 49 - 51 6.2 Einsatz primerintegrierter Reportersequenzen zum Nachweis prognostisch relevanter chromosomaler Translokationen in Leukämiezellen 51 - 53 6.3 Weitere Anwendungsmöglichkeiten primerintegrierter Reportersequenzen 53 – 54 7. Zusammenfassung 55 8. Summary 55 9. Literaturverzeichnis 56 - 62 10. Abkürzungsverzeichnis 63 - 64 11. Danksagung 65 Einleitung 1 1. EINLEITUNG Die Grundlage aller Erbinformationen jeder Zelle ist die Desoxyribonukleinsäure (DNA). Sie fungiert als Speicher aller Baupläne für Proteinmoleküle der Zelle. Alle Proteine, gleich welcher Funktion, werden nach einem auf der DNA befindlichen Plan synthetisiert. Die entstandenen Proteine wiederum sind dann am Bau der lebenswichtigen Stoffklassen, wie Lipide und Polysaccharide beteiligt. James Watson und Francis Crick entdeckten 1953 die Doppelhelix-Struktur der DNA (Gassen et al., 1996). Die DNA ist ein Polymer aus vielen Einzelbausteinen, den Desoxyribonukleotiden. Jedes Nukleotid ist eine Verbindung aus Desoxyribose, heterozyklischer Nukleobase (Adenin, Thymin, Guanin oder Cytosin) und einem Phosphormolekül und bildet die Nukleinsäurekette. Das DNA-Molekül der Zelle besteht aus zwei gegenläufigen DNA-Einzelsträngen. Die Einzelstränge sind über Wasserstoffbrücken, die sich zwischen den komplementären Basenpaare (Adenin – Thymin; Guanin – Cytosin) bilden, miteinander verbunden. Jede Base ist mit einer Desoxyribose verbunden und die 5’ und 3’ Kohlenstoffatome des Zucker untereinander durch Phosphatgruppen. So erhält die einzelsträngige DNA ein 5’ und ein 3’ Ende. Das 5’ Ende eines DNA-Stranges ist komplementär zum 3’ Ende (Watson et al., 1953). Anhand der Abfolge der vier Nukleotide Adenosin, Thymin, Guanin und Cytosin entsteht der genetische Code der Nukleinsäuren. Eine Aminosäure ist durch die genaue Abfolge von drei Nukleotiden definiert, dem sogenannten Triplett. Durch das 5’ und 3’ Ende ist auch die Leserichtung genau definiert. Neben der DNA, die zur Speicherung der Erbinformationen dient, gibt es die einzelsträngige Ribonukleinsäure (RNA). Diese unterscheidet sich durch ihrer Funktion, ihren Zuckeranteil Ribose und anhand der Base Uracil, die die Base Thymin ersetzt. Sie lässt sich anhand ihrer Funktionen in messenger RNA (mRNA), ribosomale RNA (rRNA), transfer RNA (tRNA) und nucleare RNA (nRNA) unterteilen und dient der Übertragung von genetischen Informationen (Gassen et al., 1996). Die RNA entsteht durch Transkription aus DNA und stellt die Arbeitsform der genetischen Information dar. Auf Grundlage der RNA erfolgt dann die Translation, die Herstellung des Proteinmoleküls, das durch den entsprechenden genetischen Code auf der DNA kodiert wird. Einleitung 2 Bereits geringe Änderungen der Struktur der Nukleinsäuren, wie der Austausch einer einzigen Base, können zu drastischen biologischen Veränderungen führen. Zu deren Nachweis sind klassische chemische Verfahren nur bedingt geeignet. Im niedermolekularen Bereich dient zum Beispiel der Einsatz der HPLC (= High Pressure Liquid Chromatographie) zur Auftrennung von Oligonukleotiden. Für den Nachweis und die Unterscheidung spezifischer Nukleinsäuresequenzen werden vor allem Hybridisierungstechniken eingesetzt, deren höchste Entwicklungsstufe derzeit die sogenannte „Chip Technologie“ darstellt. Aufgrund einer sehr hohen räumlichen Auflösung können hiermit tausende verschiedener Nukleinsäuresequenzen gleichzeitig erfasst werden. Andere Verfahren basieren auf der Polymerase-Kettenreaktion (PCR), die letztlich auch als Hybridisierungsverfahren mit einer hoch effizienten enzymatischen Verstärkungsreaktion (Amplifikation) verstanden werden kann. Durch diese Amplifikationsreaktion wird eine sehr hohe Empfindlichkeit erreicht, deutlich höher als es die Chip Technologie ermöglicht. Unter optimalen Bedingungen kann schon ein einziges Molekül einer bestimmten Zielsequenz nachgewiesen werden, was bei vielen Fragestellungen, wie z.B. dem Nachweis von Infektionserregern oder maligne entarteter Zellen und der Personenidentifikation in der Rechtsmedizin hervorragend genutzt werden kann. Literaturübersicht 3 2. LITERATURÜBERSICHT 2.1 Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Die Methode der Polymerasekettenreaktion wurde 1987 von Kary B. Mullis entwickelt. Die Entdeckung der PCR revolutionierte die Gentechnik, da es mittels PCR möglich ist, Nukleotidsequenzen in vitro millionenfach zu kopieren. Diese enzymatische Vervielfältigung, als Amplifikation bezeichnet, erlaubt es, geringe Mengen DNA rasch einer Analyse zugänglich zu machen (Gassen et al., 1996). Zur Amplifikation von DNA-Abschnitten mittels PCR ist es notwendig, dass der unbekannte, zu vervielfältigende DNA-Abschnitt von zwei bekannten DNA- Sequenzen eingerahmt ist. Weiterhin benötigt man als Starthilfen Oligonukleotidprimer (Primer). Hierbei handelt es sich um kurze, einzelsträngige DNA-Moleküle, die komplementär zu einer definierten Sequenz der DNA-Matrize, dem sogenannten „Template“ sind (Newton et al., 1994). Beide DNA-Stränge können als Matrize für die Synthese dienen, vorausgesetzt man setzt den entsprechenden Primer zu. Verwendet man RNA, ist es notwendig vor Beginn der eigentlichen PCR mit Hilfe einer reversen Transkriptase komplementäre DNA (cDNA) zu synthetisieren. Als Ergebnis einer PCR erhält man nach Ablauf von n Runden ein theoretisches Maximum von 2n doppelsträngigen DNA-Molekülen, die Kopien der DNA-Sequenz zwischen den Primern darstellen (Mullis et al., 1986). Neben der DNA-Matrize (Template) und den Primern benötigt man das die DNA synthetisierende Enzym, eine DNA-Polymerase. Man bediente sich ursprünglich der E. coli DNA-Polymerase I zur Verlängerung der Primer. Diese Polymerase wird jedoch durch Hitze inaktiviert und muss in jedem neuen Amplifizierungsschritt neu zugesetzt werden. Vereinfacht wird das Verfahren entscheidend durch den Einsatz von hitzestabilen DNA-Polymerasen. Zu den am häufigsten verwendeten hitzestabilen DNA-Polymerasen gehört die Taq-DNA-Polymerase aus dem thermophilen Bakterium Thermus aquaticus, das im Wasser heißer Quellen lebt (Saiki et al., 1988; Newton et al., 1994). Sie hat ihr Temperaturoptimum bei 72 - 74°C und ist auch noch bei 94°C stabil. Durch die Hitzestabilität ist es daher ausreichend, das Enzym nur einmalig am Anfang der Reaktion zuzusetzen, die Polymerase bleibt während aller weiteren PCR-Schritte aktiv. Um über Literaturübersicht 4 ausreichende Mengen eines qualitativ hochwertigen Enzyms verfügen zu können, wird das Gen der Taq-DNA-Polymerase kloniert, modifiziert und in E. coli expremiert (Amplitaq, P.E. Applied Biosystems). Da sich die Amplitaq- Polymerase leichter in reiner Form isolieren lässt, ist diese das Enzym der Wahl bei Durchführung der PCR. Eine weitere gentechnisch hergestellte, hitzestabile DNA-Polymerase ist die Amplitaq-GOLD. Dieses Enzym wird erst durch einen Heißstart vor der PCR vollständig aktiviert oder kann während der PCR schrittweise aktiviert werden (Newton et al., 1994). Auf die Technik und die Vorteile des Heißstarts wird noch genauer eingegangen. Die Fehlerquote der DNA-Polymerase liegt bei optimalen Reaktionsbedingungen bei 1 zu 80.000 und ist damit sehr gering. Allerdings ist die Fehlerquote der Polymerase von vielen Faktoren, wie zum Beispiel der Konzentration der Desoxyribonucleotidtrisphophate (dNTPs), der Magnesiumionenkonzentration, der Zykluszahl und auch der Konzentration der Polymerase abhängig (Gassen et al., 1996). Die für eine PCR erforderliche dNTP-Konzentration liegt bei etwa 100µM, obwohl die Taq-Polymerase bei niedrigeren Konzentrationen präziser arbeitet. Die optimale dNTP-Konzentration ist jedoch von vielen Faktoren abhängig. Hierzu zählen u.a. die Magnesiumionenkonzentration, die Primerkonzentration, die Länge der DNA-Kopien und die Anzahl der PCR-Zyklen. Um die beste Konzentration zu ermitteln, sollte man unterschiedliche Testansätze mit unterschiedlichen dNTP- Konzentrationen austesten. Die notwendigen Puffer für die Taq-Polymerase sind meist in den entsprechenden Testansätzen in zehnfacher Konzentration enthalten. Bezüglich der Magnesiumionenkonzentration muss, wie auch für die dNTPs das Austesten der richtigen Konzentration in verschiedenen Testansätzen erfolgen. Die optimalen Konzentrationen liegen zwischen 0,5 bis 5,0 mM. Neben der Stimulation der Polymerase bilden die Magnesiumionen zusammen mit den dNTPs einen löslichen Komplex, der für den dNTP-Einbau ausschlaggebend ist (Newton et al., 1994). Der Ablauf der PCR gliedert sich in die in Abb. 1 dargestellten Schritte. Hat man die Primer, welche die Startpunkte der DNA-Synthese vorgeben, die DNA-Polymerase und die Mischung der dNTPs in einem Reagenzansatz mit dem entsprechenden Template zusammengeführt, folgt als erster Schritt die Denaturierung. Der Probenansatz wird über einen definierten Zeitraum auf 94°C Literaturübersicht 5 erhitzt. Bei dieser Temperatur trennen sich die DNA-Stränge des Templates vollständig voneinander. Die entstandenen DNA-Einzelstränge bilden die Matrizen für die Primer und die DNA-Polymerase. Im nächsten Schritt senkt man die Temperatur, damit die Primer an die komplementären Sequenzen des Templates binden können (Annealing). Die „Annealing-Temperatur“ (Tm) bestimmt entscheidend die Spezifität der PCR. Nachdem Primer und Matrize während der Annealingphase aneinander gebunden haben, erfolgt ein erneutes Erhitzen des Ansatzes auf 72°C, der optimalen Temperatur für die Aktivität der DNA- Polymerase. Am Ende dieser Phase, deren Länge unter anderem abhängig ist von der Länge des zu amplifizierenden DNA-Abschnittes, wird der Reaktionsansatz für einige Sekunden erneut auf 94°C erhöht, damit sich die neu gebildeten Doppelstränge voneinander lösen und ein neuer Zyklus beginnen kann. Nach Ablauf einer definierten Anzahl von Zyklen endet der Prozess mit einer Phase der Denaturierung. Hinzu kommen Aufheiz- und Abkühlzeiten (Mullis et al., 1986). Abb. 1: Der zyklische Temperaturverlauf der PCR (Newton et al., 1996) Schritt 1: In einer Lösung aus Primern, dNTPs, dem Reaktionspuffer und einer hitzebeständigen DNA-Polymerase wird die doppelsträngige DNA bei Temperaturen zwischen 93-100°C denaturiert; Schritt 2: Die Oligonucleotidprimer binden in Abhängigkeit der entsprechenden Temperatur Tm an die denaturierte DNA (Matrize); Schritt 3: Die hitzestabile DNA-Polymerase verlängert die Primer bei 72°C. Alle drei Schritte zusammen bilden einen PCR-Zyklus. Die Geräte, die für einen zyklischen Temperaturwechsel während der PCR sorgen, sind sogenannte Thermocycler. Dieser Thermocycler besteht aus einem temperierbaren Reaktionsraum, in den die PCR-Probengefäße gestellt werden. Mit Hilfe einer automatischen Steuerung wird ein zyklisches Temperaturprogramm Schritt 1 Schritt 2 Schritt 3 Schritt 1 Schritt 2 Schritt 3 Schritt 1 Literaturübersicht 6 geregelt. Die jeweilige Temperatur, die Zeit pro Reaktionsschritt und die Zyklenzahl sind individuell programmierbar (Gassen et al., 1996). Erst die Entwicklung dieser Thermocycler macht die Automatisierung der PCR möglich (Newton et al., 1994). Wie bereits beschrieben, handelt es sich bei der PCR um eine sehr empfindliche, mit geringem Aufwand zu betreibende Methode. Sie ermöglicht es, in vitro millionenfache Kopien von bestimmten Nukleotidsequenzen herzustellen und somit auch kleine DNA-Mengen einer raschen Analyse zugängig zu machen. Die Anwendungsmöglichkeiten der PCR sind breit gefächert. Sie kann verwendet werden, um bekannte Sequenzabschnitte zu amplifizieren und sie so der Klonierung oder Sequenzierung zugängig zu machen. Weiterhin wird sie verwendet, um die Anwesenheit bekannter Sequenzen nachzuweisen oder anhand bekannter Sequenzen unbekannte Bereich gezielt zu amplifizieren. Weiterhin können markierte PCR-Produkte als Hybridisiersonden eingesetzt werden. Zur Steigerung der Sensitivität und Spezifität der PCR kann eine so genannte nested-PCR oder geschachtelte PCR durchgeführt werden. Das Prinzip der nested-PCR basiert auf zwei ineinander verschachtelten PCR-Läufen. Aus der Zielsequenz des ersten Laufes wird in der zweiten, sog. Nested-PCR, ein Teilstück der ersten PCR-Produkte amplifiziert. Hierdurch wird einerseits die Sensitivität und Spezifität gesteigert. Die Spezifität ist höher, da nahezu alle falschen unspezifischen Kopien unberücksichtigt bleiben. Diese unspezifischen Kopien bieten den internen Primern in der zweiten PCR-Runde nicht genügend komplementäre Sequenzen und stehen daher als Matrize nicht mehr zur Verfügung. Jedoch auch diese Nested-PCR ist anfällig für Kontaminationen (Gassen et al., 1999). Mit Hilfe der RT-PCR (Reverse-Transkriptase-PCR) können RNA-Sequenzen amplifiziert werden, wobei die RT-PCR im Vergleich zu anderen RNA- Nachweismethoden eine wesentlich größere Sensitivität aufweist. Bei Anwendung der RT-PCR haben die Amplifikationsprodukte nur eine Länge von 1-2 kb. Zurückzuführen ist dies einerseits auf die geringe Stabilität der RNA und andererseits auf die geringe Durchsatzrate der reversen Transkriptase. Wenn Gene für längere Transkripte kodieren, ist es notwendig, von der herkömmlichen RT-PCR abzuweichen und eine Marathon-PCR durchzuführen. Hierbei erfolgt Literaturübersicht 7 zuerst die Durchführung zweier getrennter RT-PCRs. Die beiden entstehenden Produkte überschneiden sich über eine Länge von 20-100 bp. Im zweiten Schritt führt man eine PCR mit den beiden äußeren Primern der ersten Ansätze und den Produkten des ersten Laufes eine neue PCR durch. Auch die Vervielfältigung unbekannter DNA-Sequenzen, ausgehend von einem kurzen Bereich mit bekannter Sequenz, sind mit Hilfe der PCR möglich (RACE-PCR = rapid amplification of cDNA ends-PCR, inverse PCR) (Gassen et al., 1999). Es können nicht beliebig lange DNA-Sequenzen amplifiziert werden. Bei einer Länge der Amplifikationsprodukte von 2-4 kb ist die Grenze der konventionellen Taq-Polymerase erreicht. Ursache hierfür sind frühe Strangabbrüche, ausgelöst durch falsch eingebaute Basen. Es wurden mittlerweile Techniken etabliert, die Amplifikationsprodukte mit Längen bis 40 kb vervielfältigen. Bei der sogenannten Long-Range-PCR findet eine Mischung aus zwei thermostabilen DNA- Polymerasen Anwendung. Neben einer Taq-Polymerase enthält der Ansatz eine „Proofreading“-Polymerase. Diese korrigiert von der Taq-Polymerase falsch eingebaute Basen und verhindert somit den vorzeitigen Abbruch der synthetisierten DNA. Bei vielen Fragestellungen ist es sinnvoll, Transkripte in der Zelle oder im Gewebe selbst zu bestimmen. Die hier anwendbare In-Situ- Hybridisierung ist häufig jedoch nicht empfindlich genug. Abhilfe schafft die In- Situ-PCR. Die DNA oder RNA in der Zelle dienen den Primern als Matrize für die PCR. Die Durchführung der PCR erfolgt direkt in den auf Objektträgern fixierten Gewebeschnitten. Man benötigt dementsprechend speziell konstruierte Thermocycler. Über radioaktive und nicht radioaktive Detektionssysteme erfolgt die Lokalisation der Amplifikationsprodukte (Gassen et al., 1999). Dient die PCR nur dem Nachweis eines bestimmten DNA-Abschnittes, spricht man von einer qualitativen PCR. Es reicht hierbei in der Regel ein einziges DNA- Molekül im Ansatz aus, um einen Nachweis zu erbringen. Die qualitative PCR ist daher eine sehr empfindliche Methode. Sie wird unter anderem dafür verwendet, Krankheitserreger aus einer Probe oder Personen in der Gerichtsmedizin zu identifizieren. Bei der Suche nach Krankheitserregern ersetzt die qualitative PCR die üblichen immunologischen Methoden immer öfter. Von Vorteil ist hier, dass Krankheitserreger mit teilweise bekanntem Genom schon nachgewiesen werden können, wenn von Seiten des betroffenen Patienten noch keine Antikörperbildung erfolgt ist. Weiterhin ermöglicht die Erregersuche mittels qualitativer PCR den Literaturübersicht 8 Erregernachweis auch bei bereits vorhandenen Antikörpern und erlaubt somit die Identifizierung einer Neuerkrankung (Fa. Roche, PCR: Eine ausgezeichnete Methode, 2003). Die Methode ermöglicht nach Ablauf einer bestimmten Anzahl von Zyklen, in der sich die PCR-Produkte exponentiell vermehren, prinzipiell auch deren quantitative Bestimmung. Man kann von der Menge der Produkte somit auf die Menge der eingesetzten Matrize schließen (Gassen et al., 1996). Bei etwa 108 Amplikonkopien erreicht die PCR dann jedoch ein Plateau (Newton et al., 1994). Ursache für das Erreichen diese Plateaus im Anschluss an die exponentielle Phase der PCR ist zum einen das Nachlassen der Enzymaktivität. Zum anderen hybridisieren die neuen DNA-Abschnitte teilweise nicht mehr mit den Primern, sondern mit sich selbst (Wilfingseder et al., 2002). Eine Möglichkeit quantitative Aussagen treffen zu können, ist die Messung paralleler Kontrollproben in getrennten oder den gleichen Reaktionsgefäßen, um kontrollieren zu können, dass sich die PCR-Reaktion noch im Bereich der exponentiellen Vermehrung befindet. Dabei müssen sich die Kontrollprobe und die Ziel-DNA ähneln und mit ähnlich strukturierten Primern amplifiziert werden können (Newton et al., 1994). Der Nachweis, die Identifizierung und die Quantifizierung der PCR-Produkte sind mit Hilfe vieler unterschiedlicher Methoden möglich. Hierzu zählen unter anderem die Gelelektrophorese, Hybridisierungstechniken wie der Southern-Blot oder der Nachweis der Amplikons in Echtzeit, zum Beispiel mittels lumineszenzoptischer Produktdetektion (Heid et al., 1996). Die einfachste Methode zum Nachweis eines PCR-Produktes ist die Gelelektrophorese. Eine kleine Menge der PCR wird auf ein Agarose- oder Polyacrylamidgel aufgetragen, im elektrischen Feld aufgetrennt und die Banden anschließend mit einem Fluoreszenzfarbstoff, zum Beispiel Ethidiumbromid, gefärbt. Dieser wird unter Bestrahlung mit UV-Licht sichtbar. Durch die Fotografie des Gels können die Ergebnisse dokumentiert werden. Zur Identifizierung des Amplikons trennt man neben den PCR-Produkten einen Größenmarker und bekannte, vorher bestimmte Kontrollprodukte auf (Newton et al., 1994). Beim Southern-Blot folgt der Auftrennung der PCR-Produkte im Gel das Transferieren, Fixieren und Hybridisieren mit spezifischen, radioaktiven oder nicht radioaktiven Sonden auf einen Filter (Gassen et al., 1999). Literaturübersicht 9 Diese Nachweismethoden erfordern jedoch weiterhin einen enormen Zeit- und Arbeitsaufwand. Der Southern-Blot beinhaltet zum Beispiel mehrere Wasch- und Fixierungsschritte und ist daher auch anfälliger gegenüber Verunreinigungen. Die Nachweise der Amplikons in Echtzeit stellen in diesem Zusammenhang eine deutliche Weiterentwicklung der PCR dar. Hierbei erfolgen die Amplifizierung und der Nachweis der PCR-Produkte in einem Reagenzgefäß. Diese sogenannte Real-Time-PCR wurde erstmals 1991 von Holland et al. (1991) beschrieben. 2.2 Störfaktoren der Polymerase-Kettenreaktion Die häufigsten Probleme bei Durchführung einer PCR sind keine Produktbildung, unspezifische Nebenprodukte und Kontaminationen (Gassen et al., 1999). Die dNTP-Konzentration, die Zusammensetzung des verwendeten Puffers und die Magnesiumionenkonzentration haben Auswirkungen auf das Gelingen einer PCR und sollten daher ausgetestet werden. In Abhängigkeit vom verwendeten biologischen Material finden sich verschiedene Hemmstoffe im Testansatz einer PCR. Die DNA-Extraktionsmethoden, anwendbar für die Extraktion aus beliebigen Proben, enthalten unterschiedliche Detergentien zur Zellyse und Denaturierung. Nichtionische Detergenzien hemmen die PCR nicht bis zu einer Konzentration von 5%, ionische Detergenzien jedoch schon in extrem niedrigen Konzentrationen. Daher sollten diese beispielsweise durch eine Phenolextraktion mit anschließender Ethanolfällung entfernt werden. Ebenso entfernt werden muss das Enzym Proteinase K, das bei vielen DNA-Extraktionsmethoden verwendet wird, da die Taq-Polymerase gegenüber Proteasen empfindlich ist. Eine der Hauptvoraussetzung für eine ausreichende Produktbildung ist neben dem Einsatz einer qualitativ guten DNA-Matrize, die Auswahl passender Primer. Die Primer sind in der Regel 20-30 Nukleotide lang. Sie sollten, wenn möglich, alle 4 Basen (Adenosin, Thymin, Cytosin, Guanin) gleich häufig enthalten. Weiterhin sollten Primer an ihrem 3’Ende weder inter- noch intramolekular komplementär sein, um die Bildung von Primerdimeren (PDs) zu vermeiden (Newton et al., 1994). Da Primer in hohen Konzentrationen im PCR-Ansatz vorkommen, sind Interaktionen untereinander leicht möglich. Bei einem zueinander komplementären Nukleotid am 3’Ende der beiden einzusetzenden Primer kann die Anzahl der Primerdimere bereits nach 30 Zyklen ansteigen. Fehlt dieses komplementäre Literaturübersicht 10 Nukleotid, tritt der negative Effekt der Primerdimerbildung bei ansonsten identischen Reaktionsbedingungen erst 10 Zyklen später ein (Brownie et al., 1997). Ein weiterer Faktor, der unabhängig vom Design der Primer zur Bildung von Primerdimeren führen kann, ist die Durchführung einer PCR unter Kaltstartbedingungen (Ferrie et al., 1992). Zur Vermeidung der Bildung von Primerdimeren sollten daher die verwendeten Primer vorsichtig ausgewählt werden. Die Verwendung des „hot-starts“ (D’Aquila et al., 1991) oder die Durchführung der „Touchdown“-PCR dient ebenfalls zur Verringerung der Bildung möglicher Primerdimere (Don et al., 1991), ebenso die Anwendung modifizierter Enzyme, wie zum Beispiel die AmpliTaq® Gold DNA Polymerase (Brownie et al., 1997). Bei einem Verfahren der sogenannten „Hot Start“ PCR sind essentielle Komponenten für die Aktivität der Polymerase von der Reaktion zunächst getrennt und werden erst nach Erreichen einer gewissen Temperatur, der optimalen Annealingtemperatur der Primer, zugesetzt oder im Rektionsansatz freigesetzt. Da die Polymerase in dem zuvor inkompletten Reaktionsansatz nicht arbeiten kann, entstehen während der ersten noch von der umgebenden Raumtemperatur ausgehenden Aufheizphase keine unspezifischen Produkte (Steffen et al., 1999). Auch bei der „Touchdown“-PCR werden die Reaktionstemperaturen optimal abgestimmt (Don et al., 1991). Die AmpliTaq® Gold DNA Polymerase wurde chemisch so modifiziert, dass sie erst nach Erreichen einer bestimmten Temperatur aktiv wird. Bei Raumtemperatur zu einem Testansatz zugegeben kann sie daher keine Primerdimere amplifizieren (Moretti et al., 1998). Neben all diesen genannten Punkten spielt die richtige Wahl der Annealing- Temperatur eine Rolle bei der Durchführung eine effizienten PCR. Die zur Berechnung der Annealing-Temperatur vorhandene Formel (Anzahl A+T)x2°C + (Anzahl G+C)x4°C) ist jedoch bei Primerlängen über 20 Nukleotide ungenau. Die idealen Temperaturen liegen 3-12°C über den so berechneten (Newton et al., 1994). Computerprogramm wie das von uns verwendete OMIGA (Oxford Molecular) können die sich aus einer bestimmten Primersequenz ergebenden optimalen Annealingtemperaturen auch bei Primerlängen über 20 Nukleotiden sehr genau Literaturübersicht 11 berechnen. Ist die Annealing-Temperatur zu niedrig, werden unspezifische DNA- Abschnitte amplifiziert. Bei zu hohen Temperaturen ist einerseits die Ausbeute an erhaltenem PCR-Produkt und andererseits die Reinheit des Produktes reduziert, da die Anlagerung der Primer an der Zielsequenz nicht ausreichend ist (Rychlik et al., 1990). In solchen Fällen ist es sinnvoll, die Annealing-Temperatur der Primer zu variieren, um eventuelle Fehlpaarungen zu minimieren. Komplementäre Regionen innerhalb der Templates können ebenfalls Probleme bei der Durchführung der PCR bedingen. Die Bildung sogenannter „hair-pins“ und anderer Strukturen stören die reguläre Verlängerung des Templates (Kubista et al., 2006). Potentielle Ursachen für Verunreinigungen sind vielfältig. Neben der Art der Probe, der Methode der Probenentnahme, der Laborausstattung, der Sauberkeit des Arbeitsplatzes und der Arbeitsmaterialien gibt es viele weitere Faktoren, die eine Verunreinigung verursachen können. Eine Negativkontrolle ist bei jedem Probenansatz unerlässlich. Auch Positivkontrollen durch charakterisierte Proben können wichtig sein. Um Verunreinigungen zu vermeiden, müssen Einrichtungen und Reagenzien für die PCR getrennt von anderer Laborausrüstung aufbewahrt werden. Materialien, die autoklavierbar sind, sollten im Autoklaven sterilisiert werden. Reagenzien lagert man in kleinen Mengen auf Vorrat, um die Kontamination großer Mengen zu vermeiden (Newton et al., 1994). Zur Vermeidung der Kontamination neuer Reaktionsansätze durch Übertragung alter PCR-Produkte empfiehlt sich die Verwendung von dUTP statt dTTP. Befindet sich in allen PCR-Produkten dieses Nukleotid und wird folgenden Reaktionen eine Uracil-N-Glykosylase (UNG) zugesetzt, so kann man eine Zerstörung von PCR- Produkten vorausgehender Reaktionsansätze erreichen, da die UNG die Hydrolyse uracilhaltiger Nukleinsäuren katalysiert und somit die Übertragung früherer dUTP-haltiger PCR-Produkte auf neue Testansätze vermieden wird (Longo et al., 1990). Eine weitere Methode zur Dekontamination der Reagenzgefäße ist die Bestrahlung der PCR-Gefäße mit UV-Licht. Diese zerstört DNA in den Reagenzgefäßen und verhindert somit eine Kontamination des Testansatzes (Sarkar et al., 1991). Zusammenfassend bleibt zu sagen, dass viele Faktoren die Effektivität und Spezifität der PCR beeinflussen. Jede einzelne Komponente der Reaktion kann Literaturübersicht 12 Ursache für ein schlechtes PCR-Ergebnis sein. Daher ist es notwendig, die PCR zu standardisieren. Es sind Kontrollansätze für jede PCR dringend erforderlich, um mögliche Kontaminationen zu erkennen. Beachtet man alle notwendigen Vorsichtsmaßnahmen und versucht mögliche Fehlbestimmungen durch eine Standardisierung der Methode zu verhindern, handelt es sich bei der PCR um eine sehr empfindliche, mit geringen Aufwand zu betreibende Methode, die auch in der Routinediagnostik ohne weiteres durchführbar ist. 2.3 Die Realtime-Polymerase-Kettenreaktion Die von Kary Mullis 1987 entdeckte Polymerasekettenreaktion revolutionierte die medizinische Forschung. Ein weiterer enormer material- und zeitsparender Fortschritt ist die Weiterentwicklung der Methode zur „Echtzeit-PCR“ (Realtime- PCR). Hierdurch werden die Amplifikation der Probe und die gleichzeitige Sichtbarmachung der Vervielfältigung in einem Ansatz ohne Nachbearbeitung und aufwändige Nachweismethoden wie Gelelektrophorese oder Southern-Blots möglich. Higuchi et al. (1992) zeigen, dass durch die Zugabe von Ethidiumbromid zum Testansatz ein Nachweis der vervielfältigten Probe auch ohne Öffnen des Testansatzes möglich ist, da die Intensität der Fluoreszenz von Ethidiumbromid unter Bestrahlung mit UV-Licht nach dem Einbau in Doppelstrang-DNA ansteigt. Dieser Fluoreszenzanstieg kann kontinuierlich gemessen werden und gibt Aufschluss über die Amplifikation der Probe. Die Kinetik der Messung lässt auf die Anzahl der DNA vor Beginn der Reaktion schließen (Higuchi et al., 1993). Diese Art der Produktdetektion vereinfacht den Prozess der PCR und ermöglicht es, viele Proben in rascher Folge zu untersuchen (Higuchi et al., 1992). Die Realtime Detektionssysteme bestehen aus einem Thermocycler und einem optischen Detektionssystem. Nach jedem Zyklus werden die Fluoreszenzwerte gemessen und mittels einer geeigneten Computersoftware ausgewertet. Die Anregung der Fluorophore erfolgt je nach System mit Halogen-, LED oder Laserlicht (Wilfingseder et al., 2002). Unter Ausnutzung der 5’→ 3’ Exonuclease-Aktivität der Taq-DNA-Polymerase gelang 1991 erstmals die Amplifizierung und gleichzeitige Detektion des PCR- Produkts mit 32P-markierten Sonden. Der Zusatz einer Oligonucleotid-Probe (sog. Literaturübersicht 13 Sonde) stört die Amplifizierung des spezifischen Produktes im PCR-Ansatz nicht und die Oligonucleotide werden nur nach Hybridisierung mit der Zielsequenz gespalten. Die Methode macht jedoch weiterhin ein aufwendiges Post-PCR- Processing zur Trennung intakter Sonden von gespaltenen Sonden notwendig (Holland et al., 1991). Zwei Jahre später folgte die Einführung mit Fluoreszenzfarbstoffen markierter Sonden. Die Entwicklung dieser sog. fluorogenen Sonden (TaqMan-Sonden) ermöglicht die Detektion der abgebauten Sonde ohne aufwendiges Post-PCR- Processing (Lee et al., 1993). Mit dem von der Firma Applied Biosystems entwickelten Sequence Detector ABI PRISMTM 7700 oder dem Light Cycler der Firma Roche ist die Messung dieser Fluoreszenzen in einem geschlossenen System möglich. Der TaqManTM PCR Assay der Firma Applied Biosystems macht sich die 5‘→ 3‘ Exonucleaseaktivität der Taq DNA-Polymerase folgendermaßen zu nutzen. Die Polymerase bindet am 5‘-Ende von Doppelstrang-DNA (dsDNA) und verursacht die Spaltung des DNA-Stranges in 5‘→ 3‘ Richtung in Mono- und Oligonucleotide. Die dort verwendete spezielle Sonde ist an ihrem 5’-Ende mit einem „Reporter“- (Fluoreszein-Derivat) und an ihrem 3’-Ende mit einem „Quenscher“-Farbstoff (Rhodaminderivat) markiert. Zusätzlich ist das 3’-Ende mit einem Phosphatrest blockiert, um eine Verlängerung des 3’Endes während der PCR zu vermeiden. Nach Bindung der Sonde an die zu amplifizierende nach der Hitzedenaturierung einzelsträngigen Zielsequenz und Anregung der intakten Sonde durch Licht einer spezifische Wellenlänge, wird die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes aufgrund der räumlichen Nähe zum Quenscher durch den so genannten Fluoreszenz- Resonanzenergietransfer (FRET) unterdrückt (Lee et al., 1993). Bei dem FRET handelt es sich um einen spektroskopischen Prozess, bei dem Energie durch Dipol-Dipol-Wechselwirkung zwischen Molekülen mit überlappenden Emissions- und Absorptionsspektren übertragen wird (Stryer et al., 1967). Wird die Sonde nun im Verlauf der Reaktion durch die Taq-Polymerase geschnitten, verliert der Quenscher-Farbstoff die Nähe zum Reporter-Farbstoff und die Fluoreszenz des Reporter-Farbstoffes steigt an. Da nur die Sonden gespalten werden, die auch sicher an der spezifischen Sequenz gebunden haben, ist das Signal sequenzspezifisch (Lee et al., 1993). Die Effizienz des FRET ist dabei umgekehrt Literaturübersicht 14 proportional zur 6. Potenz des Abstandes der beiden Farbstoffe (Higuchi et al., 1993). Die Abbildung 2 zeigt schematisch den Einfluss der 5’→ 3’ Exonuclease Aktivität der AmpliTaq® DNA Polymerase auf eine Fluorogene Sonde während der Extensionsphase einer TaqManTM PCR. Abb. 2: Einfluss der 5’ → 3’ Exonuclease Aktivität der AmpliTaq® DNA Polymerase auf eine fluorogene Sonde während der Extensionsphase einer TaqManTM PCR (Schild et al., 1996) Für das System der TaqManTM–PCR stehen mehrere Reporter-Farbstoffe wie 6- Carboxyfluorescein (FAM), Tetrachloro-6-carboxyfluorescein (TET), Hexachloro-6- carboxyfluorescein (HEX) oder VIC® zur Verfügung (Arya et al., 2005). Weitere Reporterfarbstoffe sind 2,7-Dimethoxy-4,5-dichloro-6-carboxyfluorescein (JOE) 1. Sequenzspezifische Anlagerung der Sonde und der PCR-Primer. 2. Primer-Extension und Sondenhydrolyse. 3. PCR-Produkt wir vollständig synthetisiert, die Farbstoffe werden getrennt. 4. In Abhängigkeit von der Zahl der freigesetzten Reportermoleküle wächst das Reporter-Signal. Literaturübersicht 15 und 6-Carboxy-X-rhodamin (ROX) (Schild et al., 1996). Als Quenscher dienen 6- Carboxytetramethylrhodamine (TAMRA) oder 4-(Dimethylaminoazo)benzene-4- Carboxylsäure (DABCYL) (Arya et al., 2005). Beim Light Cycler der Firma Roche arbeitet man mit zwei Oligonucleotiden. Eines markiert mit fluoreszierendem Farbstoff am 3‘Ende, ein zweites Oligonucleotid markiert am 5‘Ende. Die Oligonucleotide binden an die Zielsequenz und durch die Nähe zueinander wird eine messbare Fluoreszenz frei. Diese wird während der Annealing-Phase der Reaktion gemessen (Kreuzer et al., 1999). Auch hierbei wird die Freisetzung der messbaren Fluoreszenz ausgelöst durch den sogenannten Fluoreszenz-Energietransfer. Der Donor-Farbstoff transferiert Energie auf den Akzeptor-Farbstoff der zweiten Sonde und bewirkt so die Freisetzung der Fluoreszenz einer bestimmten Wellenlänge. Freigesetzt wird diese aber nur, wenn beide Sonden an der korrekten Sequenz des Templates binden. Die gemessene Fluoreszenz steigt auch hier proportional zu der synthetisierten DNA-Menge während der PCR (Arya et al., 2005). In Abbildung 3 wird diese Sondentechnik des Light Cycler schematisch dargestellt. Abb. 3: Sondentechnik Light Cycler Hybridisierungsproben produzieren messbare Fluoreszenzen, wenn beide Proben nebeneinander an eine einsträngige DNA-Matrize binden. Der Energietransfer erfolgt von der Donor-Fluorophore zur Akzeptor-Fluorophore mittels Fluoreszenz Energietransfer. (Caplin et al., 1999) Vergleiche der beiden Detektoren, dem ABI PRISMTM 7700 und dem Light Cycler zeigen, dass beide Systeme sehr gut zur raschen und präzisen Analyse von PCR- Produkten geeignet sind (Nitsche et al., 1999). 5’ 5’ Donor Probe Primer Acceptor Probe 5’ P Literaturübersicht 16 2.4 Quantitative PCR mit lumineszenzoptischer Produktdetektion Mit Entwicklung der Realtime-PCR ist eine Amplifikation der Probe und das gleichzeitige Sichtbarmachen der Vervielfältigung in einem Ansatz ohne Nachbearbeitung und aufwändige Nachweismethoden möglich. Um nun noch die Menge des entstehenden Produktes genau zu bestimmen, muss die quantitative Messung des PCR-Produktes in der logarithmischen Phase der PCR erfolgen (Kellogg et al., 1990). Werden bei der Realtime-PCR die mit Reporter- und Quenscher-Farbstoff markierten Sonden im Rahmen der PCR hydrolysiert, trennen sich die interferierenden Farbstoffe voneinander. Die Emission des Reporterfarbstoffes steigt an. Da für jedes amplifizierte Produkt ein Fluorophor frei wird, ist die Zunahme der messbaren Strahlung direkt proportional zur Menge der amplifizierten Sequenzen. Während die Intensität der frei werdenden Fluoreszenz des Reporterfarbstoffes (Rn+)steigt, ändert sich die Quenscher-Farbstoffintensität (Rn-) fast nicht. Die Intensität des Quenscher-Farbstoffes dient als interner Standard. Um Verfälschungen der Ergebnisse zu vermeiden, wird die Emission des Reporterfarbstoffes je Zyklus durch die Referenzfarbstoffemission (Quenscher) dividiert. Dieses ΔRn wird in jedem PCR-Zyklus berechnet und gegen die Zykluszahl aufgetragen. Die Zykluszahl, bei der ΔRn einen vorgewählten Schwellenwert (Threshold) überschreitet, wird als CT (Threshold Cycle) bezeichnet, siehe Abb. 4 (Heid et al., 1996). Abb. 4: PCR-Amplifikationsschema zur Darstellung der Zykluszahl CT, bei der die Reporterfluoreszenz Rn+ die Hintergrundfluoreszenz Rn- übersteigt. Der Threshold ist der vorgewählte Schwellenwert (Heid et al., 1996). Literaturübersicht 17 Mit einer Referenzprobe werden CT-Werte steigender Konzentrationen gemessen und eine Standardkurve erstellt. Mit deren Hilfe kann die absolute Kopienzahl der untersuchten Probe und somit die Ausgangsmenge des Templates ermittelt werden (Gibson et al., 1996). Da mit der Realtime-PCR eine genaue Quantifizierung von Proben möglich ist, hat diese Methode rasch ihren Stellenwert in der Forschung gefunden. Aber auch die Anwendung in der Routinediagnostik ist möglich (Bar et al., 2003). 2.5 Die Multiplex-PCR Kombiniert man verschiedene Primerpaare in einem PCR-Ansatz und amplifiziert mehrere Matrizen, spricht man von einer sogenannten Multiplex-PCR (Newton et al., 1994). Die Planung und Durchführung der Multiplex-PCR ist gegenüber einem singulären PCR-Ansatz zur Amplifikation nur einer einzelnen Zielsequenz deutliche schwieriger, da die verschiedenen Produkte der PCR-Reaktion akkumulieren und um das vorhandene Probenreagenz konkurrieren. Um diesen Konkurrenzeffekt weitgehend auszuschalten, müssen die Konzentration der Primer auf ein Minimum reduziert und die zueinander komplementären Sequenzabschnitte der verschiedenen Primer und Zielsequenzen so gering wie möglich sein (Kubista et al., 2006). Weiterhin sollten alle in einem Ansatz verwendeten Primer die gleiche Länge und Annealing-Temperatur haben. Eine weitere Methode zur Verringerung bzw. Vermeidung der Bildung von Primerdimeren ist die HANDS („Homo-Tag-Assisted-Non-Dimer-System“) -PCR. Die bei der HANDS-PCR verwendeten Primer erhalten an ihrem 5’ Ende zusätzlich angefügte Sequenzen, ein sogenanntes „Homo-Tail“. Diese Sequenz kann frei gewählt werden, muss jedoch bei allen im Ansatz verwendeten Primern die gleiche Sequenz haben und sollen eine etwas höhere Schmelztemperatur als die spezifische Sequenz des Primers aufweisen. Die HANDS-PCR verringert die Bildung von Primerdimeren um mehrere Zehnerpotenzen (Brownie et al., 1997). Eines der häufigsten Probleme der Multiplex-PCR ist die Kontamination von Proben und Reagenzien mit amplifizierten Sequenzen. Dies führt zu falsch- positiven Ergebnissen. Erkannt werden kann dies durch den Einsatz von Negativ- Kontrollen für jede verwendete Primerkombination. Die Multiplex-PCR führt neben dem Einsparen wichtiger Probenmaterialien, dem Einsparen von Reagenzien und Literaturübersicht 18 der Reduktion falsch negativer Ergebnisse auch zu einer Zeitersparnis (Burgart et al., 1992). Neben der Anwendung in der Routinediagnostik, zum Beispiel zur Differenzierung unterschiedlicher viraler Krankheiterreger im Liquor von Patienten mit unklaren Meningitiden (Zambrano et al., 2006), ist auch ein Einsatz in der Forschung zum Nachweis von Varianten des Hämochromatose Gens beschrieben (Bernard et al., 1998). Bei Erkrankungen wie der Muskeldystrophie Duchenne, wo sehr heterogene Mutationen und auch neue Mutationen vorliegen, ermöglicht der Einsatz der Multiplex-PCR in der pränatalen Diagnostik die Detektion von etwa 70% aller bekannten Gendeletionen (Chamberlain et al., 1988). Die akute lymphoblastische Leukämie (ALL) ist die im Kindesalter am häufigsten auftretende Leukämie. Die nachweisbaren chromosomalen Rearrangements spielen eine wichtige Rolle bei der Identifizierung klinisch relevanter Untergruppen. Mit Hilfe der Multiplex-PCR ist eine rasche Analyse bekannter Rearrangements möglich und somit eine schnellere Eingruppierung in eine entsprechende Risikogruppe (Viehmann et al., 1999). Das Vorhandensein von mehreren Reporterfarbstoffen bei der Realtime-PCR macht auch hier die Durchführung einer Multiplex-PCR möglich. Es werden mehrere fluorogene Sonden zur Diskriminierung unterschiedlicher Amplikons in einem Testansatz verwendet. Auch hier sind die Vorteile der Multiplex-Realtime- PCR die Möglichkeit der Bereitstellung interner Kontrollen, geringer Reagenzkosten und der sparsame Einsatz kostbaren Probenmaterials. Hauptbegrenzungsfaktor der Methode ist die Anzahl der vorhandenen fluorogenen Sonden, die Emission der Fluoreszenz ausgehend von den verwendetem Quenscherfarbstoffen und die monochromatische Lichtquelle in den Geräten zur Durchführung der Realtime-PCR (Arya et al., 2005). 2.6 Mögliche Anwendungen unterschiedlicher PCR-Formen und ihre Bedeutung Die PCR, deren Erfinder Kary Mullis im Jahr 1993 den Nobelpreis für Chemie erhielt, hat die molekulargenetische Diagnostik revolutioniert und zusammen mit anderen molekularbiologischen Entwicklungen, wie hocheffizienter automatisierter Literaturübersicht 19 DNA-Sequenzierungstechniken, Verfahren zur Klonierung großer DNA- Fragmente- und Fluoreszenz-Hybridisierungstechniken die Entschlüsselung der menschlichen DNA im internationalen „Human-Genome-Project“ ermöglicht. In den folgenden beiden Kapiteln werden Anwendungsbeispiele aus der infektiologischen Diagnostik und der molekulargenetischer Diagnostik bei Leukämien beschrieben. 2.6.1 Diagnostik von Infektionen mittels Polymerase-Kettenreaktion Die qualitative PCR, die alleine dem Nachweis eines bestimmten DNA-Abschnittes dient, kommt noch heute dort zum Einsatz, wo die genaue Abfolge von Genabschnitten bestimmt wird. Bei der Suche nach Krankheitserregern zum Beispiel ist die PCR den üblichen immunologischen Methoden, dem Nachweis spezifischer Antikörper, in vielen Bereichen überlegen, da sie den Nachweis des Erregers bzw. dessen Erbgut noch vor der Entstehung der spezifischen Antikörper erbringen kann. Auch die Differenzierung von florider Infektion zu ausgeheilter Infektion wird möglich (Steffen et al., 1999). Für die Anwendung der PCR in der Infektionsdiagnostik ist ausschlaggebend, wie viel von der Sequenz eines Krankheitserregers bereits bekannt ist, um falsch positive Ergebnisse zu vermeiden. Die PCR macht es möglich, auch Erreger nachzuweisen, die kaum oder nur mit viel Mühe und Zeitaufwand kultivierbar sind, da man eine einzelne Zelle oder ein Virus nachweisen kann (Newton et al., 1994). Für den alleinigen Nachweis eines Erregers im Probenmaterial reicht zunächst die qualitative PCR aus, um jedoch eine Aussage über das Fortschreiten der Erkrankung oder für die Wahl der richtigen Therapie machen zu können, ist die Kenntnis der Anzahl der Erreger von Bedeutung. Dies betrifft vor allem chronisch verlaufende Virusinfektionen wie HIV-Infektionen, CMV-Infektionen oder Hepatitis C-Virusinfektionen (Steffen et al., 1999). Die Kombination aus qualitativer und semiquantitativer PCR zum Nachweis von CMV-Infektionen bei Lebertransplantierten ermöglicht die genaue Einschätzung, wann das Risiko von CMV-assoziierten Erkrankungen erhöht ist und wann damit eine Therapie erforderlich ist (Evans et al., 1998). Auch bei der Kontrolle der HIV-positiven Patienten kann die quantitative PCR eine Virusvermehrung nachweisen und zeitlich optimierte Therapien gewährleisten (Steffen et al., 1999). Literaturübersicht 20 Die Diagnostik akuter Meningitiden und Enzephalopathien erfolgt auch noch heute mittels Mikroskopie von entnommenem Liquor, Bestimmung der Zellzahl, des Eiweißgehaltes und des Quotienten aus Glukosekonzentration im Blut und Konzentration im Liquor. Diese Art der Diagnostik ist zwar schnell, jedoch unspezifisch und wenig sensitiv. Das Anlegen einer Kultur und deren Auswertung benötigt mindestens 12 bis 24 Stunden und kann bei vorheriger antibiotischer Therapie oder zu langer Transportzeit ein falsch-negatives Ergebnis erbringen. Die etablierten immunologischen Methoden zum Nachweis von Antigenen sind nicht alle sensitiv genug, um in der therapeutisch entscheidenden Anfangsphase der Erkrankung den Erregernachweis sicher zu gewährleisten. Mit Hilfe der PCR steht hier eine schnelle, sensitive und spezifische Methode zur Verfügung, die es innerhalb weniger Stunden ermöglicht, bakterielle von viralen Meningitiden zu differenzieren, um die nötigen Therapien einzuleiten. Im zweiten Schritt ist es dann beispielsweise möglich mittels Multiplex-PCR Neisserien, Haemophilus und Streptokokken als Ursachen bakterieller Meningitiden zu unterscheiden (Radström et al., 1994). Auch die Differenzierung von Herpes simplex und Varicella zoster Viren im Liquor von Patienten mit Enzephalopathien wird mit Hilfe der PCR mit nur geringem Zeitaufwand möglich (Casas et al., 1996). Im Hinblick auf die steigende Anzahl schwer zu behandelnder Tuberkuloseerkrankungen eröffnet auch hier die PCR Optionen zur schnellen Diagnosestellung. Mittels PCR gelingt die Unterscheidung verschiedener Tuberkuloseformen aus einfach zu gewinnenden Proben wie Blut und Urin. Es zeigt sich, dass die PCR eine höhere Sensitivität als die Kultivierung aufweist (Rebollo et al., 2006). Auch die Klassifizierung unterschiedlicher Mykobacterium Spezies ist möglich (Tobler et al., 2006). Die qualitative PCR macht im Bereich der Infektionskrankheiten eine Diagnosestellung möglich, auch wenn charakteristische Symptome fehlen. Zur Beurteilung des Fortschreitens einer Krankheit, zur Einleitung der richtigen Therapie zur richtigen Zeit und zur Überprüfung des Therapieerfolgs ist jedoch die quantitative PCR weit besser geeignet (Wilfingseder et al., 2002). Literaturübersicht 21 2.6.2 Diagnostik von Leukämien mittels Polymerase-Kettenreaktion Ein weiteres Beispiel zur Anwendung der Multiplex-PCR ist der Nachweis genetischer Veränderungen in Leukämiezellen, um die Erkrankung einer bestimmten Leukämieform zuordnen zu können. In der Vergangenheit haben mikroskopisch sichtbare Veränderungen der Chromosomen (Zytogenetik) meist den ersten Anhalt auf Mutationen gegeben. Diese Veränderungen sind Ausgangspunkt für weitere Untersuchungen und schaffen die Grundlage für molekulare Charakterisierungen. Typische Veränderungen dieser Art sind die Hyperdiploidie, die bei akuten lymphatischen Leukämie (ALL) -Formen auftritt, die Monosomie 7, vorkommend bei der akuten myeloischen Leukämie (AML) oder die Trisomie 12, die gehäuft mit der chronischen lymphatischen Leukämie (CLL) korreliert. Der Nachweis dieser Veränderungen erfolgt mittels der klassischen Zytogenetik. Bei den zytogenetisch nicht darstellbaren strukturellen Aberrationen handelt es sich um Genrearrangements, die als Folge von submikroskopischen Translokationen, Deletionen und Insertionen, sowie Punktmutationen auftreten. Beispiele hierfür sind u.a. die reziproke Translokation t(12;21) oder die Deletion des p16Ink4A-Gens bei der ALL. Diese genetischen Veränderungen können mit Hilfe verschiedener Hybridisierungsverfahren sichtbar gemacht werden. Hier angewandte Methoden sind die Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung (FISH) oder die Comparative-Genom-Hybridisierung (CGH). Die Analyse der strukturellen Aberrationen erfolgt mit Methoden, die gezielt kleine Veränderungen von DNA und mRNA analysieren können. Die wichtigsten Vertreter dieser Methoden sind der Southern-Blot, die DNA-Sequenzierung und die Polymerase-Kettenreaktion (Gutjahr et al., 1993). Die bei Tumoren auftretenden Translokationen können unterteilt werden in spezifische und unspezifische Translokationen. Bei den spezifischen Translokationen handelt es sich um typische immer wieder in bestimmten Tumoren vorkommende Genrearrangements. Die unspezifischen Translokationen sind dadurch gekennzeichnet, dass sie nur im Tumor eines Patienten auftreten. Wichtig bei der Leukämiediagnostik ist es, spezifische Translokationen zu erfassen, um dies in die Therapieplanung mit einzubeziehen. Bei der genaueren Betrachtung der Translokationen hat sich herausgestellt, dass zwei verschiedene Pathomechanismen unterschieden werden können. Zum einen kommen Gene Literaturübersicht 22 eines T-Zell-Rezeptors oder eines Immunglobulins neben einem Protoonkogen zum Liegen und aktivieren dieses. Ein typischer Vertreter dieser Kategorie ist die c-MYC Translokation des Burkitt-Lymphoms. Hierbei erfolgt die Anlagerung eines Gens, welches ein Immunglobulin kodiert an ein Protoonkogen. Bei der zweiten Variante kommt es als Folge der Translokation zur Bildung eines Hybridgens, welches ein „neues Protein“ kodiert, ein sogenanntes Onkoprotein. Viele dieser Proteine kodieren Transkriptionsfaktoren. Diese Variante findet sich bei der Fusion des BCR- und ABL-Gens, welches beim Philadelphia Chromosom der chronischen myeloischen Leukämie (CML) auftritt (Rabbitts et al., 1994). Bei etwa 90 % aller kindlichen akuten lymphatischen Leukämien können chromosomale Anomalien nachgewiesen werden (Gutjahr et al., 1993). Bei der Studie chromosomaler Translokationen von hämatologischen und soliden Tumoren lassen sich drei Entstehungsprinzipen erkennen: Genetische Veränderungen führen zur Aktivierung von Protoonkogenen, stören die Signaltransduktion der Gene oder führen zu Wachstums- und Differenzierungs- störungen der Zellen. Die Kenntnisse über Produkte der Translokationen eröffnen immer neue Perspektiven für Diagnostik und Therapie, da diese Produkte tumorspezifisch sind (Rabbitts et al., 1994). Bestimmte Translokationen sind mit einer schlechten Prognose assoziiert und machen daher eine Einstufung des Patienten in eine Hochrisikogruppe notwendig. Dies betrifft u.a. kindliche Leukämien mit den MLL/AF4 und BCR/ABL- Rearrangements (Kersey et al., 1997). Im Gegensatz zu diesen Translokationen findet sich bei der TEL/AML-Translokation meist ein exzellentes Ansprechen auf die Therapie, so dass man bei dem Vorliegen dieses genetischen Defektes von einer guten Prognose ausgehen kann (Kempski et al., 1999). Die im Laufe der Jahre durchgeführten Studien ermöglichen eine gewisse zytogenetische Klassifikation der Leukämien. Bei den AML-Formen zeigte sich, dass die Formen mit t(8;21)- und inv16-Genrearrangements eine gute, t(15;17) Translokationen eine intermediäre und andere Formen, die zum Beispiel 11q23 Translokationen enthalten, eine schlechte Prognose haben (Biondi et al., 1996). Bei den ALL-Formen sind Genrearrangements, die eine schlechte Prognose bedingen das Philadelphia-Chromosom oder t(9;22) der ALL (Kempski et al., 1999) und die t(4;11) Translokation (Borkhart et al., 1997). Im Gegensatz dazu geht man bei den t(12;21) Translokationen der B-Precursor ALL von einer guten Literaturübersicht 23 Prognose aus (Kemski et al., 1999). Ebenfalls eine gute Prognose haben B-Zell- ALL Formen mit über 50 Chromosomen (Borkhardt et al., 1997). Die Kenntnis immer neuer Translokationen und auch die Suche nach Translokationen bei bereits behandelten Leukämien ermöglicht eine Einschätzung über die Prognose und eine Modifizierung der Therapieschemata, um hohe Heilungschancen einerseits und Nebenwirkungs- und komplikationsarme Therapien andererseits zu erzielen. Mit Hilfe bekannter Translokationen von Leukämien wird es möglich, mit einer quantitativen PCR den Therapieerfolg zu überprüfen. Aufgrund der hohen Sensitivität der PCR können einzelne Leukämiezellen unter 10³ bis 106 Knochenmarkstammzellen nachgewiesen werden. Anhand dieser nachgewiesenen Leukämiezellen zu einem bestimmten Zeitpunkt der Therapie lassen sich Rückschlüsse auf den Therapieerfolg ziehen (Coustan-Smith et al., 1998). Diese sogenannte „Minimal Residual Disease“ (MRD) zu definierten Zeitpunkten ermöglichen bei den kindlichen ALL-Formen prognostische Aussagen für den weiteren Verlauf der Erkrankung. Anhand der erhobenen Befunde lassen sich Rückschlüsse bezüglich der Prognose treffen und Therapien, wenn nötig, anpassen (van Dogen et al., 1998). Die Polymerasekettenreaktion ermöglicht somit nicht nur eine Zuordnung verschiedener Leukämieformen in Hochrisiko- und Niedrigrisikogruppen, sie ist auch zur Überprüfung des Therapieerfolges geeignet. Hierdurch können Therapien weiter optimiert und auch im Verlauf angepasst werden. Die Multiplex- PCR differenziert verschiedener Leukämieformen in einem Ansatz. Dies spart wertvolle Zeit und auch Probenmaterial. Unter Verwendung der Realtime-PCR liegen wichtige Ergebnisse ohne Nachbearbeitung der PCR vor. Dies führt zu einer raschen Einleitung der spezifischen Therapien entsprechend der Risikogruppen. Fragestellung 24 3. FRAGESTELLUNG Fluoreszenzoptische Verfahren zur Detektion von PCR-Produkten erbringen den Nachweis von Molekülen einer DNA-Zielsequenz ohne nachfolgende aufwendige Produktanalyse. Die Messung der PCR-Produkte erfolgt mittels Aufspaltung fluorogener Sonden, die an die Zielsequenz binden. Da mehrere Sondenfarbstoffe zur Verfügung stehen und parallel detektiert werden können, ist diese Methode grundsätzlich „multiplex-fähig“. Die Zahl der so in einer Multiplex-PCR erfassbaren Zielsequenzen entspricht zunächst der Zahl der in einem Reaktionsansatz parallel detektierbaren fluorogenen Probenfarben. Unter der Vorstellung, dass man die Sondenbindungsstelle in die Primer integriert und mehrere Primer mit der gleichen Sondenbindungsstelle ausstattet, sollte es möglich sein, nicht nur zwischen einzelnen Zielsequenzen, sondern parallel zwischen ganzen Gruppen von Zielsequenzen zu differenzieren. Dies wäre sinnvoll und ausreichend informativ, wenn eine größere Zahl von Zielsequenzen bei positivem Nachweis die gleichen Konsequenzen zur Folge hätte, beispielsweise das gleiche therapeutische Vorgehen erforderte. Ein solches PCR-System sollte etabliert werden, um an Leukämiezellproben zwischen einer Gruppe prognostisch günstiger und einer Gruppe prognostisch ungünstiger genetischer Veränderungen unterscheiden zu können. Dieses Ziel sollte in folgenden Schritten erreicht werden: I) Etablierung eines PCR-Verfahrens zur Detektion spezifischer Zielsequenzen mit Hilfe von primerintegrierten Sondenbindungsstellen (Reportersequenzen) unter Verwendung fluorogener Sonden in der TaqMan®-PCR. II) Auswahl geeigneter Primer zur Detektion prognostisch relevanter chromosomaler Translokationen in einem Multiplex-PCR-Ansatz. III) Einbau primerintegrierter Reportersequenzen in diese Primer zur parallelen Detektion einer Gruppe chromosomaler Translokationen mit guter Prognose und einer Gruppe chromosomaler Translokationen mit schlechter Prognose, wie sie bei Leukämien im Kindesalter gefunden werden. Methoden 25 4. METHODEN 4.1 Kultivierung der Zellen Die zur Verfügung stehenden Zellinien werden in RPMI-Medium (GIBCO) mit Zusatz von L-Glutamin, Penicillin/Streptomycin (GIBCO) und fetalem Kälberserum (GIBCO) kultiviert. Die Bebrütung erfolgt bei 37°C unter einer 5%igen CO2- Begasung. Das Medium setzt sich wie folgt zusammen: 500 ml RPMI-Medium 1640 (GIBCO, Kat.-Nr. 42401-018) + 5,0 ml L-Glutamin + 2,5 ml Penicillin/Streptomycin, 10.000 U/ml (GIBCO, Kat.-Nr. 15145-014 ) + 62,5 ml fetales Kälberserum, hitzeinaktiviert, EG zugelassen (GIBCO, Kat.-Nr. 10108-165) entspricht 10%igem Medium Zur Aufrechterhaltung der Zellinien erfolgt eine einmal wöchentliche Umsetzung in frisches Medium. Als Beispiel eines genetischen Markers mit schlechter Prognose bei Leukämien im Kindesalter werden die Zellinien SD1 und K562 verwendet – im Folgenden „Badies“ genannt. Als genetische Marker mit guter Prognose die Zellinien Reh1 und Kasumi – im Folgenden „Goodies“ genannt. Die Zellinien SD1 und K562 zeigen beide die Translokation t(9;22), es handelt sich jedoch um zwei Splicingvarianten des BCR/ABL-Rearrangements. Bei der Zellinie Reh1 findet sich die Translokation t(12;21) mit dem Fusionsgen TEL/AML. Kasumi zeigt die Translokation t(8;21) mit dem dazugehörigen Fusionsgen AML/ETO. Als Negativkontrolle wird die Zellinie HL60 verwendet, diese Zellinie besitzt keine solche detektierbare genetische Veränderung. Da die Genabschnitte der verwendeten Translokationen innerhalb der chromosmalen DNA in sehr großen Intronbereichen liegen können, deren Größe die mit einer PCR-Reaktion amplifizierbare Fragmentlänge bei weitem übersteigt, entscheiden wir uns zur Verwendung der RNA, die vor der PCR in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben werden muss. Methoden 26 4.2 RNA-Extraktion 4.2.1 RNA-Extraktion aus Vollblut Die Isolierung der RNA aus Vollblut wird mit dem RNeasy Blood Mini Kit von QIAGEN durchgeführt. Die RNA-Extraktion erfolgt durch die Lysierung der Erythrozyten im ersten Schritt und die Gewinnung der Leukozyten durch Zentrifugation. Als nächstes werden die Leukozyten unter Inaktivierung der RNasen lysiert. Dieser Schritt erlaubt die Isolation intakter RNA. Im Anschluss an die Homogenisierung der Probe erfolgt die RNA-Isolation mit der Methode der Säulenchromatographie. Die RNA wird an eine Quarzgelmembran gebunden, Kontaminationen mit Ethanol herausgespült und im Anschluss erfolgt die Elution mit Wasser. Die Bestimmung der RNA-Konzentration wird mit dem Photometer Ultrospec III (Pharmacia Freiburg) durchgeführt, die Überprüfung der Qualität der RNA mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese. 4.2.2 RNA-Extraktion aus Zellkulturen Die in Suspension gewachsenen Zellen werden durch Zentrifugation für 8 Minuten bei 1200 rpm pelletiert und einmal mit PBS (Phosphate Buffered Saline) gewaschen. Die Extraktion der RNA erfolgt mit TRIzol®-Reagenz (GIBCO BRL). TRIzol enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat. Je 5-10 x 106 Zellen werden dem Pellet 1 ml TRIzol-Reagenz zugegeben. Die Proben werden homogenisiert und für 5 Minuten bei 15-30°C inkubiert, um eine komplette Dissoziation von Nukleoprotein-Komplexen zu gewährleisten. Dann folgt die Zugabe von 0,2 ml Chloroform je 1 ml TRIzol-Reagenz. Die Ansätze werden für 15 Sekunden geschüttelt und weitere 2-3 Minuten bei 15-30°C inkubiert. Durch Zentrifugation - 15 Minuten mit 12.000 x g bei 2-8°C - erfolgt die Trennung in eine untere Phenolchloroform-Phase, eine Interphase und eine obere wässrige Phase. Die wässrige Phase enthält als einzige Phase die RNA. Nach Zugabe von 0,5 ml Isopropanol je 1 ml anfänglich verwendetem TRIzol zur wässrigen Phase wird der Ansatz zur Präzipitation der RNA für 10 Minuten bei 15-30°C inkubiert und weitere Methoden 27 10 Minuten mit maximal 12.000 x g bei 2-8°C zentrifugiert. Die präzipitierte RNA wird mit 1 ml 75%igem Ethanol je 1 ml anfänglich zur Homogenisierung benutztem TRIzol gewaschen, die Probe durch vortexen gemischt und anschließend für 5 Minuten bei nicht mehr als 7.500 x g bei 2-8°C zentrifugiert. Es folgt das Lufttrocknen der Pellets, sowie die Lösung der Proben in RNase-freiem Wasser. Bei 55-60°C für 10 Minuten werden die Ansätze zur vollständigen Lösung im Wasserbad inkubiert. Abschließend wird jeder Probe RNase-Inhibitor (Fa. Boehringer Mannheim, 2000U, Kat.Nr. 799025) in einer Konzentration vom 4 U/µl zugesetzt. Wie auch bei der RNA-Isolation aus Vollblut findet die Überprüfung der Konzentration mit dem Photometer Ultrospec III und die Qualitätsprüfung mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese statt. 4.3 Agarose-Gelelektrophorese Bei der Anwendung der Agarose-Gelelektrophorese erfolgt die Auftrennung der Proben proportional zum negativen dekadischen Logarithmus ihrer Größe und abhängig von ihrer Struktur (doppelsträngig, einzelsträngig, zirkulär, RNA vs. DNA), wobei die unter den gewählten Pufferbedingungen negativen Ladungen der Phosphatgruppen die Wanderung zur Anode im elektrischen Feld vermitteln. Durch Änderung der Agarosekonzentration variiert die Porengröße der Gele. 1% Agarose entspricht einer Porengröße von ca. 150nm, durch Verringerung der Agarosekonzentration erhöht sich die Porengröße. Zur Anfärbung der Nukleinsäuren eignet sich Ethidiumbromid. Es schiebt sich zwischen die Basen der Nukleinsäuren und erscheint nach Anregung mit UV-Licht als leuchtende Bande im sichtbaren Bereich. Diese Methode ermöglicht die Detektion von DNA-Mengen unter 5ng. Die Lösung der Agarose (Seakem LE Fa. Biozym) erfolgt in 1 x TAE-Puffer (Tris- Azetat-EDTA-Puffer, Zusammensetzung siehe Tabelle 1) durch Aufkochen. Nach dem Abkühlen erfolgt die Zugabe von Ethidiumbromid (2mg/ml), bevor das Gel vollständig aushärtet. Nach Lösung der Proben in Aqua dest. werden sie mit 5xAuftragspuffer (Zusammensetzung siehe Tabelle 2) versetzt und in die Geltaschen des mit Laufpuffer (1xTAE-Puffer) überschichteten Gels eingebracht. Als DNA- Methoden 28 Längenstandard wird der BioLadderTM100 (AGS) Standard verwendet. Das Einbringen der Proben erfolgt auf der Kathodenseite des Gels, dann wird eine Spannung von 100 V angelegt. Zur Überprüfung der RNA-Extraktion wird ein 1%iges Agarosegel verwendet, zur Überprüfung der PCR-Produkte ein 2%iges Gel. Tab. 1: 50 x TAE-Puffer: Ansatz für 1000ml 242 g Tris-HCl 57,1 ml Eisessig 100 ml 0,5 M Na2-EDTA auf 1000 ml mit Aqua dest. auffüllen Tab. 2: Auftragspuffer: 100 µl 50% Glycerin 100 µl 0,4% Bromphenolblau 10 µl 50xTAE 290 µl Aqua bidest. 4.4 Reverse Transkription Mit der reversen Transkription wird die RNA mit Hilfe des Enzyms M-MLV-Reverse Transcriptase1 (GIBCO BRL) in komplementäre DNA (cDNA) umgeschrieben. Der Standardansatz setzt sich wie folgt zusammen: 1,0 µg RNA in 10 µl Aqua dest. 4,0 µl 5x First Strand buffer, 40.000 Units (GiBCO BRL, Kat.-Nr. 8025 SA) 2,0 µl dNTP-Mix, je 10mM dATP, dGTP, dCTP, dUTP (Prime Zyme Biometra) 1,0 µl Random primer p(dN)6 2, 50 Units (Boehringer Mannheim, Kat.-Nr. 1034731) 1,0 µl 0,1 M Dithiothreitol (DTT) (GIBCO) 2,0 µl Aqua dest. 1 M-MLV RT = Moloney Murine Leukemia Virus Reverse Transcriptase 2 Random Hexamere sind Hexanucleotide mit einer statistischen Basenzusammensetzung, sie können an den verschiedensten Stellen der mRNA hybridisieren und so eine cDNA-Synthese über die gesamte Länge der mRNA einleiten Methoden 29 Zur Denaturierung der RNA werden die Ansätze für 5 Minuten bei 65°C im Trio- Thermoblock (Biometra) inkubiert. Nach einer Kühlung von 2 Minuten auf Eis folgt die Zugabe von: 1,0 µl RNase-Inhibitor, 40 U/µl (Boehringer Mannheim, 2.000 U, Kat.-Nr. 799025) 1,0 µl M-MLV Reverse-Transkriptase, 200 U/µl (GIBCO, Best.-Nr. 28025-013). Er folgt ein weiterer Inkubationsschritt bei 50°C für 60 Minuten und 94°C für 2 Minuten. Die nun entstandene cDNA wird entweder sofort in einer PCR eingesetzt oder bei -20°C eingefroren. 4.5 Reinigung von PCR-Produkten Zur Reinigung von DNA aus PCR-Ansätzen (PCR-Produkten) werden zwei verschiedene Verfahren eingesetzt und miteinander verglichen, die Reinigung mit dem „QIAquick PCR Purification Kit“ und mittels „Glasmilch“. 4.5.1 DNA-Isolierung mit dem QIAquick PCR Purification Kit Die Isolierung der DNA erfolgt zum einen mit dem QIAquick PCR Purification Kit von QIAGEN (Kat.Nr. 28104/106). Das Kit ist geeignet zur Isolierung von PCR Produkten einer Größe von 100bp bis zu 10kb. Hierbei kann der PCR-Ansatz ohne zwischengeschaltete Vorreinigungsschritte direkt eingesetzt werden. Das Prinzip dieser Technik basiert auf der gebräuchlichen „spin-column“ Technologie mit selektiven Bindungsarealen an Quarzgel-Membranen kombiniert mit speziellen Pufferlösungen. Die DNA bindet in Abhängigkeit vom Salzgehalt der Lösung sowie deren pH-Wert an die Quarzgelmembran, während alle anderen Bestandteile der Proben die Säule ohne zu binden, passieren. Nach einem Waschschritt erfolgt die Elution der DNA mit Tris-Puffer oder Wasser Methoden 30 4.5.2 DNA-Bandenisolierung aus Agarosegelen mit Glasmilch Weiterhin verwendet wird die DNA-Isolierung mit Glasmilch. Im Anschluss an eine Agarose-Gelelektrophorese werden einzelne DNA-Banden unter der UV-Lampe ausgeschnitten. Nach Zugabe des dreifachen Volumens an Natriumjodid wird für 5 Minuten bei 55-60°C im Wasserbad inkubiert. Es folgt die Inkubation im Hybridisierungsofen für 10 bis 30 Minuten bei Raumtemperatur nach Zugabe von Glasmilch (1µl je 1µg DNA). Die Inkubation erzielt die Adhäsion der DNA an die feinen Glaspartikel. Nach Zentrifugation der Probe mit 7200 x g bei Raumtemperatur und Dekantierung, führt dreimaliges Waschen mit Ethanol-Mix (New Wash) zur Beseitigung der Natriumjodidlösung. Unter Zugabe von 50-100µl Aqua dest. erfolgt die erneute Inkubation für 5 Minuten bei 55°C mit anschließender Zentrifugation bei 7200 x g für 1 Minute. Die gereinigte DNA befindet sich nun im Überstand der Probe. Die Bestimmung der Konzentrationen erfolgt photometrisch mit dem Ultrospec III. 4.6 Polymerase-Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist eine in-vitro Methode zur Amplifizierung von DNA-Abschnitten, die von bekannten DNA-Sequenzen eingerahmt sind. Synthetisch hergestellte Oligonukleotide, die sogenannten Primer, finden unter optimalen Bedingungen die bekannten Sequenzen auf der zu vervielfältigenden DNA und dienen so als Ausgangspunkt für die Synthese. Die Vermehrung erfolgt mit Hilfe einer DNA-Polymerase, die den Einzelstrang als Matrize für die Synthese des neuen, komplementären Stranges verwendet. Zur Wiederholung dieses Vorgangs erfolgt im Anschluss an diesen Zyklus die Trennung der nun gebildeten Doppelstrang-DNA durch Hitze. Nach dem Abkühlen können die Primer erneut binden. Wird die optimale Temperatur für die Polymerase nach einem Heizschritt wieder erreicht, verlängert diese die Primer. Auch die neu gebildeten DNA-Stränge dienen als Matrize, es kommt somit mit jedem Zyklus zum Anstieg der Konzentration der Zielsequenz, idealerweise einer Verdopplung. Methoden 31 Für die einzelnen Proben werden die Ansätze wie folgt pipettiert: 2,5 µl 10xPuffer mit MgCl2 2,5 µl Forward-Primer 250 nM Endkonzentration 2,5 µl Reverse-Primer 250 nM Endkonzentration 0,5 µl dNTP-Mix 0,125 µl Ampli-Taq® Gold Polymerase Aqua dest. 0,5 µl Template (DNA) Die Thermo-Cycler-Conditions werden auf die jeweiligen verschiedenen Ansätze abgestimmt. 1. Denaturierung 2. Annealing – Anlagerung der Primer 3. Hybridisierungstemperatur = Tm (Aufheiz-, Abkühlzeit) 4. Verlängerung der Primer Im Hinblick auf die Anwendung der Methode mit dem ABI PRISMTM 7700 Sequence Detector (Perkin Elmer) wird die PCR mit den entsprechenden Reagenzien aus dem Kit für das Gerät durchgeführt. Die Kontrolle der PCR erfolgt im 2%igen Agarosegel. Im Gegensatz zu anderen DNA-Polymerase ist die hier verwendet Ampli-Taq® Gold DNA-Polymerase chemisch so modifiziert, dass sie bei Raumtemperatur inaktiv ist und erst nach Erreichen einer bestimmten Temperatur aktiviert wird. 4.7 Nested-PCR Ziel der Nested-PCR oder auch verschachtelten PCR ist die Steigerung der Produktspezifität und die Vermeidung der Amplifizierung unspezifischer Nebenprodukte der ersten PCR. In einer ersten Runde wird mit externen Primern ein DNA-Molekül amplifiziert, das in einer zweiten PCR den internen Primern als Matrize dient. Durch die Nested- PCR erhöht sich die Empfindlichkeit und Spezifität der DNA-Vervielfältigung erheblich. Unspezifische Produkte der ersten PCR bieten nicht genug Methoden 32 komplementäre Sequenzen für interne Primer und stehen somit in weiteren Runden nicht mehr als Matrize zur Verfügung. Leider steigt mit der hohen Spezifität auch die Anfälligkeit gegenüber Verunreinigungen. Die Thermal Cyler Conditions werden eventuell im zweiten Lauf modifiziert und den verwendeten Primern angepasst. Testansätze: 2,5 µl 10xPuffer 4,0 µl MgCl2 1,0 µl Forward-Primer 200 nM Endkonzentration 1,0 µl Reverse-Primer 200 nM Endkonzentration 2,0 µl dNTP-Mix 0,25 µl UNG-Erase 0,125 µl Polymerase Aqua dest. Template Thermo-Cyler-Conditions: 50°C, 2 min; 94°C, 10 min 95°C, 30 sec; 60°C, 1 min; 74°C, 1 min 35 Zyklen 72°C, 10 min Perkin Elmer Thermoblock Methoden 33 4.8 Realtime-PCR Die Realtime-PCR wird mit dem ABI-PRISMTM 7700 Sequenz Detector durchgeführt. Die für die „Goodies“ verwendete Sonde wird 5‘-FAM/TAMRA- 3‘markiert, die für die „Badies“ 5‘-VIC/TAMRA-3‘. Die Testansätze werden wie folgt pipettiert: 2,5 µl 10xPuffer 4,0 µl MgCl2 2,5 µl Forward-Primer 10nM 2,5 µl Reverse-Primer 10nM 2,5 µl HANDS-Primer 500nM 2,0 µl dNTP-Mix 2,5 µl Sonde 200nM FAM-bNOS (Goodies) 2,5 µl Sonde 200nM VIC-NPY (Badies) 0,25 µl UNG-Erase 0,125 µl Polymerase Aqua dest. Template Thermo-Cyler-Conditions: 50°C, 2 min; 94°C, 10 min 95°C, 15 sec; 68°C, 2 min 5 Cyclen 95°C, 15 sec; 60°C, 1 min; 72°C, 1 min 35 Cyclen 4.9 Auswahl von Primersequenzen für die PCR Die Auswahl geeigneter Primersequenzen ist für die PCR von entscheidender Bedeutung, da die PCR-Primer die spezifische Bindung an die Zielsequenz vermitteln. Idealerweise sollte die Primersequenz im verwendeten Probenmaterial nur ein einziges Mal vorkommen; zumindest aber sollten die beiden die Zielsequenz flankierenden Plusstrang- und Minusstrangprimer nicht in enger Nachbarschaft zueinander außerhalb der Zielsequenz binden können, damit kein unspezifisches PCR-Produkt entstehen kann. Diese Bedingung lässt sich bei Methoden 34 Einsatz chromosomaler DNA oder cDNA in der Regel nicht sicher vorhersagen, sondern nur in Vorversuchen ermitteln. Berechnet werden können jedoch andere wichtige Eigenschaften der Primer, wie die Schmelztemperatur ihrer Bindung an die Zielsequenz und die Neigung zur Ausbildung unerwünschter Sekundärstrukturen (z.B. Haarnadelformation) und Primerdimeren, die dazu führen könnte, dass nur noch ein geringer Teil der eingesetzten Primer für die Produktamplifikation in der PCR zur Verfügung steht, mit der Folge einer geringen Sensitivität. Um hier Vorhersagen treffen zu können, wurden alle verwendeten Primer mit dem Computerprogramm Omiga® der Firma Oxford Molecular (seit 2001 zur Gruppe „Accelrys Software“ gehörend) ausgewählt und überprüft. Ergebnisse 35 5. ERGEBNISSE 5.1 Testung des HANDS-PCR-Prinzips an einem konstitutiv exprimierten Gen („Housekeeping“ Gen) Zur Etablierung eines PCR-Verfahrens erfolgte zunächst die Testung des HANDS- PCR-Prinzips, an einer konstitutiv exprimierten Gensequenz, einem „Housekeeping“ Gen, hier GAPDH. Die HANDS-PCR („Homo-Tag-Assisted-Non- Dimer-System“) ist ein Verfahren zur Blockierung der Bildung unerwünschter Primer-Dimere, die ansonsten die PCR-Effizienz empfindlich beeinträchtigen könnten (Brownie et al., 1997). Hierbei enthalten alle Primer eine identische, an ihrem 5’-Ende angefügte Nukleotidsequenz, ein sogenanntes „Homo-Tail“. „Housekeeping“-Gene werden weitgehend unabhängig vom Zelltyp, Zellstadium und den Wachstumsbedingungen exprimiert. Deshalb können sie in einer quantitativen PCR-Reaktion als Vergleichswert dienen, der die RNA-Menge und – Qualität der zu untersuchenden Probe widerspiegelt. 5.1.1 Herstellung eines Standards Die durch reverse Transkription entstandene cDNA wurde als Ausgangsmaterial („Template“) in einer PCR mit spezifischen Primern für die GAPDH-Sequenz eingesetzt. Die spezifischen Primer enthielten an ihrem 5‘-Ende die Homo-Tail Sequenz nach dem Prinzip der HANDS-PCR. Die verwendeten Primersequenzen sind im Anschluss aufgelistet: Spezifische GAPDH-Primersequenzen: Forward Primer mit Homo-Tail(HANDS-Primer) und integrierter Sonden-Sequenz: 5‘- GCG TAC TAG CGT ACC ACG TGT CGA CTG ATC CTG CTG CGA TGC AAT GCT TTT CGC CAT CAA TGA CCC CTT CAT T-3‘ Revers-Primer mit Homo-Tail (HANDS-Primer): 5‘- GCG TAC TAG CGT ACC ACG TGT CGA CTT GCA AAT GAG CCC CAG CCT T-3‘ (5’-Homo-Tail kursiv; Sondenbindungsstelle fett gedruckt; Spezifische Sequenz unterstrichen) Ergebnisse 36 Um eventuelle durch Kontaminationen verursachte falsch-positive Resultate erkennen zu können wurde als Negativkontrolle eine zusätzliche Probe eingesetzt, die als Template (Ausgangsmaterial) nur Wasser enthält. Zur Optimierung der Primerkonzentrationen wurde eine Realtime-PCR mit den spezifischen Primern unter Verwendung einer FAM-markierten Sonde durchgeführt. Es zeigte sich, dass eine Konzentration von 100nM Forward- und 300nM oder 600nM Reverse-Primer bei der niedrigsten Zykluszahl bereits ein positives Signal erbringt und somit die PCR-Amplifikation mit diesen Primerkonzentrationen am effizientesten abläuft. Die Auswertung des Realtime- PCR-Laufes ist in Abbildung 5 dargestellt. Abb. 5: Primeroptimierung Ergebnis der PCR zur Optimierung der Primerkonzentrationen der spezifischen Primer für das Housekeeping Gen GAPDH. Dargestellt ist das Ergebnis, wie es vom ABI-PRISMTM Sequence Detector System abgebildet wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen Zyklen abgebildet. Die Y-Achse gibt die in den jeweiligen Zyklen gemessene Fluoreszenzintensität an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ zu bezeichnen ist (Threshold). Die Proben sind wie folgt bezeichnet: A1 100nM Foward-Primer + 100nM Reverse-Primer; A2 300nM Forward-Primer + 100nM Reverse-Primer; A3 600nM Forward-Primer + 100nM Reverse- Primer; B1 100nM Forward-Primer + 300nM Reverse-Primer; B2 300nM Forward-Primer + 300nm Reverse-Primer; B3 600nM Forward-Primer + 300nM Reverse-Primer, C1 100nM Forward-Primer + 600nM Reverse-Primer; C2 300nM Forward-Primer + 600nm Reverse-Primer; C3 600nM Forward-Primer + 600nM Reverse-Primer. Die in dieser PCR entstandene DNA wird im Folgenden als „Standard“ bezeichnet und diente als Template zur Erarbeitung der optimalen PCR-Bedingungen für die endgültige PCR. Die Überprüfung der Homogenität des „Standards“ erfolgte zusätzlich mit Hilfe der Agarose-Gelelektrophorese. Die Isolierung des Standards erfolgte mit dem QIAquick Purification Kit. Ergebnisse 37 5.1.2 Optimierung der PCR-Bedingungen für den Einsatz des „Homotail“- oder „HANDS“-Primers Als nächster Schritt erfolgte der Einsatz des Homo-Tail-Primers (auch HANDS- Primer genannt). Die Sequenz des Primers lautet: 5‘- GCG TAC TAG CGT ACC ACG TGT CGA CT-3‘. Im PCR-Testansatz mit dem Homo-Tail-Primer wurde als Template der gewonnene „Standard“ eingesetzt. Versuchsreihen zur Optimierung der PCR-Bedingungen zeigten, dass eine Annealingtemperatur von 60°C und eine Magnesiumkonzentration von 4 nM die besten Ergebnisse zeigten. Nun wurden die optimalen Homo-Tail-Primer-Konzentrationen für die Realtime- PCR ermittelt. Es wurden Homo-Tail-Primer-Konzentrationen von 250nM, 500nM und 1000nM und unterschiedliche Konzentrationen des Standards eingesetzt. Abbildung 6 zeigt den Probenansatz mit unterschiedlichen Homo-Tail-Primer- Konzentrationen. Abb. 6: Homo-Tail-Primer Optimierung Ergebnis der PCR zur Optimierung der Primerkonzentrationen des Homotail-Primers. Dargestellt ist das Ergebnis, wie es vom ABI-PRISMTM Sequence Detector System abgebildet wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen Zyklen abgebildet. Die Y-Achse gibt die in den jeweiligen Zyklen gemessene Fluoreszenzintensität an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ zu bezeichnen ist (Threshold). Die Proben sind wie folgt bezeichnet: A1 Standard-Konzentration 10-2 + 250nM Homo-Tail, B1 Standard-Konzentration 10-4 + 250nM Homo-Tail, C1 Standard-Konzentration 10-2 + 500nM Homo- Tail, D1 Standard-Konzentration 10-4 + 500nM Homo-Tail, E1 Standard-Konzentration 10-2 + 1000nM Homo-Tail, F1 Standard-Konzentration 10-4 + 1000nM Homo-Tail. Die Konzentrationen von 250 und 500nM zeigten gleich gute Ergebnisse. Im später durchgeführten Multiplex-Ansatz zeigten die 500nM-Ansätze ein etwas Ergebnisse 38 besseres Signal in der Realtime-PCR bei gleich guter Darstellung der Banden im Gel. Bei Anwendung der 1000nM-Konzentration zeigte sich eine klare Bande im Gel bei schlechtem Signal in der Realtime-PCR. Die Homo-Tail-Primer- Konzentration von 500nM zeigte das beste Signal. 5.1.3 Optimierung der Sondenkonzentration für die Realtime-PCR Zur Testung der optimalen Sondenkonzentration wurden folgende Komponenten zusammen pipettiert: Puffer, Magnesiumchlorid, Homo-Tail-Primer, dNTPs, UNG, DNA-Polymerase und als Template der „Standard“. Es wurde eine FAM-markierte Sonde verwendet. Das beste Signal konnte, wie in Abbildung 7 ersichtlich, mit einer Sondenkonzentration von 200nM pro Ansatz erzielt werden. Abb. 7: Sondenoptimierung Ergebnis der PCR zur Optimierung der Sondenkonzentration. Dargestellt ist das Ergebnis, wie es vom ABI-PRISMTM Sequence Detector System abgebildet wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen Zyklen abgebildet. Die Y-Achse gibt die in den jeweiligen Zyklen gemessene Fluoreszenzintensität an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ zu bezeichnen ist (Threshold). Die Proben sind wie folgt bezeichnet: D1 50nM Sondenkonzentration, E1 100nM Sondenkonzentration, F1 200nM Sondenkonzentration Neben der Optimierung der Sondenkonzentration zeigten Versuchsansätze mit unterschiedlichen Annealingtemperaturen, dass auch für die Sonden eine Temperatur von 60°C ein gutes Ergebnis zeigt. Der nächste Arbeitschritt beinhaltete die Optimierung der Bedingungen zur Durchführung der Multiplex-PCR. Da in einem Probenansatz verschiedene Ergebnisse 39 Translokationen nachgewiesen werden sollten, mussten die Bedingungen diesbezüglich angepasst werden. Das eingesetzte Template würde später DNA sein. Zu ermitteln war nun die minimal notwenige Primerkonzentration der spezifischen Primer. Da viele verschiedene Primer eingesetzt werden sollten, musste versucht werden, deren Konzentration so niedrig wie möglich zu halten. Auf diesem Wege sollten falsch-positive Ergebnisse oder Primer-Primer- Interaktionen vermieden, Primer gespart und die bestmögliche Ausbeute erreicht werden. Im nächsten Testansatz wurden daher neben dem Homo-Tail-Primer auch die Primerkonzentrationen der Forward- und Revers-Primer variiert. Zusätzlich wurden Negativ-Kontrollen (NTC – no template control = Wasser als Template) mit gemessen. Die Kontrolle der Realtime-PCR Ergebnisse erfolgte nach dem Lauf zusätzlich mittels Agarose-Gelelektrophorese. Primerkonzentrationen von 10-20nM zeigten hier die besten Ergebnisse. Nach Optimierung der PCR-Bedingungen anhand eines Housekeeping Gens erfolgte im Weiteren die Anwendung der hier ermittelten Bedingungen zum Nachweis chromosomaler Translokationen. 5.2 Optimierung der PCR-Bedingungen zum Nachweis chromosomaler Translokationen kindlicher Leukämien Aus den zur Verfügung stehenden Zellinien wird RNA isoliert. Die Kontrolle erfolgte im Agarosegel, siehe Abbildung 8. Abb. 8: Kontrolle der aus Zellinien von Leukämiezellen isolierten RNA mittels Agarose-Gelelektrophorese. Abgebildet ist der Längenstandard BioLadder Standard IV von AGS (links im Bild) und die aus den verschiedenen Zellreihen isolierte RNA. Ergebnisse 40 Die RNA wurde mittels RT-PCR in cDNA umgewandelt. Nach Isolierung der DNA wurden die mit dem Housekeeping Gen erarbeiteten PCR-Bedingungen verwendet, um geeignete Primer zur Detektion prognostisch relevanter chromosomaler Translokationen auszuwählen. Im Folgenden werden die genetischen Marker von Leukämien mit schlechter Prognose als „Badies“, die mit guter Prognose als „Goodies“ bezeichnet. 5.2.1 Auswahl der geeigneten Primer zur Detektion prognostisch relevanter chromosomaler Translokationen Die ersten PCR-Ansätze erfolgten zur Testung der spezifischen Primer. Es wurde die nach RNA-Isolation und RT-PCR gewonnene DNA mittel QIAquick Purification Kit isoliert und als Template in einen Ansatz mit spezifischen Primern mit der integrierten Homo-Tail- und Sondensequenz pipettiert. Wie schon zu Beginn der Vorversuche erfolgten zunächst Reaktionsansätze im Perkin Elmer Thermoblock ohne TaqManTM-Sonde bevor die Durchführung der Realtime-PCR folgte. Hier zeigte sich zunächst, dass mit den verwendeten Primern keine sauberen Banden zu erzielen waren. Auch die Modifikation der Testansätze, die Variation der Primerkonzentrationen, die Veränderung der Annealingtemperaturen und der Versuch unterschiedlicher Magnesiumkonzentrationen führte bei guter Ausbeute der RNA-Isolation nicht zum gewünschten Ziel. Da mit Hilfe der spezifischen Primer zur Amplifizierung der Translokationen keine spezifischen Banden nachzuweisen waren, erfolgte zunächst die Überprüfung des Ausgangsmaterials, der aus den Zellinien gewonnen RNA und des Folgeprodukts nach reverser Transkription, der cDNA. Hierzu wurden die im Kapitel 5.1.1 beschriebenen Primer zum Nachweis des Housekeeping Gens verwendet. Es zeigte sich, dass die RNA von ausreichender Qualität war, da mit diesen Primern ein spezifisches PCR-Produkt erhalten wurde. Mit den spezifischen Primern zum Nachweis der Translokationen kindlichen Leukämien, waren jedoch keine Amplifikationsprodukte zu erzielen, die in der Agarose-Gelelektrophorese anhand spezifischer Banden nachgewiesen werden konnten. Zur Erhöhung der PCR-Sensitivität und -Spezifität wurde daher die entscheidende PCR-Reaktion im TaqManTM als zweiter Lauf einer Nested-PCR durchgeführt. Die im ersten Schritt der Nested-PCR eingesetzten externen Primer enthielten keine Ergebnisse 41 Homo-Tail-Sequenz und auch kein integrierte Sondensequenz. Auch hier wurden Optimierungsversuche bezüglich der richtigen Konzentrationen und Reaktionsbedingungen durchgeführt. Die Sequenzen der verwendeten externen Primer lauten: Externe Primer für vor geschalteten Lauf einer Nested-PCR: „Badies“: Bady 1 und 2 t(9;22) (mBCR Positivzellinie: SD1; MBCR Positivzellinie: K562) m-BCRupmRNA 5’-CAGCTCCAATGAGAACCTCACCTCCAGCG M-BCRupmRNA 5’-AGAGAAGAGGGCGAACAAGGGCAGCAAGG ABLdomRNA 5’-CTCAGCGGATACTCAGCGGCATTGCGG „Goodies“: Goody 1 t(12;21) (verwendete Positivzellinie: REH) TELupmRNA 5’-GGCACTCCGTGGATTTCAAACAG AMLdomRNA 5’-AACGCCTCGCTCATCTTGCCTGG Goody 2 t(8;21) (verwendete Positivzellinie: Kasumi) AML1upmRNA 5’-TTCACAAACCCACCGCAAGTCG ETOdomRNA 5’-TGAACTGGTTCTTGGAGCTCCTTG Eine Konzentration von 2µM spezifischer Primer im ersten Lauf der Nested-PCR erwies sich in mehreren Versuchen als die optimale Konzentration. Zur Kontrolle der Zelllinien wurde zusätzlich zu dem Lauf mit den spezifischen externen Primern ein paralleler Lauf mit GAPDH-Primern durchgeführt. Das Ergebnis des ersten Laufes der Nested-PCR wurde im Agarosegel (Abbildung 9) überprüft. Ergebnisse 42 Das aus diesem PCR-Schritt gewonnene Produkt wurde als Template im nächsten Schritt der PCR einsetzt. 5.2.2 Optimierung der PCR-Bedingungen für die Realtime-PCR Die Optimierung der eingesetzten internen Primer, die in der endgültigen Realtime-PCR eingesetzt wurden, erfolgte im Anschluss. Zur Optimierung wurden Einzelansätze ohne TaqManTM-Sonde durchgeführt. Dies bedeutet, in die Reaktionsansätze wurden lediglich die zur Zelllinie passenden internen Primer pipettiert. Da im endgültigen Ansatz viele verschiedene Primer in einen Ansatz pipettiert wurden, mussten die Konzentrationen der spezifischen internen Primer möglichst gering gehalten werden. Versuche mit unterschiedlichen Konzentrationen und Verdünnungsreihen zeigten die besten Ergebnisse bei Konzentrationen der Primer von 10nM. Die Variation der Magnesiumkonzentrationen zeigte, ebenso wir die Variationen der Annealingtemperaturen keine deutliche Verbesserung der Ergebnisse. Um sicher zu gehen, dass die richtigen Sequenzen amplifiziert wurden, wurde vor Durchführung der Multiplex-PCR eine Versuchsreihe mit Einzelansätzen durchgeführt. D.h. je Ansatz wurde nur das zur Zellinie passende Primerpaar pipettiert. Die Überprüfung erfolgte erneut im Agarosegel (Abbildung 10). Abb. 9: Agarose-Gelelektrophorese des ersten Laufes der Nested-PCR mit den spezifischen Primern Abgebildet ist das Ergebnis der Gelelektro- phorese. Rechts der Größenstandard BioLadder 100 der Firma AGS (*), die dicke Bande liegt bei 500 bp, der Abstand von Bande zu Bande beträgt jeweils 100 bp. Es finden sich eine sehr schwache Bande für SD 1 und deutliche Banden für K562, Reh1 und Kasumi. SD1 K562 Reh1 Kasumi * Ergebnisse 43 Erst nach Optimierung dieser PCR-Bedingungen erfolgte im zweiten Schritt die Testung der Realtime-PCR. Als Negativkontrolle dienten Wasser und DNA aus Zelllinien ohne genetische Marker von Leukämien (HL60). Die hier verwendeten Primer- und Sondensequenzen, die auch im entscheidenden Realtime-PCR-Ansatz verwendet wurden, sind im Folgenden aufgelistet: Primersequenzen, die im entscheidenden PCR-Lauf nach dem TaqManTM- Verfahren unter Einsatz von „PIRS“ verwendet werden: „Badies“: m-BCR intern Hands sense: 5’-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-CCAATgAgAACCTCACCTCCAgCg M-BCR intern Hands sense: 5’-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-AgAgggCgAACAAgggCAgCAAgg ABL intern Hands NPY antisense (Gegenprimer für beide o.g. Primer, sowohl für M-BCR als auch für mBCR): 5’-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-gA- TgTggTAgCATTTgCAgTCTgCTggC-gCggATACTCAgCggCATTgCgg (5’-Homo-Tail kursiv; Sondenbindungsstelle fett gedruckt; Spezifische Sequenz unterstrichen) Abb. 10: Agarose-Gelelektrophorese des zweiten Laufes der Nested-PCR mit den spezifischen Primern nicht als Multiplex- PCR Abgebildet ist das Ergebnis der Gelelektro- phorese. Rechts der Größenstandard BioLadder 100 der Firma AGS (*), die dicke Bande liegt bei 500 bp, der Abstand von Bande zu Bande beträgt jeweils 100 bp. Es finden sich eine sehr schwache Bande für K562 und deutliche Banden für SD1, Reh1 und Kasumi. SD1 K562 Reh1 Kasumi * Ergebnisse 44 „Goodies“: TEL intern Hands HNNO sense: 5’-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-gA-TCCTgCTgCgATgCAATgCTTTTC- CggCACTCCgTggATTTCAAACAg AML1 intern Hands antisense 5’-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-AACgCCTCgCTCATCTTgCCTgg AML1 intern Hands sense 5’-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-CTTCACAAACCCACCgCAAgTCg ETO intern Hands HNNO antisense 5’-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT-gA-TCCTgCTgCgATgCAATgCTTTTC- TgAACTggTTCTTggAgCTCCTTg (5’-Homo-Tail kursiv; Sondenbindungsstelle fett gedruckt; Spezifische Sequenz unterstrichen) Im Anschluss erfolgte die Durchführung der Multiplex-PCR mit Primern mit primerintegrierten Reportersequenzen als Realtime-PCR. 5.3 Automatisierter Nachweis chromosomaler Translokationen kindlicher Leukämien mit Hilfe der Multiplex-Realtime-PCR mit primerintegrierten Reportersequenzen Neben dem Homo-Tail-Primer wurden bei der Realtime-PCR eine FAM-markierte Sonde zum Nachweis der Gensequenzen mit guter Prognose und um eine VIC- markierte Sonde zum Nachweis der Gensequenzen mit schlechter Prognose verwendet. Die Sequenz des Homo-Tail-Primer und die Sondensequenzen lauten wie folgt: 5’-Homo-Tail = 5’-gCgTACTAgCgTACCACgTgTCgACT zwischen Homo-Tail (HANDS-Tag) und Sondenbindungsstelle 2 Basen zusätzlich: gA Ergebnisse 45 FAM-Sonde (für Goodies): 5’-(FAM)-TCCTgCTgCgATgCAATgCTTTTC-(TAMRA) VIC-Sonde (für Badies): 5’-(VIC)-TgTggTAgCATTTgCAgTCTgCTggC-(TAMRA) Nach Testung der spezifischen externen und internen Primer im Einzelansatz, wie oben beschrieben, erfolgte im weiteren Verlauf der Versuche die Durchführung einer einfachen Realtime-PCR. Unter Kenntnis des Templates wurden die spezifischen Primer für die vorliegende Translokation pipettiert, die Sonden zugegeben und ein entsprechendes Signal erzielt. Als nächstes wurde versucht, eine Multiplex-PCR zu etablieren. Erneut wurden optimale Bedingungen in unterschiedlichen Testansätzen erprobt. Mit folgendem Testansatz gelang die Durchführung der geplanten, als Ziel dieser Arbeit avisierten Multiplex-PCR. Ein 50µl Reaktionsansatz enthielt folgende Komponenten: 5µl 10x PCR-Puffer 4µl 25nM MgCl2 2µl dNTP-Mix (ATP, CTP, GTP und TTP) 5µl „Homo-Tail“-Primer (500 nM Endkonzentration) 5µl FAM-Sonde (200 nM Endkonzentration) 5µl VIC-Sonde (200 nM Endkonzentration) 0,25 µl UNG (Substanz zur Elimination von Kontaminationen) 0,125 µl AmpliTaq® Gold Polymerase 0,5µl von jedem spezifischen Primer (PIRS-modifizierte Primer und jeweilige Gegenprimer, 10nM Endkonzentration) 2µl der zu untersuchenden Probe steriles Aqua bidest. ad 50 µl Ergebnisse 46 Die PCR-Cycler Bedingungen sind folgende: 50°C - 2 min (Kontaminationsinaktivierung durch UNG) 95°C - 10 min (Denaturierung und Aktivierung der AmpliTaq® Gold Polymerase = Hot Start) danach 5 Zyklen zu 95°C - 15 s  60°C - 1 min  72°C 1 min danach 35 Zyklen zu 95°C 15 s  68°C - 1 min  72°C 1 min Die Ergebnisse der Multiplex-PCR unter Einsatz von PIRS mit TaqManTM Verfahren sind in Abbildung 11 und 12 mit unterschiedlichen Farbfiltern abgebildet. Abb. 9: Multiplex-PCR zu Differenzierung von Leukämien unterschiedlicher Prognose mittels eines Testabsatzes – Badies: Ergebnis der VIC-Signale der Multiplex-PCR mit PIRS . Dargestellt ist das Ergebnis, wie es vom ABI-PRISMTM Sequence Detector System abgebildet wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen Zyklen abgebildet. Die Y-Achse gibt die in den jeweiligen Zyklen gemessene Fluoreszenzintensität an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ zu bezeichnen ist (Threshold). Die Proben sind wie folgt bezeichnet: A4 = m-BCR (Bady), A5 = M-BCR (Bady), A6 = TEL/AML (Goody), A7 = AML/ETO (Goody), B4 - B7 = vier gleiche Negativkontrollen (mRNA der Zellinie HL60 ohne Translokation; C4 = Wasserkontrolle der PCR (ohne Template). Ergebnisse 47 Abb.10: Multiplex-PCR zu Differenzierung von Leukämien unterschiedlicher Prognose mittels eines Testabsatzes – Goodies: Ergebnis der FAM-Signale der Multiplex-PCR mit PIRS. Dargestellt ist das Ergebnis, wie es vom ABI-PRISMTM Sequence Detector System abgebildet wird. Auf der X-Achse ist die Zahl der abgelaufenen Zyklen abgebildet. Die Y-Achse gibt die in den jeweiligen Zyklen gemessene Fluoreszenzintensität an. Die schwarze Linie parallel zur X-Achse gibt den Grenzwert an, unter dem das Fluoreszenzsignal als negativ zu bezeichnen ist (Threshold). Die Proben sind wie folgt bezeichnet: A4 = m-BCR (Bady), A5 = M-BCR (Bady), A6 = TEL/AML (Goody), A7 = AML/ETO (Goody), B4 - B7 = vier gleiche Negativkontrollen (mRNA der Zellinie HL60 ohne Translokation; C4 = Wasserkontrolle der PCR (ohne Template). Man sieht, dass nur die “Badies” ein positives VIC-Signal aufweisen, während nur die “Goodies” ein positives FAM-Signal zeigen. Alle anderen Proben sind negativ. Es liegen somit keine falsch-positiven Resultate vor. Als Negativkontrollen dienten eine Wasserkontrolle und DNA, gewonnen aus der Zellinie HL60. Zur Überprüfung des Online-PCR Ergebnisses wurde im Anschluss der Messung im TaqManTM eine Agarose-Gelelektrophorese durchgeführt um das Ergebnis zu sichern. Das Ergebnis der Gelelektrophorese ist in Abbildung 12 dargestellt. Ergebnisse 48 Anhand der durchgeführten Versuche konnte gezeigt werden, dass mittels Multiplex-Realtime-PCR unter der Verwendung primerintegrierter Reportersequenzen und der Verwendung der HANDS-PCR der Nachweis verschiedener Translokationen kindlicher Leukämien in einem Testansatz möglich ist. Hier erfolgte die Verwendung zweier verschiedener Sonden, womit eine Differenzierung leukämiespezifischer Veränderungen mit guter und schlechter Prognose möglich war (Abb. 11 und 12). * SD1 K562 Reh1 Kasumi * Abb. 11: Agarose-Gelelektrophorese der Multiplex-PCR mit PIRS Abgebildet ist das Ergebnis der Gelelektro- phorese. Links und Rechts der Größenstandard BioLadder 100 der Firma AGS (*), die dicke Bande liegt bei 500 bp, der Abstand von Bande zu Bande beträgt jeweils 100 bp. Es finden sich schwache Banden für SD1, K562 und Reh1 sowie eine stärkere Bande für Kasumi. Diskussion 49 6. DISKUSSION 6.1 Entwicklung einer Multiplex- Realtime-PCR mit fluoreszenzoptischer Produktdetektion über primerintegrierte Reportersequenzen (PIRS) Die sogenannte „Realtime“-PCR erlaubt eine direkte Produktdetektion während der PCR-Reaktion. Hierbei werden fluoreszenzmarkierte Oligonukleotide (Sonden) verwendet, die dem PCR-Ansatz zugesetzt werden. Diese Sonden binden üblicherweise innerhalb der zu amplifizierenden Zielsequenz und generieren ein direkt messbares Fluoreszenzsignal während der PCR-Amplifikation. Da die Intensität des Fluoreszenzsignals direkt proportional zur Menge des PCR- Produkts ist, sind quantitative Aussagen über die Menge der ursprünglich im PCR- Ansatz vorhandene Anzahl der Kopien der nachzuweisenden Zielsequenz möglich, solange sich die PCR-Reaktion in der Phase der exponentiellen Produktvermehrung befindet. In dieser Form hat die Realtime-PCR als quantitative PCR eine sehr weite Verbreitung gefunden. Das Verfahren der Realtime-PCR ist prinzipiell „multiplex-fähig“, d.h. es können in einer einzigen PCR-Reaktion mehrere Zielsequenzen gleichzeitig detektiert werden. Hierbei muss für jede zu erfassende Zielsequenz eine eigene Sonde (TaqManTM), bzw. ein Sondenpaar (Light-Cycler) mit einer spezifischen Fluoreszenzmarkierung zugesetzt werden. Neben dem Aufwand der Sondengenerierung bleibt eine wesentliche Einschränkung hinsichtlich der Zahl gleichzeitig erfassbarer Zielsequenzen: Die Zahl der Sondenfarbstoffe ist begrenzt und somit können nicht mehr als 3 – 5 Zielsequenzen gleichzeitig in einer Multiplex-PCR nachgewiesen werden. Das Ziel dieser Arbeit lag darin zu prüfen, ob die Sondenbindungsstelle in die PCR-Primer gelegt werden kann, wodurch eine einzige Sonde dem Nachweis mehrerer Zielsequenzen dienen kann. Die Sondenbindungsstelle wird in der Arbeit auch als „primerintegrierte Reportersequenz (PIRS)“ bezeichnet. Zur Umsetzung wurde das TaqManTM-PCR System gewählt, da hier nur jeweils eine Sonde benötigt wird. Im Light-Cycler wird für jede Zielsequenz ein Sondenpaar benötigt, wodurch sich die Länge der für eine Sondenbindung erforderlichen Anschnitte in PCR-Primern gegenüber dem TaqManTM-PCR System verdoppelt. Hierdurch steigen die Kosten der Primersynthese und die Gefahr unspezifischer Diskussion 50 Primerbindung mit den möglichen Folgen falsch-positiver Resultate und geringerer Sensitivität. Der Nachweis von PCR-Produkten über primerintegrierte Reportersequenzen (PIRS) kann natürlich nur funktionieren, wenn ein spezifisches Fluoreszenzsignal erst dann generiert wird, wenn die Primer in ein PCR-Produkt eingebaut worden sind und keinesfalls schon die in allen Primern von Anfang an vorhandenen Sondenbindungsstellen dieses Signal hervorrufen können. Dieses Problem lies sich unter Nutzung des spezifischen Reaktionsablaufs, der für die Entstehung des Fluoreszenzsignals bei der TaqManTM-PCR erforderlich ist, lösen. So entsteht das sondenspezifische Fluoreszenzsignal in der TaqManTM- PCR erst dann, wenn die Sonde während der PCR durch die Exonucleaseaktivität der Taq-Polymerase gespalten wird. Dies kann jedoch nur gelingen, wenn die DNA-Synthese der Taq-Poymerase auch über die Sondenbindungsstelle der Primer läuft und zwar, wie