Aus dem Max-Planck-Institut für Physiologische und Klinische Forschung, W.G. Kerckhoff-Institut, Abteilung für Experimentelle Kardiologie, Bad Nauheim In vivo und in vitro Untersuchungen zur Rolle des Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktors-II im Schweineherzen, IGF-II transgenen Mäusen und Myoblasten Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaftlichen Fakultät der Justus-Liebig-Universität Giessen vorgelegt von Diplom-Biologin Stefanie Böhm Giessen, 2002 D26 Dekan: Prof. Dr. Jürgen Janek 1. Berichterstatter: Prof. Dr. Rainer Renkawitz 2. Berichterstatter: Prof. Dr. Wolfgang Schaper Tag der mündlichen Prüfung: 17.6.2002 meiner lieben Familie Danksagung Die vorliegende Dissertation wurde in der Arbeitsgruppe Molekulare Kardiologie der Abteilung Experimentelle Kardiologie des Max-Planck-Institutes für physiologische und klinische Forschung (W. G. Kerckhoff-Institut) in Bad Nauheim unter Anleitung von Herrn Prof. Dr. Wolfgang Schaper angefertigt. Herrn Prof. Dr. Wolfgang Schaper danke ich für die Vergabe des Themas und die Bereitstellung des Arbeitsplatzes. Weiterhin danke ich ihm, daß er es mir ermöglichte, die Ergebnisse der Arbeit auf Kongressen vorstellen zu dürfen. Für die Begutachtung meiner Arbeit möchte ich ihm herzlich danken. Herrn Prof. Dr. Rainer Renkawitz danke ich für die Bereitschaft zur Vertretung vor dem Fachbereich Biologie an der Justus-Liebig-Universität Giessen und die Begutachtung der Dissertation. Herrn Dr. René Zimmermann danke ich für seine engagierte Betreuung und seinen Diskussionseifer. Weiterhin möchte ich mich für seine freundliche Unterstützung während der gesamten Zeit und für die Durchsicht der Arbeit bedanken. Für eine gute Zusammenarbeit im Labor möchte ich mich bei Frau Claudia Ullmann ganz herzlich bedanken, wie auch für das eifrige Korrekturlesen. Frau Marianne Granz gilt mein besonderer Dank hinsichtlich gemeinsamer Arbeiten im Labor. Auch bei ihr möchte ich mich herzlich für das Durchsehen der Arbeit bedanken. Allen Mitgliedern des Labors schulde ich meinen Dank für das angenehme und freundliche Arbeitsklima und alle offenen Ohren. Herrn Gerhard Stämmler danke ich für die Unterstützung bezüglich aller computertechnischen Fragen. Zusammenfassung Zusammenfassung Der Insulin-ähnliche Wachstumsfaktor-II (IGF-II) spielt eine zentrale Rolle bei der Proliferation und Differenzierung von Zellen. Für das porcine IGF-II sind mehrere mRNAs beschrieben. Die 6.0 kb mRNA ist nach dem Okklusion/Reperfusionsmodells im Herzen induziert. Exogen appliziertes IGF-II wirkt kardioprotektiv und verringert den infarzierten Bereich im Schweineherzen. Ziel dieser Arbeit war es, Aufschluß über die Rolle des IGF-II in Myoblasten zu bekommen. Es sollte untersucht werden, welcher Promotor für die durch Ischämie- und Stress- induzierte 6.0 kb mRNA verantwortlich ist. Eine genomische Karte des Schweinegens galt es zu erstellen und anhand von transgenen Mäusen und einer Myoblasten-Zellkultur sollte die Regulation des IGF-II in Myoblasten näher betrachtet werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Untersuchungen an Gewebeproben aus dem Myokard des Schweins weisen auf eine ähnliche Struktur des humanen und porcinen IGF-II-Gens hin. Promotor P1 und P2 sind für die Transkription der 6.0 kb mRNA verantwortlich. Auch konnte eine 6.0 kb Antisense-RNA nachgewiesen werden. Die herzspezifische Überexpression von humanem IGF-II in Mäusen scheint von Nachteil für die Entwicklung zu sein, da lediglich ein Foundertier gefunden wurde und die Nachkommenzahl der heterozygoten Tiere vermindert war. In vitro Untersuchungen in Myoblasten zeigten, daß die Expression des endogenen IGF-II von der Zelldichte abhängt. Dies deutet auf eine positive Rückkopplung bei der Regulation des IGF-II hin. Die Überexpression bewirkte eine Vergrößerung der Zellen und hemmte die Differenzierungsfähigkeit zu Myotuben. Wie in den transgenen Mäusen konnten auch in der Zellkultur Sense- und Antisense-RNAs des H19 nachgewiesen werden. Vergleichbar mit dem Schweineherzen war eine IGF-II Antisense- RNA auch in den nicht transfizierten Myoblasten zu detektieren. Der IGF-II Rezeptor, der die IGF-II-Konzentration reguliert, war in den IGF-II überexprimierenden Myoblasten induziert. Neben dem genomischen Imprinting spielt also auch die Regulation über Antisense-RNA eine Rolle. Exogenes IGF-II hemmt die Expression der IGF-II-Antisense-RNA und der H19 Sense- mRNA, hat aber keinen Einfluß auf die Transkription der Antisense-RNA des H19. Umgekehrt scheint IGF-II in seiner Expression nicht von H19 beeinflußt zu sein. Parallel zu seinen kardioprotektiven Effekten hat IGF-II auch negativen Einfluß, seine Wirkung ist ambivalent. Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht in: Böhm S, Deindl E, Schaper W, Zimmermann R. Preliminary characterization of the porcine Insulin-like growth factor II promoters. Growth Hormone & IGF Research, 1999; 9, P55 2000, Workshop on Current concepts and Methods in Cardiovascular Research: Characterisation of the genomic organisation of Insulin-like growth factor II (IGF II), a gene involved in ischaemia / reperfusion injury in the pig heart. Böhm S, Shimada M, Deindl E, Bauer EP, Schaper W, Zimmermann R. Transient and stable transfection of IGF-II in L6 rat myoblasts alter IGF-II receptor expression. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2000; 32, A64 Shimada M, Böhm S, Schaper W, Zimmermann R. Gene Expression patterns of the insulin-like growth factor system in cardiac & skeletal muscle cells. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 2001; 33, A111 Inhaltsverzeichnis I Inhaltsverzeichnis 1 EINLEITUNG 1 1.1 Die Familie der Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren 1 1.2 Insulin-like growth factor-II (IGF-II) 3 1.2.1 Das IGF-II-Gen 3 1.2.1.1 Evolution des IGF-II-Genes 3 1.2.1.2 Struktureller Aufbau des IGF-II-Gens 3 1.2.1.3 Alternatives Spleißmuster des IGF-II-Genes 4 1.2.2 Regulation des IGF-II 6 1.2.2.1 Entwicklungs- und gewebsspezifische Regulation 6 1.2.2.2 Genomischer Stempel – Genomic Imprinting 7 1.2.2.3 H19-Gen 9 1.2.3 IGF-II-Protein 9 1.2.4 Zelluläre Signalwege des IGF-II 10 1.2.4.1 Rezeptoren des IGF–Systems 10 1.2.4.2 Bindungsproteine 12 1.2.5 Die Rolle des IGF-II bei Erkrankungen 12 1.3 Herz und Herzmuskelzellen 13 1.3.1 Myoblasten im Herzen und im Skelettmuskel 13 1.3.2 IGF-II und Ischämie 13 1.4 Fragestellung 14 2 MATERIAL UND METHODEN 15 2.1 Material 15 2.1.1 Geräte und sonstige Bedarfsgegenstände 15 2.1.2 Verbrauchsmaterialien 16 2.1.3 Chemikalien 16 2.1.3.1 Chemikalien, Lösungen und Nährmedien für molekularbiologische Techniken 16 2.1.3.2 Chemikalien, Proteine und Antikörper für die Proteinchemie 20 2.1.3.3 Chemikalien für die Zellkultur 22 2.1.4 Enzyme und Kits 22 2.1.5 Oligonukleotide 23 2.1.6 Plasmide und verwendete Klone 24 2.1.7 Bibliotheken 25 2.1.8 Bakterienstämme 25 2.2 Methoden 26 Inhaltsverzeichnis II 2.2.1 Kompetente Bakterien (CaCl2-Methode) 26 2.2.2 Transformation von Bakterien 26 2.2.3 Blau-Weiß-Differenzierung 27 2.2.4 Plasmidpräparation 27 2.2.4.1 Quick-Check (nach Rinji Akada 98) 27 2.2.4.2 Plasmidpräparation 28 2.2.4.3 Anlegen von Glyzerinstocks der Bakterienklone 28 2.2.5 Quantifizierung von Nukleinsäuren 28 2.2.6 Restriktionsverdau 28 2.2.7 Polymerase-Ketten-Reaktion 29 2.2.7.1 PCR-Protokoll zur Amplifikation von genomischer DNA 29 2.2.7.2 Aufreinigung von PCR-Produkten 30 2.2.8 Auffüllen von 5'-Überhängen mit der Klenow-Polymerase 30 2.2.8.1 Dephosphorylierung von 5'-Enden 30 2.2.9 Klonierung von PCR-Produkten und restringierten Fragmenten 30 2.2.10 Isolation von Nukleinsäuren 31 2.2.10.1 Isolation genomischer DNA aus Gewebe 31 2.2.10.2 Genomische DNA-Isolation aus Mausschwanz-Biopsien 101 31 2.2.10.3 RNA-Isolation 32 2.2.10.4 DNA/RNA-Isolation aus Zellen 32 2.2.11 Gelelektrophorese 33 2.2.11.1 DNA-Gel 33 2.2.11.2 Denaturierendes Formaldehydgel 33 2.2.11.3 Southern Blot Analyse 33 2.2.12 Northern Blot Analyse 34 2.2.13 Markierung der Sonden 35 2.2.13.1 Sondenherstellung 35 2.2.13.2 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen durch Elektroelution 35 2.2.13.3 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mit Geneclean III Kit 35 2.2.13.4 32P-Markierung von Sonden 36 2.2.13.5 Hybridisierung mit cDNA-Sonden und Oligonukleotiden 37 2.2.13.6 Quantifizierung der Signale 37 2.2.14 Screening von Bibliotheken 38 2.2.15 Sequenzierung nach Sanger mit ALF 38 2.2.16 Proteinanalyse 38 2.2.16.1 Proteinisolation aus Zellen 38 2.2.16.2 Western Blot Analyse 39 2.2.16.3 Proteingel 39 2.2.16.4 Detektion des Western Blots 39 2.2.17 Zellkultur 40 2.2.17.1 Passagieren von Zellen und Ansetzen von Zellversuchen 40 2.2.17.2 Zellzahlbestimmung 40 2.2.17.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen 41 Inhaltsverzeichnis III 2.2.17.4 Ernte der Zellen 41 2.2.17.5 Transiente und stabile Transfektion 41 2.2.17.6 Auswertung der Morphologie der Zellen 42 2.2.18 Transgene Mäuse 42 2.2.19 Stunning Protokoll 42 3 RESULTATE 43 3.1 Restriktionskarte des IGF-II-Gens des Schweins 43 3.1.1 Subklone des IGF-II-Genes beim Schwein 43 3.2 Promotor-Aktivitäten des porcinen IGF-II-Gens 46 3.2.1 Northern Blot Analyse als indirekter Nachweis der Promotor-Aktivitäten 46 3.2.1.1 Promotor P1 generiert eine 6.0 kb mRNA 48 3.2.1.2 Zwei mRNAs werden ausgehend von Promotor P2 transkribiert 49 3.2.1.3 Promotor P3 ist verantwortlich für eine 4.8 kb mRNA 50 3.2.1.4 Vier mRNAs werden bei Einsatz des Promotors P4 transkribiert 51 3.2.1.5 In zwei mRNAs kann die 3' UTR Region detektiert werden 51 3.2.1.6 Struktur des porcinen IGF-II-Genes 54 3.2.2 Antisense-RNA 54 3.3 Konstruktion IGF-II transgener Mäuse 56 3.3.1 Das Konstrukt 56 3.3.2 Mäusestamm 57 3.3.3 Herstellung der transgenen Mäuse 57 3.3.4 Nachweis des Transgens mittels PCR und genomischem Southern Blot 57 3.3.5 Expressionsuntersuchungen des Transgens auf mRNA-Ebene 58 3.3.6 Expression des H19-Gens in IGF-II transgenen Mäusen 59 3.3.7 Analyse der Paarung (Anzahl der Nachkommen) 60 3.4 Transfektion des humanen IGF-II in Myoblasten 62 3.4.1 Das Konstrukt 63 3.4.2 Transfektion von pEGFP-C1 in L6 Myoblasten 63 3.4.3 Transfektion der L6 Zellen mit pEGFP/IGF-II 63 3.4.4 Selektion stabil transfizierter Zellen 65 3.4.5 Expression der Konstrukte 65 3.4.5.1 Transkription der Konstrukte 65 3.4.5.2 Translation der Konstrukte 67 3.4.6 Lokalisierung des fluoreszierenden Proteins in der Zelle 70 3.4.7 Morphologie transfizierter L6 Myoblasten und ihr Differenzierungsverhalten 71 3.4.8 IGF-II Expression in Abhängigkeit der Zelldichte 73 3.4.9 Antisense-Expression des IGF-II 76 3.4.10 Transkription des H19-Gens in Sense- und Antisense-Richtung 77 3.4.11 Einfluß der Überexpression auf das IGF-System 78 Inhaltsverzeichnis IV 4 DISKUSSION 81 4.1 Struktur des IGF-II-Gens in unterschiedlichen Spezies 81 4.2 Alternativer Einsatz der Promotoren beim Schwein 81 4.2.1 Transkription unterschiedlicher mRNAs ermöglicht Aussage über Promotor- Aktivitäten 81 4.2.2 IGF-II-Antisense-Transkripte im Schweineherzen 84 4.2.3 Rolle der 6.0 kb mRNA im Stunning-Modell 85 4.3 Herzspezifische Überexpression des IGF-II in transgenen Mäusen 86 4.3.1 Wirkung der Überexpression des IGF-II Transgens 86 4.3.2 H19 in IGF-II transgenen Mäusen 88 4.4 Überexpression des humanen IGF-II in Myoblasten 89 4.4.1 Zelldichte-abhängige Expression des IGF-II in Myoblasten 89 4.4.2 Lokalisierung des endogenen und exogenen IGF-II in der Zelle und im Überstand 90 4.4.3 Veränderte Morphologie der IGF-II transfizierten L6-Zellen 90 4.4.4 Überexpression des IGF-II inhibiert Differenzierungsfähigkeit der Myoblasten. 91 4.4.5 Expression anderer Mitglieder des IGF-Systems 93 4.4.6 Expression des H19-Gens 94 4.4.7 Einfluß des IGF-II auf die Expression von Aktin 97 4.5 Imprinting und Antisense-Regulation des IGF-II / H19–Systems 98 5 LITERATUR 101 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS 113 Einleitung 1 1 Einleitung 1.1 Die Familie der Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren Die Insulin-ähnlichen Wachstumsfaktoren (insulin-like growth factors, IGFs) sind kleine Polypeptide mit insulin-ähnlicher und wachstumsfördernder Wirkung. Zwei Spezies, IGF-I und IGF-II, sind bekannt 1,2. Sie haben sowohl zueinander (54 %) als auch zu Insulin strukturelle Homologien (47 %). IGF-I ist ein basisches Polypeptid mit 70 Aminosäuren (AS), welches eine große Rolle im postnatalen Wachstum spielt, während IGF-II, ein schwach saures Peptid mit 67 AS, hauptsächlich in der fetalen Entwicklung involviert ist. Während IGF-I nicht glykosyliert ist, wurden von IGF-II neben der nicht glykosylierten Form auch mindestens 12 verschiedene Isoformen mit Molekulargewichten zwischen 11-20 kDa und unterschiedlicher Glykosylierung gefunden 3,4. Die IGFs werden in erster Linie in der Leber synthetisiert und zirkulieren in weitaus höherer Konzentration (im nanomolaren Bereich) im Blutplasma als Insulin (picomolare Konzentration). Ihre Sekretion findet langsam und kontinuierlich statt. Beide Wachstumsfaktoren binden mit höherer Affinität an sechs extrazelluläre Bindungsproteine (IGFBP) als an die Rezeptoren (Typ I und Typ II). Aufgrund der Bindung an die IGFBPs werden die IGFs in ihrer biologischen Aktivität und der Halbwertszeit reguliert. Neben diesen Bindungsproteinen hoher Affinität gibt es solche mit niedriger Affinität wie das IGFBP-7, das auch „IGFBP-related protein 1“ (IGFBP-rP1) genannt wird oder das IGFBP-8 (IGFBP-rP1) 5. Insgesamt sind bisher neun solcher Proteine (IGFBP-rP1-9) beschrieben 6. Daneben gibt es Proteasen, die Bindungsproteine abbauen 7 (Abb. 1). Zu den metabolischen, insulin-ähnlichen Effekten der IGFs gehören z. B. die Stimulierung der Glucose-Aufnahme, die Glykogen- und Lipid-Synthese 8. Auch wenn die IGFs im Vergleich zum Insulin bei der Stimulation von metabolischen Effekten eine 10-100-fach geringere Wirksamkeit zeigen, können hohe Konzentrationen an IGF hypoglykämische Effekte auslösen. Anders als beim Insulin werden die IGFs nicht ausschließlich von einem Organ produziert. Sie haben neben ihren metabolischen Eigenschaften auch wachstumsfördernde Wirkungen und können ihre Einleitung 2 mitogenen Wirkungen sowohl über autokrine und/oder parakrine als auch über endokrine Mechanismen ausüben, wobei sie die DNA- und RNA-Synthese stimulieren und die Proliferationsrate in einer Vielzahl von Zellen in vitro und in vivo erhöhen 8-10. Abb. 1: IGF-IGFBP-Achse. IGFBP-1 bis -6 binden die IGFs mit hoher Affinität und regulieren die Verfügbarkeit der freien IGFs. Neun IGFBP-rPs binden die IGFs mit geringer Affinität. Spezifische IGFBP-Proteasen verdauen die IGFBPs und regulieren dadurch die Menge an IGFs wie auch die IGFBPs selbst. IGFBPs sind in IGF-abhängige und unabhängige Mechanismen involviert. IGF-I und IGF-II binden an zwei unterschiedliche Rezeptoren, den Typ I und den Typ II–Rezeptor 7. Sie stimulieren Endothelzellen 11-13, glatte Muskelzellen 14-18 und Fibroblasten 17-20 und die Differenzierung von Osteoblasten und Myoblasten 21-24. Gerade im Herzen scheint IGF-II eine besondere Rolle zu spielen. So wird das IGF-II pränatal stark exprimiert, während nach der Geburt die mRNA-Menge sinkt; dennoch unterstützt IGF-II die Kontraktiliät der Myozyten 25. Vogt und Mitarbeiter 26 konnten am Schweineherzen zeigen, daß IGF-II ischämische Präkonditionierung imitiert und daher die Infarktgröße signifikant reduziert. Man kann von einer kardioprotektiven Funktion des IGF-II ausgehen. Diese Ergebnisse, im Zusammenhang mit denen von Kluge 27, die eine Induktion der 6.0 kb mRNA bei Stress und Ischämie zeigen, erfordern eine Untersuchung des IGF-II bezüglich seiner Aufgaben und der Regulation bei Stress und Ischämie. Einleitung 3 1.2 Insulin-like growth factor-II (IGF-II) Für das IGF-II sind auch die Synonyme Somatomedin A und Multiplication Stimulating Activity (MSA) bekannt. Die Halbwertszeit des freien IGF-II liegt bei 20-30 min und die des an IGFBP- gebundenen IGF-II bei 12-15 Stunden 28. Die Funktion von IGF-II in vivo wurde an IGF-II knock-out Mäusen untersucht. IGF-II defiziente Tiere zeichnen sich durch ein auf 60 % verringertes Geburtsgewicht aus 29. Dieser Zwergwuchs-Phänotyp tritt nur auf, wenn das durch homologe Rekombination ausgeschaltete Gen vom Vater vererbt wird, da das maternale IGF-II-Allel geprägt ist und somit nicht transkribiert wird 30. Darin zeigt sich die Bedeutung, die dem IGF-II für normales Wachstum während der Embryonalentwicklung zukommt. 1.2.1 Das IGF-II-Gen 1.2.1.1 Evolution des IGF-II-Genes Das humane IGF-II-Gen liegt auf dem kurzen Arm des Chromosom 11 31-34, 12.6 kb nach Angaben von Bell 35 bzw. 1.4 kb 3' des Insulin-Genes (nach Genbank-Angaben, Acc. Nr. L15440). Des weiteren sind Antisense-Transkripte beim Huhn und der Maus bekannt 36,37. Moore 37 beschrieb ein Antisense-Gen, das im 5' Bereich des IGF-II-Gens liegt (s. 1.2.2.2) und dessen Transkripte sich mit den sense-mRNAs überlappen 37; seine Funktion ist derzeit noch nicht untersucht. Es kann davon ausgegangen werden, daß das IGF-II-Gen stark konserviert ist, da es bezüglich der kodierenden Sequenzen zwischen Mensch, Maus und Ratte eine Homologie von 91 % aufweist. Bei Maus und Ratte befindet sich das Gen auf Chromosom 7 bzw. 1. Beim Schwein ist seit kurzem bekannt, daß das IGF-II-Gen auf dem kurzen Arm des Chromosom 2 liegt. 1.2.1.2 Struktureller Aufbau des IGF-II-Gens Das humane IGF-II-Gen hat eine Größe von ca. 30 kb und besteht aus 9 Exons. Die Exons 1 bis 6 bilden in verschiedener Zusammensetzung die 5' UTR (untranslatierte Region) des Gens. Exon 7, 8 und der 5' Bereich von Exon 9 sind kodierender Bereich. In Exon 9 sind zwei Polyadenylierungsstellen bekannt, die in der 3' UTR liegen. Es sind 4 Promotoren (P1-P4) für die Einleitung 4 Regulation des IGF-II-Gens verantwortlich. Diese werden alternativ eingesetzt. Die beiden Promotoren P3 und P4 enthalten TATA-Box-ähnliche Sequenzen an der Position -25. P3 enthält zusätzlich noch eine CCAAT-Box an Position -78 und hat einen hohen GC-Gehalt von 80 %. Im Vergleich zum humanen IGF-II sind die Gene der Maus und der Ratte stark homolog, jedoch sind Exon 1, 2 und 3 nicht beschrieben. Man geht davon aus, daß diese Exons fehlen und es keinen homologen Promotor zu dem des humanen P1 gibt. Auch in der Maus, die zwei Insulin-Gene besitzt 38, liegt IGF-II 3' vom Insulin Gen 39. Abb. 2: Struktur des IGF-II-Gens. Skizziert ist die genomische Organisation des humanen und des Maus/Ratte IGF-II-Gens, welche stark konserviert ist. Das humane IGF-II-Gen liegt 3' des Insulin. Neben den 9 Exons (als Rechtecke dargestellt) im humanen Gen sind die vier zugehörigen Promotoren(P) und die beiden Polyadenylierungsstellen (*) in Exon 9 eingezeichnet. Die Struktur des humanen IGF-II-Gens ist in Relation zu der von Maus/Ratte gesetzt. 1.2.1.3 Alternatives Spleißmuster des IGF-II-Genes Das IGF-II-Gen wird alternativ gespleißt. Beim Menschen sind sechs mRNAs mit Größen von 6.0, 5.3, 5.0, 4.8, 2.2 und 1.8 kb bekannt 40-42. Für das IGF-II des Schweins sind ebenfalls mehrere mRNAs von 6.0, 5.3, 4.8, 4.4, 2.2, 1.9, 1.7 kb und 1.2 beschrieben 27,43,44. Die verschiedenen Promotoren des humanen IGF-II generieren die unterschiedlichen prä-mRNAs, welche alternativ gespleißt werden (Abb. 3). Einleitung 5 Abb. 3: Alternatives Spleißmuster des humanen IGF-II. IGF-II-prä-mRNAs werden von vier Promotoren(P) ausgehend transkribiert und durch alternatives Spleißen die fertigen mRNAs generiert, wobei bis auf eine 1.8 kb mRNA alle mRNAs für das gleiche Protein kodieren; proteinkodierende Exons (als Rechtecke dargestellt) sind gekennzeichnet. Beim Menschen sind sechs mRNAs mit 6.0, 5.3, 5.0, 4.8, 2.2 und 1.8 kb beschrieben. Die Polyadenylierungsstellen sind mit einem Stern (*) markiert. Bis auf einen Fall ist der 3' Bereich und damit der kodierende Bereich der mRNAs immer gleich und besteht aus Exon 7, 8 und dem 5' Bereich des Exon 9. Nur die kleinste mRNA von 1.8 kb besteht ausschließlich aus dem 3' Bereich des Exon 9 und entsteht durch posttranskriptionale Prozessierung. Alle anderen mRNAs kodieren für das gleiche Protein 45,46. Beim humanen IGF-II-Gen liegt der Promotor P1 5' des Exon 1 und generiert eine mRNA von 5.3 kb, bestehend aus Exon 1, 2, 3 als 5' UTR und dem proteinkodierenden Anteil mit den Exons 7, 8 und 9. Promotor P2 ist für eine 5 kb mRNA mit dem Exon 4 als 5' UTR verantwortlich. Dem humanen Promotor P3 können zwei mRNAs mit den Größen 6.0 und 2.2 kb zugeordnet werden, die beide Einleitung 6 Exon 5 als 5' UTR tragen, jedoch unterschiedliche Polyadenylierungsstellen benutzen. Der letzte Promotor (P4) ist für die Expression der 4.8 kb mRNA verantwortlich; er liegt 5' des Exon 6 (Abb. 3). Für das porcine IGF-II ist die alternative Zusammensetzung der verschiedenen mRNAs noch nicht beschrieben. Es sind beim Schwein lediglich unterschiedliche mRNAs in ihrer gewebespezifischen Expression charakterisiert (s. 1.2.2.1). 1.2.2 Regulation des IGF-II 1.2.2.1 Entwicklungs- und gewebsspezifische Regulation IGFs und insbesondere IGF-II haben einen großen Einfluß auf die Embryonalentwicklung. So ist bei IGF-II-knock-out-Mäusen ein kleinerer Phänotyp zu finden. Entsprechend sind IGF-II transgene Mäuse mit Überexpression größer als der Wildtyp 47. Die Verwendung der Promotoren ist entwicklungs- und gewebsspezifisch 40,46,48-50. Die humanen Promotoren P2, P3 und P4 sind in fetalem Gewebe aktiv (einschließlich der Leber) und bleiben während der Entwicklung in fast allen nicht-hepatischen Geweben angeschaltet. Eine Ausnahme ist die Leber, in der die Promotoren P2, P3 und P4 komplett inaktiv sind, während der Promotor P1 für die Transkription verantwortlich ist 40. Von Hedley 43 wurde beschrieben, daß in der fetalen Leber des Schweins mRNAs von 5.4 und 2.3 kb und im Gegensatz dazu in der adulten Leber mRNAs von 4.7 und 1.2 kb vorhanden sind. Im Plexus choroideus des Schweinehirns wurden von Nielsen 51 mRNAs des IGF-II von 1.2, 1.6, 2.4 und 4.4 kb gefunden. Im Herzen wird das IGF-II pränatal stark exprimiert; nach der Geburt sinkt die mRNA-Menge. IGF-II induziert DNA-, Protein-Synthese und hat Einfluß auf die Proliferation von Rattenventrikel-Myozyten durch Unterdrückung lysosomaler Protein-Degradation. Damit kann auch die Entstehung von Hypertrophie erklärt werden 28,52. Weiterhin unterstützt IGF-II die Kontraktiliät der Myozyten 25. Von Kluge 27 wurden im Herzen des Schweins mRNAs der Größen 6.0, 5.3, 4.8, 2.2, 1.9 und 1.7 kb gefunden. Einleitung 7 Vogt 26 konnte bei intramyokardialer Gabe von IGF-II zeigen, daß IGF-II eine ischämische Präkonditionierung nachahmt und dadurch den Infarkt signifikant verringert. Daher kann man davon ausgehen, daß IGF-II kardioprotektiv ist. Diese Ergebnisse im Zusammenhang mit denen von Kluge 27, die eine Induktion der 6.0 kb mRNA bei Stress und Ischämie zeigen, werfen die Frage auf, welche Aufgabe der durch Stress und Ischämie induzierten 6.0 kb mRNA des IGF-II beim Schwein zukommt. 1.2.2.2 Genomischer Stempel – Genomic Imprinting Mit „Imprinting" wird das Phänomen bezeichnet, bei dem es aufgrund einer Gameten- spezifischen Methylierung kurzer Genabschnitte in der Keimbahn entweder zu einer Aktivierung oder Reprimierung eines Allels kommen kann 53,54. Das IGF-II-Gen hat einen genomischen Stempel auf dem maternalen Allel, d.h. das maternale Allel ist geprägt und nicht aktiv, wohingegen das paternale Allel transkribiert wird (Abb. 4, http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/imprinting/maps/chr7imp.gif). Lediglich in Leber, Plexus Choroideus und ZNS wie auch in verschiedenen Tumoren 55-57 wird auch das maternale Allel transkribiert; man spricht dann von einem „Loss of imprinting“ (LOI, Verlust des genomischen Stempels). Dies kann mit der Methylierung der CpG-Inseln in den Promotoren P2, P3 und P4, welche in den anderen Geweben aktiv sind, erklärt werden. Promoter P1, der in der Leber aktiv ist, enthält keine CpG-Inseln und ist daher nicht methyliert. Dies erklärt die dortige biallelische Expression. Neben dem eigentlichen Imprinting, bei dem das Gen durch diesen epigenetischen Mechanismus in seiner Transkription gehemmt wird, gibt es auch genetische Mechanismen, bei denen Antisense-RNA oder „Silencer" eine wesentliche Rolle spielen. Bei der Antisense- Hemmung verhindert die Transkription der Antisense-RNA die Translation der Sense-mRNA. Meist wird der maternale Stempel durch Methylierung ausgelöst 58,59. Auch der Kondensationsgrad des Chromatins spielt eine Rolle in der Regulation des Imprintings. Einleitung 8 Abb. 4: Lokalisierung der IGF-II- und H19-Gene auf dem Chromosom 7 der Maus verglichen mit dem humanen Chromosom 11 und ihre genomische Stempel. Weiterhin ist die gesamte Region homolog zum humanen 11p15.5 dargestellt und die genomischen Stempel der einzelnen Gene vermerkt. Pfeil nach links bedeutet einen maternalen Stempel, das paternale Allel wird transkribiert. Pfeil nach rechts stellt einen paternalen Stempel dar, das maternale Allel ist aktiv. Diese Region beinhaltet Gene, die alle durch genomische Stempel reguliert werden. Zusätzlich ist auch das IGF-II-antisense (IGF2as) eingezeichnet. Die Zeichnung ist folgender Internetseite http://www.mgu.har.mrc.ac.uk/imprinting/maps/chr7imp.gif entnommen. IGF-II und H19, welches 3' des IGF-II liegt, sind Teil zweier topologisch separater benachbarter Chromatin-Domänen (SARs, scaffold attachment regions). Das kondensierte Chromatin des H19-Gens kontrolliert ebenfalls die Transkription des IGF-II 60. Das Gen für den M6P/IGF-II-Rezeptor (Chromosom 6 beim Menschen) unterliegt ebenfalls dem Imprinting, welches reziprok zu dem des IGF-II ist 58,59. Einleitung 9 1.2.2.3 H19-Gen IGF-II zeigt in vielen Tumoren eine Überexpression, wohingegen H19 Eigenschaften eines Tumorsupressorgens zugeschrieben werden 61. H19 liegt beim Menschen 3' des IGF-II-Gens auf Chromosom 11 (s.1.2.2.2). Es wird zwar transkribiert, ein Protein konnte bis jetzt der mRNA nicht zugeordnet werden. Die mRNA konnte postnatal nur in Skelettmuskel und Herzmuskel nachgewiesen werden 62, während sie nur in bestimmten Phasen der fetalen Entwicklung in verschiedenen Organen detektiert werden konnte 63. Das H19 Gen unterliegt wie das IGF-II einem genomischen Stempel (s. 1.2.2.2). Im Falle des H19 Gens ist das paternale Allel geprägt, nur das maternale Allel wird transkribiert 64 (Abb. 4). 1.2.3 IGF-II-Protein Die IGFs sind in vier Domänen gegliedert, die vom N-Terminus ausgehend als B-, C-, A- und D-Domäne bezeichnet werden. Etwa 70 % der Aminosäurereste in der A- und B-Region von IGF-I und IGF-II sind identisch. Zu den entsprechenden Resten der A- und B-Region des Insulins zeigen sie eine 50 % ige Identität. Die C-Domänen der IGFs, die dem C-Peptid des Insulins entsprechen, zeigen keine Sequenzhomologien, weder zueinander noch zum Proinsulin. Die D-Domäne im IGF-II hat kein entsprechendes Gegenstück im Insulin. Beide IGFs entstehen durch proteolytische Spaltung aus einem längeren Vorläuferprotein. Das Präpro-IGF-II besteht aus der Signalsequenz am N-Terminus, die für die Sekretion des IGF-II verantwortlich ist, den Domänen BCAD und dem E-Peptid am C-Terminus. Die Signalsequenz wird nach der Sekretion entfernt, anschließend wird auch die E-Domäne vom Pro-IGF-II abgespalten. Die reifen IGFs werden durch intramolekulare Disulfidbrücken zusammengehalten, wobei eine innerhalb der A-Domäne und zwei zwischen den A- und B-Domänen liegen 65. Terasawa 66 hat die dreidimensionale Struktur des IGF-II in wässriger Lösung durch NMR bestimmt (Abb. 5). Einleitung 10 Abb. 5: IGF-II-Präproprotein. Dargestellt sind die Domänen des Präpropeptides und seine Disulfidbrücken 65. Die Signalsequenz ist für die Sekretion des Proteins verantwortlich und wird nach der Sekretion entfernt, anschließend wird die E-Domäne vom reifen IGF-II abgespalten. Mit Swissprot3D (http://www.expasy.ch) ist die 3-D-Struktur des IGF-II und IGF-I dargestellt. Die Proteinsequenz des IGF-II ist stark konserviert und zeigt eine Homologie von 91 % (61 von 67 AS) zwischen Mensch und Maus 67. Das IGF-II ist ein saures Glykoprotein mit einem Gewicht von 7.5 kD. Es sind allerdings noch andere höhermolekulare Isoformen bekannt, die zwischen 11 und 20 kD liegen und an den löslichen IGF-II-Rezeptor gebunden sein können 3. 1.2.4 Zelluläre Signalwege des IGF-II 1.2.4.1 Rezeptoren des IGF–Systems Die Wirkung der IGFs auf zellulärer Ebene erfolgt durch Wechselwirkung mit spezifischen Rezeptoren. IGF-I und IGF-II binden an den IGF-I-Rezeptor (Typ I, IGF-I-R), den Mannose-6- Phosphat (M6P)/IGF-II-Rezeptor (Typ II, IGF-II-R) und den Insulin-Rezeptor. Die wachstumsfördernden Wirkungen beider IGFs laufen in erster Linie über den membranständigen IGF-I-Rezeptor und in begrenztem Umfang über den Insulinrezeptor. Der IGF-I-Rezeptor gehört zur Familie der Insulinrezeptoren, zu der neben dem Insulinrezeptor auch der „insulin-receptor- related-receptor“ zuzuordnen ist. Der IGF-I-Rezeptor bindet IGF-II mit einer 3-10-fach und Insulin mit einer ungefähr 500-fach niedrigeren Affinität als IGF-I 68. Der Typ-II IGF-Rezeptor besteht aus einer singulären Peptidkette und ist identisch mit dem Kationen-unabhängigen M6P- Einleitung 11 Rezeptor. IGF-II bindet zwar mit einer höheren Affinität an den IGF-II-Rezeptor, jedoch ist die Signaltransduktion des IGF-II-Rezeptors noch unklar 69. Die mitogene Wirkung beider IGFs wird hauptsächlich durch ihre Bindung an den IGF-I- und den Insulin-Rezeptor ausgelöst, während der M6P/IGF-II-Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Regulation der IGF-II-Konzentration spielt. Die Bindung von IGF-II an den M6P/IGF-II- Rezeptor führt zur Internalisierung in die Zelle, in der IGF-II zu den Lysosomen transportiert und abgebaut wird 70-72 (Abb. 6). Abb. 6: IGF-Rezeptoren. IGF-I, IGF-II und Insulin binden an den IGF-I-R und den Insulinrezeptor. An den IGF-II-R binden nur IGF-II und IGF-I. Der IGF-I-R vermittelt metabolische und wachstumsfördernde Effekte, wohingegen der IGF-II-R nur für den Abbau des IGF-II verantwortlich ist 65. Einleitung 12 1.2.4.2 Bindungsproteine Im Extrazellularraum liegen die IGFs zu ca. 95 % an eine Familie hochaffiner IGF-Bindungs- proteine (IGFBP) gebunden vor, die keine Sequenzhomologie zu den IGF-Rezeptoren aufweisen. Es sind sechs verschiedene Bindungsproteine (IGFBP-1 bis -6) beschrieben 7,18,73-76. Sie binden IGF-I und IGF-II, aber kein Insulin. Die Bindungsaffinitäten variieren unter den IGFBPs; einige haben eine höhere Affinität für IGF-II als für IGF-I. Durch die Bindung der IGFs an die IGFBPs wird ihre Verfügbarkeit reguliert und die Halbwertszeit der IGFs verlängert. Das IGFBP-3 bindet in Kombination mit einer säurelabilen Untereinheit (acid labile subunit, ALS) den Großteil des zirkulierenden IGFs 77-79, wodurch ein Komplex von 150 kD entsteht. Neben den Bindungsproteinen hoher Affinität gibt es auch BPs mit niedriger Affinität, die unter anderem als IGFBP-rPs bezeichnet werden 6. Neun solcher IGFBP-rPs sind bisher bekannt. IGFBP-7 und –8 werden z.B. als IGFBP-rP-1 und 2 bezeichnet. Die Bindungsproteine werden andererseits durch spezifische Proteasen (IGFBP-Proteasen) abgebaut. IGF-I und IGF-II aktivieren diese Proteasen 80,81 (Abb. 1). 1.2.5 Die Rolle des IGF-II bei Erkrankungen Erhöhte IGF-II-Expression führt zu pränatalen Wachstumsstörungen (Beckwith-Wiedemann- Syndrom) und zur Tumorentwicklung (Wilm´s Tumor) 82-84. Kinder, die an dem Beckwith- Wiedemann-Syndrom (BWS) leiden, zeigen allgemeines Überwachstum, eine Vergrößerung der Zunge und einseitiges Überwachstum einer Körperhälfte (Hemihypertrophie). Damit geht die Prädisposition zur Entwicklung eines embryonalen Tumors einher. Von Überwachstum betroffene Gewebe zeigen eine Duplikation des paternalen IGF-II Allels 85 oder ein LOI, so daß beide Allele aktiv sind 86. Einleitung 13 1.3 Herz und Herzmuskelzellen 1.3.1 Myoblasten im Herzen und im Skelettmuskel Kardiomyozyten sind terminal differenzierte Zellen, die sich nicht mehr teilen können. Sterben Zellen ab, können diese nicht durch neue ersetzt werden, d.h. der Verlust der Zelle ist irreversibel. Dies ist beim Herzinfarkt der Fall. Es erfolgt kurz nach der Geburt keine Zellteilung wie in anderen Geweben (z.B. Leber, Niere oder wie im Skelettmuskel durch Satellitenzellen). Daher kann davon ausgegangen werden, daß Kardiomyozyten einen anderen Weg zur Steigerung ihrer Überlebensfähigkeit haben. So könnten sie u. a., wie auch in den Neuronen, trophische Faktoren besitzen, die für die Erhaltung der Myozyten notwendig sind. Für IGF-II ist nachgewiesen worden, daß es im Herzen verschiedener Spezies exprimiert wird, wozu neben dem Menschen 35,87, Affe 88, Schwein 89 und Ratte 90-93 gehören. Speziell in neonatalen Ratten-Myozyten 23,24, Endothelzellen 12,13, glatten Muskelzellen 16-18 und Fibroblasten 17-19 wird IGF-II transkribiert. IGF-II hat Einfluß auf die Proliferation fetaler Rattenventrikelmyozyten. Es induziert DNA-Synthese, hat daher Einfluß auf das Wachstum des Ventrikels und induziert Hypertrophie 28. IGF-II wird im Schwein in all diesen Zelltypen exprimiert, kann aber im Herzen keine mitogene Funktion haben, da im adulten Myokard keine Proliferation stattfindet. Es muß also eine andere Aufgabe haben. 1.3.2 IGF-II und Ischämie Unter Ischämie versteht man die Verminderung der Perfusion eines Gewebes und den damit einhergehenden Sauerstoffmangel, die Unterversorgung mit metabolischen Substraten sowie die Ansammlung von Stoffwechselprodukten 94. Das Myokard reagiert darauf mit einer Reihe adaptiver Prozesse. Wiederholte kurze koronare Okklusionen (Gefäßverschlüsse) führen zu länger anhaltenden kontraktilen Dysfunktionen 95 und einer erhöhten ischämischen Toleranz bezüglich nachfolgender Okklusionen längerer Dauer 96. Einleitung 14 Als experimentelles Modell für das menschliche Herz eignet sich besonders wegen seiner Größe und der Vergleichbarkeit der koronaren Anatomie das Herz des Schweins 97. Zudem besitzt es keine nativen Kollateralen und bildet - wie im Menschen ebenfalls beschrieben - nach myokardialer Ischämie viele mikrovaskuläre Gefäße aus. Es konnte von Kluge und Vogt 26,27 gezeigt werden, daß IGF-II im Schweineherzen nach Okklusion/Reperfusion induziert, d.h. die 6.0 kb mRNA unter Stress und Ischämie hochreguliert ist. Außerdem wirkt IGF-II kardioprotektiv, da es die Größe des infarzierten Gebietes in dem eben beschriebenen Modell der Okklusion/Reperfusion verringert. Allerdings liegen bisher keine Kenntnisse über die Regulation des IGF-II unter solchen Bedingungen vor. 1.4 Fragestellung Ziel dieser Arbeit war es, Aufschluß über die Regulation des IGF-II nach Ischämie/Reperfusion zu bekommen. Es sollte untersucht werden, welche mRNAs des IGF-II beim Schwein durch den jeweils entsprechenden Promotor generiert werden und im Speziellen, welcher Promotor des IGF-II-Gens für die durch Ischämie und Stress-induzierte 6.0 kb mRNA verantwortlich ist. Eine genomische Karte des IGF-II-Gens des Schweines galt es zu erstellen. Weiterhin stellte sich die Frage nach der Funktion des IGF-II in Myoblasten. Mittels unterschiedlicher Modelle war die Wirkung des IGF-II in den Myoblasten zu analysieren. Neben den Untersuchungen am Modell der Ischämie/Reperfusion des Schweineherzens sollte eine transgene Mauslinie mit herzspezifischer Überexpression des IGF-II etabliert werden. Parallel dazu waren Zellkulturstudien von Interesse, um den Einfluß der Überexpression des IGF-II-Gens auf Myoblasten anhand von Transfektionsstudien zu analysieren. Material und Methoden 15 2 Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Geräte und sonstige Bedarfsgegenstände Standardgerätschaften werden nicht gesondert aufgeführt. A.L.F. DNA Sequencer Pharmacia LKB, Freiburg Autoklav, Varioklav, Typ 500 H-P Labortechnik, München Bakterienschüttler Certomat HK B. Braun Biotech Betastrahlenzähler (β-Counter) Berthold, Bad Wildbad Brutschrank Cytoperm Heraeus, Hanau Corex-Röhrchen Heraeus, Hanau Filmentwicklungsmaschine Optimax Beetz, Langen Fluoreszenzmikroskop Leica, Wetzlar Hybridisierungsofen Biometra, Göttingen Hybridisierungsröhren Biometra, Göttingen Kamera Polaroid, UK Kühlzentrifuge Eppendorf, Hamburg Laminar Flow Ceag Schirp, Selm-Bork Neubauer-Zählkammer Superior, Lauda-Königshofen PCR-Geräte: - Thermocycler Gene Amp PCR 9600 Perkin-Elmer, Weiterstadt - PTC-200 Biozym, Hess. Oldendorf pH-Meter Schott, Mainz PhosphorImager Storm 860, zugehörige Kassetten Molecular Dynamics, Freiburg Präzisions-Küvetten aus Quarzglas Hellma, Nürnberg Spektrophotometer 4054, UV/visible Pharmacia Biosystems, Freiburg Ultra Turrax IKA-Labortechnik, Staufen Ultraschall-Sonifizierer Branson, Dietzenbach UV-Stratalinker 1800 Stratagene, Heidelberg UV-Transilluminator ( 302 nm, mittelwellig) Herolab, Wiesloch Vakuum Konzentrator Speed Vac GMI, Clearwater, USA Vertikale Elektrophorese/Naßblotkammer Invitrogen, Groningen, Niederlande Zentrifugen und Rotoren: - RC-5B mit SS-34 und GS-3 Sorvall, Hanau - J2-21 mit JA-21 und JA-10 Beckmann, München Material und Methoden 16 2.1.2 Verbrauchsmaterialien Übliche Verbrauchsmaterialien werden nicht extra genannt. 3MM-Papier Whatman, Kent, UK Chroma Spin TM Columns Clontech, Heidelberg Chromatographiepapier DE 81 Whatman, Kent, UK DE81-Papier Whatman, Kent, UK Dialyseschlauch Sigma, Deisenhofen ExpressHyb Hybridization Solution Clontech, Heidelberg Filter: - Protran BA 85 (82 mm) Schleicher&Schuell, Dassel - Protran BA 85 (132 mm) Schleicher&Schuell, Dassel - Duralon UV™ Stratagene, Heidelberg - Nitrozellulose Invitrogen, Groningen, Niederlande Gewebekulturflaschen 75 cm2 Greiner, Frickenhausen Hyperfilm ECL Amersham, Freiburg Kryo-Röhrchen Nunc, Wiesbaden Plastikküvetten Roth, Karlsruhe Polypropylen-Zentrifugenröhrchen Falcon, Le Pont de Claix, FR Reaktionsgefäße: 1.5 und 2.0 ml (Eppendorftube) Eppendorf, Hamburg Röntgenfilme X-Omat AR Kodak, Stuttgart Sterilfilter Roth, Karlsruhe Zellschaber Greiner, Frickenhausen Ultrafree-4 Units Millipore, Eschborn 2.1.3 Chemikalien Die üblichen Chemikalien wurden von den Firmen Roth, Karlsruhe; Merck, Frankfurt a. M.; Sigma, Deisenhofen und Serva, Heidelberg bezogen und werden bei den Lösungen und Medien aufgeführt. Zusätzliche Chemikalien sind gesondert genannt. Wenn nicht anders vermerkt, wurde Wasser als Lösungsmittel verwendet. 2.1.3.1 Chemikalien, Lösungen und Nährmedien für molekularbiologische Techniken Chemikalien: 4'6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI), 1µg/ml Mo Bi Tec, Göttingen Agarose: - SeaKEM GTG Biozym, Hess. Oldendorf - LE-Agarose Biozym, Hess. Oldendorf Ammoniumperoxodisulfat (APS) Merck, Frankfurt a. M. Material und Methoden 17 Calciumchlorid (CaCl2) Merck, Frankfurt a. M. Dextransulfat Roth, Karlsruhe dNTPs Roth, Karlsruhe Harnstoff, ultrarein Amersham, Freiburg Propidiumjodid, 1µg/ml Mo Bi Tec, Göttingen Salmonsperma DNA (ssDNA) Sigma, Deisenhofen TEMED (N’N’N’N’Tetramethylethylendiamin) Pharmacia, Freiburg Lösungen: 1 x Lambda-Verdünnungspuffer - 100 ml 10 x Lambda-Verdünnungspuffer - 0.1 % Gelatine Sigma, Deisenhofen - in H2O, autoklavieren und bei 4°C lagern 10x TE Puffer - 100 mM Tris/HCl Roth, Karlsruhe - 10 mM EDTA Roth, Karlsruhe 50 x Denhardt´s - 1 % Ficoll 400 Sigma, Deisenhofen - 1 % Polyvinylpyrrolidon Sigma, Deisenhofen - 1 % Bovine serum albumin (BSA) Sigma, Deisenhofen Ampicillin Roth, Karlsruhe - Stammlösung von 60 mg/ml H2O (Lagerung bei -20°C) - wurde im LB-Medium auf 60 µg/ml verdünnt Ethidiumbromid Roth, Karlsruhe - 10 mg/ml in H2O und 1 mg/ml Guanidiniumpuffer - 4 M Guanidiniumthiocyanat Roth, Karlsruhe - 25 mM Na-citrat, pH 7 Roth, Karlsruhe - 0.5 % N-Lauryl-Sarcosylsarcosin Sigma, Deisenhofen - 0.1 M ß-Mercaptoethanol in DEPC-H20 Roth, Karlsruhe Hybridisierungspuffer für Northern Blot - 50 % deionisiertes Formamid Gibco, Karlsruhe - 10 % Dextransulfat Roth, Karlsruhe - 1 % (w/v) SDS Roth, Karlsruhe - 1 M NaCl Roth, Karlsruhe - 100 µg/ml ssDNA Sigma, Deisenhofen Hybridisierungspuffer für Southern Blot - 6 x SSC Gibco, Karlsruhe - 5 x Denhardt´s Reagenz - 0.5 % (w/v) SDS Roth, Karlsruhe - 100 µg/ml ssDNA Sigma, Deisenhofen - 50 % deionisiertes Formamid Gibco, Karlsruhe Material und Methoden 18 Hybridisierungspuffer für Phagenscreening - 5 x SSC Gibco, Karlsruhe - 5 x Denhardt´s Reagenz - 0.1 % SDS Roth, Karlsruhe - 50 % deionisiertes Formamid Gibco, Karlsruhe - 100 µg/ml ssDNA Sigma, Deisenhofen Isopropyl-ß-D-Thio-Galactopyranosid (IPTG) Sigma, Deisenhofen - 200mg/ml-Stammlösung in H2O dest. - Lagerung bei –20°C Kanamyzin Sigma, Deisenhofen - 50 mg/ml H2O (Lagerung bei -20°C) - wurde im LB-Medium auf 50 µg/ml verdünnt RNA-Proben- Puffer - 750 µl deionisiertes Formamid (bei – 20°C lagern) Gibco, Karlsruhe - 150 µl 10 x MOPS Roth, Karlsruhe - 240 µl Formaldehyd Merck, Frankfurt a. M. - 100 µl Glyzerin Roth, Karlsruhe - Bromphenolblau Roth, Karlsruhe - Xylencyanol Sigma, Deisenhofen - ad 1.5 ml mit H2O - Lagerung bei –20°C TBE - 100 mM Tris Roth, Karlsruhe - 100 mM Borsäure Roth, Karlsruhe - 2 mM EDTA Roth, Karlsruhe - pH 8.0 TE - 10 mM Tris Roth, Karlsruhe - 1 mM EDTA Roth, Karlsruhe - pH 8.0 Verdaupuffer für genomische DNA aus Gewebe - 100 mM NaCl Roth, Karlsruhe - 10 mM Tris / HCl pH 8.0 Roth, Karlsruhe - 25 mM EDTA pH 8.0 Roth, Karlsruhe - 0.5 % SDS Roth, Karlsruhe - 0.1 mg / ml Proteinase K Promega, Mannheim Verdaupuffer für genomische DNA aus Mäuseschwänzen - 50 mM Tris/HCl pH 8.0 Roth, Karlsruhe - 100 mM EDTA Roth, Karlsruhe - 0.5 % SDS Roth, Karlsruhe - 500 µg Proteinase K Promega, Mannheim X-Gal AppliChem, Darmstadt - 20 mg/ml-Stammlösung in Dimethylformamid Roth, Karlsruhe - Lagerung bei –20°C Material und Methoden 19 10 x MOPS-Puffer - 41.8 g MOPS (3-Morpholinopropansulfonsäure) Roth, Karlsruhe - 4.1 g NaAcetat Roth, Karlsruhe - 3.72 g EDTA (Ethylendiamintetraacetat) Roth, Karlsruhe - in 1l DEPC-H2O auf pH 7.0 mit NaOH einstellen - autoklavieren ist nicht notwendig, da alle Substanzen in DEPC-H2O gelöst werden DEPC-H 2 O - 0.1 % DEPC in H2O Roth, Karlsruhe - üN bei 37°C und autoklavieren 10 x DNA Proben-Puffer - 1ml 0.5 M EDTA Roth, Karlsruhe - 0.1 ml 10 % SDS Roth, Karlsruhe - 2.7 ml Glyzerin Roth, Karlsruhe - 0,01 % (w/v) Bromphenolblau Sigma, Deisenhofen - 0,01 % (w/v) Xylencyanol Sigma, Deisenhofen - 0.9 ml H2O Denaturierungslösung für Southern Blot - 1.5 M NaCl Roth, Karlsruhe - 0.5 M NaOH Roth, Karlsruhe Neutralisierungslösung für Southern Blot - 1.5 M NaCl Roth, Karlsruhe - 0.5 M Tris/HCl pH 8.0 Roth, Karlsruhe 10 x Lambda-Verdünnungspuffer - 0.35 M Tris/HCl pH 7.5 Roth, Karlsruhe - 0.1 M MgSO4 • 7H2O Roth, Karlsruhe - in H2O, autoklavieren und bei 4°C lagern PBS - 137 mM NaCl Roth, Karlsruhe - 2,7 mM KCl Roth, Karlsruhe - 7,4 mM Na2HPO4 Roth, Karlsruhe - 1,5 mM KH2PO4 Roth, Karlsruhe - pH 7.4 20 x SSC - 3 M NaCl Roth, Karlsruhe - 0.3 M Natriumcitrat pH 7.0 Roth, Karlsruhe 10 x TBE - 1 M Tris/HCl pH 8,0 Roth, Karlsruhe - 1 M Borsäure Roth, Karlsruhe - 25 mM EDTA Roth, Karlsruhe Material und Methoden 20 Medien: Luria-Bertani-Medium (LB-Medium) - 10 g/l Pepton aus Casein tryptisch verdaut Roth, Karlsruhe - 5 g/l Hefeextrakt Roth, Karlsruhe - 5 g/l NaCl Roth, Karlsruhe - pH 7.0 - Sterilisieren (Autoklavieren) NZYM-Platten - NZYM Sigma, Deisenhofen - 1.5 % Agar Roth, Karlsruhe SOC-Medium: zu SOB-Medium geben - 1 M MgCl2 (sterilfiltriert) Merck, Darmstadt - 1 M MgSO4 (sterilfiltriert) Roth, Karlsruhe - 2M Glucose Roth, Karlsruhe Top Agarose - 7 g Agarose/ 100 ml NZYM-Medium Lambda-Medium - LB-Medium - 10 mM MgSO4 Roth, Karlsruhe - 0.2 % Maltose Roth, Karlsruhe LB/ MgSO 4 -Platten - LB-Medium - 10 mM MgSO4 • 7 H2O Roth, Karlsruhe LB-Platten - LB-Medium - 1.5 % Agar Roth, Karlsruhe SOB-Medium - 10 g Trypton Roth, Karlsruhe - 2.5 g Hefeextrakt Roth, Karlsruhe - 0.25g NaCl Roth, Karlsruhe - auf 500 ml mit H2O dest. auffüllen - autoklavieren 2.1.3.2 Chemikalien, Proteine und Antikörper für die Proteinchemie Chemikalien und Puffer: 0.5 % Ponceau S-Lösung in 40 % MetOH, 15 % Eisessig Merck, Darmstadt/Roth, Karlsruhe 4-12 % Bis/Tris-Gele Invitrogen, Groningen, Niederlande BSA, fettsäurefrei Sigma, Deisenhofen Dithiothreitol, ultrarein (DTT) Serva, Heidelberg Material und Methoden 21 Hepes-Puffer: - 20 mM Hepes pH 7.9 Roth, Karlsruhe - 20 % Glyzerin Roth, Karlsruhe - 0.4 M KCl Roth, Karlsruhe - 1.5 mM MgCl2 Roth, Karlsruhe - 0.1 mM EDTA Roth, Karlsruhe - 5.7 mM PMSF (Phenylmethylsulfonyl-Fluorid) Roth, Karlsruhe Laemmli-Puffer (5 x) pH 6.8: - 0.0625 M Tris/HCl Roth, Karlsruhe - 2.3 % SDS Roth, Karlsruhe - 10 % Glyzerin Roth, Karlsruhe MES-SDS-Laufpuffer (20 x): Invitrogen, Groningen, Niederlande - 1 M MES - 1 M Tris/HCl - 69.3 mM SDS - 20.5 mM EDTA - pH 7.3 Stripping-Puffer: - 100 mM 2-Mercaptoethanol Roth, Karlsruhe - 2 % SDS Roth, Karlsruhe - 62, 5 mM Tris/HCl pH 6.7 Roth, Karlsruhe TBS: - 20 mM Tris/HCl Roth, Karlsruhe - 137 mM NaCl Roth, Karlsruhe - pH 7.6 TBS-T-Puffer: - TBS - 0.1% Tween-20 Roth, Karlsruhe NuPage-Transferpuffer (20 x): Invitrogen, Groningen, Niederlande - 0.5 M Bicine - 0.5 M Bis/Tris - 20.5 mM EDTA - 1 M Chlorobutanol - pH 7.2 Rekombinante Proteine: rekombinantes humanes IGF-II-Protein BioTrend, Köln rekombinantes GFP Protein Clontech, Heidelberg Antikörper: Anti-alpha/gamma Muskel-Aktin, monoklonal (HHF35) Dako, Glostrup, Dänemark Anti-GAPDH, monoklonal BioTrend, Köln Anti-GFP, monoklonal Clontech, Heidelberg Material und Methoden 22 Anti-IGF-II, monoklonal (S1F2) Upstate, Biozol, Eching Rabbit Anti-Mouse Immunoglobulins/HRP Dako, Glostrup, Dänemark 2.1.3.3 Chemikalien für die Zellkultur Dimethylsulfoxid (DMSO) Sigma, Deisenhofen DMEM Gibco, Karlsruhe Fetal Bovine Serum (FBS) Sigma, Deisenhofen FugeneTM6 Roche, Mannheim Geniticin (G418) Amersham, Freiburg Natriumpyruvat Gibco, Karlsruhe Non-Essential Amino Acids Gibco, Karlsruhe Penicillin-Streptomycin für Zellkultur (Pen/Strep) Gibco, Karlsruhe Trizol Gibco, Karlsruhe Trypsin/EDTA Gibco, Karlsruhe 2.1.4 Enzyme und Kits Enzyme: Alkalische Phosphatase Boehringer, Mannheim AutoReadTMSequencing Kit Pharmacia LKB, Freiburg DNase I Gibco, Karlsruhe GeneAmp Perkin Elmer, Weiterstadt Klenow Polymerase Promega, Mannheim Proteinase K Promega, Mannheim RNace-It Cocktail Stratagene, Heidelberg RNase Sigma, Deisenhofen T4 Polynukleotidkinase Promega, Mannheim Restriktionsendonukleasen wurden von den Firmen Promega, Mannheim; Stratagene, Heidelberg; Amersham, Freiburg und Gibco, Karlsruhe bezogen. Kits: ECL-Kit Amersham, Freiburg DC Protein Assay Biorad, München Geneclean III Kit Dianova, Hamburg MegaPrime Labeling Kit Amersham, Freiburg PCR-Script™ Amp Cloning-Kit Stratagene, Heidelberg pGEM-T-Easy Vector System Promega, Mannheim Qiaquick PCR Purification Kit Qiagen, Hilden ready to go-T4-Ligase Amersham, Freiburg rediprime II™, RandomPrime Labeling Kit Amersham, Freiburg Material und Methoden 23 Taq-Master-Mix Qiagen, Hilden Wizard Plus DNA Mini/Midiprep Purification System Promega, Mannheim Größenmarker: Lambda DNA / Eco R I + Hind III-Fragmente Promega, Mannheim Lambda DNA / Hind III-Fragmente Promega, Mannheim phi X 174 RF DNA / Hae III-Fragmente Promega, Mannheim RNA-Größen-Marker G319 Promega, Mannheim Supercoiled DNA-Leiter Gibco, Karlsruhe Multi-Mark Invitrogen, Groningen, Niederlande Radioaktive Nukleotide: α 32P-dCTP Amersham, Freiburg γ 32P-ATP Amersham, Freiburg 2.1.5 Oligonukleotide Alle Oligonukleotide außer uni, rev, die im AutoRead Sequencing Kit (Amersham) enthalten sind und zur Sequenzierung verwendet wurden, wurden von der Firma MWG, Ebersberg synthetisiert. Oligonukleotide, die zur Hybridisierung verwendet wurden, sind auch in Abb. 10 eingezeichnet. uni: 5' - CGA CGT TGT AAA ACG ACG GCC AGT - 3', 5'-Fluorescein-markierung, (universal) rev: 5' - CAG GAA ACA GCT ATG AC - 3', 5'-Fluorescein-markierung, (reverse) T3: 5' - TCA CTA AAG GGA ACA AAA - 3', 5'-Fluorescein-markierung T7: 5' - GCG TAA TAC GAC TCA CTA - 3', 5'-Fluorescein-markierung #92: 5' - CTT CCC CAT GAC CAC ATC AGC – 3', (humanes IGF-II Exon 1, sense) Homologie zu Acc. Nr. L15440 (Nukleotide 6964-6987) #93: 5' - GGG TTT GTG GTT TGG ATG – 3', (porcine IGF-II mRNA, antisense) Homologie zu Acc. Nr. X56094 (Nukleotide 1125-1108) #104: 5' - CCT GCT GGA GAC CTA CTG – 3', (porcine IGF-II mRNA, sense) Homologie zu Acc. Nr. X56094 (Nukleotide 604-621) #119: 5' - CTT CCG GGT CCA GTG TCC GG – 3', (porcine IGF-II mRNA, antisense) Homologie zu Acc. Nr. X56094 (Nukleotide 36-17) #148: 5' - CGT GGC ATC GTT GAG GAG TG – 3', 5'-Fluorescein-markierung, (humanes IGF-II Exon 8, sense) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 7537-7556) #149: 5' - AAC AGC ACT CCT CAA CGA TG – 3', 5'-Fluorescein-markierung, (humanes IGF- II Exon 8, antisense) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 7561-7542) #155: 5' - CTG TCC ACG TCC TGA GGG CGC G – 3', (humanes IGF-II Exon 4, antisense) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 142-121) #156: 5' - GGA GTC AGC AGC GAG GCA GCG GG – 3', (humanes IGF-II Exon 5, antisense) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 1982-1960) #157: 5' - CAC AGC CCT GGT TAC CTA CAG CTC AG – 3', (humanes IGF-II Exon 6, Material und Methoden 24 antisense) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 3998-3973) #158: 5' - GCC AGG GCT GCC CGA GAC CCC AG – 3', (porcine IGF-II mRNA, sense) Homologie zu Acc. Nr. X56094 (Nukleotide 257-279) #159: 5'- GCAGGGGCCGGCCAGCAGGCTC - 3', (MLc2v-Promotor der Ratte, sense, Promotorspezischer Primer, PP) Homologie zu Acc. Nr. U26708 (Nukleotide 1951-1972) #163: 5' - TGG GGA CCG CGG CTT CTA CTT C – 3', 5'-Fluorescein-markierung, (humanes IGF-II Exon 7, sense) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 5781-5802) #164: 5' - TGC TTA CCG CCC CAG TGA GAC – 3', 5'-Fluorescein-markierung, (humanes IGF-II Exon 7, sense) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 5718-5738) #186: 5' - CGGAACTACGACGGTATC - 3', (18S antisense) Homologie zu Acc. Nr. X01117 (Nukleotide 1080-1061) #285: 5' - CAG GAC GTG GAC AGG GAG GGC -3' (humanes IGF-II Exon 7, sense) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 5781-5802) #286: 5' - CTG CCT CGC TGC TGA CTC CCG - 3', (humanes IGF-II Exon 4, sense) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 129-149) #287: 5' - CTC CTC CTG CCC CAG CGA GCC -3', (humanes IGF-II Exon 6, sense) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 3947-3967) #335: 5' - GAT GCT GCT GTG CTT CCT CAG CC – 3' (humanes IGF-II, Exon 9, antisense, Genspezifischer Primer, GP1) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 8388-8366) #337: 5' - GCA GTT TTG CTC ACT TCC GAT TG – 3' (humanes IGF-II, Exon 9, antisense, Genspezifischer Primer, GP2) Homologie zu Acc. Nr. X03562 (Nukleotide 8193-8171) #351: 5' - TGA GCT AGG GCT GGA AAG AA - 3', (humanes H19, sense) Homologie zu Acc. Nr. AF087017 (Nukleotide 8596-8615) #352: 5' - CGA TCC CCT AAA CCT CCT TC - 3', (humanes H19, antisense) Homologie zu Acc. Nr. AF087017 (Nukleotide 8836-8817) 2.1.6 Plasmide und verwendete Klone Bluescript KS+ Stratagene, Heidelberg Bluescript SK+ Stratagene, Heidelberg PCR-Script Stratagene, Heidelberg pEGFP-C1 Clontech, Heidelberg pGEM T Promega, Heidelberg pGEM T-Easy Promega, Heidelberg Material und Methoden 25 Name Vektor / Selektion kloniert in Insert Spezies Herkunft IGF-II /8-1 pUC12 /Amp Eco R I ~1.2 kb human ATCC Nr. 57482, Genbank Acc. Nr. M13970 IGF-II 0.46 ES pBS SK+ / Amp Eco R I / Sal I 0.46 kb human IGF-II/8-1 subkloniert Mlc2v/IGF-II pBluescript / Amp Eco R I ~1.2 kb human IGF-II/8-1 subkloniert pEGFP-C1 pEGFP / Kan, G418 Clontech, Heidelberg pEGFP-C1/IGF-II pEGF-C1 / Kan, G418 Eco R I ~1.2 kb human Stefanie Böhm IGF-II / P1 pBS II KS+/Amp Bam H I / Hind III 0.59 kb human E. Holthuizen IGF-II / P2 pEMBL/Amp Bam H I 0.98 kb human E. Holthuizen IGF-II / P3 pUC/Amp Eco R I / Sal I 0.85 kb human E. Holthuizen IGF-II / P4 pBS II KS+/Amp Bam H I / Hind III 0.114 kb human E. Holthuizen IGF-II 5' Region PCR-Script/Amp Srf I ~1 kb Schwein Stefanie Böhm IGF-I pKT218 / Tet Pst I 0.66 kb human ATCC Nr. 59944 Insulin Rezeptor pUC12 / Amp Eco R I 4.1 kb human ATCC Nr. 57492 IGF-I Rezeptor pUC13 / Amp Eco R I 0.7 kb human ATCC Nr. 59294 IGF-II Rezeptor pBS SK- / Amp Eco R I 1.9 kb human ATCC Nr. 78211, Genbank Acc. Nr. 78019 IGFBP-5 pBlue SK+ / Amp Eco R I 1.64 kb human M.Kiefer IGFBP-6 pBlue SK- / Amp Eco R I 0.98 kb human M. Kiefer 18S rRNA pUC830 / Amp Eco R I /Bam H I 0.77 kb Maus I.Oberbäumer 2.1.7 Bibliotheken Cosmid-Bibliothek Clontech, Heidelberg Lambda EMBL3/SP6 Clontech, Heidelberg Porcine Genomic Library in Lambda FIX II Vector Stratagene, Heidelberg 2.1.8 Bakterienstämme E. coli JM 109 Promega, Heidelberg E. coli K802 Clontech, Heidelberg E. coli XL1-blue MRA Stratagene, Heidelberg E. coli XL1-blue MRA (P2) Stratagene, Heidelberg E. coli XL1-blue Stratagene, Heidelberg Material und Methoden 26 2.2 Methoden 2.2.1 Kompetente Bakterien (CaCl2-Methode) Bakterien, die transformiert werden sollen, müssen kompetent sein, d.h. Fremd-DNA aufnehmen können. Dazu wurde der entsprechende Stamm (Xl 1-blue oder JM109) auf einer LB-Platte ausgestrichen und üN bei 37°C inkubiert. Eine Kolonie wurde in LB-Medium transferiert und üN bei 37°C und 250 rpm geschüttelt. Anschließend wurde die Kultur 1:50 in LB-Medium verdünnt und bis zu einer Dichte von OD550 = 0.4 - 0.5, d.h. bis zur logarithmischen Wachstumsphase wachsen gelassen. In einem Eiswasserbad wurde die Kultur für 10 min unter leichtem Schütteln abgekühlt und bei 4°C und 2500 x g zentrifugiert. Das Bakterienpellet wurde in 250 ml eiskalter 0.1 M CaCl2-Lösung resuspendiert und 30 min auf Eis inkubiert. Es erfolgte eine weitere Zentrifugation. In 20 ml eiskalter 0.1 M CaCl2-Lösung wurde das Pellet gelöst und unter Zugabe von Glyzerin (in einer Endkonzentration von 15 %) aufgenommen. Zur Steigerung der Kompetenz inkubierte man sie üN bei 4°C. Zur endgültigen Lagerung wurden Aliquots zu je 1ml in Eppendorftubes gegeben und in flüssigem Stickstoff schockgefroren. Die Aliquots wurden dann bei -80°C gelagert. 2.2.2 Transformation von Bakterien Kompetente Bakterien wurden auf Eis aufgetaut. 10 – 100 ng der Plasmid-DNA wurden zugegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgte bei 42°C ein Hitzeschock für 45-60 sec. 1 ml LB-Medium wurde zu den Bakterien gegeben und 1 h bei 37°C inkubiert, in dieser Zeit können die Bakterien, die das Plasmid aufgenommen haben, die Antibiotikaresistenz aufbauen. Die Bakterien wurden anschließend pelletiert, in 100 µl LB- Medium resuspendiert und auf der entsprechenden Platte (LB mit entsprechendem Antibiotikum zur Selektion) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Material und Methoden 27 2.2.3 Blau-Weiß-Differenzierung Im Falle einer Blau-Weiß-Differenzierung, d.h. bei Verwendung eines Plasmides, welches das lacZ'Gen trägt und eines Bakterienstammes (JM109, XL-1blue), der für den C-Terminus der ß-Galactosidase kodiert, wurden auf den LB-Platten mit dem entsprechenden Antibiotikum mit Hilfe eines Drygalskispatels 40 µl X-Gal (20 mg/ml) und 4 µl IPTG (200 mg/ml) gleichmäßig verteilt und bei 37°C mindestens 1h vor dem Ausplattieren des Transformationsansatzes inkubiert. Nach der Inkubation üN bei 37°C können weiße von blauen Kolonien unterschieden werden. Zellen, die ein Plasmid mit einem intakten lacZ'Gen tragen, sind in der Lage das künstliche Substrat X-Gal zu spalten und bilden daher blaue Kolonien. Durch Klonierung eines Fragmentes in die multiple Klonierungssequenz (multiple cloning site, MCS) ist das lac Z'Gen inaktiviert und die Bakterien, die es enthalten, sind daher weiß. 2.2.4 Plasmidpräparation Zum Ansetzen der üN-Minikulturen wurden Kolonien von einer Platte gepickt und in 3 ml Medium gegeben. Bei der Midikultur wurden 10 µl der Minikultur zu 50 - 100 ml Medium gegeben und über Nacht bei 37°C und 250 rpm geschüttelt. 2.2.4.1 Quick-Check (nach Rinji Akada 98) Nach der Herstellung von Plasmidkonstrukten (s. 2.2.9) wurde der Quick-Check verwendet, um zu überprüfen, ob der Vektor ein Insert trägt. Zu 100 µl der üN-Kulturen wurden 50 µl Phenol/Chloroform und 10 µl DNA-Proben-Puffer gegeben und für 10 sec gemischt. Die obere wäßrige Phase, welche die Nukleinsäuren enthält, wurde durch Zentrifugation (5 min, 15000 x g) von der unteren organischen Phase getrennt. 40 µl der wäßrigen Phase wurden elektrophoretisch aufgetrennt. Dadurch können Plasmide, welche einen Größenunterschied von mehr als 200 bp haben, unterschieden werden. Weiterhin werden bakterielle genomische DNA und RNA aufgetrennt. Material und Methoden 28 2.2.4.2 Plasmidpräparation Die Präparation der DNA erfolgte nach der Anleitung des Wizard® Plus Mini/Midiprep Purification System (Promega, Mannheim); die Maxipräparation wurde nach dem Protokoll von Wang 99 durchgeführt. 2.2.4.3 Anlegen von Glyzerinstocks der Bakterienklone 850 µl einer üN-Kultur wurden mit 150 µl Glyzerin (86 %) gemischt und bei –80°C gelagert. Um aufbewahrte Kulturen zu amplifizieren, wurden die Bakterienklone mit einer Impföse ausgestrichen und üN bei 37°C inkubiert und damit vereinzelt. Anschließend konnte mit der beschriebenen Plasmidpräparation (s. 2.2.4.2) fortgefahren werden. 2.2.5 Quantifizierung von Nukleinsäuren Die Konzentration der Nukleinsäuren kann photometrisch bestimmt werden. Hierbei entspricht die OD260 = 1 bei DNA einer Konzentration von 50 ng/µl und 40 ng/µl bei RNA. Die Reinheit der Nukleinsäuren läßt sich durch den Quotienten aus OD260/OD280 ermitteln, welcher zwischen 1.5 und 2.0 liegen sollte. Die OD280 ermöglicht eine Aussage über die Verunreinigung durch Proteine und Phenolreste aus der Präparation. Bei der Insert-Herstellung (s. 2.2.13.3) wurde die Konzentration mit den einzelnen Banden des Größenmarkers verglichen und dadurch abgeschätzt. 2.2.6 Restriktionsverdau Restriktionsendonukleasen erkennen spezifische Sequenzen in der DNA und schneiden innerhalb des Palindroms so, daß ein 5', 3'-Überhang oder glatte Enden entstehen. Die Einheiten, die pro Enzym eingesetzt werden müssen, ergeben sich aus der Relation der Schnittstellen in der Lambda-DNA und der zu untersuchenden DNA. Zur Linearisierung eines Vektors oder zur quantitativen Isolierung eines Inserts aus einem Vektor wurden 30-50 µg der DNA in einem Gesamtvolumen von 100-200 µl für 2 Stunden oder üN bei 37°C verdaut. Die DNA wurde danach elektrophoretisch aufgetrennt und das gewünschte Fragment aus dem Gel eluiert (s. 2.2.13.1). Material und Methoden 29 2.2.7 Polymerase-Ketten-Reaktion Die Polymerase-Ketten-Reaktion ist ein Verfahren zur selektiven in vitro Anreicherung von DNA-Fragmenten mit Hilfe von thermostabilen DNA-Polymerasen. Diese ergänzen einen DNA- Einzelstrang zum Doppelstrang, wenn ihnen ein kurzer doppelsträngiger Bereich als Startpunkt zur Verfügung steht. Durch Wiederholen einer temperaturabhängigen Reaktionsfolge von DNA- Denaturierung, Primeranlagerung und DNA-Doppelstrang-Synthese kommt es zur exponentiellen Vermehrung der Zielsequenz. Bei der Auswahl der Primersequenzen für die PCR-Reaktionen wurde Folgendes beachtet. Um eine möglichst spezifische Amplifikation der Zielsequenz in der PCR zu gewährleisten, müssen die Primer lang genug sein, um bei einer hinreichend hohen Anlagerungstemperatur selektiv mit der Zielsequenz zu hybridisieren. Die zur Primerwahl benötigten Sequenzen der jeweiligen Gene wurden entsprechenden Datenbanken entnommen (genebank; http://www.ncbi.nlm.nih.gov). Durch computergestützten Homologievergleich der gewählten Primersequenzen mit entsprechenden Datenbanken (Blast; http://www.ncbi.nlm.nih.gov) wurden unspezifische Hybridisierungen ausgeschlossen. 2.2.7.1 PCR-Protokoll zur Amplifikation von genomischer DNA PCR-Amplifikationen aus genomischen DNA-Proben zur Genotypisierung der Mäuse wurden unter Standardbedingungen des Taq-PCR-Mastermixes (Qiagen, Hilden) nach Vorschrift des Herstellers durchgeführt. Als Template wurde 1 µl einer 1:10-Verdünnung der Mäuseschwanz- DNA-Präparation (s. 2.2.10.2) eingesetzt. Es wurde der Taq-PCR-Mastermix verwendet und unterschiedliche Primerkombinationen verwendet. Nach Überprüfung der erfolgreichen Amplifikation im 1 % igen Agarosegel wurde die DNA mittels Southern Blot auf eine Nylonmembran transferiert und mit einer cDNA-Sonde, welche innerhalb des amplifizierten Bereiches liegt, mit den Primern aber keine Homologie hat, hybridisiert. Dieser zusätzliche Test ermöglicht es, eine Aussage über die Amplifikation der Zielsequenz zu treffen und wurde während der Etablierung der PCR durchgeführt (s. 3.3.4). Material und Methoden 30 PCR zu Amplifikation anderer genomischer Sequenzen wurden mit GeneAmp durchgeführt und nach Angaben des Herstellers (Perkin Elmer) eingesetzt. 2.2.7.2 Aufreinigung von PCR-Produkten PCR-Produkte wurden vor der Klonierung mit dem Qiaquick PCR Purification Kit von Qiagen aufgereinigt, um freie Nukleotide abzutrennen. Hierbei wurden alle Nukleinsäuren kleiner 100 bp von den größeren (bis zu 10 kb) abgetrennt. 2.2.8 Auffüllen von 5'-Überhängen mit der Klenow-Polymerase Folgender Reaktionsansatz wurde 30 min bei 37°C inkubiert und einer Phenol/Chloroform- Extraktion mit anschließender Fällung unterzogen (s. Fällung bei 2.2.10.1). Nach dem Trocknen des Pellets, wurde es in einem geringen Vol Wasser gelöst. Reaktionsansatz: max. 5 µg DNA 5 µl Klenowpuffer 100 µM je dNTP (dATP, dCTP, dGTP, dTTP) 6 U Klenow Polymerase ad 50 µl mit H2O 2.2.8.1 Dephosphorylierung von 5'-Enden Um die Religation eines restringierten Vektors zu verhindern, werden dessen 5'-Enden mit Alkalischer Phosphatase dephosphoryliert. Zu 1 bis 2 µg DNA wurde 1 U Alkalische Phospha- tase (CIP = Calf Intestine Phosphatase) (Boehringer, Mannheim) sowie 5 µl 10 x CIP-Puffer gegeben und der Ansatz mit Wasser auf 50 µl aufgefüllt. Nach einer 30-minütigen Inkubation wurde die Reaktion durch eine Phenol/Chloroform-Extraktion gestoppt, die DNA gefällt und in einem geeigneten Vol TE-Puffer aufgenommen. 2.2.9 Klonierung von PCR-Produkten und restringierten Fragmenten Ligationen wurden entweder mit dem PCR-Script™ Amp Cloning-Kit (Stratagene, Heidelberg), pGem T (Easy)-Kit (Promega, Mannheim) oder mit der ready to go-T4-Ligase (Amersham, Freiburg) nach jeweiliger Vorschrift durchgeführt. Material und Methoden 31 PCR-Produkte wurden mit dem PCR-Script-SK(+)-Plasmid blunt end oder über T-Überhang mit dem pGEM T Easy-Vektor/pGEM T-Vektor ligiert. Da die Taq-Polymerase an die 3'-Enden der PCR-Fragmente jeweils ein überhängendes dA-Nukleotid anhängt, können diese DNA-Fragmente direkt in einen geöffneten T-Vektor ligiert werden, der komplementäre dT-Überhänge aufweist. Generell wurden zur Ligation Vektor und PCR-Fragment in einem molaren Verhältnis von 1:1 bis 1:5 eingesetzt und über Nacht bei 16°C oder 1 h bei RT inkubiert und anschließend in frisch aufgetaute kompetente Bakterien transformiert (s. 2.2.2). Wurde die ready to go-T4-Ligase verwendet, wurde die Ligation in einem molaren Vektor/Insert- Verhältnis von 1 : 5 bis 1 : 10 angesetzt. Es ergab sich daher der nachstehende Ansatz. Ligationsansatz: - 50 ng Vektor - 5-10 facher molarer Überschuß an Insert-DNA - 1 x Ligationspuffer - 2000 U T 4 DNA-Ligase - ad 10 µl mit H2O 2.2.10 Isolation von Nukleinsäuren 2.2.10.1 Isolation genomischer DNA aus Gewebe Die Isolation der genomischen DNA wurde nach Ausubel 100 durchgeführt. 100 mg Gewebe wurden in 1.2 ml Verdaupuffer mittels eines Micropistilles zerkleinert und 18-20 h bei 50°C geschüttelt. 1 Vol P/C/I (1:24:1) wurde zugegeben und gemischt. Nach einer Zentrifugation bei 1700 x g für 10 min wurde der wäßrige Überstand mit 0.5 Vol 3 M Na-Acetat pH 5.2 und 2 Vol abs. EtOH versetzt. Die präzipitierte DNA wurde mit 70 % EtOH gewaschen und das DNA- Pellet in 200 µl TE-Puffer resuspendiert. Zum besseren Lösen des Pellets wurde es bei 65°C schüttelnd inkubiert. 2.2.10.2 Genomische DNA-Isolation aus Mausschwanz-Biopsien 101 Zur Analyse des Genotyps von Mäusen wurde ein ca. 0.5 cm langes Stück der Schwanzspitze des zu untersuchenden Tieres unter Äthernarkose abgeschnitten und in 500 µl Verdaupuffer gegeben. Man inkubierte die Schwänze üN bei 55°C in einem Schüttelinkubator und führte Material und Methoden 32 anschließend eine Extraktion der DNA mit Phenol und P:C:I durch. Die DNA wurde dann mit 2 Vol abs. EtOH und 1/10 Vol Na Acetat pH 7.0 gefällt und mit 70 % EtOH gewaschen. Das Pellet wurde in TE gelöst und die Fällung wiederholt. 2.2.10.3 RNA-Isolation Für die RNA-Isolation wurde eine abgewandelte Version des Protokolls von Chomczynski und Sacchi 102 verwendet. Alle Schritte erfolgten auf Eis. 0.4 g Gewebe wurden in 4 ml Guanidiniumpuffer in Polypropylen-Zentrifugenröhrchen homogenisiert (Ultra Turrax). 0.4 ml 2 M Na-Acetat pH 4, 0.8 ml Chloroform/Isoamylalkohol (49:1) und 4 ml Phenol (mit Wasser gesättigt) wurden zugegeben und gemischt. Es folgten eine Inkubation auf Eis für 15 min und eine Zentrifugation bei 4°C, 5000 x g für 40 min. Die obere Phase wurde in 15 ml Corex-Röhrchen überführt und mit 1 Vol Isopropanol gemischt und für 1 h oder üN bei -20°C inkubiert. Die pelletierte RNA (nach einer Zentrifugation für 20-30 min bei 4°C und 7800 x g) wurde mit 70 % EtOH gewaschen und in 800 µl Guanidiniumpuffer aufgenommen und in ein Eppendorftube überführt. 1 Vol Isopropanol wurde zugegeben, gemischt und für 1 h bei -20°C gestellt. Um die RNA erneut zu pelletieren, wurde für 20 min bei 4°C und 15000 x g zentrifugiert und mit 70 % Ethanol gewaschen. Das RNA-Pellet wurde in 50 - 100 µl DEPC-H20 aufgenommen und bei 65°C für 10 min inkubiert, um sie zu lösen. 2.2.10.4 DNA/RNA-Isolation aus Zellen Zur Isolation von Nukleinsäuren aus Zellen wurden diese mit Trizol mittels Zellschaber geerntet und nach Protokoll des Herstellers aufgereinigt. Die Zellen wurden in 1 ml Trizol-Reagenz aufgenommen und bei RT für 5 min inkubiert. Anschließend wurden 200 µl Chloroform hinzugegeben und nach einer weiteren 3-minütigen Inkubation bei RT wurde für 15 min bei 12000 x g und 4°C zentrifugiert. Die obere Phase wurde in ein frisches Eppendorftube überführt und mit 1 Vol Isopropanol versetzt. Nach 10-minütiger Inkubation bei RT wurde erneut für 10 min bei 12000 x g und 4°C zentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 75 % EtOH gewaschen und getrocknet. Das Pellet wurde in einem geeigneten Vol (30-50 µl) Material und Methoden 33 DEPC-Wasser gelöst und die RNA gemessen. Es wurde EtOH zugegeben, so daß eine Endkonzentration von 70 – 80 % vorlag. Die RNA wurde bei -80°C gelagert. 2.2.11 Gelelektrophorese 2.2.11.1 DNA-Gel Die Trennweise des Agarosegels ist in seiner Porengröße begründet. Zur Herstellung des Agarosegels wurde Agarose in TBE eingewogen und aufgekocht. Die Auftrennung der DNA hängt von der Prozentigkeit des Gels ab, d.h. je höher prozentig ein Gel ist, um so besser werden kleine und um so schlechter werden große Fragmente aufgetrennt. Der Agaroselösung wurde nach Abkühlung auf ca. 50°C Ethidiumbromid zugegeben und in einen Schlitten mit Kamm gegossen. Ethidiumbromid interkaliert in die DNA und RNA und kann später mit UV sichtbar gemacht werden. Nach dem Auspolymerisieren des Gels wurde es in eine Kammer mit 1 x TBE gegeben, die DNA mit Proben-Puffer in die Taschen geladen und bei 10 V/cm laufen gelassen. Aufgrund des negativ geladenen Phosphat-Zuckerrückgrates der DNA wandert diese im elektrischen Feld zur Anode. 2.2.11.2 Denaturierendes Formaldehydgel Prinzip des Formaldehydgeles ist die Auftrennung der RNA in denaturiertem Zustand, d.h. daß die vor dem Auftragen denaturierte RNA im Gel durch die Einwirkung des Formaldehyds einzelsträngig bleibt. Sie wandert aufgrund der negativen Ladung des Phosphat-Zuckerrückgrates zur Anode und trennt sich damit nach ihrem Gewicht bzw. der Größe auf. Es wurden jeweils 15 µg RNA eingesetzt. Entsprechende Vol wurden in der Vakuumzentrifuge eingetrocknet und in 15 µl Proben-Puffer (14 µl RNA-Proben-Puffer und 1 µl 1 mg/ml Ethidiumbromid) aufgenommen, für 15 min bei 65°C denaturiert und auf ein 1 % Agarosegel in MOPS und 0.66 M Formaldehyd geladen. Es lief bei 10 V/cm und wurde anschließend geblottet. 2.2.11.3 Southern Blot Analyse Das Agarosegel wurde zur Depurinierung 5 - 15 min in 0.25 N HCl geschwenkt. Das dann in Wasser geschwenkte Gel sollte anschließend für 15 min denaturiert und danach 15 min Material und Methoden 34 neutralisiert werden. Da für den folgenden Blotaufbau als Transferpuffer 20 x SSC verwendet wurde, wurde das Gel ebenfalls in 20 x SSC equilibriert. Die Membran (Duralon UV™, Stratagene, Heidelberg) wurde nach dem Benetzen mit Wasser ebenfalls in 20 x SSC getränkt. Der Blotaufbau erfolgte im Sandwich-System. Dieser Aufbau ermöglicht es, die DNA gleichzeitig auf zwei Filter zu transferieren. Das Gel wurde hierzu zwischen zwei Filter gelegt und diese wiederum mit Whatman 3 MM - Papier begrenzt. Um die Kapillarkraft zu unterstützen, wurde oben und unten eine Lage Zellstoff aufgebaut. Es wurde üN transferiert. Die DNA mußte anschließend mittels UV (120 mJ/cm2 mit UV Stratalinker 1800) mit der Membran verknüpft werden. 2.2.12 Northern Blot Analyse Nach Beendigung der Elektrophorese wurde das Gel 10 min in H2O dest. und anschließend in 10 x SSC zur Entfernung des Formaldehyds geschwenkt. Auf zwei Schalen wurde eine Platte als Brücke gelegt, auf die ein Stapel Zellstoff und darauf 3 Lagen 3MM-Papier gelegt wurden. Das obere Papier wurde mit 10 x SSC getränkt, wie auch die Membran, die zuvor mit H2O äquilibriert wurde. Auf die Membran wurde das Gel gelegt. Der Teil des 3MM–Papiers, der nicht mit der Membran und dem Gel in Kontakt trat, wurde mit Frischhaltefolie abgedeckt, um einen falschen Lauf des Transferpuffers zu verhindern. Auf das Gel wurde eine Brücke aus 2 Lagen in SSC getränktem 3MM-Papier gelegt, welche in die beiden Schalen, die mit 10 x SSC gefüllt waren, ragten und auf dem Gel auflagen. Darauf wurde eine Glasplatte gelegt und der Aufbau beschwert. Der Transfer erfolgte über Nacht. Um die RNA aus dem Gel auf die Membran zu transferieren, wurde die Kapillar- und Schwerkraft genutzt. Nach dem Blotvorgang wurde die Membran in 2 x SSC geschwenkt, um Salz auszuwaschen. Die RNA wurde anschließend durch UV-Licht an die Membran fixiert (120mJ/cm2 mit UV-Stratalinker) und die Positionen der 28S und 18S rRNA markiert. Material und Methoden 35 2.2.13 Markierung der Sonden 2.2.13.1 Sondenherstellung 30 µg Plasmid–DNA wurden mit den entsprechenden Restriktionsendonukleasen verdaut (s. 2.2.6) und mittels Gelelektrophorese aufgetrennt. Das Insert wurde entweder mittels Elektroelution oder mit dem Geneclean III-Kit (Dianova) aufgereinigt und anschließend die Konzentration des Inserts auf einem Gel im Vergleich zum Größenmarker abgeschätzt. 2.2.13.2 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen durch Elektroelution Diese Elutionsmethode wurde zur Isolation großer Fragmente eingesetzt. Die zu eluierende Gelbande wurde unter UV-Licht ausgeschnitten und mit einem geringen Vol 1 x TBE Puffer luftblasenfrei in einen Dialyseschlauch gegeben. Der Schlauch sollte in der Gelkammer so platziert werden, daß die DNA aus dem Gelstück in den Puffer im Dialyseschlauch innerhalb des elektrischen Feldes laufen kann. Vor der Entnahme des Dialyseschlauches wurden die Elektroden für 5-10 Sekunden umgepolt, um die DNA von der Wand des Schlauches zu lösen. Der flüssige Schlauchinhalt wurde in ein Eppendorftube überführt und zur Abtrennung von Agaroseresten 5 Min zentrifugiert. Nach einer P/C-Extraktion des Überstandes mit anschließender Fällung wurde die eluierte DNA in einem geeigneten Vol Wasser aufgenommen. 2.2.13.3 Isolation von DNA-Fragmenten aus Agarosegelen mit Geneclean III Kit Das ausgeschnittene Gelstück wurde bei dieser Methode in 0.5 Vol TBE-Modifizierer und 4.5 Vol NaJ-Lösung bei 55°C gelöst. 7 µl der mitgelieferten Glasmilch wurden zugegeben, gemischt und für 15 min bei RT inkubiert. Dadurch wurde es der DNA ermöglicht an die Silica- Matrix zu binden. Anschließend wurde diese 5 sec bei 15000 x g abzentrifugiert. Das Pellet wurde dreimal mit „New Wash“-Lösung gewaschen und zum Schluß in 20 µl H2O dest. aufgenommen und abzentrifugiert. Dabei erfolgte die Elution der DNA von der Silica-Matrix und der Überstand, der die DNA enthält, konnte in ein neues Reaktionsgefäß überführt werden. Material und Methoden 36 2.2.13.4 32P-Markierung von Sonden cDNA-Sonden wurden mittels „random priming“ radioaktiv markiert. Es wurden der rediprime II™, RandomPrime Labeling Kit oder der Mega Prime-Kit von Amersham verwendet. Das Prinzip des random priming 103 beruht darauf, daß Hexanukleotide verschiedenster Zusammensetzung mit dem zu markierenden DNA-Fragment hybridisieren und dem Klenow- Fragment der DNA-Polymerase I als Start dienen. Die Polymerase synthetisiert einen komplementären Strang, wobei radioaktiv markierte Nukleotide eingebaut werden, in diesem Fall das alpha32P dCTP. Hierzu wurden 50 ng DNA in einem Vol von 46 µl 5 min gekocht und damit denaturiert, d.h. die doppelsträngige DNA wurde in ihre Einzelstränge getrennt. Anschließend wurde das Pellet des rediprime-Kits, welches das Klenow-Fragment, Hexanukleotide, dATP, dTTP und dGTP enthält, darin resuspendiert; es wurden 4 µl alpha32P dCTP hinzugefügt und mindestens 10 min bei 37°C inkubiert. Analog dazu wurde auch der Mega Prime-Kit eingesetzt, wobei in diesem Fall alle Reaktionsbestandteile einzeln zusammengegeben wurden. Zur Quantifizierung der Markierungsreaktion, d. h. zur Messung der Menge an eingebautem radioaktivem Nukleotid, wurde 1 µl des Ansatzes auf einen Streifen Whatman DE81-Papier, welcher zwischen zwei Objektträgern (OT) eingeklemmt wurde, getropft und in eine Pufferwanne mit 0.5 M KH2PO4 gehängt. Freie Nukleotide wandern schneller als das zu markierende bzw. das markierte Fragment, daher kann man nach Trocknen des Streifens, diesen unter der Auftragsstelle trennen, oberen und unteren Abschnitt in ein Szintillationsröhrchen geben und die Zerfälle pro min (counts per minute, cpm) messen. Die Einbaurate sollte mindestens 30 % betragen und 1 Mio counts pro ml Hybridisierungslösung eingesetzt werden. Oligonukleotide wurden am 5'-Ende radioaktiv markiert, indem es durch die T4-Polynukleotidkinase phosphoryliert wird. Hierzu wurden 10 pmol eines Oligonukleotides mit 20 U der T4-Polynukleotidkinase am 5' Ende phosphoryliert. Material und Methoden 37 Reaktionsansatz: 10 pmol Oligonukleotid 5 µl des 10 x – Kinasepuffers 6µl gamma32PATP 20 U T4-Polynukleotidkinase Der Ansatz wurde 30 min bei 37°C inkubiert und durch Zugabe von 2 µl 0.5 M EDTA oder erhitzen auf 65°C für 5 min abgestoppt. Mittels Chroma-SpinTM-10 Columns (Clontech, Heidelberg) können die markierten Oligonukleotide von den freien Nukleotiden abgetrennt werden. 2.2.13.5 Hybridisierung mit cDNA-Sonden und Oligonukleotiden Hybridisierungen von Southern und Northern Blots mit cDNA-Sonden erfolgten nach Hersteller-Anleitung der verwendeten Membran (Stratagene, Heidelberg). Es wurde bei 42°C prä- und hybridisiert. Die Prähybridisierung erfolgte für mindestens 1 h und die Hybridisierung üN. Nach der Hybridisierung wurde die Membran stringent gewaschen, wobei mit 2 x SSC / 0.1 % SDS bei RT begonnen wurde und je nach Sonde und Stringenz die Salzkonzentration verringert oder die Temperatur erhöht wurde. Die feuchte Membran wurde in Frischhaltefolie eingeschlagen und üN in einer PhosphorImager-Kassette oder auf einem Röntgenfilm exponiert und ausgewertet (2.2.13.6). Bei der Hybridisierung mit Oligonukleotiden wurde ExpressHyb (Clontech, Heidelberg) eingesetzt. 2.2.13.6 Quantifizierung der Signale Die Signale konnten mit der ImageQuant-Software des Storm 860 (Molecular Dynamics, Freiburg) ausgewertet werden. Es wurde auf 18S rRNA normiert, um Ladungsunterschiede auszugleichen. Hierzu wurden die Werte der Hybridisierungen durch die der 18S-Werte geteilt. Die Kontrolle wurde 100 % gesetzt und alle Daten wurden als Mittelwert + SEM dargestellt. Die Gruppen (Minimum von n = 3) wurden statistisch mittels t-test oder Mann-Whitney Rank Sum Test miteinander verglichen und statistische Signifikanz wurde bei p < 0.05 akzeptiert. Entsprechend wurden auch die Signale bei der Western Blot Analyse ausgewertet Die Werte wurden auf das entsprechende GAPDH-Signal und die Ponceau S Färbung normiert (s.2.2.16.4). Material und Methoden 38 2.2.14 Screening von Bibliotheken Zum Screenen der Bibliotheken wurde nach den Angaben des Herstellers vorgegangen. Die Isolation der Cosmid-DNA wurde entsprechend einer Maxi-Präparation durchgeführt (s. 2.2.4.2). Die Aufreinigung der Lambda-DNA erfolgte nach einem vereinfachten Verfahren zur Isolation von Lamda-DNA aus flüssigem Lysat 100. 2.2.15 Sequenzierung nach Sanger mit ALF Zur Sequenzierung wurde der AutoReadTM Sequencing Kit von PharmaciaBiotech verwendet und der A.L.F. DNA Sequencer (Pharmacia LKB, Freiburg) hierfür eingesetzt. Das Prinzip dieser Sequenzierung 104 beruht auf dem Einsatz von Didesoxynukleotiden, die aufgrund der fehlenden 3' Hydroxylgruppe zur vorzeitigen Termination der DNA–Synthese führen. Einzelsträngige DNA dient als Matrize. Ein Primer mit freier 3'-OH-Gruppe ist komplementär zu einer kurzen Sequenz. Davon ausgehend synthetisiert eine DNA-Polymerase DNA-Stränge. Der Reaktionsansatz wird in vier Aliquots aufgeteilt. Zu jedem Aliquot wird ein Gemisch zugegeben, das Desoxynukleosidtriphosphate aller vier Basen (dNTPs) und, in einer geringen Konzentration, Didesoxytriphosphat (ddNTPs) von jeweils nur einer der vier Basen enthält. Den Didesoxytriphosphaten fehlt die 3'-OH-Gruppe. Sie werden von der DNA- Polymerase wie die Desoxynucleosidtriphosphate eingebaut, führen dann jedoch zum Kettenabbruch. In jedem Ansatz wird ein anderes ddNTP eingesetzt, so daß alle synthetisierten DNA-Fragmente im jeweiligen Ansatz mit der gleichen Base enden. Durch den statistisch verteilten Kettenabbruch entsteht ein Gemisch aus Fragmenten verschiedener Länge. Alle Fragmente haben das gleiche 5'-Ende, aber verschiedene 3'-Enden. 2.2.16 Proteinanalyse 2.2.16.1 Proteinisolation aus Zellen Die Zellen wurden für mind. 24 h serumfrei gesetzt und anschließend das Medium abgezogen, 5,7 µl PMSF (aus 1M Stammlösung) in 1 ml Überstand hinzugefügt und mit Ultrafree-4 Units aufkonzentriert. Material und Methoden 39 Zellen wurden mit PBS abgeschabt, bei 300 x g zentrifugiert, in Hepes-Puffer aufgenommen und mit einem Micropistill homogenisiert. Danach wurden die Proteine dreimal in Stickstoff schockgefroren und anschließend bei 37°C aufgetaut. Die Proteinmengen der einzelnen Proben wurden mit dem DC Protein Assay von Biorad bestimmt. 2.2.16.2 Western Blot Analyse 2.2.16.3 Proteingel Proteine werden durch das dem Polyacrylamidgel zugesetzte amphipatische SDS negativ geladen und bilden ein Protein-SDS-Komplex, dessen Gesamtladung der Größe des Proteinmoleküls proportional ist. Im elektrischen Feld des SDS-Polyacrylamidgels bewegen sich die Proteinkomplexe daher zur Anode hin. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Proteine ist proportional zum Logarithmus ihres Molekulargewichtes und wird durch die Konzentration des Polyacrylamids im Gel (Porengröße) und die angelegte Spannung bestimmt. Es wurden die 4-12 % Bis/Tris-Fertiggele der Firma Invitrogen BV verwendet. Die denaturierten Proben in Laemmli- Puffer liefen bei 200 V unter Verwendung des MES-SDS-Laufpuffers und wurden danach auf Nitrozellulosefilter per Naßblot transferiert. Zur Färbung der Western Blots wurde Ponceau S- Lösung verwendet. 2.2.16.4 Detektion des Western Blots Der Filter wurde 1 h bei RT mit TBS-T/2.5 % BSA (fettsäurefrei) geblockt und anschließend üN mit dem ersten Antikörper bei 4°C inkubiert; der Anti-IGF-II-Antikörper wurde über 2 Nächte bei 4°C inkubiert. Die verschiedenen Antikörper wurden folgendermaßen eingesetzt: Anti-alpha, gamma Aktin, monoklonal (HHF35) 1:300; Anti-GAPDH, monoklonal 1:3000; Anti-GFP, monoklonal 1:1000; Anti-IGF-II, monoklonal (S1F2) 1:1000 in TBS-T/2.5 % BSA. Danach wurde mehrmals mit TBS-T gewaschen. Als zweiter Antikörper wurde der Anti-Mouse Antikörper, gekoppelt mit HRP 1:10000 1 h bei RT eingesetzt oder 1:2500 in TBS-T/2.5 % BSA 15 min bei RT inkubiert. Material und Methoden 40 Zur Detektion der Proteine wurde der ECL-Kit von Amersham verwendet. Hierbei wird das Substrat (Luminol) durch die Peroxidase (HRP), welche an den zweiten Antikörper gekoppelt ist, unter alkalischen Bedingungen katalytisch oxidiert, wodurch eine Chemilumineszens bei einer Wellenlänge von ca. 428 nm entsteht. Diese kann man mit blaulicht-sensitiven Röntgenfilmen (Hyperfilm ECL, Amersham) detektieren. Der Filter konnte nach dem Strippen bei 50°C mehrmals verwendet werden. 2.2.17 Zellkultur Als Zellkultursystem wurden L6 (Skelettmuskelzellen aus der Ratte) eingesetzt. Sie wachsen als Monolayer und sind spindelförmig, können bei niedriger Zelldichte auch voluminöser und gedrungener sein. Als Medium wurde DMEM (4 mM L-Glutamin, 1.5 g/l Natriumbicarbonat, 4,5 g/l Glucose) mit 10 % FBS, 1 % Pen/Strep, 1 % Na-pyruvat und 1 % Non-Essential Aminoacids verwendet (Vollmedium). Die Zellen wurden bei 5 % CO2, 95 % Luftfeuchtigkeit und 37°C inkubiert. 2.2.17.1 Passagieren von Zellen und Ansetzen von Zellversuchen Die als Monolayer wachsenden L6 Zellen sollen im Zustand der Subkonfluenz, d. h. wenn die Zellen einen noch nicht ganz dichten Rasen bilden, passagiert werden. Bei 70 % iger Konfluenz wurden die Zellen daher 1:2 bis 1:20 verdünnt bzw. auf weitere Kulturschalen verteilt. Hierzu wurde den Zellen das Medium entzogen und mit PBS, das auf 37°C vorgewärmt war, gewaschen. Nach kurzzeitigem Benetzen der Zellen mit Trypsin und Inkubation von ca. 5-10 min im Brutschrank, kugeln sich die Zellen ab und können resuspendiert werden. Trypsin als proteolytisches Enzym spaltet die an der Zell-Zell-Bindung beteiligten Proteine, wodurch sich die Zellen von der Schale ablösen. Der Trypsinierungsvorgang wurde mit Vollmedium gestoppt und die Zellen entsprechend der gewünschten Verdünnung verteilt. 2.2.17.2 Zellzahlbestimmung Die Zellzahl wurde mit einer Neubauer-Zählkammer bestimmt. Hierzu müssen die Zellen abtrypsiniert und resuspendiert werden. 10 µl wurden hierzu eingesetzt. Alle 16 kleinen Quadrate Material und Methoden 41 wurden ausgezählt. Diese haben eine Fläche von 1mm2 und ein Vol von 0.1 µl, die Zellzahl pro ml erhält man durch Multiplikation des Mittelwertes mit 104. 2.2.17.3 Einfrieren und Auftauen von Zellen Zellen wurden abtrypsiniert und anschließend in FBS bzw. DMEM mit 10 % FBS aufgenommen. DMSO (mit Medium gemischt) soll langsam, d.h. tropfenweise bis zu einer Endkonzentration von 10 % zugegeben werden, um die Zellen vor Schaden beim Einfrieren und Auftauen zu bewahren, wobei DMSO die Kristallbildung und damit die Lyse der Zellen verhindert. Die Zellsuspension wurde bei -80°C und zur längeren Aufbewahrung in einem Stickstofftank gelagert. Zum Auftauen wurden die kältestabilen Röhrchen (Kryo-Röhrchen) aus dem Stickstofftank genommen und auf Eis gestellt. Für kurze Zeit ließ man sie in einem 37°C-Wasserbad vorsichtig auftauen. In einer Zellkulturflasche wurde vorgewärmtes Medium vorgelegt und die Zellen hinzugegeben. Um das noch verbliebene DMSO vollständig zu entfernen, erfolgte nach 24 h ein Mediumwechsel. 2.2.17.4 Ernte der Zellen Nach Beendigung des Versuches wurde den Zellen das Medium entnommen und mit 5 ml PBS gewaschen. Nach Zugabe von PBS sollen die Zellen dann mit dem Zellschaber möglichst rasch und gründlich vom Boden der Zellkulturflasche- bzw. schale abgelöst werden. Die resuspendierten Zellen wurden in Epppendorftubes überführt und sofort auf Eis gestellt. Das Zellpellet wurde bei 300 x g und 4°C für 5 min zentrifugiert, das überständige PBS verworfen und das Zellpellet bis zur weiteren Verwendung bei -80°C tiefgefroren. Analog dazu kann die Ernte auch mit Trizol (s. 2.2.10.4) erfolgen. 2.2.17.5 Transiente und stabile Transfektion Die Zellen wurden nach Anleitung der Firma Roche, Mannheim mittels FugeneTM6 transfiziert. Zur Selektion der transfizierten Zellen wurde Geniticin (G418) in einer Konzentration von 400 µg/ml eingesetzt. Daraus können Zellen vereinzelt und Klone weiterkultiviert werden. Material und Methoden 42 2.2.17.6 Auswertung der Morphologie der Zellen Die Zellen wurden mit einem inversen Fluoreszenzmikroskop (Leica) betrachtet und fotografiert. Die Bilder konnten mit dem NIH-Programm ausgewertet werden, wobei neben der Längs- und Querachse auch die Fläche der Zellen errechnet wurde. Die Ergebnisse wurden statistisch mit dem Mann-Whitney Rank Sum Test ausgewertet. 2.2.18 Transgene Mäuse Zur Herstellung der IGF-II transgenen Mäuse wurden C57BL/6 verwendet. Hierbei handelt es sich um einen Inzuchtstamm. Die Mäuse sind schwarz und haben ein Gewicht von 20-22/18-20 g (m/w). Die Weibchen tragen 18-21 Tage und der Wurfdurchschnitt liegt bei 5-7 Jungtieren. Die Firma Atugen (Berlin) führte die Mikroinjektion des Konstruktes durch (s. 3.3). 2.2.19 Stunning Protokoll Folgendes Protokoll der Okklusion / Reperfusion wurde, wie von Kluge 27 beschrieben, verwendet. Abb. 7: Stunning Protokoll. Es sind die Zeiträume für Okklusion (Occ) und Reperfusion (Rep) eingezeichnet. Zusätzlich ist die sham-Operation aufgeführt. Resultate 43 3 Resultate 3.1 Restriktionskarte des IGF-II-Gens des Schweins Um einen Überblick über die genomische Struktur des IGF-II beim Schwein zu bekommen, wurde eine Southern Blot Analyse durchgeführt. Dies ermöglichte es, eine grobe Karte des IGF-II-Gens des Schweins zu erstellen. Weiterhin waren Datenbankeinträge bei der Auswertung der Ergebnisse der Restriktions- und Southern Blot Analyse hilfreich. Es wurden die humane genomische Sequenz (Genbank Accession Nr. X03562 und L15440) und eine bekannte mRNA-Sequenz (Genbank Accession Nr. X56094) des Schweins zur Erstellung der Restriktionskarte des IGF-II-Gens beim Schwein hinzugezogen. Für die Southern Blot Analyse wurde genomische DNA des Schweins aus der Leber isoliert und mit Bam H I, Eco R I, Hind III, Kpn I, Pst I, Pvu II, Sac I, Xba I, Xho I und Not I restringiert. Anschließend wurde eine Southern Blot Hybridisierung mit einer cDNA-Sonde (IGF-II/0.46ES) durchgeführt. Bereiche, die homolog zu der verwendeten Sonde sind, ergeben in der Southern Blot Analyse ein Signal und ermöglichen die Erstellung einer Restriktionskarte für den hybridisierten Bereich (Abb. 8; die sich daraus ergebende genomische Struktur ist in Abb. 16 zu finden). 3.1.1 Subklone des IGF-II-Genes beim Schwein Neben der Restriktionsanalyse wurden auch eine Cosmid-Bibliothek und eine Lambda-Bibliothek gescreent. Zusätzlich wurde mittels genomischer PCR versucht, verschiedene Bereiche des IGF-II-Genes zu amplifizieren. Jeder dieser Methoden lag die Annahme zugrunde, daß die Sequenz des Schweine-IGF-II stark homolog zu der des Menschen ist. Dies war in den Tatsache begründet, daß die Sequenzen zwischen Mensch (Genbank Accession Nr. X03562 und L15440), Maus (Genbank Accession Nr. U71085) und Ratte (Genbank Accession Nr. X02213) auch sehr konserviert sind. Beim Schwein ist eine mRNA (Genbank Accession Nr. X56094) beschrieben, die als Referenz bei der Oligonukleotidsuche herangezogen wurde. Resultate 44 Abb. 8: Southern Blot Analyse des IGF-II des Schweines. 10 µg Genomische DNA wurden mit Bam H I, Eco R I, Hind III, Kpn I, Pst I, Pvu II, Sac I, Xba I, Xho I und Not I verdaut und elektrophoretisch aufgetrennt. Es wurde ein Southern Blot durchgeführt, wobei die DNA zuerst depuriniert, dann denaturiert und schließlich neutralisiert wurde. Sie wurde mittels Kapillarblot auf eine Nylonmembran transferiert. Die Hybridisierung wurde mit IGF-II/0.46ES durchgeführt. Spur 1: unverdaut, Spur 2: Bam H I; Spur 3: Eco R I; Spur 4: Bam H I und Eco R I; Spur 5: Hind III; Spur 6: Kpn I; Spur 7: Hind III und Kpn I; Spur 8: Pvu II; Spur 9: Sac I; Spur 10: Pvu II und Sac I; Spur 11: Xba I; Spur 12: Xho I; Spur 13: Xba I und Xho I; Spur 14: Pst I; Spur 15: Not I; Spur 16: Pst I und Not I, Spur 17:Sac I und Bam H I, Spur 18: Kpn I und Sac I, Spur 19: Eco R I und Sac I. Es wurde die Cosmid-Bibliothek und die Lambda-Bibliothek mittels radioaktiv markierter Sonde gescreent. Hierbei wurden verschiedene Sonden verwendet: Promotor-Sonden (P1, P2, P3 und P4) und eine zum kodierenden Bereich homologe Sonde (IGF-II/0.46 ES). Positive Klone wurden teilweise subkloniert und sequenziert. Mit genomischer PCR konnten auch Sequenzen aus dem 5' Bereich und dem 3' Bereich amplifiziert werden. Verschiedene Klone mit Homologien zur Insulin / IGF-Familie wurden isoliert. Es handelte sich hierbei um Sequenzen, die in der Genbank wie folgt bezeichnet waren: FSH genomische DNA humanes Chromosom 11 humanes IGF-II, Exon 5 humanes IGF-II, Exon 6 Resultate 45 humanes IGF-II, 3' Region/Exon 7 humanes IGF-II, 5' Region (wurde auch als Sonde für Southern Blot Analyse eingesetzt) humanes IGF-II, Exon 9 humanes IGF-II, 3' von Exon 1 humanes pre - pro - IGF-I, Ib Exon 4 Ovalbumin Ratten IGF-II, 5' von Exon 1 Ratten IGF-II, Exon 1 Relaxin Schweine leydig Insulin - like hormon Schweine SINE Schweine zentromerspezifische Repeats Schweine-Mikrosatelliten Aus diesen Klonen, verglichen dem humanen IGF-II-Gen und der Schweine mRNA (s.3.2), konnte die grobe Struktur des porcinen IGF-II-Gens ermittelt werden (Abb. 16). Ein durch PCR erzielter Klon der 5' - Region (s. o. humanes IGF-II, 5' Region) läßt die Aussage zu, daß auch das porcine IGF-II ein Exon besitzt, das Homologie zu Exon 1 des humanen IGF-II- Genes hat. Mit diesem Klon wurde auch eine Southern Blot Analyse (Abb. 9) durchgeführt. Die Sonde hybridisierte sowohl mit der restringierten genomischen DNA des Menschen als auch mit der des Schweins. Auch die genomische DNA der Maus ergab ein Signal, obwohl bei der Maus nur Pseudoexons dieser Region beschrieben sind. Es können aufgrund des Southern Blots (Abb. 9) Restriktionsschnittstellen für Eco R I und Pst I zugeordnet werden. Weiterhin kann man aufgrund des Nachweises dieser Region beim porcinen IGF-II davon ausgehen, daß es wie beim Menschen ein Exon 1 und damit auch den Promotor P1 besitzt. Zusätzlich bestätigen Ergebnisse der Northern Blot Analyse diese Schlußfolgerung (s. 3.2.1). Resultate 46 Abb. 9: Southern Blot Analyse der Exon 1 Region des IGF-II. 10 µg Genomische DNA von Mensch, Schwein, Kaninchen und Maus wurden mit Eco R I und Pst I verdaut und elektrophoretisch aufgetrennt. Es wurde eine Southern Blot Analyse durchgeführt und mit der porcinen Sonde gegen Exon 1 (Klon: humanes IGF-II, 5' Region, s.o.) hybridisiert. Spur 1-4: Eco R I; Spur 5-8: Pst I; Spur 1, 5: Mensch; Spur 2, 6: Schwein; Spur 3, 7: Kaninchen; Spur 4, 8: Maus. 3.2 Promotor-Aktivitäten des porcinen IGF-II-Gens 3.2.1 Northern Blot Analyse als indirekter Nachweis der Promotor-Aktivitäten Ein Ziel der Arbeit war es, eine Aussage über die Verwendung der Promotoren des porcinen IGF-II zu treffen. Man kann davon ausgehen, daß die sechs unterschiedlichen mRNAs des porcinen IGF-II wie beim Menschen alternativ gespleißt und durch verschiedene Promotoren generiert werden. Der Einsatz der Promotoren wurde indirekt nachgewiesen. Hierzu wurden verschiedene IGF-II-Sonden (Abb. 10) eingesetzt, die für die unterschiedlichen mRNAs spezifisch sind. Oligonukleotide wurden so gewählt, daß sie im Vergleich mit der Struktur des humanen IGF-II im 5' Bereich einer mRNA lokalisiert sind, d.h. 3' des entsprechenden Promotors. Indirekt, d h. über die Transkription einer mRNA ist es im Vergleich mit der Transkription des humanen IGF-II möglich, zu klären, welcher Promotor eine entsprechende mRNA des porcinen Resultate 47 IGF-II generiert. Analog zum Screenen der Bibliotheken lag bei der folgenden Analyse die Annahme zugrunde, daß eine ähnliche Struktur des IGF-II-Genes beim Schwein und beim Menschen vorliegt. cDNA-Sonden und Oligonukleotide homolog zur menschlichen Sequenz (Genbank Accession Nr. X03562 und L15440) und zu der bekannten mRNA des Schweines (Genbank Accession Nr. X56094) wurden für die Hybridisierungen ausgewählt. Die hierzu ausgewählten Sonden in Form von cDNA oder Oligonukleotiden sind in Abb. 10 aufgeführt. Abb. 10: Lage der verschiedenen cDNA-Sonden und Oligonukleotide. Es ist die Struktur des humanen IGF-II-Gens dargestellt und die Lage der verschiedenen cDNA-Sonden sowie der verwendeten Oligonukleotide eingezeichnet. Weiterhin ist bei den Oligonukleotiden die Orientierung mit einem Pfeil verdeutlicht, um Sense- und Antisense-Oligonukleotide zu unterscheiden. Sterne kennzeichnen die Polyadenylierungsstellen; P entspricht Promotor. Resultate 48 3.2.1.1 Promotor P1 generiert eine 6.0 kb mRNA Es wurde die humane cDNA-Sonde IGF-II/P1, welche homolog zu der 5' UTR der humanen 5.3 kb mRNA ist und Exon 1 und Exon 2 enthält, in der Northern Blot Hybridisierung verwendet. Beim Menschen ist der Promotor P1 für eine mRNA von 5.3 kb verantwortlich, die aus den Exons 1, 2, 3, 7, 8 und 9 besteht. Im Schwein konnten bei der Northern Blot Hybridisierung drei mRNAs mit den Größen 6.0, 4.8 und 1.2 kb detektiert werden. Zusätzlich wurde die Existenz der mRNAs unter Verwendung eines Antisense-Oligonukleotides (#119), welches in Exon 1 liegt, überprüft. Es konnten die gleichen Signale wie bei der Hybridisierung mit der cDNA-Sonde detektiert werden (Abb. 11). Abb. 11: Northern Blot Analyse des Promotors P1. 15 µg Gesamt-RNA wurde elektrophoretisch aufgetrennt und auf eine Nylonmembran transferiert. C: Kontrolle, E: Experiment, das Protokoll der zugehörigen Versuche ist im Stunning Protokoll beschrieben (s. 2.2.19). Es wurde mit der cDNA-Sonde P1 (A) und mit dem Antisense-Oligonukleotid #119 (B) hybridisiert. Resultate 49 Aus den Hybridisierungsergebnissen des Northern Blots kann man schließen, daß drei unterschiedlich große mRNAs, darunter eine 6.0 kb mRNA, von einem gemeinsamen Promotor generiert werden, der dem humanen Promotor P1 homolog ist. 3.2.1.2 Zwei mRNAs werden ausgehend von Promotor P2 transkribiert Zwei deutliche Banden mit den Größen 4.8 und 0.8 kb wurden mit der humanen cDNA-Sonde IGF-II/P2, die gegen das humane Exon 4 gerichtet ist, detektiert. Abb. 12: Northern Blot Analyse des Promotors P2. Der Northern Blot aus Abb. 11 wurde mit cDNA-Sonde P2 (A) und Antisense-Oligonukleotid #155 aus Exon 4 (B) hybridisiert. Beim Menschen wird von Promotor P2 aus eine mRNA von 5 kb transkribiert, die aus Exon 4, 7, 8 und 9 besteht. Zusätzliche Hybridisierung mit einem Antisense-Oligonukleotid (#155) aus dem gleichen Exon ergab mehrere mRNAs (6.0, 2.2, 1.9, 1.7 und 1.2 kb), darunter auch eine 6.0 kb Resultate 50 mRNA; bei der 6.0 kb mRNA könnte es sich um eine Vorläufer-mRNA handeln, die noch nicht vollständig gespleißt ist. Die kürzeren mRNAs könnten durch Einsatz unterschiedlicher Polyadenylierungssignale, wie es auch beim Menschen der Fall ist, entstehen. Weiterhin ist eine Kreuzhybridisierung mit bisher unbekannten Sequenzen nicht auszuschließen (Abb. 12). 3.2.1.3 Promotor P3 ist verantwortlich für eine 4.8 kb mRNA Beim Menschen generiert der Promotor P3 zwei unterschiedlich große mRNAs von 6.0 und 2.2 kb. Zum Nachweis der Verwendung des Promotors P3 beim Schwein wurde eine humane cDNA-Sonde (IGF-II/P3) verwendet, die in Exon 5 liegt. Diese cDNA–Sonde gegen Exon 5 ergab jedoch kein Signal. Mit einem Antisense-Oligonukleotid (#156) gegen das humane Exon 5 konnte beim Schwein eine einzelne Bande bei 4.8 kb detektiert werden (Abb. 13). Abb. 13: Hybridisierung mit Antisense-Oligonukleotid gegen Exon 5. Der gleiche Northern Blot wie in Abb. 11 wurde mit dem Antisense-Oligonukleotid #156 hybridisiert. Das Oligonukleotid ist zu Exon 5 homolog. Es wurde eine mRNA von 4.8 kb detektiert. Es kann davon ausgegangen werden, daß Promotor P3 für die Transkription einer mRNA von 4.8 kb verantwortlich ist, da das verwendete Antisense-Oligonukleotid homolog zum humanen Exon 5 des IGF-II ist und dieses in der mRNA enthalten ist, die beim Menschen von Promotor P3 generiert wird. Dennoch war es nicht möglich, ein Signal mit der cDNA-Sonde (IGF-II/P3) zu Resultate 51 erzielen, was die Frage offenläßt, in wieweit der zuständige Promotor des Schweins dem humanen Promotor P3 homolog ist. 3.2.1.4 Vier mRNAs werden bei Einsatz des Promotors P4 transkribiert Der Promotor P4 ist beim Menschen für eine mRNA von 4.8 kb verantwortlich. Beim Schwein wurde mit einer humanen cDNA-Sonde gegen Exon 6 (IGF-II/P4), welches 3' des Promotors P4 liegt, eine 2.2 kb mRNA detektiert. Schwächere Banden bei 5.3, 4.4, 2.8 und 1.2 kb waren ebenfalls vorhanden. Bei der Hybridisierung mit einem Antisense-Oligonukleotid (#157), das ebenfalls in Exon 6 liegt, gab es kein Signal (Abb. 14). Abb. 14: Einsatz des Promotor P4 wurde mittels Northern Blot Analyse untersucht. Hybridisierung mit der cDNA-Sonde P4 wurde mit dem obigen Blot (Abb. 11) durchgeführt. Wie auch im Fall des Promotors P2, welcher mehrere mRNAs generiert, könnte es sich bei der 5.3 kb mRNA um eine unvollständig gespleißte Vorläufer-mRNA handeln. Die kleineren mRNAs könnten durch Verwendung verschiedener Polyadenylierungssignale entstehen. 3.2.1.5 In zwei mRNAs kann die 3' UTR Region detektiert werden Beim Menschen ist eine mRNA von 1.8 kb beschrieben, die aus der 3' UTR besteht. Die Hybridisierung mit einem Antisense-Oligonukleotid aus der 3' UTR des Exon 9 (#93) ergab beim Resultate 52 Schwein zwei Signale bei 1.9 und 1.2 kb (Abb. 15). Daher kann man beim Schwein davon ausgehen, daß die 3' UTR in zwei unterschiedlich großen mRNAs enthalten ist. Abb. 15: Analyse der 3' UTR mittels Northern Blot Hybridisierung. Das Antisense- Oligonukleotid #93, welches in der 3' UTR liegt, wurde zur Hybridisierung verwendet. Abb. 16: Struktur des porcinen IGF-II verglichen mit dem humanen Gen. Schematisch dargestellt ist die genomische Organisation des humanen und des Schweine-IGF-II-Gens, welche aus der genomischen Sequenz des Menschen und der mRNA des Schweins abgeleitet wurde. Hinzugezogen wurden die Ergebnisse aus den Sequenzierungen der unterschiedlichen Subklone und der Southern Blot Hybridisierungen. Beim Schwein sind Exon 1 und Exon 2 verknüpft. Die Existenz des Promotors P3 beim Schwein ist noch unklar, da Exon 4 nur mit einem Oligonukleotid nachgewiesen werden konnte. Neben den 9 Exons im humanen Gen sind die vier zugehörigen Promotoren (P) und die beiden Polyadenylierungsstellen(*) in Exon 9 eingezeichnet. Mögliche Zusammensetzung der alternativ gespleißten mRNAs beider Spezies sind aufgeführt. Weiterhin sind die Restriktionsschnittstellen für Bam H I (B), Eco R I (E), Pst I (P), Pvu II (Pv) und Sac I (S) innerhalb des porcinen IGF-II-Gens gekennzeichnet. Resultate 53 Resultate 54 3.2.1.6 Struktur des porcinen IGF-II-Genes Aus den Ergebnissen der Southern Blot Analyse, der Northern Blot Hybridisierung und den Sequenzen der Subklone im Vergleich zu den schon bekannten Sequenzen wurde folgende Karte des porcinen IGF-II-Gens erstellt (Abb. 16). Die Struktur des porcinen IGF-II-Genes ist dem des Menschen ähnlich und es enthält einen Promotor P1, der neben dem Promotor P2 für die Transkription einer 6.0 kb mRNA verantwortlich ist. Da der Einsatz des Promotors P3 nur mit einem Antisense-Oligonukleotid nachgewiesen werden konnte, ist es nicht klar, ob das porcine IGF-II einen homologen Promotor besitzt. Weiterhin kann man aus Vergleichen der Subklone schließen, daß Exon 1 und 2 nicht durch ein Intron getrennt ist. Weiterhin konnten die Restriktionsschnittstellen für Bam H I, Eco R I, Pst I, Pvu II und Sac I innerhalb des porcinen IGF-II-Gens im Bereich des Exon 1 und in der kodi