Immunhistochemischer Nachweis des muskarinischen Acetylcholinrezeptors M2 im Magen-Darm-Trakt der Maus Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Vorgelegt von Markus Leimbach aus Dortmund Gießen, 2013 Aus dem Institut für Anatomie und Zellbiologie des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Geschäftsführender Direktor: Herr Prof. Wolfgang Kummer 1. Gutachter: Prof. Dr. W. Kummer 2. Gutachter: PD Dr. M. Roderfeld Tag der Disputation: 28.04.2014 Meinen Eltern I Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung ................................................................................................................. 1 1.1 Histologischer Aufbau des Verdauungstraktes.................................................... 1 1.1.1 Ösophagus .................................................................................................. 3 1.1.2 Magen ......................................................................................................... 3 1.1.3 Dünndarm .................................................................................................... 4 1.1.4 Dickdarm ..................................................................................................... 5 1.2 Das cholinerge System ....................................................................................... 6 1.2.1 Funktion des Acetylcholins im Verdauungstrakt ........................................... 6 1.3 Muskarinische Rezeptoren ................................................................................. 8 1.3.1 Einteilung und Aufbau von muskarinischen Rezeptoren ................................... 8 1.3.2 Vorkommen & Wirkung muskarinischer Rezeptoren im Verdauungstrakt..... 9 1.4 Fragestellung .....................................................................................................13 2. Material und Methoden ............................................................................................15 2.1 Material .............................................................................................................15 2.1.1 Versuchstiere ..............................................................................................15 2.1.2 Primärantikörper ..................................................................................................... 15 2.1.3 Sekundärreagenzien ...................................................................................16 2.1.4 Chemikalien ................................................................................................16 2.1.5 verwendete Lösungen ................................................................................17 2.2 Methoden ..........................................................................................................18 2.2.1 Gewebegewinnung .....................................................................................18 2.2.2 Gewebeaufarbeitung ..................................................................................19 2.2.3 Immunhistochemie ......................................................................................19 2.2.4 Auswertung .................................................................................................21 2.3. Statistik ............................................................................................................ 21 3. Ergebnisse ............................................................................................................. 22 3.1 Makroskopische Befunde ................................................................................. 22 3.1.1 makroskopisches Erscheinungsbild des Magens bei M2R-Gendefizienz ... 22 3.1.2 statistische Analyse auf Unterschiede der Magen- und Körpergewichte .... 23 3.2 Immunhistochemische Befunde ........................................................................ 30 3.2.1 Ösophagus ................................................................................................ 30 3.2.2 Fundus gastricus ....................................................................................... 37 3.2.3 Pylorus....................................................................................................... 43 3.2.4-3.2.6 Duodenum, Jejunum, Ileum .............................................................. 48 3.2.4 Duodenum ................................................................................................. 49 II 3.2.5 Jejunum ..................................................................................................... 52 3.2.6 Ileum .......................................................................................................... 57 3.2.7 Caecum ..................................................................................................... 63 3.2.8 Colon descendens ..................................................................................... 68 4. Diskussion .............................................................................................................. 74 4.1 Verteilung und Bedeutung des M2R in der Tunica muscularis .......................... 75 4.2 Verteilung und Bedeutung des M2R in der Tela submucosa............................. 77 4.3 Verteilung und Bedeutung des M2R in der Tunica mucosa .............................. 78 4.3.1 Lamina muscularis mucosae ...................................................................... 78 4.3.2 Lamina propria mucosae ........................................................................... 80 4.4 Gemeinsamkeiten und Unterschiede im Verteilungsmuster in den einzelnen Organabschnitten ................................................................................................... 82 4.5 Magenvergrößerung bei M2R-Gendefizienz ..................................................... 83 5. Zusammenfassung ................................................................................................. 86 6. Summary ................................................................................................................ 87 7. Literatur .................................................................................................................. 88 Abbildungsverzeichnis .............................................................................................. 101 Danksagung ............................................................................................................ 104 Publikationen ............................................................................................................ 105 Erklärung zur Dissertation. ....................................................................................... 106 1 1. Einleitung 1.1 Histologischer Aufbau des Verdauungstraktes Dem Wandaufbau des Verdauungstraktes liegt ein einheitlicher Aufbau zugrunde. Je nach vorrangiger Funktion wie Transport, Sekretion oder Resorption bestehen lokale Unterschiede in den einzelnen Abschnitten. Charakteristisch sind, in der Schichtenfolge von innen nach außen aufgelistet, die Tunica mucosa, die Tela submucosa, die Tunica muscularis und die Tunica adventitia bzw. Tunica serosa. Die Tunica mucosa weist die größten regionalen Unterschiede auf. Sie besteht aus drei Anteilen. Innen liegt die Lamina epithelialis mucosae, welche als Barriere dient, zusätzlich regional aber spezifische Aufgaben besitzt und deren Epithelauskleidung sich aus diesem Grund den einzelnen Organabschnitten angepasst hat. Daran schließt sich die Lamina propria mucosae an, welche hauptsächlich aus lockerem Bindegewebe besteht. Darin kommen zahlreiche freie Zellen, wie z.B. Lymphozyten, Granulozyten und Makrophagen vor. Ferner verlaufen dort die terminalen Verzweigungen der Blut- und Lymphkapillaren. Daran schließt sich eine aus glatten Muskelzellen bestehende Lamina muscularis mucosae an. Sie vermittelt der Tunica mucosa eine lokalisierte Eigenbeweglichkeit und ist in ihrem Ausbildungsgrad von Abschnitt zu Abschnitt des Magen-Darm-Kanals unterschiedlich ausgeprägt. An die Tunica mucosa mit ihren Unterabteilungen schließt sich die Tela submucosa an. Sie besteht aus lockerem kollagenem Bindegewebe. In ihr verlaufen die größeren Blut- und Lymphgefäße. Sie dient als Verschiebeschicht für die Schleimhaut. Außerdem liegt ein Nervengeflecht in ihr, der Plexus submucosus oder auch Meissner-Plexus. Er bildet zusammen mit dem Plexus myentericus (Auerbach-Plexus) das enterische Nervensystem, welches die Motilität der Muskulatur sowie die Sekretion der in der Mukosa gelegenen Drüsen des Gastrointestinaltraktes steuert. Das enterische Nervensystem besteht in seiner Gesamtheit aus einer Vielzahl von unterschiedlichen Neuronenarten (motorisch, sensorisch, Interneurone), welche ebenfalls durch verschiedene Neurotransmitter aktiviert oder inhibiert werden können (Costa et al. 1996, Timmermanns et al. 1997, Qu et al. 2008). Zusätzlich dienen noch interstitielle Zellen von Cajal (ICC) als Schrittmacher und Vermittler zwischen dem enterischen Nervensystem und der Muskulatur (Takayama et al. 2002, Sanders und Ward 2006, Olsson und Holgren 2011). Die ICC sind durch gap junctions miteinander verbunden und bilden auf diese Weise ein koordiniertes Netzwerk. Auf der einen Seite liegen sie 2 direkt an den Varikositäten der intramuralen Neurone, auf der anderen Seite sind sie über gap junctions mit glatten Muskelzellen verbunden (Rumessen et al. 1982, Komuro 2006). Diese funktionale Einheit ermöglicht rhythmische Kontraktionen und Relaxationen. Die ICC können aufgrund ihrer Zugehörigkeit zu den verschiedenen Nervenplexus und ihrer Lage zwischen den Muskelzellen unterteilt werden: zum einem in die ICC des Plexus myentericus (ICC-MP), welche slow-waves Kontraktion generieren, des Weiteren in die ICC innerhalb der zirkulären Muskelschicht (ICC-CM) und der longitudinalen Muskelschicht (ICC-LM), häufig zusammengefasst als intramuskuläre ICC (ICC-IM). Außerdem existieren noch ICC innerhalb des tiefen muskulären Plexus (deep muscular plexus ICC-DMP), der zwischen der inneren und äußeren Ringmuskelschicht liegt. Zusätzlich kommen sie noch in der Submukosa (ICC- SM) und der Subserosa (ICC-SS) vor. Während sie im Darm eher einheitlich verteilt sind, bestehen im Magen regionale Unterschiede im Verteilungsmuster der ICC, wo insbesondere die ICC-CM und die ICC-LM deutlich ausgeprägt sind, während die ICC- MP geringer vorkommen (Komuro 2006). Die Tunica muscularis besteht mit Ausnahme der oberen zwei Drittel des Ösophagus aus glatter Muskulatur, welche in 2 Schichten gegliedert ist, das Stratum circulare (innere Ringmuskelschicht) und das Stratum longitudinale (äußere Längsmuskelschicht). Sie dient der Durchmischung der Nahrung und der Weiterbeförderung des Darminhaltes. Zwischen diesen beiden Schichten liegt in einer Bindegewebszone, der o.g. Plexus myentericus, welcher die Tunica muscularis innerviert. Ein Großteil der Abschnitte des Verdauungstraktes ist zur Bauchfellhöhle hin durch ein zur Tunica serosa zugehöriges einschichtiges Plattenepithel (Mesothel) bedeckt, das wiederum auf einer dünnen Bindegewebsschicht, der Lamina propria serosae, liegt. An extraperitoneal (Ösophagus und Rektum) und retroperitoneal gelegenen (Duodenum, Teile des Kolon) Abschnitten wird die Serosa durch eine aus lockerem Bindegewebe bestehende Tunica adventitia ersetzt. 3 1.1.1 Ösophagus Die Speiseröhre, der Ösophagus, ist ein beim Menschen ca. 25 cm langer Muskelschlauch und dient der Nahrungsbeförderung vom Pharynx in den Magen. Er lässt sich in drei wesentliche Abschnitte unterteilen: einen kurzen Halsteil, den Pars cervicalis, einen Brustteil, Pars thoracalis, welcher auch der längste Abschnitt ist, und dem Bauchteil, Pars abdominalis. Er ist grundsätzlich nach dem Bauplan des Verdauungstraktes aufgebaut. Die Lamina epithelialis mucosae besteht aus einem mehrschichtigen, unverhornten Plattenepithel. Darunter schließt sich eine dünnschichtige Lamina mucularis mucosae an (Berdanier 2004). Die Tunica muscularis besteht aus einer äußeren Längs- und einer inneren Ringschicht, welche in der Adventitia beginnen und das Lumen schlingenartig umgreifen (Kaufmann et al. 1968). Sie besteht bei der Maus nur aus quergestreifter Muskulatur, während beim Menschen nur im oralen Abschnitt Skelettmuskulatur vorkommt und im Verlauf nach aboral durch glatte Muskulatur ersetzt wird (Green et al. 1966, Kaufmann et al. 1968) Die Blutversorgung erfolgt über ein adventitielles Arteriennetz, welches über ausgedehnte Anastomosen parallel zu den auf- und absteigenden Muskelbündeln zieht (Günther und Lierse 1968). 1.1.2 Magen Der Magen des Menschen wird prinzipiell in vier Abschnitte unterteilt, den Mageneingang (Pars cardiaca), den Magenfundus (Fundus gastricus), den Magenkörper (Corpus gastricum) und den Magenausgang (Pars pylorica). Bei der Maus wird der Magen in 2 Regionen unterteilt. Zum einen in einen drüsenlosen, kutanen Vormagen sowie in einen Drüsenmagen, der in eine kleine Cardia-, eine große Fundus- und eine Pylorusregion unterteilt werden kann (Green et al. 1966, Treuting et al. 2012). Der Magen dient als Zwischenspeicher für die aufgenommene Nahrung, aber der Nahrungsbrei (Chymus) wird dort auch mechanisch und chemisch aufbereitet und partiell verdaut. Aufgrund dieser funktionalen Unterschiede existieren zwischen den einzelnen Magenabschnitten Besonderheiten im Wandaufbau. Während das Oberflächenepithel beim Menschen in allen Magenregionen einheitlich einschichtig hochprismatisch aufgebaut ist, besteht es bei der Maus im Vormagen aus einem mehrschichtigen Plattenepithel und wechselt ab einer erhabenen Begrenzungslinie, welche aus verdickter Lamina propria des Vormagens besteht, in den Drüsenmagen. 4 Dort enthalten die apikal gelegenen Zellhälften Schleimgranula, welche die Schleimhaut vor Andauung durch den Magensaft schützt. Die in der Lamina propria muscosae gelegenen Magendrüsen sind in den einzelnen Abschnitten unterschiedlich aufgebaut. Beim Menschen sind die Kardiadrüsen (Glandulae cardiacae), die Hauptdrüsen im Fundus und Corpus ventriculi (Glandulae gastricae propriae) und die Pylorusdrüsen (Glandulae pyloricae) zu unterscheiden. Die Kardiadrüsen liegen am Mageneingang im Übergang zum Ösophagus und sind muköse Drüsen, welche für eine Schleimbarriere zwischen dem sauren Magenmilieu und dem Ösophagus sorgen. Die Drüsen im Corpus und Fundus ventriculi sind wenig verzweigte tubulöse Drüsen, die bis zur Lamina muscularis mucosae reichen. In der Wand der Drüsenschläuche kommen unterschiedliche Zelltypen vor, welche in charakteristischer Weise auf die verschiedenen Drüsenabschnitten verteilt sind. Im Isthmus liegen die Nebenzellen, welche Muzin produzieren, im Halsteil (Cervix) die für die Salzsäureproduktion benötigten Belegzellen und im Hauptteil (Pars principalis) neben den o.g. Belegzellen viele Hauptzellen, welche Pepsinogene und eine Magenlipase synthetisieren und sezernieren. Die Glandulae pyloricae sind wiederum stärker verzweigt und reichen tiefer in die Lamina propria hinein. Sie unterscheiden sich histologisch und funktionell nicht wesentlich von den Kardiadrüsen. Die Magendrüsen beginnen bei der Maus erst im Fundus und bestehen dort ebenfalls hautsächlich aus Haupt-, Neben- und Belegzellen. Den Abschluss der Magenschleimhaut bildet eine gut ausgeprägte Lamina muscularis mucosae. Daran schließt sich eine gefäßreiche Tela submucosa an. Die Tunica muscularis ist im Magen aufgrund seiner Funktion zur Vermischung des Chymus mit Enzymen und Säuren sowie des Weitertransportes in den Dünndarm besonders deutlich ausgeprägt. Zusätzlich zu den Strata circulare und longitudinale existiert im Magen eine weitere, schräg verlaufende Muskelschicht, die Fibrae obliquae. Diese liegt als dünne Muskelschicht zwischen der Tela submucosa und dem Stratum circulare, welches am prominentsten ausgeprägt ist (Treuting et al. 2012). 1.1.3 Dünndarm Nachdem der Chymus den Pylorus passiert hat, erreicht er den Dünndarm, welcher sich in drei Abschnitte gliedert: Duodenum (Zwölffingerdarm), Jejunum (Leerdarm) und Ileum (Krummdarm). Die Oberfläche der Schleimhaut wird durch Falten, Zotten und Mikrovilli stark vergrößert und durch Ringfalten (Plicae circulares, Kerckring-Falten) aufgeworfen. An ihrer Bildung sind die Mukosa und die Submukosa beteiligt, die Tunica muscularis jedoch nicht. Die Ringfalten sind im Duodenum am höchsten und 5 flachen dann nach aboral deutlich ab. Die Zotten (Villi intestinales) sind blatt- bis fingerförmige Erhebungen der Mukosa, zwischen deren Basen zahlreiche Krypten (Glandulae intestinales, Lieberkühn-Krypten) münden. Die Krypten reichen bis zur Lamina muscularis mucosae und sind Ort der Zellerneuerung. Die Villi intestinales sind von einem hochprismatischen Epithel überzogen. Die Hauptaufgabe des Epithels ist die Resorption. Als Gerüst für das Zottenstroma dient ein engmaschiges Gefäßsystem. Dieses reicht direkt bis unter das Epithel (Abbas et al. 1989). Die Endothelzellen direkt unterhalb des Epithels bestehen aus einer dünnen und einer dicken Region. Der dünne Teil liegt zum Epithel hin und ist fenestriert, während der dickere Anteil den Nucleus beinhaltet und zentral im Villus liegt. Das Kapillarnetz dient dem Abtransport von durch das Epithel resorbierten Molekülen. Es gelangt über eine zentral gelegene Venole in einem mukösen und submukösen Venenplexus. Ebenfalls zentral im Villus liegt ein Lymphgefäß, über welches aus dem Interstitium gesammelte Lymphe über submuköse Lymphbahnen abfließt. Parallel zur Längsachse der Zotten verlaufen glatte Muskelzellen, welche von der Lamina muscularis mucosae bis zur Zottenspitze ziehen. Diese Muskelzellen können während der Resorption rhythmische Kontraktionen ausführen. Durch diese „Pumpbewegungen“ wird einerseits der Blut- und Lymphabfluss gefördert, andererseits kommt das Zottenepithel mit neuem, resorptionsfähigem Material in Berührung. Das Dünndarmepithel ist ein einschichtiges hochprismatisches Epithel und besteht zu einem Grossteil aus Enterozyten. Der luminale Zellanteil wird durch Mikrovilli vergrößert. Zwischen den Enterozyten liegen schleimbildende Drüsenzellen, die Becherzellen. Diese produzieren als Gleitfilm für den Chymus Muzine. Die Anzahl der Becherzellen nimmt vom Duodenum in Richtung Ileum kontinuierlich zu. Das Duodenum unterscheidet sich durch das Vorkommen von Brunner Drüsen (Glandulae submucosae) von den anderen Dünndarmabschnitten. 1.1.4 Dickdarm Die Hauptfunktion des Dickdarmes ist die Resorption von Wasser und Elektrolyten und damit die Eindickung des Darminhaltes. Gleichzeitig erfolgt die Sekretion von Schleim (Muzine). Er gliedert sich in Caecum (Blinddarm), Colon (Grimmdarm), Rectum (Mastdarm) und Canalis analis (Analkanal). Der Schichtaufbau des Dünndarms setzt sich in modifizierter Form im Dickdarm fort. Die Schleimhautoberfläche ist relativ glatt. Es fehlen Plicae circulares und Zotten. Das Epithel ist einschichtig und hochprismatisch. Tiefe, eng stehende Krypten ziehen bis zur Tunica muscularis 6 mucosae. Diese enthalten hauptsächlich schleimbildende Becherzellen, resorbierende Enterozyten mit Mikrovillussaum so wie auch endokrine Zellen und sind Ort der Zellerneuerung. Die Lamina propria mucosae enthält Blut- und Lymphkapillaren sowie zahlreiche Zellen der Abwehr (Makrophagen, Eosinophile, Mastzellen). Die Lamina muscularis mucosae besteht aus mehreren Muskelzelllagen. In der Submukosa liegen reichlich Fettzellen sowohl einige Lymphfollikel. Die Tunica muscularis besteht aus einer gut ausgeprägten Ringmuskelschicht. Die Längsmuskulatur ist auf Tänien zusammengedrängt, dadurch kann eine longitudinale Verkürzung des Darmrohres erreicht werden. Je nach Peritonealverhältnissen ist er von einer Adventitia oder Serosa bedeckt (Drenckhahn 2008). 1.2 Das cholinerge System 1.2.1 Funktion des Acetylcholins im Verdauungstrakt Acetylcholin ist ein wichtiger Neurotransmitter des zentralen und peripheren Nervensystems. Über cholinerge Neurone beeinflusst es sowohl neuronale als auch nicht-neuronale Zielzellen über die jeweiligen Rezeptoren. Acetylcholin wird aus Cholin und Acetyl-CoA im Zytosol der Nervenendigungen gebildet. Anschließend wird es in Vesikeln gespeichert und bei Bedarf mittels Exozytose aus diesen in den synaptischen Spalt entlassen, wo es zu einer Aktivierung des Rezeptors an der Zielzelle kommt. Diese Rezeptoren unterteilen sich in zwei Hauptgruppen, nikotinische und muskarinische Rezeptoren. Sie wurden bereits 1914 von Sir Henry Dale nach den Stoffen, für welche sie eine hohe Affinität besitzen, benannt (Burgen 1995). Nikotinerge Rezeptoren werden durch Nikotin, dem Hauptalkaloid der Tabakpflanze (Nicotinia tabacum) aktiviert und durch Curare gehemmt, während die muskarinergen Rezeptoren (MR) selektiv durch Muskarin, dem Alkaloid des Fliegenpilzes (Amanita muscaria var. muscaria) aktiviert und durch Atropin geblockt werden. Diese beiden Hauptgruppen lassen sich in viele weitere Untergruppen aufteilen, kommen prä- und postsynaptisch vor und werden im zentralen sowie im peripheren Nervensystem exprimiert. Die MR vermitteln ihre Zellantwort mittels eines second messenger und intrazellulären Signalkaskaden (Caulfield und Birdsall 1998). Durch die unterschiedlichen Signalkaskaden der einzelnen MR und ihrer unterschiedlichen morphologischen Verteilung kommt es zu einer Vielzahl von Zellantworten. Im Gastrointestinaltrakt werden über die MR insbesondere die Kontraktion der glatten Muskulatur und die Drüsensekretion reguliert (Caulfield 1993, Eglen et al. 1996 und 7 2001, Ehlert 2003, Tobin et al. 2009). Auch wurde bereits gezeigt, dass der Ionentransport im Ileum und Colon der Ratte durch die Aktivierung von MR an der Zellmembran von Enterozyten gesteigert werden kann (Rimele und Gaginella 1982). Gleiches gilt für die Permeabilität von Makromolekülen im Jejunum der Maus, welche ebenfalls dem Einfluss von Acteylcholin unterliegt (Cameron and Perdue 2007). Während lange Zeit der Fokus auf der Rolle des Acetylcholins als Neurotransmitter beruhte, wird zunehmen klarer, dass Acetylcholin ubiquitär vorkommt und auch in vielen nicht-neuronal beeinflussten physiologischen Abläufen eine wichtige Rolle spielt (Wessler et al. 1998 und 2003). Beide Rezeptorgruppen wurden in verschiedenen nicht-neuronalen Geweben nachgewiesen, also in Zellen, welche unabhängig von Neuronen sind und in denen das Acetylcholin als auto- oder parakriner Botenstoff wirkt (Wessler et al. 1998 und 2003, Eglen 2006). So wurde die Cholinacetyltransferase als essenzielles Enzym der Acteylcholinsynthese in verschiedenen nicht-neuronalen Zelltypen nachgewiesen. Als Beweis für die Befähigung zur Acetylcholinsynthese wird auch der Nachweis der Expression des cholinergen Genlocus herangezogen (Eiden 1998). Erste Untersuchungen diesbezüglich wurden 1966 von Morris für die humane Plancenta beschrieben (Morris 1966). Seitdem ist Acetylcholin in einer Mehrzahl von verschiedenen nicht-neuronalen Geweben beschrieben worden, wie z.B. im Endothel der Pulmonalarterie (Haberberger et al. 2000), im Rattenhoden (Schirmer et al. 2011) und in humaner Haut (Kurzen und Schallreuter 2004). Die genaue Speicherung des Acetylcholins in diesen Zellen und der Freisetzungsmechanismus sind bislang noch unbekannt (Klapproth et al. 1997, Wessler et al. 2003). Bereits 1984 konnte Furchgott zeigen, dass durch Acetylcholin aktivierte muskarinische Rezeptoren auf Endothelzellen mittels eines endothelium-derived relaxing factor (EDRF) eine Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur vermitteln (Furchgott 1984). Darauf folgten verschiedene Untersuchungen, die den Mechanismus der durch Endothelzellen vermittelten Relaxation der glatten Gefäßmuskulatur erforschten bzw. diskutierten (Peach et al. 1985). Für die glatte Gefäßmuskulatur der Aorta der Maus konnte z.B. eine Stickstoffoxid-induzierte Vasodilatation gezeigt werden, welche insbesondere der MR-Subtyp M3 steuert (Khurana et al. 2004). Im Oberfächenepithel des Dünn- und Dickdarmes konnte ebenfalls nicht-neuronales Acetylcholin nachgewiesen werden (Wessler et al. 1998, Klapproth et al. 1997). Insbesondere werden dem M1R und dem M3R eine Bedeutung bei der Sekretion und Resorption zugesprochen (Hirota und McKay 2006, Haberberger et al. 2006). Allerdings besteht ebenfalls eine Beeinflussung der epithelialen Chlorid-Ionen Sekretion durch die in der Mukosa gelegenen cholinergen Neurone (Cooke 1984). Aufgrund der Vielzahl von verschiedenen Neuronen und Neurotransmitter im 8 Gastrointestinaltrakt und deren Interaktion ist eine genaue Differenzierung der Funktion der verschiedenen zellulären Quellen des Acetylcholins im Ionentransport erschwert (McConalogue und Furness 1994). 1.3 Muskarinische Rezeptoren 1.3.1 Einteilung und Aufbau von muskarinischen Rezeptoren Acetylcholin bindet in der Körperperipherie an Rezeptoren und vermittelt auf diese Weise seine Wirkung auf die Effektorzelle. Wie bereits beschrieben existieren zwei unterschiedliche Rezeptorklassen, die nikotinischen Acetylcholinrezeptoren und die muskarinischen. Erste wissenschaftliche Untersuchungen sowie die Isolierung der einzelnen Substanzen begannen bereits im neunzehnten Jahrhundert (Burgen 1995). Eine weitere Klassifizierung der Rezeptoren erfolgte durch die Erforschung von weiteren selektiven Agonisten und Antagonisten. 1951 zeigten Riker und Wescoe für Gallamin eine kardioselektive antagonistische Wirkung am MR (Hulme et al.1990, Caulfield und Birdsall 1998). Durch die Entdeckung weiterer Antagonisten konnte im Verlauf eine weitere Unterteilung in einzelne Subtypen und deren physiologische Rollen vorgenommen werden. Diese binden mit einer unterschiedlichen Affinität an den einzelnen MR (Caulfied und Birdsall 1998, Eglen et al., 1996 und 1999). Eine Schlüsselrolle nimmt dabei das Pirenzepin ein, das eine sehr hohe antagonistische Affinität zu den MR im Gehirn und im Magen hat, während es eine deutlich niedrigere Affinität zu den kardialen MR besitzt (Hosey 1992). Durch die Erforschung der genetischen Struktur der MR konnten durch molekularbiologische Methoden weitere Rezeptorsubtypen differenziert werden, so dass bis zum heutigen Tag die Existenz von fünf unterschiedlichen muskarinischen Rezeptoren (M1R-M5R) nachgewiesen werden konnte. Sie alle gehören zu der Gruppe der G-Protein gekoppelten Rezeptoren (Caulfield 1993, Wess 1996) und besitzen eine gemeinsame Rezeptorstruktur. Es sind Glykoproteine, welche aus sieben Transmembrandomänen in α-Helixform bestehen und durch intra- und extrazelluläre Schleifen miteinander verbunden sind. Ein aminoterminales Ende (N-Terminus) liegt extrazellulär, zytosolisch endet der Peptidstrang mit einem carboxyterminalen Ende (C-Terminus). Zwischen der zweiten und der dritten extrazellulären Schleife liegen zwei über eine Disulfidbrücke verbundene Cysteinreste, die einerseits die Tertiärstruktur des Rezeptors stabilisieren und andererseits auch eine Rolle bei der Aufrecherthaltung der aktiven 9 Rezeptorkonformation spielen (Hulme et al. 1990, Strader et al. 1994, Caulfield und Birdsall 1998). Die G-Proteine sind Heterotrimere und bestehen aus den drei Untereinheiten α, β und γ. Es existieren verschiedene G-Proteine, die sich in den jeweiligen Untereinheiten unterscheiden und dadurch verschiedene Enzyme oder Ionenkanäle stimulieren oder inhibieren (Strader et al. 1994). Die α-Untereinheit ist hauptverantwortlich für die physiologische Funktion des G-Proteins. In Bezug auf die MR können die G-Proteine aufgrund der unterschiedlichen α-Untereinheit in zwei Hauptgruppen unterteilt werden. Zum einen in die Gruppe der Gi-Proteine, welche die membranständige Adenylatzyklase und dadurch ebenfalls die Bildung des second messengers zyklisches Adenosinmonophosphat (cAMP) hemmen und so weitere Stoffwechselwege beeinflussen. Zum anderen in die der Gq-Proteine. Diese aktivieren die Phospholipase C und führen anschließend über die second messenger Inositoltrisphosphat (IP3) und Diacylglycerin (DAG) zu einer Erhöhung des zytosolischen Kalziumspiegels bzw. einer Aktivierung der Proteinkinase C. Dies leitet letztendlich eine Aktivierung verschiedener Enzyme ein und bewirkt so eine Zellantwort. Die MR-Subtypen M2R und M4R gehören der ersten Gruppe an, während die Subtypen M1R, M3R und M5R der zweiten Gruppen zuzuordnen sind. Nach Stimulation des MR an der Zelloberfläche mit einem exogenen Liganden beginnt eine Signaltransduktionskaskade. Es kommt zu einer Konformationsänderung und zur Freilegung der G-Protein Bindungsstelle. Der Austausch von Guanosindiphosphat (GDP) zu Guanosintriphosphat (GTP) führt zu einer Dissoziation der α-Untereinheit vom Rest des G-Proteins. Diese kann nun zu zell- oder membranständigen Proteinen diffundieren und deren Signalübertragungskaskade (s.o.) aktivieren oder inhibieren. 1.3.2 Vorkommen und Wirkung der muskarinischen Rezeptoren im Verdauungstrakt MR werden von Zellen im gesamten Körper exprimiert. Bereits in den siebziger Jahren des letzten Jahrhunderts konnte eine Forschungsgruppe (Barlow et al. 1972 und 1976) pharmakologische Unterschiede zwischen MR in verschiedensten Geweben wie dem Herzvorhof, dem Ileum, der Bronchialmuskulatur und der Iris nachweisen (Ehlert et al. 1997, Caulfield und Birdsall 1998). Aufgrund der großen Anzahl von MR an der Zelloberfläche von glatter Muskulatur und deren relativ leichter Gewebegewinnung wurde insbesondere der Verdauungstrakt (Magen, Dünndarm, Dickdarm) an verschiedenen Tiermodellen untersucht. Hierbei wurde der Schwerpunkt auf die Rolle des MR in der Muskelkontraktion gelegt (Eglen et al. 1996). Mittlerweile existieren eine Vielzahl von Untersuchungen in verschiedenen Tiermodellen und Geweben. Aufgrund 10 der unterschiedlichen Untersuchungsmethoden wie Ligandenbindungsstudien, immunhistochemischen Untersuchungen, elektrophysiologischen Tests oder autoradiographischen Verfahren, sowie dem Fehlen von hoch selektiven Agonisten und Antagonisten und lange Zeit auch von spezifischen Antikörpern (Pradidarcheep et al. 2008 und 2009, Jositsch et al. 2009) für die einzelnen MR und der Tatsache, dass Zellen mehrere Subtypen des MR exprimieren, fallen die Ergebnisse teilweise unterschiedlich aus (Hulme et al. 1990, Caulfield und Birdsall 1998, Wess 2004). Wir untersuchten in dieser Arbeit mittels Immunhistochemie einzelne Abschnitte des Verdauungstraktes von C57/B6Ntac Mäusen. Da auch die Spezifität von Antikörpern gegen den MR sehr unterschiedlich ist (Pradidarcheep et al. 2008 und 2009, Jositsch et al. 2009), verwendeten wir zur Kontrolle eine MR knockout Maus (MR KO-Maus), die durch das Ausschalten von den jeweiligen kodierenden Genabschnitten für den M2R und M3R gendefizient ist. Diese MR KO-Mäuse sind lebensfähig und zeigen keine offensichtlichen Unterschiede in Bezug auf die Lebensdauer oder die Fertilität (Gomeza et al. 1999, Matsui et al. 2002). Auch bei der der Präparation der Tiere und der anschließenden histologischen Untersuchung einzelner Organe wie Herz, Lunge und Milz wurden bisher keine wesentlichen Unterschiede beschrieben (Matsui et al. 2002). Jedoch wurden Unterschiede in der Gehirnfunktion wie Erinnerungs- und Lernvermögen gemessen (Seeger et al. 2004). Durch das Fehlen eines MR-Subtypen kommt es nicht zu einer veränderten Expression der übrigen vier MR (Gomeza et al. 1999). Verschiedene immunhistochemische Untersuchungen für den Gastrointestinaltrakt konnten die MR auf glatter Muskulatur, auf Ganglien des Plexus myentericus und Plexus submucosus, auf Epithelzellen und an Blutgefäßen nachweisen (Badaut et al. 1997, Iino und Nojyo 2006, Takeuchi et al. 2005 und 2006, Harrington et al. 2008 und 2010). Der M1R ist mit einem Anteil von ca. 40-50% der häufigste MR in verschiedenen Gehirnregionen (z.B. Cortex, Hippocampus, Thalamus, Cerebellum) (Levey 1993, Bymaster et al. 2003). M1R KO-Mäuse zeigen eine erhöhte lokomotorische Aktivität, aber keine kognitiven Unterschiede im Lernen und Erinnerungsvermögen (Miyakawa et al. 2001, Wess et al. 2003). Außerdem ist er in größerer Anzahl in den Speicheldrüsen (Levey 1993) und im Ganglion cervicale superius (Caulfield und Birdsall 1998) vorhanden. Im Colon des Menschen wurde der M1R auf Nervenzellen des Plexus myentericus und des Plexus submucosus entdeckt (Harrington et al. 2010). Im Colon der Maus wurde die mRNA des M1R im Epithel der Krypten nachgewiesen, wo er Einfluss auf den Ionentransport hat (Haberberger et al. 2006). Von allen muskarinischen Rezeptorsubtypen ist seine numerische Anzahl am geringsten, er kommt hauptsächlich im Gehirn vor. 11 Von den fünf bekannten MR werden insbesondere der M2R und der M3R im Verdauungstrakt exprimiert (Eglen et al. 1996, Ehlert et al. 1997). Sie sind hauptverantwortlich für die durch Acetylcholin induzierte Kontraktion der glatten Muskulatur des Verdauungstraktes und kommen sowohl im Stratum circulare als auch im Stratum longitudinale vor (Dörje et al. 1991, Takeuchi et al. 2005, Iino und Nojyo 2006, Harrington et al. 2008 und 2010). Dabei wirken sie additiv (Ehlert 2003, Braverman et al. 2008). Während der M3R über seine second messenger IP3 und DAG eine direkte Muskelkontraktion bewirkt, bewirkt eine Aktivierung des M2R eine Hemmung der cAMP Synthese und dadurch eine indirekte Kontraktion durch Inhibierung einer Relaxation (Uchiyama und Chess-Williams 2004, Kitazawa et al. 2007). Der M3R ist der entscheidende Rezeptor für die Muskelkontraktion, während der M2R redundant ist oder als back-up System fungiert, falls es zu einer Störung in der Signalkaskade des M3R-Systems kommt (Braverman et al. 2008). Außerdem wird ihm eine regulierende Eigenschaft bei der Freisetzung von Acetylcholin in den synaptischen Spalt zugewiesen. So scheint der M2R die Initialisierung und die Terminierung der Acetylcholinfreisetzung zu beeinflussen (Slutsky et al. 2002). Im Ileum der Maus zeigte sich auch eine Markierung für den M2R auf cholinergen Neuronen im Plexus myentericus (Takeuchi et al. 2005). Im Dünndarm und Colon des Meerschweinchens zeigten außerdem ICC eine Markierung mit M2R-Antikörper (Iino und Nojyo 2006, Harrington et al. 2008). Der M3R hat außerdem eine wichtige Funktion bei der Speichelsekretion, bei der Muskelkontraktion in der Blase, der Trachea, des Verdauungstraktes sowie der Pupille (Levey 1993, Caulfield und Birdsall 1998, Matsui et al. 2000, Bymaster et al. 2003, Stengel et al. 2002). Während er in der Blasenmuskulatur hauptverantwortlich für die Vermittlung der Muskelkontraktion ist, beträgt sein Anteil an der Carbachol-induzierten maximalen Kontraktion im Magenfundus ca. 50-60% (Stengel et al. 2002). Die Kontraktilität des Musculus detrusor vesicae in KO-Tieren ist auf ca. 5% von der des Wildtypes reduziert (Matsui et al. 2004). Über die Veränderung der Speichelsekretion in diesen Tieren wird kontrovers diskutiert. Während Matsui 2004 eine deutliche Reduktion gemessen hat, konnte Wess (2003) keinen Unterschied feststellen (Matsui et al. 2004, Wess et al. 2003). Diese Beobachtungen lassen sich, wie bereits oben beschrieben, mit dem multiplen Vorkommen der verschiedenen muskarinischen Rezeptoren in den jeweiligen Organen und den damit verbunden Kompensationsmechanismen erklären. Beide Arbeitsgruppen konnten einen deutlichen Gewichtsunterschied zwischen den KO- und den Wildtyp-Mäusen messen. M3R KO-Mäuse haben ein um ca. 25% geringeres Körpergewicht. Dies ist durch eine geringere Nahrungsaufnahme bedingt, welche 12 Wess auf eine verminderte Produktion des appetitstimulierenden Hormons Melanin concentrating hormone (MCH) zurückführt, während Matsui auf eine deutlich reduzierte Speichelsekretion schließt. Eine Änderung in der Entleerungsrate des Magens zwischen den KO- und den Wildtypmäusen konnte nicht festgestellt werden (Kitazawa et al. 2007). Der M4R hat im Gehirn ein ähnliches Verteilungsmuster wie der M1R. Die größte Anzahl liegt im Striatum (29%), während sein Anteil im Thalamus, Hippocampus und Cortex ca. 15% aller MR beträgt (Levey 1993). In peripheren Organen ist er vermehrt in der Lunge, den Speicheldrüsen und der Muskulatur des Ileums nachgewiesen worden (Bymaster et al. 2003, Dörje et al. 1991). Im Gegensatz zur Gallenblase (Oktay et al. 1998) hat der M4R im Magenfundus, der Blase oder der Trachea keinen Einfluss auf die Kontraktilität (Stengel et al. 2000). Immunhistochemisch konnte er bereits im Plexus myentericus des Ileums der Maus nachgewiesen werden. Auf glatten Muskelzellen wurde er nicht gefunden (Takeuchi et al. 2005). Das Expressionslevel des M5R ist im Gegensatz zu den übrigen MR deutlich geringer. Zusätzlich fehlten direkte Nachweismethoden. Daher waren sein Vorkommen und seine physiologische Wirkung lange Zeit ungeklärt (Matsui et al. 2004). Studien an MR KO-Tieren konnten bisher seine Bedeutung in der Regulierung der Gehirndurchblutung sowie über dopaminerge Neurone im Striatum einen Einfluss auf Morphinwirkung bzw. Drogeneinfluss nachweisen (Elhusseiny et al. 2000, Basile et al. 2002). 13 1.4 Fragestellung Muskarinische Rezeptoren sind wichtige Regulatoren bei vielen Funktionen des zentralen und peripheren Nervensystems, da an ihnen das Acetylcholin, ein wichtiger Neurotransmitter, bindet. Erste Hinweise auf die Existenz von MR gibt es seit 1951 durch Riker und Wescoe (Caulfield und Birdsall 1998). Bis heute wurden 5 Rezeptorsubtypen, M1R-M5R, identifiziert (Caulfield 1993). Aufgrund des ähnlichen Aufbaus, des mehrfachen Vorkommens zweier Rezeptorsubtypen und der Tatsache, dass diese in den verschiedensten Geweben exprimiert werden, sind sowohl immunhistochemische als auch physiologische Untersuchungen zur Funktion der einzelnen Rezeptoren erschwert. Durch molekulargenetische Techniken konnten Mausstämme generiert werden, welche für jeweils einen der fünf Rezeptortypen defizient sind. Im Zuge dessen konnten verschiedene physiologische Funktionen der einzelnen Rezeptoren in der Signalübertragung des Acetylcholins entschlüsselt werden. Von der genauen Erforschung der einzelnen muskarinischen Rezeptoren erhofft man sich Fortschritte bei der Behandlung verschiedenster Krankheiten, wie z.B. dem Morbus Alzheimer, der chronisch obstruktiven Lungenerkrankung, der überaktiven Harnblase oder dem Reizdarmsyndrom. Ein Artikel im deutschen Ärzteblatt 2012 über die Forschungsansätze in der Alzheimer-Forschung verdeutlicht, wie aktuell diese Forschungsthemen sind (Grübler 2012). Bisherige Untersuchungen zeigten, dass insbesondere der M2R und zu einem kleineren Anteil auch der M3R die am meisten exprimierten Rezeptoren in den Muskelschichten des Verdauungstraktes sind (Levey 1993, Ehlert et al. 1997). Seitdem wurden einzelne Abschnitte bzw. Organe an verschiedenen Tiermodellen (Ratte, Kaninchen, Meerschwein, Maus) insbesondere unter funktionellen Aspekten untersucht. Eine vollständige Identifizierung des Verteilungsmusters im Gastrointestinaltrakt fehlt aber bisher. Ziel dieser Arbeit ist es, die muskarinischen M2-Rezeptoren im Verdauungstrakt der Maus vom Ösophagus bis zum Colon descendens zu lokalisieren und die zelluläre Verteilung in den einzelnen Organabschnitten zu erfassen. Hierzu wurde die etablierte Methode der Immunhistochemie angewandt. Es wurde ein monoklonaler Antikörper gegen den M2R verwendet, welcher sich bei der Austestung im Vergleich von M2R- gendefizienten Mäusen mit den korrespondierenden Wildtyp-Mäusen als spezifisch erwies (Jositsch et al. 2009). Darüber hinaus wurden die Magengewichte im Verhältnis zum Gesamtkörpergewicht zwischen gendefizienten und Wildtyp-Mäusen registriert und statistisch ausgewertet, um organmorphologische Veränderungen zu erfassen. 14 Mit Hilfe der in dieser Arbeit gewonnenen Erkenntnisse über die histologische Verteilung ergeben sich weitere Hinweise auf die biologischen Funktionen des M2R und daraus folgend auch auf therapeutische Aspekte der Erkrankungen des Verdauungstraktes. 15 2. Material und Methoden 2.1 Material 2.1.1 Versuchstiere Für die Immunhistochemie wurden C57/B6Ntac Mäuse (Charles River Laboratories Sulzfeld, D) beiderlei Geschlechts im Alter von 10 Wochen mit einem Körpergewicht von 20,2 g – 23,1 g sowie eine für die muskarinischen Rezeptoren M2R und M3R gendefiziente Maus im Alter von 17 Wochen mit einem Gewicht von 22,3 g verwendet. Für die statistische Auswertung wurden zusätzlich M2R-gendefiziente Mäuse mit dem korrespondierenden Wildtyp verwendet. Die Mäuse stammten aus dem Zentralen Tierlabor der Justus-Liebig-Universität Giessen und wurden spezifiziert pathogenfrei gehalten. 2.1.2 Primärantikörper Die verwendeten Primärantikörper sind in Tabelle 1 spezifiziert. Antigen Wirtsspezies/Klon Verdünnung Quelle M2 muskarinischer Acetylcholinrezeptor Ratte, monoklonal, Klon M2-2-B3 1:400 Chemicon International Temecula, USA CD31 (PECAM-1) Ratte, monoklonal, Klon MEC 13.3, biotiniliert 1:500 BD Biosciences San Jose, USA Smooth Muscle Actin Maus, monoklonal Klon 1A4, FITC-konjugiert 1:800 Sigma-Aldrich St. Louis, USA Tabelle 1: Primärantikörper zur immunhistochemischen Darstellung von muskarinischen Rezeptoren des Typs M2R, Endothelzellen und glatten Muskelzellen 16 2.1.3 Sekundärreagenzien In Tabelle 2 sind die genutzten Sekundärantikörper aufgelistet. Reagenz Konjugat Wirtsspezies Verdünnung Quelle Anti-Ratten-IgG Indocarbocyanin (Cy3) Esel, polyklonal 1:1000 Dianova Hamburg, D Streptavidin Fluoreszein- isothiocyanat (FITC) Streptomyces avidinii 1:500 Sigma-Aldrich St. Louis, USA Tabelle 2: Sekundärreagenzien Der Primärantikörper Anti-α-Smooth Muscle Actin ist mit FITC konjugiert, so dass hier die Inkubation mit einem Sekundärantikörper entfiel. 2.1.4 Chemikalien Substanz Firma Ort Aceton Merck KgaA Darmstadt, D Dinatriumhydrogen- Sigma-Aldrich GmbH Steinheim, D phosphat-Dihydrat Glycerol, wasserfrei Merck KGaA Darmstadt, D Isofluran Baxter Deutschland GmbH Unterschleißheim, D Natriumazid Merck KGaA, Darmstadt, D Natriumcarbonat Merck KgaA Darmstadt, D (Na2CO3) Natriumchlorid Carl Roth GmbH & Co. Karlsruhe, D Natriumhydrogen- Merck KGaA Darmstadt, D carbonat Natriumhydrogen- Carl Roth GmbH & Co. Karlsruhe, D phosphat-Dihydrat Pferdeserum HyClone Bonn, D Rinderserum- Sigma-Aldrich GmbH Steinheim, D albumin (BSA) Tween 20 Sigma-Aldrich GmbH Steinheim, D Tabelle 3: verwendete Chemikalien 17 2.1.5 verwendete Lösungen Stammlösung A (0,2 M) für Phosphatpuffer 31,2 g NaH2PO4 x 2 H2O (Natriumhydrogenphosphat-Dihydrat) in 1000 ml Aqua destillata. Stammlösung B (0,2 M) für Phosphatpuffer 35,60 g Na2HPO4 x 2 H2O (Dinatriumhydrogenphosphat-Dihydrat) in 1000 ml Aqua destillata. PBS (Phosphatgepufferte Salzlösung) Zu 22,40 g Natriumchlorid wurden 28,75 ml der Stammlösung A und 96,20 ml Stammlösung B gegeben, der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und das Gemisch auf 5 Liter mit Aqua destillata aufgefüllt. PBS + NaCl (PBS mit doppeltem Salzgehalt) Zu 44,8 g Natriumchlorid wurden 28,75 ml der Stammlösung A und 96,20 ml Stammlösung B gegeben, der pH-Wert auf 7,4 eingestellt und das Gemisch auf 5 Liter mit Aqua destillata aufgefüllt. PBS + NaCl + NaN3 (Phosphatgepufferte Salzlösung plus Natriumchlorid plus Natriumazid 0,1%) 2,875 ml der Stammlösung A wurden mit 9,620 ml der Stammlösung B gemischt. Dazu wurden 2,24 g Natriumchlorid sowie 0,5 g Natriumazid gegeben und auf 500ml mit Aqua destillata aufgefüllt. Die Lagerung erfolgte bei –20 ° C Rattenserum Kardial gewonnenes Vollblut wurde für 48 h im Kühlschrank bei +4° C gelagert. Durch Zentrifugieren, Abpipetieren des Überstandes und die Wiederholung dieses Vorganges wurde das Serum isoliert. Das Rattenserum wurde mit PBS zu einer 5%igen Lösung verdünnt. Blocklösung Um die Zellmembran zu permeabilisieren und unspezifische Proteinbindungsstellen zu sättigen erfolgte die Verwendung einer Blocklösung, bestehend aus 10% normales Pferdeserum 0,1% Rinderserumalbumin (BSA) 18 0,5% Tween 20 in PBS. gepuffertes Glycerol 50 ml 0,5 M Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3) mit 0,5 M Dinatriumcarbonat (Na2CO3) auf pH-Wert 8,6 einstellen. Einen Teil dieser Pufferlösung mit zwei Teilen Glycerol mischen. 2.2 Methoden 2.2.1 Gewebegewinnung Zuerst wurde das Lebendgewicht mit einer Feinwaage auf das Zehntelgramm genau bestimmt. Anschließend wurden die Tiere durch Inhalation einer Überdosis Isofluran getötet und durch einen abdominellen Medianschnitt von der Regio cervicalis superior bis zur Regio pubica geöffnet. Daraufhin wurde den Tieren in folgender Reihenfolge 0,5–1 cm große Gewebeproben aus folgenden Organen entnommen: 1. Thorakaler Ösophagus 2. Magenfundus 3. Pylorus 4. Duodenum 5. Jejunum 6. Ileum 7. Caecum 8. Colon descendens Bevor der Magen in einen Fundus- und einen Pylorusabschnitt aufgeteilt wurde, wurde er mit einer 5 ml fassenden Einwegspritze und unter Verwendung einer Knopfkanüle mit PBS gespült und sein Leergewicht bestimmt. Aus dem Gesamtkörpergewicht und dem Magengewicht wurde der Quotient gebildet. Es wurde darauf geachtet, dass die Proben immer aus den gleichen Abschnitten des Magen-Darm-Traktes entnommen wurden. Nachdem das Gewebe mit einem Wattestäbchen und einem kurzem Waschvorgang in PBS vom Darminhalt gereinigt war, wurde es in einer Cryomold (15 x 15 x 5 mm) (Sakura Finetek Europe B.V., Zoeterwoude, NL) platziert, mit Tissue Tek bedeckt und eingefroren. Zu diesem Zweck wurde Isopentan mit Flüssigstickstoff 19 gekühlt und die Cryomold solange in die flüssige Phase des Isopentan gelegt, bis das mit Tissue Tek bedeckte Gewebe vollkommen eingefroren war. Danach wurde das Cryomold kurz in flüssigem Stickstoff weiter gefroren. Bis zur Verwendung wurden die Gewebeproben bei –80° C in einem Tiefkühlschrank gelagert. 2.2.2 Gewebeaufarbeitung Die Proben wurden aus dem Cryomold entnommen, auf Filterpapier (Ø 32 mm, Schleicher&Schuell Micro Science GmbH, Dassel, D) mit Hilfe von Tissue Tek festgefroren und in einem Kryostaten CM 3000 (Fa. Leica, Bensheim, D) so eingespannt, dass Schnitte senkrecht zur Schleimhautoberfläche des Organs geführt wurden. Die Temperatur des Kryostaten sowie des Schneidemessers betrug –20° C. Es wurden 10 µm dicke Schnitte angefertigt, welche auf Superfrost Plus Objektträger (Menzel-Gläser, Braunschweig, D) aufgezogen wurden. Die Schnitte wurden pro Objektträger in 2 Gruppen unterteilt, um eine Spezifitätskontrolle des Sekundärantiköpers zu ermöglichen. Die Schnitte wurden für 10 min mit Aceton bei - 20° C fixiert und anschließend eine Stunde bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Durch die jeweilige Umrandung der beiden Schnittgruppen mit einem Fettstift wurden die zu inkubierenden Flächen verringert und das spätere Verlaufen der Lösungen verhindert. 2.2.3 Immunhistochemie Die Schnitte wurden für eine Stunde mit einer Blocklösung versehen, um unspezifische Proteinbindungsstellen abzusättigen. Nach Entfernung der Lösung wurde eine Schnittgruppe mit 100 µl des Primärantikörpers (siehe Tabelle 1) und zur Negativkontrolle die andere Gruppe mit PBS+NaCl benetzt und über Nacht in einer feuchten, luftdichten Kammer im Dunkeln bei Raumtemperatur gelagert. Die Inkubation der Gewebe mit PBS und NaCl diente der Kontrolle des Sekundärsystems. Auf diese Weise kann die Spezifität des Sekundärantikörpers beurteilt werden. Die Spezifität des Primärantikörpers gegen den M2R wurde durch die Austestung am M2R/M3R KO-Tier nachgewiesen. Der Primärantikörper wurde am nächsten Morgen mittels einer Pumpe abgesaugt und die Objektträger für 2 x 10 min in einer mit PBS gefüllten Küvette gewaschen. Als Nächstes wurden die Schnitte für 1 Stunde mit dem Sekundärantikörper (siehe Tabelle 2) inkubiert und in einer feuchten Kammer dunkel gelagert. Um die Lokalisation der Antikörperbindung sichtbar zu machen, wurden 20 fluoreszierende Sekundärantikörper verwendet, die gegen die speziesabhängigen Immunglobulin-Antigene gerichtet sind. Danach wurde der Sekundärantikörper abgesaugt und die Schnitte erneut für 2 x 10 min mit PBS gewaschen, um ungebundene Antikörper zu entfernen. Im Anschluss daran folgte eine Nachfixierung für 10 min in 4% Paraformaldehyd und abermaliges Waschen für 2 x 10 min in PBS. Daraufhin wurden die Schnitte mit 30 µl Carbonat-gepuffertem Glycerol (pH 8,6) benetzt und mit Deckgläsern versehen. Es wurden zwei verschiedene Doppelmarkierungen angefertigt. Zum einem wurde der M2R, welcher mittels Cy3- gekoppelter Anti-Ratten-IgG markiert wurde, zusammen mit glatten Muskelzellen, die durch einen FITC-konjugierten Anti-α-Smooth Muscle Actin angefärbt wurden, dargestellt. Zum anderen wurde der M2R zusammen mit Endothelzellen gekennzeichnet. Diese wurden durch den biotinilierten Anti-CD31 (PECAM-1) detekiert und über eine Streptavidin-Brücke mit dem Fluoreszenzfarbstoff FITC nachgewiesen. Um diese Doppelmarkierung zu ermöglichen, war eine Änderung des Versuchsprotokolls nötig. Nach einer wie oben beschriebenen Immunhistochemie mit dem M2R- Primärantikörper und einem Cy3-konjugierten Sekundärantikörper wurden nach der Fixierung mit 4% Paraformaldehyd die Objektträger für 1 Stunde mit 100 µl 5%igem Rattenserum inkubiert, um alle Bindungsstellen des Sekundärantikörpers abzusättigen. Das Serum wurde nach 1 Stunde entfernt. Nach diesem Schritt folgte eine Inkubation über Nacht mit einem CD31 (PECAM-1) Antikörper bzw. PBS+NaCl zur Negativkontrolle in einer feuchten Kammer. Am darauf folgenden Tag wurden die Objektträger für 2 x 10 min mit PBS gewaschen und für 1 Stunde mit einem FITC- konjugierten Sekundärantikörper inkubiert. Nach abermaligem Absaugen und 2 x 10 min Waschen in PBS erfolgte eine Nachfixierung in 4% Paraformaldehyd für 10 min. Nach Wiederholung des Waschens in PBS für 2 x 10 min wurden die Objektträger mit gepuffertem Glycerol eingedeckelt. Alle Objektträger wurden im Dunkeln bei +4° C aufbewahrt und anschließend mit dem Fluoreszenzmikroskop ausgewertet. Die Negativkontrolle diente zur Überprüfung der Spezifität des Sekundärantikörpers (siehe Tabelle 1 und 2). Pro Objektträger wurden 2 Schnitte auf diese Weise behandelt. 21 2.2.4 Auswertung Die Auswertung erfolgte an einem Epifluoreszenzmikroskop (Axioplan 2 Imaging mot, Carl Zeiss AG, Göttingen, D) und an einem Confocal Laser Scanning Mikroskop (Leica SP2–AOBS, Bensheim D). Für die Epifluoreszenzmikroskopie wurden die in Tabelle 4 aufgeführten Filter verwendet. Fluorochrom Anregungsfilter (nm) Dichroischer Spiegel (nm) Sperrfilter (nm) Cy3 525-556 555 570-650 FITC 460-490 505 515-550 Tabelle 4: verwendete Fluorochrome und Fluoreszenzfilter für die Epifluoreszenzmikroskopie Cy3 leuchtet orange, FITC grün. Markierte Bereiche wurden aufgesucht und anschließend mit Hilfe des Programms Axio Vision 3,0 (Carl Zeis Vision GmbH, Göttingen, D) fotografiert und auf einen Computer gespeichert. Bei der Beurteilung der Schnitte wurde auf Intaktheit und homogene Anfärbung des Gewebes geachtet. 2.3. Statistik Für die statistische Auswertung des Magen-Lebendgewicht-Quotienten von M2R-KO und korrespondierenden Wildtyp-Mäusen wurde SSPS (Version 11.0, SSPS Inc. Headquarters Chicago, IL, USA) verwendet. Es erfolgten eine explorative Datenanalyse und Testung mit dem 2 seitigen t-Test für unabhängige Stichproben. P- Werte ≤ 0,05 wurden als signifikant betrachtet. Zusätzlich wurden die Ergebnisse in Form von Boxplots und Punktwolken dargestellt. Insgesamt wurden 57 Mäuse in die statistische Auswertung mit einbezogen, welche in einem ersten Schritt in eine Gruppe von M2R-KO Mäuse (n=29) und eine Gruppe von M2R-WT Mäuse (n=28) getrennt wurden. Unvollständig erhobene Daten, wie fehlendes Alter und Geschlecht, wurden hierbei nicht weiter berücksichtigt. 22 3. Ergebnisse 3.1 Makroskopische Befunde 3.1.1 Makroskopisches Erscheinungsbild des Magens bei M2R-Gendefizienz A WT A WT B M2R KO B M2R KO B M2R KO Abbildung 1: Vergleich der Mägen von M2R-KO- und WT-Mäusen Die Fotographien zeigen die jeweils frisch entnommenen, noch nicht vom Mageninhalt befreiten Mäusemägen (Abbildung 1) aus den verwendeten Wildtypen (WT, Bild A) und M2R Knockouttieren (M2R KO, Bild B). Während die Magengröße augenscheinlich nicht wesentlich verändert ist, so erscheint insbesondere der Vormagen (Pfeile) der KO-Maus deutlich aufgebläht. 23 3.1.2 Statistische Analyse auf Unterschiede der Magen- und Körpergewichte Im ersten Schritt wurde die Gruppe der M2R KO-Mäuse (n=29) von der Gruppe der WT-Mäuse (n=28) getrennt. Dabei wurden drei Variablen bei der statistischen Untersuchung berücksichtigt: das Magengewicht, das Körpergewicht und der daraus errechnete Quotient (Magengewicht/Körpergewicht). Alle drei Variablen zeigten zwischen den beiden Mausstämmen einen signifikanten Unterschied bei durchgeführtem 2-seitigem t-Test, bei allen drei betrug p≤0,001. Bei der separaten Betrachtung der Werte für das Körper- und Magengewicht (Abbildung 2 und 3) fallen Unterschiede auf. So liegt der Mittelwert des Körpergewichtes bei den M2R KO-Mäusen bei 30,10 ± 4,26 g (Standardabweichung, SD), bei den WT-Mäusen ist er um mehr als 30% höher, bei 42,70 ± 9,64 g. n=29 n=28 p 0,001≤ Abbildung 2: Die Körpergewichte beider Mausstämme in g als Boxplotdarstellung. Zu sehen sind der Median (M2R KO: 29,88 g, WT: 42,9 g) sowie Quartile und Ausreißer (Kreise). Dabei weisen die Mausstämme einen signifikanten Unterschied im Bezug auf ihr Körpergewicht auf (p≤0,001 bei 2-seitigem t-Test für unabhängige Stichproben). ° bezeichnet Ausreißer zwischen dem 1.5-fachen und dem 3-fachen Interquartilsabstand vom Median entfernt. 24 Das Körpergewicht der Mäuse zeigt, dass die M2R KO-Mäuse in ihrem Mittelwert unter dem der WT-Mäuse liegen. Die Daten des Magengewichtes zeigen ein gegenteiliges Bild. Hier liegt der Mittelwert in der Gruppe der M2R KO-Mäuse bei 0,95 ± 0,59 g, bei den WT-Mäusen bei einem Wert von 0,48 ± 0,21 g. p 0,001≤ n=29 n=28 Abbildung 3: Darstellung der Magengewichte beider Mausstämme in g. Der Median liegt bei den M2R KO-Mäusen bei 0,86 g und bei den WT-Mäusen bei 0,39 g. Im Vergleich waren beide Magengewichte signifikant unterschiedlich (p≤0,001, bei 2-seitigen t-Test für unabhängige Stichproben). ° bezeichnet Ausreißer zwischen dem1.5-fachen und dem 3-fachen Interquartilsabstand vom Median entfernt. 25 Abbildung 4 liefert eine graphische Darstellung der Unterschiede zwischen beiden Mausstämmen in Form der errechneten Quotienten. Der Maximalwert lag in der M2R KO-Gruppe bei 0,086 und bei der WT-Gruppe bei 0,023. p 0,001≤ n=29 n=28 Abbildung 4: Boxplotdarstellung des Quotienten bei den M2R KO- und WT-Mäusen. Auch hier weisen beiden Mausstämme einen signifikanten Unterschied auf (p≤0,001 bei 2-seitigen t-Test für unabhängige Stichproben). Der Median lag bei den M2R KO-Mäusen bei 0,03 und bei den WT-Mäusen bei 0,01. ° bezeichnet Ausreißer zwischen dem 1.5-fachen und dem 3-fachen Interquartilsabstand vom Median entfernt. 26 Nach der Unterteilung in Gruppen nach Mausstämme erfolgte eine weitere Unterteilung in eine Gruppe jünger als 250 Tage und eine Gruppe älter als 250 Tage innerhalb jeden Mausstammes. Grund dieser Aufteilung war, wie in Abbildung 5 ersichtlich, die altersabhängige Entwicklung des Magengewichtes darzustellen. Alter in Tagen M ag en ge w ic ht in g Abbildung 5: Punktwolke der Magengewichte innerhalb der Mausstämme bei aufsteigendem Alter 27 Bei genauerer Betrachtung der Gewichte innerhalb der Altersgruppen zeigt die Gruppe der WT-Mäuse höhere Werte beim Körpergewicht und erniedrigte Werte beim Magengewicht gegenüber den M2R KO-Mäusen. In der Gruppe der älteren Tiere war dieser Unterschied deutlicher ausgeprägt als bei den jungen Tieren. Die Abbildungen 6 und 7 stellen diesen Unterschied graphisch dar. Der 2-seitige t-Test für unabhängige Stichproben zeigte dabei einen signifikanten Unterschied im Körpergewicht bei den beiden Mausstämmen, sowohl bei den Mäusen jünger als 250 Tage als auch bei denen älter als 250 Tage (p≤0,001 bzw. p=0,001). In Form von Werten stellt sich die Situation wie folgt dar: der Mittelwert des Körpergewichtes der Gruppe <250 Tagen bei den M2R KO-Mäusen beträgt 28,26 ± 3,56 g, bei den gleichaltrigen WT-Mäusen liegen die Werte bei 39,47 ± 8,67 g. Der Mittelwert der Altersgruppe >250 Tage beträgt bei den M2R KO-Mäusen 33,60 ± 3,23 g, während er bei den WT-Mäusen bei 48,51 ± 8,86 g liegt (Abbildung 6). p≤0,001 p=0,001 n=19 n=18 n=10 n=10 Abbildung 6: Vergleich der Körpergewichte der Mausstämme bei den einzelnen Altersgruppen. Die Mediane betrugen in der Gruppe <250 Tage bei den M2R KO-Mäusen 28,7 g, bei den WT-Mäusen 32,5 g. In der Gruppe >250 Tage 40,25 g bzw. 47,85 g. Dabei war in beiden Altersgruppen der Unterschied signifikant (p≤0,001 bzw. p=0,001 bei 2-seitigem t- Test für unabhängige Stichproben). 28 Auch das Magengewicht zwischen den beiden Altersgruppen weist signifikant unterschiedliche Werte auf (p=0,004 bzw. p=0,003). So beträgt es bei den M2R KO- Mäusen <250 Tage im Mittel 0,70 ± 0,4 g, während die WT-Mäuse im Mittel ein Magengewicht von 0,40 ± 0,21 g hatten. Die Gruppe der älteren Mäuse weist einen Wert von 1,42 ± 0,62 g, bzw. einen Wert von 0,64 ±0,25 g auf (Abbildung 7). p=0,004 p=0,003 n=19 n=18 n=10 n=10 Abbildung 7: Vergleich der Magengewichte der Mäuse bei den einzelnen Altersgruppen. In den Altergruppen zeichnen sich signifikante Unterschiede im Bezug auf das Magengewicht ab (p=0,004 bzw. p=0,003, bei 2-seitigem t-Test für unabhängige Stichproben). Die Mediane betrugen dabei in der Altersgruppe <250 Tage 0,59 g bzw. 1,325 g und in der Gruppe >250 Tage 1,325 g bzw. 0,73 g. ° bezeichnet Ausreißer zwischen dem 1.5-fachen und dem 3-fachen Interquartilsabstand vom Median entfernt. * bezeichnet Extremwerte mit mehr als dem 3-fachen Interquartilsabstand vom Median entfernt. 29 Aufgrund der Unterschiede in den Werten für das Körper- und Magengewicht zeigen auch die Quotienten signifikante Unterschiede. So betrug der Mittelwert des Quotienten bei den M2R KO-Mäusen <250 Tage 0,024, bei der jungen Gruppe der WT-Mäuse lag er bei 0,01. Die Standardabweichung lag bei 0,012 bzw. 0,02. Die Mittelwerte des Quotienten bei den Mäusen älter als 250 Tage waren deutlich höher. So lag er bei den M2R KO-Mäusen bei 0,04 und bei den WT-Mäusen bei 0,01. Die Standardabweichungen lagen bei 0,02 bzw. bei 0,01. Vergleichend ist festzustellen, dass in beiden Altersgruppen die M2R KO-Mäuse einen höheren Quotienten aufweisen als die Gruppe der WT-Mäuse. Weiterhin steigt der Quotient bei beiden Mausgruppen im Alter an, bei den M2R KO-Mäusen allerdings stärker als bei den WT-Mäusen. Abbildung 8 stellt dies graphisch dar. p 0,001≤ p 0,001≤ n=19 n=18 n=10 n=10 Abbildung 8: Boxplotdarstellung des Magenquotienten, aufgeteilt in Altersgruppen. Auch die Quotienten weisen einen signifikanten Unterschied zwischen den Mausstämmen in den Altersgruppen auf (p≤0,001 bzw. p≤0,001). Die Mediane in der Altersgruppe <250 Tage lagen bei 0,02 bzw. 0,01. In der Gruppe >250 Tage betrugen sie 0,04 bzw. 0,01. ° bezeichnet Ausreißer zwischen dem 1.5-fachen und dem 3-fachen Interquartilsabstand vom Median entfernt. 30 3.2 Immunhistochemische Befunde 3.2.1 Ösophagus Für jeden Organabschnitt wurde jeweils die Spezifität des Antikörpers gegen den M2R ausgetestet. Im Ösophagus zeigte sich nur eine Immunreaktion in dem Gewebe der Wildtyp-Maus, während in der korrespondierenden für M2R und M3R gendefizienten Maus eine unspezifische Markierung von Epithelzellen zu erkennen war. Die im Wildtyp spezifisch M2R-markierten Zellen befanden sich in der Tunica muscularis sowohl im Stratum circulare als auch im Stratum longitudinale, wobei es ein vermehrtes Vorkommen im Stratum circulare zu geben schien. Im korrespondieren Knockouttier waren diese Zellen nicht zu sehen (Abbildung 9). Die Doppelimmunfluoreszenzen mit den Antikörpern gegen M2R und αSMA zeigten, dass bei es sich bei diesen M2R-markierten Zellen um glatte Muskelzellen innerhalb der Tunica muscularis handelte. Glatte Muskelzellen der Gefäßwand und der Lamina muscularis mucosae exprimierten den M2R nicht (Abbildung 10 und 11). Dies verdeutlichten auch die CLSM-Aufnahmen (Abbildung 12). Im Überlagerungsbild (A`` und B``) erscheinen doppelt angefärbte Zellen jeweils gelblich. Diese lagen auch hier ausschließlich in der Tunica muscularis. Eine weitere Doppelimmunfluoreszenz wurde mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1, einem Marker für Endothelzellen durchgeführt (Abbildung 13). Auch hier fanden sich M2R-markierte Zellen vermehrt in der zirkulären Muskulatur, während in der Lamina muscularis mucosae und der Tela submucosa kein Signal zu erkennen war. Eine Co-Lokalisation mit dem Endothelzellmarker zeigte sich weder in der Epifluoreszenzmikroskopie noch im CLSM (Abbildung 14). 31 A lmm sc sl e M2R 40 µmA lmm sc sl e M2R 40 µm40 µm lmm sc sl eM2/3R- B 40 µm lmm sc sl eM2/3R- B 40 µm40 µm C sc lmm M2R e 40 µmC sc lmm M2R e 40 µm40 µm D sc M2/3R- 40 µmD sc M2/3R- 40 µm40 µm Abbildung 9: Ösophagus, Immunfluoreszenz mit dem M2R-Antikörper In Bild A sind in der Tunica muscularis markierte Zellen sowohl im Stratum circulare (sc) als auch im Stratum longitudinale (sl) zu erkennen. Muskelzellen der Lamina muscularis mucosae (lmm) sind nicht immunreaktiv. Im korrespondierenden KO-Tier sind diese Zellen nicht zu sehen (Bilder B und D). Eine unspezifische, da auch im Knockouttier vorhandene, Immunreaktivität zeigen basale Epithelzellen (e, Bild B). Bild C zeigt eine Vergrößerung des Stratum circulare (sc) mit Anteilen der Tunica mucosa aus einer Wildtyp-Maus. Die Vergrößerungsaufnahme D zeigt einen Abschnitt des Stratum circulare (sc) aus dem KO-Tier, in der keine Immunfluoreszenz zu erkennen ist. 32 A lmm sc * e M2R 40 µmA lmm sc * e M2R 40 µm40 µm g g A` lmm sc * e SMA 40 µm g g A` lmm sc * e SMA 40 µm40 µm B lmm sc sl * * M2R 40 µm B lmm sc sl * * M2R 40 µm40 µm g g B` lmm sc sl * * SMA 40 µm g g B` lmm sc sl * * SMA 40 µm40 µm Abbildung 10: Ösophagus, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA Die Bilder A und A´ zeigen einen identischen Schnitt durch den Epithelbereich (e) und das Stratum circulare (sc), während die Bilder B und B` einen kompletten Querschnitt aller Wandschichten durch den Ösophagus zeigen. Es finden sich viele M2R-markierte Zellen in der Tunica muscularis, deutlich mehr im Stratum circulare (sc) als im Stratum longitudinale (sl). Die in den Bildern A` und B´ markierte Lamina muscularis mucosae (lmm) und die Gefäßmuskulatur (g) zeigen keine M2R-Immunreaktion. Mit Sternchen gekennzeichnete Zellen sind doppelt angefärbt. 33 A * * * M2R 20 µmA * * * M2R 20 µm20 µm g A` * * * SMA 20 µm g A` * * * SMA 20 µm20 µm B * * M2R 20 µmB * * M2R 20 µm20 µm g B` * * SMA 20 µm g B` * * SMA 20 µm20 µm Abbildung 11: Ösophagus, Stratum cirulare, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA Die Bilder A und A´ sowie B und B´ zeigen Vergrößerungen aus dem Stratum circulare. In der Vergrößerung erkennt man immunreaktive Zellen (Sternchen) in der Muskulatur sowie das Fehlen von M2R-Immunreaktivität an der Oberfläche von Gefäßmuskelzellen (g). 34 M2R 60 µm g A lmm M2R 60 µm60 µm g A lmm SMA 60 µm g A` SMA 60 µm60 µm g A` merge g A`` lmm merge g A`` lmm M2R 10 µmB lmm M2R 10 µm10 µmB lmm SMA 10 µmB` lmm SMA 10 µm10 µmB` lmm merge B`` lmm merge B`` lmm Abbildung 12: Ösophagus, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA, CLSM-Aufnahme Zellen mit M2R sind rot, glatte Muskelzellen grün dargestellt, doppelt angefärbte Zellen erscheinen gelblich. Fast alle M2R-positiven Zellen innerhalb der Tunica muscularis sind αSMA-positiv, während in der Lamina muscularis mucosae sowie in der Gefäßmuskulatur keine M2R-positiven Zellen vorkommen. 35 A e sc sl M2R 40 µmA e sc sl M2R 40 µm40 µm A` e sc sl CD31 40 µmA` e sc sl CD31 40 µm40 µm B lmm sc e M2R 40 µmB lmm sc e M2R 40 µm40 µm B` lmm sc e CD31 40 µmB` lmm sc e CD31 40 µm40 µm C sc M2R e 20 µmC sc M2R e 20 µm20 µm C` sc CD31 e 20 µmC` sc CD31 e 20 µm20 µm Abbildung 13: Ösophagus, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31), einem Endothelzellmarker Die Bilder A, A´ und B, B´ zeigen die Lokalisation von M2R (rot) und CD31 positiven Endothelzellen (grün) im Ösophagus einer Wildtypmaus. Es finden sich im Stratum circulare (sc) mehr M2R markierte Zellen als im Stratum longitudinale (sl) der Tunica muscularis, während in der Lamina muscularis mucosae (lmm) sowie in der Tela submucosa kein Signal zu erkennen ist. Eine Co-Lokalisation mit PECAM-1 gibt es nicht. Bild B zeigt die unspezifische Fluoreszenz von basalen Epithelzellen (e). Eine Vergrößerung des Abschnittes vom Epithel (e) bis zur zirkulären Muskulatur (sc) des Ösophagus zeigen die Bilder C und C´. Die einzeln in der Tunica muscularis liegenden 36 M2R-positiven Zellen werden nicht von dem Endothelzellmarker Anti-PECAM-1 erkannt. A M2R 60 µmA M2R 60 µm60 µm CD31 A` 60 µm CD31 A` 60 µm60 µm merge A`` 60 µm merge A`` 60 µm60 µm B M2R 10 µmB M2R 10 µm10 µm CD31 B` 10 µm CD31 B` 10 µm10 µm merge B`` 10 µm merge B`` 10 µm10 µm Abbildung 14: Ösophagus, Tunica muscularis, CLSM-Aufnahme Es besteht keine Co-Lokalisation zwischen dem M2R (rot) und PECAM-1 (grün) in der Tunica muscularis. 37 3.2.2 Fundus gastricus Auch im Magenfundus erfolgte eine Austestung der Spezifität des verwendeten M2R- Antikörpers. Es zeigte sich eine deutliche Immunreaktion im Bereich der Tunica muscularis, eine schwache der Lamina muscularis mucosae sowie eine wiederum deutliche für subeptheliale Zellen in der Tunica mucosa. Im Knockouttier waren diese Markierungen nicht aufzufinden. Hier bestand lediglich eine unspezische Markierung im Bereich des Mesothels und des unverhornten Plattenepithels (Abbildung 15). Die Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA zeigte eine deutliche Co-Lokalisation in der Tunica muscularis. Die Lamina muscularis mucosae, welche aus glatten Muskelzellen gebildet wird, zeigte für den M2R nur eine sehr schwache Immunreaktion. Glatte Gefäßmuskelzellen in der Tela submucosa zeigten keine Doppelmarkierung. Die in der Tunica mucosa gelegene Myozyten der Muskelpumpe reichten von der Lamina muscularis mucosa bis in den lumennahen Bereich und wurden durchgehend mit dem αSMA Antikörper markiert. Ebenfalls lagen M2R- exprimierende Zellen in der Lamina propria mucosae direkt unterhalb des Epithels (Abbildung 16). Die Vergrößerungsaufnahmen dieses Bereiches zeigten, dass diese immunreaktiven Zellen keine glatten Muskelzellen waren, da diese das subepitheliale Gebiet nur einzeln erreichten und nicht M2R- immunreaktiv waren (Abbildung 17). Die Doppelimmunfluoreszenz mit den Antikörpern gegen den M2R und PECAM-1 zeigte, dass es sich bei diesen in unmittelbarer Nähe des Oberflächenepithels angefärbten Zellen um Endothelzellen handelte, da diese eine deutliche Co-Lokalisation zeigten. Die in der Tunica muscosae gelegenen Glandulae gastricae banden den PECAM-1 Antikörper unspezifisch (Abbildung 18 und 19). Endothelzellen innerhalb der Tunica muscularis oder der Tela submucosa banden den M2R-Antikörper nicht (Abbildung 17). 38 A M2R lmm tm 40 µmA M2R lmm tm 40 µm40 µm B M2/3R- lmm m tm 40 µmB M2/3R- lmm m tm 40 µm40 µm C M2R e fg * * * 20 µm * * * C M2R e fg * * * 20 µm20 µm * * * D M2/3R- e fg fg 20 µmD M2/3R- e fg fg 20 µm20 µm E M2/3R- p e 40µmE M2/3R- p e 40µm40µm Abbildung 15: Magen, Fundus, Immunfluoreszenz mit dem M2R-Antikörper Im Wildtyp sind Zellen in der Tunica muscularis (tm) deutlich, in der Lamina muscularis mucosae (lmm) schwach (Bild A), sowie subepitheliale Zellen (e, Oberflächenepithel) und Zellen in der Lamina propria mucosae (Sternchen Bild C), welche unmittelbar neben den Foveolae gastricae (fg) liegen, mit dem M2R-Antikörper markiert. Im KO- Tier sind in vergleichbaren Fundusabschnitten nur unspezifisch angefärbte Zellen am Mesothel (m) sichtbar (Bild B). Weder subepitheliale Zellen noch Zellen in der Lamina propria mucosae sind im KO-Tier markiert (Bild D). Bild E zeigt die Übergangsregion vom Vormagen in den Magenfundus. Diese ist am verhornten Plattenepithel (p) zu erkennen, welches unspezifisch angefärbt ist. 39 A * sc M2R 40 µm * A * sc M2R 40 µm40 µm * A` SMA * sc 40 µm * A` SMA * sc 40 µm40 µm * sc slB M2R lmm g 40 µm sc slB M2R lmm g 40 µm40 µm lmm g sc slB` SMA 40 µm lmm g sc slB` SMA 40 µm40 µm * ** C M2R 40 µm * ** C M2R 40 µm40 µm * ** C` SMA 40 µm * ** C` SMA 40 µm40 µm Abbildung 16: Magen, Fundus, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA In den Bildern A und A´ sieht man ein doppelt markiertes Stratum circulare (sc) der Tunica muscularis sowie in der Tunica mucosa angefärbte Myozyten der Muskelpumpe und M2R-markierte Zellen unmittelbar unterhalb der Lamina epithelialis mucosae (Sternchen). Die Aufnahmen B, B` verdeutlichen, dass nur in der Tunica muscularis (Stratum circulare sc, Stratum longitudinale, sl), aber weder in der Lamina muscularis mucosae (lmm), noch in der Gefäßmuskulatur (g) M2R-positive Zellen liegen. Der M2R wird in der Tunica mucosa zusätzlich von Zellen, welche direkt unter dem Epithel liegen, exprimiert (Sternchen in den Bildern A und C). 40 M2R A 20 µm * *** * e M2R A 20 µm20 µm * *** * e SMA A` 20 µm * *** * e SMA A` 20 µm20 µm * *** * e M2R B e ** * 20 µm M2R B e ** * 20 µm SMA B` e ** * 20 µm SMA B` e ** * 20 µm20 µm Abbildung 17: Magen, Fundus, Vergrößerung des adluminalen Bereiches der Lamina propria mucosae, Doppelimmunfluoreszenz mit den Antikörpern gegen M2R und αSMA M2R-exprimierende Zellen (Sternchen) liegen in der Lamina propria mucosae, direkt unterhalb des Oberflächenepithels (e). Glatte Muskelzellen erreichen das subepitheliale Gebiet nur vereinzelt; diese sind nicht M2R-immunreaktiv. 41 M2R A lmm sc 40 µm M2R A lmm sc 40 µm40 µm CD31 A` lmm sc 40 µm CD31 A` lmm sc 40 µm40 µm M2R B * * * * * 40 µm * M2R B * * * * * 40 µm40 µm * CD31 B` * * * * * 40 µm * CD31 B` * * * * * 40 µm40 µm * Abbildung 18: Magen, Fundus, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31) Das Stratum circulare (sc) der Tunica muscularis ist deutlich für den M2R immunreaktiv, die Lamina muscularis mucosae (lmm) nur schwach (Bild A). PECAM-1 markierte Endothelzellen sind nur vereinzelt in der Tunica muscularis vorhanden (Bild A`). Vereinzelt im mittleren, besonders aber im epithelnahen Drittel der Tunica mucosa, wird der M2R exprimiert (Sternchen in Bild B). In der Tunica mucosa binden die Glandulae gastricae unspezifisch den CD31 Antikörper. Erkennbar ist aber, dass die adluminal gelegenen M2R-positiven Zellen auch den CD31-Antikörper binden (Sternchen in Bild B´). 42 M2R A e * * * 20 µm M2R A e * * * 20 µm20 µm CD31 A` 20 µm e * * * CD31 A` 20 µm20 µm e * * * M2R B 20 µm * ** * * e M2R B 20 µm20 µm * ** * * e CD31 B` 20 µm * ** * * e CD31 B` 20 µm20 µm * ** * * e Abbildung 19: Magen, Fundus, Vergrößerung des adluminalen Bereiches, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31) Die Bilder A, A´ und B, B´ zeigen eine deutliche Co-Lokalisation (Sternchen) beider Markierungen in der Lamina propria unmittelbar unter dem Oberflächenepithel (e). 43 3.2.3 Pylorus Die Immunfluoreszenz mit dem M2R-Antikörper zeigte in der Wildttypmaus, wie auch im Fundus gastricus, eine deutliche Anfärbung der zirkulären Muskulatur sowie subepithelialer Zellen (Abbildung 20, Bilder A und C). Die Lamina muscularis mucosae wurde auch hier nur in geringem Maße markiert (Abbildung 20, Bild A). Entsprechende Pylorusregionen aus einer M2R/M3R-gendefizienten Maus zeigten keinerlei Immunreaktion (Abbildung 20, Bilder B und D). Die Doppelimmunfluoreszenz in diesem Magenabschnitt mit den Antikörpern gegen M2R und αSMA zeigte eine Doppelmarkierung der glatten Muskelzellen in der Tunica muscularis und der Lamina muscularis mucosae (Abbildung 21, Bilderpaar A, A`). Die direkt unter dem Oberflächenepithel liegenden M2R-immunreaktive Zellen waren jedoch keine glatten Muskelzellen. Dies verdeutlichen die Vergrößerungsaufnahmen (Abbildung 21, Bildpaar B, B`). Dort erkennt man, dass die Myozyten der Muskelpumpe nicht den M2R exprimierten. Hingegen wurden Endothelzellen durch den M2R-Antikörper und den PECAM-1-Antikörper markiert (Abbildung 22, Bilder B und B`). Die in der Tela submucosa gelegenen Endothelzellen der Gefäßmuskulatur wurden hingegen nicht mit dem M2R-Antikörper markiert (Abbildung 22, Bildpaar A, A`). Die Analyse mit dem CLSM bestätigte diesen Befund (Abbildung 23). 44 sc * * * * A M2R lmm* * 40 µm sc * * * * A M2R lmm* * 40 µm40 µm B M2/3R- 40 µmB M2/3R- 40 µm40 µm * * * * * * * * * * * * * M2R 20 µmC * * * * * * * * * * * * * M2R 20 µm20 µmC D M2/3R- 20 µmD M2/3R- 20 µm20 µm Abbildung 20: Pylorus, Immunfluoreszenz mit dem M2R-Antikörper Bild A zeigt eine deutlich angefärbte zirkuläre Muskulatur (sc), im geringem Maße ist auch die Lamina muscularis mucosae (lmm) markiert. Eine deutliche Immunreaktion ist auch in subepithelialen Zellen zu erkennen (Sternchen). Das Bild B zeigt eine entsprechende Pylorusregion aus einem M2R/M3R- gendefizienten Tier. Hier sind weder die zirkulären Muskelzellen, noch die Lamina muscularis mucosae oder Zellen im Epithelbereich mit dem M2R-Antikörper markiert. Die Bilder C und D zeigen Vergrößerungen aus der Mukosa einer Wildtypmaus und einer M2R/M3R KO-Maus. 45 sc * * * * lmm A M2R 40 µm sc * * * * lmm A M2R 40 µm40 µm A` SMA g g sc lmm 40 µmA` SMA g g sc lmm 40 µm40 µm * * * * * * B M2R 20 µm * * * * * * B M2R 20 µm20 µm B` SMA 20 µmB` SMA 20 µm20 µm Abbildung 21: Pars pylorica, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA Während Zellen in der Tunica muscularis (hier nur zirkuläre Anteile, sc) und der Lamina muscularis mucosae (lmm) doppelt markiert sind, zeigt die Gefäßmuskulatur (g) keine Markierung mit dem M2R-Antikörper (Bilder A, A`). Darüber hinaus sind Zellen in der Tunica mucosa immunreaktiv (Sternchen). In den Vergrößerungsbildern B und B` erkennt man, dass dies unterschiedliche Zellen sind. M2R-angefärbte Zellen (Sternchen) sind nur im subepithelialen Bereich zu finden, während glatte Muskelzellen die gesamte Tunica mucosa durchziehen. 46 A * * * * lmm M2R 40 µmA * * * * lmm M2R 40 µm40 µm A` g CD31 * * * * lmm 40 µmA` g CD31 * * * * lmm 40 µm40 µm B * * * M2R 20 µm * * * B * * * M2R 20 µm20 µm * * * CD31 20 µmB` * * * * * * CD31 20 µm20 µmB` * * * * * * Abbildung 22: Pars pylorica, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31) In beiden Bilderpaaren sind identische Zellen direkt unterhalb des Oberflächenepithels sowohl mit dem M2R-Antiköper als auch mit dem CD31-Antikörper angefärbt (Sternchen). Die Bilder B und B´ sind eine Vergrößerung aus diesem Tunica mucosa- Bereich. Unterschiede sind im Stratum circulare (sc) der Tunica muscularis und in der Lamina muscularis mucosae (lmm) zu sehen. Diese sind nur durch den M2R- Antikörper angefärbt. In der Tela submucosa ist hingegen die Gefäßmuskulatur (g) mit dem M2R-Antikörper unmarkiert, während dort Endothelzellen durch den PECAM-1- Antikörper markiert werden (Bilder A und A´). 47 M2R A 40 µm M2R A 40 µm40 µm SMA A` 40 µm SMA A` 40 µm40 µm merge 40 µmA`` merge 40 µm40 µmA`` M2R B M2R B CD31 B` CD31 B` merge B`` merge B`` Abbildung 23: Pars pylorica, lumennaher Mukosabereich, CLSM Die A-Serie wurde mit dem M2R-Antikörper (rot) und αSMA-Antikörper (grün) inkubiert. Man erkennt M2R-markierte Zellen im luminalen Mucosadrittel, während glatte Muskelzellen in den tieferen Lagen zu finden sind. Doppelt angefärbte Zellen sind nicht zu sehen. In Serie B wurden der M2R-Antikörper (rot) und der CD31-Antikörper (grün) verwendet. Im überlagerten Bild erkennt man, dass beide Antiköper identische Zellen in der Tunica mucosa anfärben (gelbe Färbung). 48 3.2.4-3.2.6 Duodenum, Jejunum, Ileum Im Duodenum, Jejunum und Ileum zeigte die Immunfluoreszenz mit dem M2R- Antikörper eine deutliche Immunreaktion im Bereich der Tunica muscularis und in den Zottenspitzen bei der Wildtypmaus, nicht jedoch im M2R-gendefizienten Tier (Abbildungen 24, 27, 32). Unspezifisch, da ebenfalls im Knockouttier markiert, banden das Mesothel (Abbildung 32) und Zellen der Glandulae (Abbildung 24 und 27) den Antikörper. Die Doppelimmunfluoreszenz mit dem M2R- und dem αSMA-Antikörper zeigte, dass alle glatten Muskelzellen der Tunica muscularis den M2R exprimierten (Abbildung 25, 28 und 33). Im Duodenum und Jejunum fehlte eine Lamina muscularis mucosae (Abbildung 28). Erst im Ileum existierte wieder eine dünnschichtige, nur durch den αSMA-Antikörper markierte Lamina muscularis mucosae (Abbildung 33). Allen Dünndarmabschnitten gemeinsam waren wiederum die in den apikalen Zottenbereich gelegenen deutlich für den M2R immunreaktiven Zellen (Abbildung 25, 29, 34). Alle Aufnahmen aus diesem lumennahen Bereich zeigten keine Co-Lokalisation mit αSMA- Immunreaktivität, es handelte sich also nicht um glatte Muskelzellen. Auch glatte Muskelzellen der Muskelpumpe und der Gefäßmuskulatur exprimierten keinen M2R. Die unterschiedliche Lage von M2R- und αSMA-markierten Zellen in den Villi zeigt stellvertretend für alle Dünndarmabschnitte die CLSM Bildserie des Ileums (Abbildung 37). Die Doppelimmunfluoreszenz mit M2R- und PECAM-1-Antikörpern zeigten für genau diese Zellen eine Doppelmarkierung (Abbildung 26, 31, 36). Während die immunreaktiven Endothelzellen die gesamte Zotte durchliefen, lagen die M2R- positiven Zellen fast ausschließlich im zum Lumen gerichteten Anteil (Abbildung 30, 31). In der Tela submucosa gelegene Endothelzellen wurden im Gegensatz dazu nicht mit dem M2R-Antikörper markiert (Abbildung 35). Die für diese Antikörper mittels CLSM aufgenommene Bildserie verdeutlicht die Co-Lokalisation (Abbildung 37). 49 3.2.4 Duodenum A sl M2R sc gl gl 40 µmA sl M2R sc gl gl 40 µm40 µm B M2/3R- m 40 µmB M2/3R- m 40 µm40 µm C M2R 20 µm * * C M2R 20 µm20 µm * * M2/3R- D 20 µm M2/3R- D 20 µm20 µm Abbildung 24: Duodenum, Immunfluoreszenz mit dem M2R-Antikörper Die Tunica muscularis und Zellen in den Zottenspitzen sind deutlich immunreaktiv für den M2R (Bild A). Die Bilder C und D zeigen Vergrößerungen aus dem Zottenbereich. Hier liegen M2R angefärbte Zellen fast ausschließlich im apikalen Zottenbereich (Sternchen in Bild C). Drüsen (gl, Bild A) und Mesothel (m, Bild B) werden unspezifisch markiert. Eine Lamina muscularis mucosae ist in den Duodenumabschnitten nicht vorhanden. 50 M2R A 40 µm * * * M2R A 40 µm40 µm * * * SMA A` * * * 40 µm SMA A` * * * 40 µm40 µm * M2R B 20 µm * * * M2R B 20 µm20 µm * * SMA B` * 20 µm * * SMA B` * 20 µm20 µm * * Abbildung 25: Duodenum, apikaler Zottenbereich, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA Es zeigen sich M2R-markierte Zellen (Sternchen) insbesondere im apikalen Bereich der Zotten (Bilder A und B), während Zellen der Muskelpumpe (grün) diesen nicht erreichen. Sternchen kennzeichnen identische Zellen im jeweiligen Bildpaar. 51 M2R A 20 µm M2R A 20 µm20 µm M2R B 40 µm M2R B 40 µm40 µm CD31 A` 20 µm CD31 A` 20 µm20 µm CD31 B` 40 µm CD31 B` 40 µm40 µm merge A`` 20 µm merge A`` 20 µm20 µm merge B`` 40 µm merge B`` 40 µm40 µm Abbildung 26: Duodenum, apikaler Zottenbereich, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31) In Bildserie A findet sich eine intensive Anfärbung von M2R-positiven Zellen im apikalen Bereich der Zotten. Genau diese Zellen werden auch mit dem CD31- Antikörper markiert. Dies verdeutlich Serie B, welche eine Vergrößerung eines Zottenabschnittes zeigt. Die gelbliche Markierung in den Bilden A`` und B`` zeigt die Doppelmarkierung an. 52 3.2.5 Jejunum M2R A 40 µm * gl tm M2R A 40 µm40 µm * gl tm M2/3R- B 40 µm gl gl tm M2/3R- B 40 µm40 µm gl gl tm M2R C 20 µm * * ** M2R C 20 µm20 µm * * ** M2/3R- D 20 µm M2/3R- D 20 µm20 µm Abbildung 27: Jejunum, Immunfluoreszenz mit dem M2R-Antikörper Deutliche Anfärbung der Tunica muscularis (tm) sowie von Zellen in den Zotten (Sternchen, Bilder A und C). Zellen der Glandulae (gl) sind auch im M2R- gendefizienten Tier angefärbt (Bild B). Im Jejunum ist keine Lamina muscularis mucosae vorhanden. Bild D zeigt einen Zottenabschnitt aus einer M2R-gendefizienten Maus. 53 M2R A 40 µm tm M2R A 40 µm40 µm tm SMA A` 40 µm tm SMA A` 40 µm40 µm tm M2R B 40 µm tm * * * * M2R B 40 µm40 µm tm * * * * SMA B` tm * * 40µm * * SMA B` tm * * 40µm40µm * * M2R C 40 µm * * M2R C 40 µm40 µm * * SMA C` 40 µm * * SMA C` 40 µm40 µm * * Abbildung 28: Jejunum, Doppelimmunfluoreszenz mit dem Antikörper gegen M2R und αSMA Anfärbung der Tunica muscularis (tm, Bildpaare A und B) sowie von Zellen in den Zotten. Die komplette Tunica muscularis ist auch für den αSMA immunreaktiv (Bilderpaare A und B). Während der M2R nur im luminalen Bereich der Zotten zu finden ist (Sternchen), sind glatte Muskelzellen der Zottenpumpe in dieser Region nicht vorhanden (Bilderpaar C). 54 M2R A 20 µm M2R A 20 µm20 µm M2R B * 20 µm M2R B * 20 µm20 µm SMA A` 20 µm SMA A` 20 µm20 µm SMA B` * 20 µm SMA B` * 20 µm20 µm merge A`` 20 µm merge A`` 20 µm20 µm Abbildung 29: Jejunum, lumennaher Zottenbereich, Immunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA In diesen Vergrößerungen verdeutlicht sich die unterschiedliche Lage der M2R- und der αSMA–positiven Zellen. M2R–positive Zellen sind hauptsächlich direkt subepithelial oder im lumennahen Bereich vorhanden (Bilder A und B), während glatte Muskelzellen in den meisten Fällen den apikalen Bereich nicht erreichen oder getrennt von M2R-markierten Zellen liegen (Bilder A`, A`` und B`). 55 M2R A 40 µm tm * * M2R A 40 µm40 µm tm * * CD31 A` 40 µm tm * * CD31 A` 40 µm40 µm tm * * M2R B 40 µm sc * * * M2R B 40 µm40 µm sc * * * B` sc * * * CD31 40 µmB` sc * * * CD31 40 µm40 µm Abbildung 30: Jejunum, Doppelimmunfluoreszenz gegen M2R und PECAM-1 (CD31) Die Bilder A und B zeigen eine mit dem M2R-Antikörper deutlich angefärbte Tunica muscularis (tm, Bild B nur Stratum circulare (sc) abgebildet) sowie gefärbte Zellen im subepithelialen Zottenbereich (Sternchen). Die mit CD31-Antikörper angefärbten Endothelzellen durchlaufen die kompletten Villi (Bilder A` und B`) und sind nur im adluminalen Bereich ebenfalls mit dem M2R-Antikörper markiert. 56 M2R A 20 µm M2R A 20 µm20 µm CD31 A` 20 µm CD31 A` 20 µm20 µm merge A`` 20 µm merge A`` 20 µm20 µm Abbildung 31: Jejunum, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31) Die Bildserie zeigt eine Vergrößerung aus dem Zottenbereich. Die M2R sind nur im adluminalen Bereich zu erkennen (Bild A), während die Endothelzellen die Villi komplett durchlaufen (Bild A`). Dies verdeutlicht das Überlagerungsbild A``. 57 3.2.6 Ileum M2R A 40 µm tm M2R A 40 µm40 µm tm M2/3R- B 40 µm tm m gl gl M2/3R- B 40 µm40 µm tm m gl gl M2R C 20 µm M2R C 20 µm20 µm M2/3R- D 20 µm M2/3R- D 20 µm20 µm Abbildung 32: Ileum, Immunfluoreszenz mit dem M2R-Antikörper Auch im Ileum ist die Tunica muscularis (tm) deutlich für den M2R immunraktiv (Bild A). In den Zotten sind Zellen, wie auch im übrigen Dünndarm, besonders im adluminalen Bereich angefärbt (Bild C). In einem M2R-gendefizienten Tier sind in gleichen Ileum- Abschnitten weder die Tunica muscularis (tm, Bild B) noch Zellen in den Zotten angefärbt (Bild D). Einzig das Mesothel (m) und Zellen der Glandulae (gl) erscheinen unspezifisch markiert (Bild B). 58 M2R A lmm g sc * * * * 40 µm M2R A lmm g sc * * * * 40 µm40 µm SMA A` lmm g sc * * * * 40 µm SMA A` lmm g sc * * * * 40 µm40 µm M2R B lmmg 40 µm sc sl M2R B lmmg 40 µm40 µm sc sl SMA B` lmmg 40 µm sc sl SMA B` lmmg 40 µm40 µm sc sl Abbildung 33: Ileum, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA Eine deutliche Anfärbung der Tunica muscularis mit Stratum circulare (sc) und longitudinale (sl) durch beide Antikörper ist in den Bilderpaaren A und B zuerkennen. Eine dünnschichtige Lamina muscularis mucosae (lmm), in der Tela submucosa liegende Gefäßmuskulatur und von der Lamina muscularis mucosae ausgehende glatte Muskelzellen, welche in die Zotten ziehen, sind nur durch den αSMA-Antikörper markiert (Bilder A` und B`). Mit Sternchen sind in Bild A M2R-markierte Zellen in den Zotten gekennzeichnet. Die identischen Zellen in Bild A` sind nicht durch den αSMA- Antikörper markiert. 59 M2R A * * 20 µm M2R A * * 20 µm20 µm M2R B 20 µm M2R B 20 µm20 µm SMA A` * * 20 µm SMA A` * * 20 µm20 µm SMA B` 20 µm SMA B` 20 µm20 µm merge B`` 20 µm merge B`` 20 µm20 µm Abbildung 34: Ileum, Vergrößerung der adluminalen Zottenabschnitte, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA Es ist keine Übereinstimmung von M2R- (Sternchen in Bildserie A, A`) und αSMA- markierten Zellen zu erkennen. 60 M2R tm 40 µmA * * M2R tm 40 µm40 µmA * * CD31 A` g tm * * 40 µm CD31 A` g tm * * 40 µm40 µm M2R B tm* 40 µm * ** M2R B tm* 40 µm40 µm * ** CD31 B` tm * ** * 40 µm CD31 B` tm * ** * 40 µm40 µm Abbildung 35: Ileum, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31) Die Tunica muscularis (tm) ist immunreaktiv für den M2R-Antikörper. In der Zottenspitze sind ebenfalls markierte Zellen zu finden (Sternchen in den Bildern A und B). Diese sind identisch mit den PECAM-1-positiven Endothelzellen (Sternchen in den Bildern A` und B`). In der Tela submucosa liegende Gefäßendothelien (g) werden nur von dem PECAM-1 Antikörper markiert (Bild A`). 61 M2R A 20 µm * * * M2R A 20 µm20 µm * * * CD31 A` 20 µm * * * CD31 A` 20 µm20 µm * * * M2R B * * * * 20 µm * M2R B * * * * 20 µm20 µm * CD31 B` * * * * 20 µm * CD31 B` * * * * 20 µm20 µm * Abbildung 36: Ileum, Vergrößerung aus dem luminalen Zottenbereich, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31) In unmittelbarer Nähe zu dem Epithel liegen doppelt markierte Zellen (Sternchen). Die markierten Endothelzellen durchlaufen die gesamte Zotte, M2R-positive Zellen sind fast ausschließlich im zum Lumen gerichteten Anteil gelegen. 62 M2R A M2R A SMA A` SMA A` merge A`` merge A`` M2R B M2R B CD31 B` CD31 B` merge B`` merge B`` Abbildung 37: Ileum, Zottenspitzen, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA (Serie A), sowie mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31) (Serie B), CLSM-Aufnahme Bildserie A zeigt die unterschiedliche Lage von M2R und αSMA markierten Zellen in den Villi. Bildserie B verdeutlich die Co-Lokalisation des M2R mit PECAM-1 (gelb). 63 3.2.7 Caecum Die Vergleichsaufnahmen zwischen einer M2R KO- und einer Wildtypmaus zeigten M2R-exprimierende Zellen in der Tunica muscularis und im lumennahen Bereich der Lamina propria mucosae (Abbildung 38). Im Gewebe des gendefizienten Tiers wurden keine Zellen markiert. Die Doppelimmunfluoreszenz mit dem M2R- und dem αSMA- Antikörper zeigte nur eine Doppelmarkierung der Tunica muscularis (Abbildung 39), während die Lamina muscularis mucosae, glatte Gefäßmuskulatur und Myozyten der Muskelpumpe nur für den αSMA-Antikörper positiv waren (Abbildung 40). Die Bilder mit dem PECAM-1-Antikörper, insbesondere die Vergrößerungsaufnahmen aus der epithelnahen Schicht, zeigten eine Markierung der M2R-immunreaktiven Zellen, welche unter dem Oberflächenepithel in der Lamina propria lagen (Abbildung 41 und 42). M2R A 40 µm sc * * * * M2R A 40 µm40 µm sc * * * * M2/3R- B tm 40 µm M2/3R- B tm 40 µm40 µm M2R C * * * 20 µm M2R C * * * 20 µm20 µm M2/3R- D 20 µm M2/3R- D 20 µm20 µm Abbildung 38: Caecum, Immunfluoreszenz mit dem M2R-Antikörper Vergleichsaufnahmen zwischen einer M2R KO- und einer Wildtyp-Maus. M2R- exprimierende Zellen liegen in der Tunica muscularis (Bild A, nur Stratum circulare (sc) angeschnitten) und im lumennahem Bereich der Lamina propria mucosae (Sternchen 64 in den Bildern A und C). Im Gewebe des gendefizienten Tieres sind keine Zellen markiert (Bilder B und D). M2R A tm * * * * * 40 µm M2R A tm * * * * * 40 µm40 µm A` 40 µm lmm SMA tm * * * * A` 40 µm40 µm lmm SMA tm * * * * M2R B 20 µm ** * M2R B 20 µm20 µm ** * SMA B` 20 µm ** * SMA B` 20 µm20 µm ** * Abbildung 39: Caecum, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA Die Tunica muscularis ist doppelt markiert (tm, Bilderpaar A, A`). Die Lamina muscularis mucosae (lmm) ist nur für αSMA positiv (Bild A`). Vergrößerungen aus dem Epithelbereich zeigen, dass M2R-positive Zellen keine Zellen der Muskelpumpe sind (Bilder B, B`). 65 M2R A 20 µm M2R A 20 µm20 µm SMA 20 µmA` SMA 20 µm20 µmA` merge 20 µmA`` merge 20 µm20 µmA`` Abbildung 40: Caecum, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA Diese Serie zeigt einen lumennahen Epithelbereich. Wie im Überlagerungsbild A`` verdeutlicht, sind die M2R-markierten Zellen keine glatten Muskelzellen. 66 M2R A tm * * * * 40 µm M2R A tm * * * * 40 µm40 µm A` tm 40 µm CD31 * * * * A` tm 40 µm40 µm CD31 * * * * M2R B * * * 20 µm M2R B * * * 20 µm20 µm B` 20 µm M2R * * *B` 20 µm20 µm M2R * * * Abbildung 41: Caecum, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31) Im Querschnitt zeigen sich M2R-markierte Zellen im Bereich der Tunica muscularis (tm) und der Lamina propria (Sternchen, Bildpaar A, A`). Markierte Endothelzellen kommen dagegen nur vereinzelt in der Tunica muscularis vor (Bild A`), erscheinen aber identisch mit den M2R-positiven Zellen in der Lamina propria (Sternchen in B und B´). 67 M2R A 20 µm M2R A 20 µm20 µm CD31 A` 20 µm CD31 A` 20 µm20 µm merge A`` 20 µm merge A`` 20 µm20 µm Abbildung 42: Caecum, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und PECAM-1 (CD31) Die Vergrößerung der lumennahen Schicht verdeutlicht als gelbliche Überlagerung eine Doppelmarkierung (A``). 68 3.2.8 Colon descendens Im Colon descendens zeigte sich bei Testung der Antikörperspezifität eine deutliche Immunreaktion in der Tunica muscularis und der Lamina muscularis mucosae sowie in den bereits oben beschriebenen subepithelialen Zellen. Bei der gendefizienten Maus erschienen Becherzellen unspezifisch markiert. Auffällig für diesen Darmabschnitt war eine wieder deutlich ausgeprägte Lamina muscularis mucosae (Abbildung 43). Diese wurde, ebenso wie die Tunica muscularis, doppelt mit dem αSMA- und dem M2R- Antikörper markiert (Abbildung 44). Glatte Muskelzellen, welche ausgehend von der Lamina muscularis mucosae bis in den subepthelialen Bereich zogen, waren dies nicht (Abbildung 45). Vergrößerungsbilder des Epithelbereiches verdeutlichen, dass vereinzelte Zellen direkt unterhalb des Oberflächenpithels den M2R exprimierten, während glatte Muskelzellen diesen Bereich nicht erreichten (Abbildung 45). Diese lumennahen Zellen waren Endothelzellen, wie die Doppelimmunfluoreszenz mit dem M2R- und dem PECAM-1-Antikörper verdeutlicht (Abbildung 46). Weitere doppelt positive Zellen bestanden nicht. Markierte Endothelzellen in der Tela submucosa zeigten keine Immunreaktion mit dem M2R-Antikörper (Abbildung 46). Die CLSM- Bilderserien, welche jeweils für einen lumennahen Mukosabereich angefertigt wurden, zeigten den gleichen Befund wie die oberen Abschnitte des Magen-Darm-Kanals: eine Co-Lokalisation der M2R- und der PECAM-1-Immunreaktivität (Abbildung 48) sowie keine Doppelmarkierung mit dem αSMA-Antikörper (Abbildung 47). 69 M2R A 40 µm lmm sc * * * ** M2R A 40 µm40 µm lmm sc * * * ** M2/3R- B 40 µm lmm sc M2/3R- B 40 µm40 µm lmm sc M2R C 20 µm ** * M2R C 20 µm20 µm ** * M2/3R- D 20 µm M2/3R- D 20 µm20 µm Abbildung 43: Colon descendens, Immunfluoreszenz mit dem M2R-Antikörper Es sind deutliche Anfärbungen im Stratum circulare (sc) der Tunica muscularis, der Lamina muscularis mucosae (lmm) sowie von Zellen im subepithelialen Bereich (Sternchen, Bilder A und C) in den Schnitten der Wildtyp-Maus zu erkennen. Bei der gendefizienten Maus erscheinen Becherzellen, welche sich um die Kryptenlichtungen gruppieren, unspezifisch markiert (Bilder B und D). 70 A M2R 40 µm lmm sc e A M2R 40 µm40 µm lmm sc e B M2R 40 µm sc lmm e B M2R 40 µm40 µm sc lmm e SMA A` 40 µm lmm sc e SMA A` 40 µm40 µm lmm sc e SMA B` 40 µm sc lmm e SMA B` 40 µm40 µm sc lmm e A`` merge 40 µm lmm sc e A`` merge 40 µm40 µm lmm sc e Abbildung 44: Colon, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA Beide Schnitte durch die Schleimhaut zeigen ein doppelt angefärbtes Stratum circulare (sc) der Tunica muscularis und Lamina muscularis mucosae (lmm). M2R- immunreaktive Zellen finden sich in der Lamina propria mucosae in unmittelbarer Nähe des hochprismatischen Epithels (e) (Bilder A und B). Glatte Muskelzellen ziehen, ausgehend von der Lamina muscularis mucosae, bis in den subepithelialen Bereich (Bilder A` und B`). Das Bild A`` ist ein Überlagerungsbild, indem doppelt angefärbte Zellen gelblich erscheinen. 71 M2R e A * * * 20 µm M2R e A * * * 20 µm20 µm M2R B 20 µm e * * * M2R B 20 µm20 µm e * * * SMA A` e * * * 20 µm SMA A` e * * * 20 µm20 µm SMA B` e 20 µm * * * SMA B` e 20 µm20 µm * * * merge 20 µmB`` e merge 20 µm20 µmB`` e Abbildung 45: Colon, Vergrößerung des Oberflächenepithelbereiches, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA Während M2R-exprimierende Zellen (Sternchen in den Bildern A und B) vereinzelt direkt unter dem Oberflächenepithel (e) vorkommen, erreichen glatte Muskelzellen diesen Bereich nicht (Bilder A´, und B`). Dies verdeutlich das Überlagerungsbild B``. 72 M2R sc sl lmm A e 40 µm * * * M2R sc sl lmm A e 40 µm40 µm * * * M2R B 20 µm e ** * M2R B 20 µm20 µm e ** * CD31 A` sc sl lmm e g 40 µm * * * CD31 A` sc sl lmm e g 40 µm40 µm * * * CD31 20 µm e B` ** * CD31 20 µm20 µm e B` ** * merge 40 µmA`` sc sl lmm e g * * * merge 40 µm40 µmA`` sc sl lmm e g * * * merge 20 µm e B`` ** * merge 20 µm20 µm e B`` ** * Abbildung 46: Colon, Doppelimmunfluoreszenz mit M2R- und PECAM-1 (CD31)-Antikörpern Das Bild A zeigt eine deutliche Markierung mit dem M2R-Antikörper in der Tunica muscularis (Stratum circulare (sc) und Stratum longitudinale (sl)), der Lamina muscularis mucosae (lmm) und von Zellen im Epithelbereich (e). Bild A`` verdeutlicht, dass Endothelzellen (g) in der Submucosa keinen M2R exprimieren, während Endothelzellen in der lumennahen Mukosa (Sternchen) dies tun (Bildserie B). 73 M2R A 20 µm M2R A 20 µm20 µm SMA A` 20 µm SMA A` 20 µm20 µm merge A`` 20 µm merge A`` 20 µm20 µm Abbildung 47: Colon, lumennaher Mukosabereich, CLSM, Doppelimmunfluoreszenz mit Antikörpern gegen M2R und αSMA In den CLSM-Bildern verdeutlicht sich, dass die M2R-positiven Zellen unterhalb des Epithels nicht αSMA-immunreaktiv sind (merge). M2R-posit