Funktionelle Charakterisierung der SANT-Domänen des Korepressors N-CoR Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften vorgelegt beim Fachbereich 08 der Justus-Liebig-Universität in Giessen von Jens Tiefenbach aus Gladenbach Frankfurt im August 2003 vom Fachbereich 08 (naturwissenschaftlicher Fachbereich) der Justus-Liebig Universität als Dissertation angenommen. Dekan: Prof. Dr. Jürgen Janek Gutachter: Prof. Dr. Rainer Renkawitz. PD. Dr. Thorsten Heinzel Inhaltsverzeichnis Zusammenfassung 1 Einleitung 1 1.1 Regulation der Transkription durch Chromatinmodifikationen 1 1.2 Die Korepressoren N-CoR und SMRT 6 1.3 Interaktionen der Korepressoren N-CoR / SMRT 9 1.4 Regulation der Korepressoren N-CoR/SMRT 12 1.5 N-CoR/SMRT in der Embryonalentwicklung und in Krankheiten 13 1.6 Das SUMO Protein 15 1.7 Der SUMO-Konjugationsweg 17 1.8 Funktion der SUMO-Modifikation 18 1.9 Aufgabenstellung und Zielsetzung 20 2 Material und Methoden 21 2.1 Chemikalien und Materialien 21 2.2 Plasmide 22 2.3 Antikörper 27 2.4 Spezielle Enzyme und Enzymkits 27 2.5 Peptide 28 2.6 Primer 28 2.7 E.coli Stämme und Anzuchtbedingungen 29 2.8 Zelllinien und Medien 30 2.9 Hefestamm und Anzuhtbedingungen 30 2.10 Lösungen und Puffer 31 2.11 Poymerase-Ketten-Reaktion (PCR) 31 2.12 DNA Methoden 31 2.13 Transformation von Plasmiden in E.coli 33 2.14 Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli 34 2.15 Proteinbiochemische Methoden 34 2.16 In vitro GST-Pulldown 35 2.17 Immunoblot (Western Blot) 36 2.18 Immunopräzipitation (IP) 37 2.19 Methoden der Zellkultur 37 2.20 Transfektion von Säugerzellen 37 2.21 ß-Galactosidasetest 38 2.22 Messung der Luziferaseaktivität / Repressionstest 38 2.23 Immunofluoreszenzanalyse 38 2.24 In vitro SUMO-Modifikation 39 2.25 Far-Western Hybridisierung 40 2.26 In vivo Markierung von 3H Acetyl-Histonen 42 2.27 Histondeacetylasetest 43 2.28 Biacore 43 2.28 Methoden im Hefe-Zwei-Hybrid-System 44 3 Ergebnisse 47 3.1 Far Western Blot Hybridisierung 47 3.1.1 Sonde für die Far Western Blot Hybridisierung 47 3.1.2 Far Western Blot Hybridisierung mit der N-CoR SANT1+2-Domäne 48 3.2 Identifikation von Interaktionspartnern des Korepressors N-CoR 51 3.2.1 Hefe-Zwei-Hybrid Screen mit der N-CoR SANT1+2-Domäne 51 3.2.2 Interaktionspartner im Hefe-Zwei-Hybrid Screen 54 3.2.3 In vitro Proteininteraktionen mit den SANT-Domänen 59 3.2.4 Eingrenzung des Interaktionsbereichs innerhalb der N-CoR SANT1+2-Domäne 61 3.2.5 PIAS1 und die cDNA I interagieren mit zusätzlichen Regionen von N-CoR 63 3.3 N-CoR enthält SUMO-Konsensussequenzen 64 3.3.1 PIAS1 und N-CoR interagieren spezifisch in vivo 65 3.3.2 TDG interagiert mit N-CoR in vivo 67 3.3.3 N-CoR ist in vivo modifiziert 68 3.3.4 Detektion der N-CoR Sumoylierung 69 3.3.5 N-CoR in vitro SUMO-Modifikationstest 70 3.3.6 N-CoR und PIAS1 kolokalisieren in vivo 71 3.3.7 PIAS1 vermindert die Repression von N-CoR 73 3.3.8 Alaninsubstitutionen in der N-CoR SANT1-Domäne 74 3.3.9 Deletionen der N-CoR SANT1, SANT2 und SANT1+2-Domänen 77 3.3.10 Immunfluoreszenzfärbung der Gal-N-CoR∆Sumo Mutanten 78 3.3.11 Repressionstest verschiedener N-CoR Mutanten 80 3.3.12 HDAC3 interagiert nicht mit N-CoR∆SANT1 81 3.4 Die SANT1-Domäne von N-CoR vermittelt die Histonbindung 83 3.4.1 Die N-CoR SANT1-Domäne interagiert mit Histon H3 / H4 84 3.4.2 Die N-CoR SANT1+2-Domäne interagiert mit Histonpeptiden 85 3.4.3 Interaktion der SANT1-Domäne mit Histonen mittels Biacore-Messung 86 3.4.4 Kombination von Histoninteraktionsdomänen mit N-CoR SANT-Domänen 89 3.4.5 HDAC3 Aktivierung durch N-CoR DAD SANT1 91 4 Diskussion 94 4.1 Die N-CoR SANT-Domänen vermitteln Proteininteraktionen 93 4.2 N-CoR ist SUMO modifiziert 96 4.3 Änderung der N-CoR Lokalisation durch heterologe Expression der SUMO-E3-Ligase PIAS1 98 4.4 Funktionelle Bedeutung der N-CoR Sumoylierung 100 4.5 Potentielle Interaktionspartner der N-CoR SANT-Domäne 103 4.6 Die N-CoR SANT Domäne vermittlelt Histonbindung 104 4.7 Die SANT-Domäne als HDAC-Aktivierungsdomäne 109 5 Literaturverzeichnis 112 6 Abkürzungsverzeichnis 126 5. Zusammenfassung Zusammenfassung Der Korepressor N-CoR vermittelt die Repression von nukleären Hormonrezptoren in Abwesenheit ihrer Liganden und ist darüber hinaus für die embryonale Entwicklung von Säugern entscheidend. N-CoR ist in der Zelle mit Histondeacetylasen (HDACs) komplexiert. Diese Enzyme bewirken im Zusammenspiel mit ihren Gegenspielern, den Histonacetyltransferasen, durch Deacetylierung und Acetylierung von Histonen eine dynamische Modifikation des Chromatins und beeinflussen so die Transkription von Genen. Die Interaktion zwischen regulatorischen Proteinen, Histonen und histon- modifizierenden Proteinen ist ein fundamentaler und konservierter Mechanismus der Genregulation in höheren Eukaryonten. Die Histonkodehypothese von Rice und Allis (2000) beschreibt, dass bestimmte Proteindomänen existieren, die spezifisch an posttranslational modifizierte Histone binden und so die Genexpression regulieren. Für Faktoren die Bromodomänen und Chromodomänen enthalten, konnten spezifische Interaktionen zu modifizierten Histonen gezeigt werden. Koregulatoren (Koaktivatoren und Korepressoren) und Transkriptionsfaktoren enthalten eine Fülle noch uncharakterisierter Domänen, die in ähnlicher Weise wirken könnten. Der Korepressor N-CoR enthält beispielsweise zwei uncharakterisierte SANT-Domänen. Die SANT-Domäne ist zwischen Hefe und Säugern konserviert und spielt vermutlich in der Chromatinmodifizierung oder Transkription eine Rolle. In der vorliegenden Arbeit wurden verschiedene Screeningmethoden zur Identifikation von Interaktionspartnern der N-CoR SANT-Domänen eingesetzt. Far- Western-Blot Hybridisierungen zeigten mehrere potentielle Interaktionspartner der N-CoR SANT 1+2-Domäne (As 425-758). In einem Hefe-Zwei-Hybrid Screen war es möglich, Interaktionspartner der N-CoR SANT-Domäne zu isolieren. Insgesamt 14 verschiedene Proteine wurden in dem Hefescreen identifiziert. Die Proteine PIAS1, Ubc9, TDG, Hoxa-4, TAFII250 und cDNA I interagierten in vitro in einem Pulldown- Experiment spezifisch mit der N-CoR SANT1-Domäne. Die Interaktionen waren spezifisch für den Korepressor N-CoR und es konnte ein Unterschied zwischen der SANT1 und der SANT2-Domäne festgestellt werden. Drei der im Hefescreen gefundenen Proteine (PIAS1, Ubc9 und Pc2) deuteten darauf hin, dass N-CoR durch die Konjugation von SUMO-Proteinen posttranslational modifiziert sein könnte. In Ko-Immunopräziptitationen konnte die Interaktion zwischen N-CoR und der SUMO-E3-Ligase PIAS1 in vivo bestätigt werden. Die N-CoR SUMO-Modifikation wurde indirekt in vivo und in einem in vitro Sumoylierungstest nachgewiesen. Endogenes N-CoR und PIAS1 kolokalisieren im Zellkern, wobei die heterologe Expression der SUMO-E3 Ligase die für N-CoR typische Aggregatbildung im Kern verhindert und eine diffusere Verteilung und eine 5. Zusammenfassung Häufung in der Nähe der Kernmembran induziert. In Kolokalisierungsstudien konnte ferner gezeigt werden, dass eine N-CoR-∆SUMO Konsensussequenzmutante eine veränderte zytoplasmatisch-nukleäre Lokalisation aufweist. Dies traf ebenfalls auf ∆SANT-Mutanten von N-CoR zu, die im Vergleich zum N-CoR Wildtypprotein eine unterschiedliche Lokalisation bei heterologer Expression von PIAS1 zeigten. Die Koexpression von PIAS1 reduzierte die Repression eines Luziferasereporters durch N-CoR. Andererseits war die Repression des Proteins ebenfalls durch Alanin- Substitution in potentiellen SUMO-Stellen vermindert. Im Hefescreen wurden weiterhin Proteine wie RanBP9, Pc2, TDG, TAFII250, CGBP, BTBD1, Hoxa-4 und eine uncharakterisierte cDNA I als interessante N-CoR Interaktionspartner identifiziert. Einige dieser Proteine erlaubten aufgrund publizierter Daten eine hypothetische Deutung ihrer Funktion im N-CoR Korepressorkomplex. Vielversprechend für zukünftige Untersuchungen sind die Proteine Pc2, BTBD1, RanBP9, TDG und TAFII250, auf die im Rahmen dieser Arbeit aber nicht näher eingegangen werden konnte. Die SANT-Domäne wurde ferner im Zusammenhang der Histonkodehypothese betrachtet. In Pulldown-Experimenten konnte gezeigt werden, dass die N-CoR SANT1-Domäne Histonbindung vermittelt. Die N-CoR SANT1-Domäne interagierte mit hyperacetylierten Histonen, hauptsächlich mit H3 und in geringerem Umfang mit H4. Die SANT2-Domäne des Korepressors hingegen interagierte nicht mit Histonen. Untersuchungen mit Histonpeptiden zeigten eine starke Interaktion der N-CoR SANT1+2-Domäne mit unmodifizierten Histonpeptiden H2A, H2B, H3 oder H4. Mit der Biacore-Technologie wurde das Ergebnis der Interaktion zwischen der N-CoR SANT1-Domäne und den Histonen bestätigt. Eingeschlossen in die Untersuchung wurde die enzymatische Aktivität rekombinanter HDACs unter dem Gesichtspunkt der Histonbindung der SANT-Domäne. Für rekombinante HDAC3 konnte die Aktivierung durch die N-CoR Deacetylaseaktivierungs-Domäne, bestätigt werden. Eine Aktivierung weiterer HDACs mit SANT-Chimärenproteinen war nicht möglich Die spezifische Substraterkennung chromatinmodifizierender Proteine ist eine elementare Fragestellung für die Klärung der molekularen Mechanismen der Chromatinregulation. Die Entschlüsselung des Histoncodes und die Zusammen- setzung bzw. das Wirken regulatorischer Proteinkomplexe wird auch für die nächsten Jahre eine wichtige Forschungsarbeit darstellen. In der vorliegenden Arbeit wurden die Zusammenhänge zwischen den N-CoR SANT-Domänen und der Histonkodehypothese weiterentwickelt und spezifische Proteininteraktionen dieser Domäne charakterisiert. 1. Einleitung 1 Einleitung In mehrzelligen Organismen bewirkt die selektive Expression bestimmter Gene die Entstehung verschiedener Zelltypen, die in einer Fülle von Organen unterschiedliche Funktionen wahrnehmen. Die temporäre und zellspezifische Kontrolle der Genexpression ist einer der fundamentalsten Prozesse der Biologie. Die genetische Information eines Lebewesens ist auf ihrer DNA gespeichert, welche im Komplex mit Proteinen vorliegt und als Chromatin bezeichnet wird. Die Umschreibung von DNA- Abschnitten (Genen) in Ribonukleinsäuren bezeichnet man als Transkription. Die Enzyme, die diesen Vorgang katalysieren, sind DNA-abhängige-RNA-Polymerasen (RNA Pol). Die Initiationsrate der Polymerase an regulatorische DNA-Stellen (Promotoren) wird durch DNA-bindende Aktivatoren, basale Transkriptionsfaktoren, Koregulatoren (Koaktivatoren und Korepressoren) und chromatinmodifizierende Proteine unterstützt oder inhibiert. Modifikationen des Chromatins zeigen aktive (Euchromatin) oder stille (Heterochromatin) Bereiche der Genexpression an. Im Genom mehrzelliger Organismen dient ein hoher Prozentsatz der Genprodukte der Kontrolle der Genexpression: Diese Genprodukte sind lediglich für die Unterscheidung der zellspezifischen und temporären Transkription bestimmter Gene verantwortlich. Die Frage der Regulierung, der Zusammensetzung aber auch der Kommunikation dieser chromatinmodifizierenden Komplexe untereinander, ist elementar für das Verständnis der molekularen Mechanismen, die der Entstehung vieler Erkrankungen, wie zum Beispiel Krebs zugrunde liegen. 1.1 Regulation der Transkription durch Chromatin- modifikationen Bei den chromatinassoziierten Proteinen handelt es sich um zwei generelle Gruppen DNA-bindender Faktoren, die hochkonservierten globulären Histone und die Nicht- Histon-Proteine. Das Nukleosom stellt die sich wiederholende Struktureinheit des Chromatins dar und besteht aus 146 Basenpaaren DNA, die um ein Histonoktamer, bestehend aus jeweils zwei Molekülen der Core-Histone H2A, H2B, H3 und H4, gewunden sind. Der C-Terminus der Core-Histone interagiert mit den jeweiligen anderen C-Termini und bildet so das Nukleosomen-Core (Arents et al., 1991; Luger et al., 1997). Die hydrophilen N-terminalen Bereiche der Core-Histone (Abb. 1.1) haben eine flexible Struktur und ragen aus dem Nukleosomen-Core heraus. Sie werden daher auch als Histonschwänze bezeichnet (Luger and Richmond, 1998). Jedes Nukleosomen ist durch Linker-DNA, an die ein Histon H1 und HMG Proteine binden, von dem nächsten Nukleosom separiert (Hill, 2001). Die DNA wird durch das Core- Histonoktamer und das Linker-Histon H1 zwischen den Nukleosom verpackt und 1 1. Einleitung bildet Chromatinketten, welche ihrerseits in eine höhere Chromatinstruktur verpackt werden (Horn and Peterson, 2002). Die Chromatinstruktur ist äußerst dynamisch und bestimmte Aminosäuren der Core-Histone, besonders in den exponierten Seitenketten der N-Termini, sind Ziel posttranslationaler Modifikationen. Zu diesen kovalenten Modifikationen zählen Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, Ubiquitinierung und ADP-Ribosylierung. (Cheung et al., 2000; Strahl and Allis, 2000) Der basische Charakter der Histonschwänze führt beispielsweise durch Acetylierung zu einer veränderten ionischen Ladung des Histon N-Terminus und Abb. 1.1: Posttranslationale Modifikationen an Histon N-termini Histonmethylierung kann sowohl an einem Arginin sowie an einem Lysin erfolgen, Acetylierung und Ubiquitinierung erfolgen ausschließlich an Lysin, ADP-Ribosylierung und Phaosphorylierung an Serinen der Histon N-termini. Die Lysine der Histone H3 und H4 sind ein häufiges Ziel posttranslationaler Modifikation, besonders von Acetylierung und Methylierung. Diese Modifikationen treten auch an Histon H2A und H2B auf (Wolffe and Hayes, 1999). M=Methylierung, P=Phosphorylierung, *=Acetylierung, U=Ubiquitinierung. resultiert in einer Änderung der Chromatinverpackung und der Bindung von Transkriptionsfaktoren und chromatinmodifizierenden Proteinen (Jenuwein and Allis, 2001). Das Lysin ist Ziel unterschiedlicher posttranslationaler Modifikationen. Diese können im Fall der Acetylierung, Ubiquitinierung und Sumoylierung reversibler Art sein oder im Fall der Methylierung einen permanenten Status besitzen. Ein einzelnes Lysin kann lediglich durch eine Modifikation verändert werden, jedoch können in einem Protein verschiedene Lysine unterschiedliche Gruppen tragen (Jenuwein and Allis, 2001). 2 1. Einleitung Die Fähigkeit der Histone die DNA im Nukleus zu verpacken und zu kondensieren stellt über die Rekrutierung von DNA-bindenden Faktoren einen zusätzlichen komplexen Prozeß der nukleären Regulierung in bezug auf die Gentranskription, die DNA Replikation, die Rekombination und die DNA Reparatur dar. Die Chromatinstruktur selbst bildet durch Verhinderung der Bindung von Transkriptionsfaktoren an entsprechende DNA-Stellen eine Barriere für die Transkription (Orphanides und Reinberg, 2000). Nukleäre Hormonrezeptoren (NR) gehören zu einer Gruppe von Transkriptionsfaktoren, die die Fähigkeit besitzen ihre Bindungsstellen (response elements) in dieser kompakten Chromatinstruktur zu finden und zu binden (Collingwood et al., 1999; Deroo and Archer, 2001; Hsiao et al., 2002). Die Aktivitäten solcher sequenzspezifischen Transkriptonsfaktoren, welche entweder reprimierend oder aktivierend auf die Expression wirken, werden von Kofaktoren beeinflußt, mit denen sie im Komplex vorliegen. Diese Kofaktoren verändern die Chromatinstruktur lokal und steuern so die Genexpression. Die Rekrutierung chromatinmodifizierender Faktoren zur Veränderung der Chromatinarchitektur wird hauptsächlich durch zwei Strategien verfolgt. Einerseits durch ATP-abhängige chromatinmodifizierende Komplexe (CRCs) und andererseits durch Histon-modifizierende Proteine. Chromatinmodifizierende Komplexe sind zwischen Hefe und Mensch konserviert und benötigen ATP zur Veränderung der Chromatinstruktur (Becker und Hörz, 2002). Es handelt sich um Multiproteinkomplexe, die aufgrund der jeweiligen vorhandenen ATPase in drei Familien (Swi/Snf, ISWI und Mi-2/NURD) zusammengefaßt werden (Becker und Hörz, 2002). Der Mi-2/NURD Komplex besitzt zusätzlich Histondeacetylaseaktivität und verbindet daher die beiden Strategien der Chromatinveränderung: ATP-abhängige Chromatinmodifizierung und Histonmodifikation (Guschin et al., 2000). Histone unterliegen einer Vielzahl posttranslationaler Modifikationen. Die Acetylierung und Deacetylierung von Core-Histonen wurde intensiv studiert und als ein zentraler Regulationsmechanismus der eukaryotischen Genexpression beschrieben (Abb. 1.2). Aktives Chromatin enthält hyperacetylierte Histone, wohingegen die Deacetylierung mit inaktiven Chromatin korreliert (Deckert und Struhl, 2001; Grunstein, 1990; Khochbin et al., 2001; Kuo et al., 2000; Turner, 1993). Der Grad der Histonacetylierung in der Promotorregion wird durch die Rekrutierung von Koregulatorkomplexen und von den jeweils assoziierten enzymatischen Aktivitäten der Histonacetyltransferasen (HATs) oder Histondeacetylasen (HDACs) reguliert (Struhl, 1998). Drei HAT Familien wurden identifiziert: Die GNAT (SAGA/PCAF/Gcn5), die MYST (NuA4/TIP60) und die p300/CBP Familie (Brown et al., 2000; Narlikar et al., 2002). Die verschiedenen HATs sind in verschiedenen Komplexen enthalten und nehmen unterschiedliche biologische Funktionen war. Dies 3 1. Einleitung kann einerseits in der Acetylierung von Core-Histonen oder andererseits der Acetylierung von Nicht-Histon-Proteinen resultieren. HDACs sind in drei Klassen zusammengefaßt: Klasse I HDACs (HDACs 1, 2, 3, und 8) ähneln dem Hefe RPD3 Protein und sind nukleär lokalisiert; Klasse II HDACs (HDACs 4, 5, 6, 7, 9, und 10) sind zu dem Hefeprotein HDA1 homolog und können im Zytoplasma wie auch im Nukleus enthalten sein. Die dritte Klasse HDACs bildet eine strukturell unterschiedliche Klasse von NAD-abhängigen Enzymen, die Ähnlichkeit mit den Hefe SIR2 (silent information regulator 2) Proteinen aufweisen (Gottschling, 2000; Gray und Ekstrom, 2001; Imai et al., 2000; Landry et al., 2000; Rundlett et al., 1996; Smith et al., 2000; Thiagalingam et al., 2003; Vidal und Gaber, 1991). S ta rk a c e ty lie rte C o re -H is o n e b e s o n d e rs H 3 u n d H 4 + g e la d e n e N te rm in i (b in d en b en ach b arte N u k le os om en ) A k tive s C h ro m a tin re p r im ie rte s C h ro m a tin Abb. 1.2: Veränderung der Chromatinstruktur durch Histonmodifikation Posttranslationale Modifikationen an Histonen, wie Acetylierung und Deacetylierung führen zu einer lokalen Veränderung der Chromatinstruktur. Der Verlust der Acetylgruppen an Lysin-Aminosäuren im Histon bedingt eine kompaktere, reprimierte Chromatinstruktur, die es benachbarten Nukleosomen erlaubt, elektrostatische Wechselwirkungen einzugehen. Posttranslationale Modifikationen der Core-Histone führen zur Rekrutierung von Faktoren, die diese Modifikationen durch spezifische Domänen erkennen. Je nachdem welche Modifikationen vorliegen und an welchen Aminosäuren diese erfolgen, ergibt sich ein bestimmter Histonkode, der von spezifischen Proteinen erkannt wird. Modifikationen der gleichen oder benachbarter N-Termini von Histonen sind möglicherweise wechselseitig voneinander abhängig und führen zu einer Fülle verschiedenster Kombinationen der Modifikationen. Strahl und Allis entwickelten diese Hypothese des Histonkodes (Strahl und Allis, 2000). Die Bromodomäne war die erste Domäne, der man eine solche spezifische Interaktion zu einer kovalenten 4 1. Einleitung Histonmodifikation (acetylierte Lysine) zuweisen konnte (Dhalluin et al., 1999; Owen et al., 2000; Winston und Allis, 1999). Die Analyse der Humangenomsequenz zeigt, dass diese Domäne in ungefähr 134 Proteinen enthalten ist; beispielsweise in Transkriptionsfaktoren, die über Histonacetyltransferaseaktivität verfügen (Gcn5, PCAF, TAFII250). Das Protein TAFII250 besitzt eine Tandem Bromodomäne und interagiert präferentiell mit diacetylierten Histonpeptiden (Jacobson et al., 2000). Ferner konnte man zeigen, dass die Acetylgruppe des Lysin 9 im Histone H3 erst durch eine HDAC entfernt werden muß, bevor eine Methylgruppe durch eine Histonmethyltransferase (HMT) übertragen werden kann. Diese Methylierung ist eine stabile Modifikation und resultiert in der Bindung von Chromodomänen enthaltenden Proteinen, die diese Modifikation erkennen. Für das Protein HP1 (heterochromatin protein I) konnte gezeigt werden, dass dieses spezifisch und selektiv methyliertes Lysin 9 des Histons H3 bindet (Bannister et al., 2001). Die Assoziation des HP1 Proteins mit Histonen im Heterochromatin führt zu einer stärker kondensierten Chromatinstruktur und damit zu stark reprimierten Genbereichen. Mittlerweile wurde die Hypothese dahingehend weiterentwickelt, dass beispielsweise die Phosphorylierung eines Serins oder Threonins eine Möglichkeit der dynamischen Beeinflussung der Methylierung und damit der Transkription darstellt. Die Phosphorylierung einer Aminosäure N-terminal, in direkter Nachbarschaft des methylierten Lysins würde in transkriptionell stillen Genabschnitten erfolgen, und die Phosphorylierung C-terminal des methylierten Lysins würde in aktiven Bereichen festzustellen sein (persönliche Mitteilung Allis, Keystone Chromatin Meeting 2003). Histonmodifizierende Proteine enthalten diverse Domänen (Chromo-Shadow, SANT), denen man bis zum jetzigen Zeitpunkt keine Funktion zuordnen konnte. Es ist wahrscheinlich, dass manche dieser Domänen die Hypothese des Histonkods weiterführen. Der INHAT (inhibitor of acetyltransferases) Komplex enthält eine Acetyltransferase inhibierende Domäne, die Histone bindet und so spezifisch diese Stellen als Acetylierungssubstrat maskiert (Seo et al., 2001). In der Zelle existieren eine Fülle von Möglichkeiten wie Proteine mit Histonen in Wechselwirkung treten und so Einfluß auf die Transkription nehmen können. 5 1. Einleitung 1.2 Die Korepressoren N-CoR und SMRT Die Chromatinmodifizierung durch nukleäre Hormonrezeptoren (NR) erfolgt durch die Rekrutierung bestimmter Koaktivator- oder Korepressorkomplexe. Die Rezeptoren können einerseits als Heterodimer oder als Homodimer die Transkription durch direkte Bindung an DNA Erkennungsstellen (response element; RE) aktivieren bzw. reprimieren oder andererseits durch Bindung an andere DNA-gebundene Transkriptionsfaktoren Einfluss auf die Expression eines Zielgenes nehmen (Abb. 1.3). Die molekulare Wirkung vieler nukleärer Hormonrezeptoren gehört aufgrund ihrer Bedeutung in der Biologie und Medizin und aufgrund ihrer einfachen Regulierbarkeit zu den gut untersuchten und sehr gut verstandenen Transkriptionsfaktoren. Nukleäre Hormonrezeptoren werden in einer Genfamilie zusammengefasst, deren einzelne Mitglieder die Transkription durch verschiedene Mechanismen regulieren (Aranda und Pascual, 2001; Glass und Rosenfeld, 2000). Ac Ac Ac Ac Ac NRRE NRNR Aktivierung Koaktivatoren HATs Arginin-HMTs Chromatinmodifizierung Komplex P Me Repression N-CoR/SMRT HDACs Chromatinmodifizierung INHAT Abb. 1.3: Transkriptionsmodell Nukleärer Hormonrezeptoren Nukleäre Hormonrezeptoren (NR) binden spezifische Erkennungsstellen (response elements; RE) der DNA. In Anwesenheit des spezifischen agonistischen Liganden ist ein Koaktivatorkomplex assoziiert, in dem Histonacetyltransferasen, eventuell auch Arginin-Methyltransferasen enthalten sind. Durch diese enzymatischen Aktivitäten liegt das Chromatin in einer offenen transkriptionell aktiven Form vor und das Zielgen wird exprimiert. In Abwesenheit des Liganden bzw. in Anwesenheit des Antagonisten interagiert ein Korepressorkomplex mit den NR. Histondeacetylasen entfernen die Acetylgruppe von den Lysin-Aminosäuren und dies bewirkt eine transkriptionell inaktive Chromatinstruktur. Chromatinmodifizierende und INHAT Komplexe unterstützen durch Öffnen oder Schließen oder durch Maskierung bestimmter Substrataminosäuren diesen Prozeß. Die Tatsache, dass der Thyroidhormonrezeptor und der Retinsäurerezeptor (T3R und RAR) in Abwesenheit ihrer entsprechenden Liganden aktiv die Transkription durch übertragbare Repressionsdomänen reprimieren können (Baniahmad et al., 1992), 6 1. Einleitung führte zur Entdeckung zweier Proteine, die für eine effektive Genrepression durch diese Rezeptoren erforderlich sind (Abb. 1.4). Das 270 kDa Protein N-CoR (nuclear receptor co-repressor) wurde in einem Hefesceen mit der Ligandenbindungsdomäne des T3R identifiziert und ist mit dem T3R-RXR Heterodimer in Abwesenheit des Liganden assoziiert (Hörlein et al., 1995). Andere Arbeitsgruppen isolierten ein homologes Protein SMRT (silencing mediator of retionoic und thyroid hormone receptors) (Chen und Evans, 1995; Ordentlich et al., 1999; Park et al., 1999). N-CoR und SMRT besitzen beide eine zweigeteilte Interaktiondomäne (NID) in ihrem C-Terminus über die sie mit nukleären Hormonrezeptoren interagieren (Li et al., 1997a; Zamir et al., 1996). In der NID ist ein L-X-X-X-I-X-X-X-I/L Motiv enthalten, welches als CoRNR Box bezeichnet wird (Hu und Lazar, 1999; Nagy et al., 1999; Perissi et al., 1999). Das L-X-X-X-I-X-X-X-I/L Motiv ähnelt dem L-X-X-L-L Erkennungsmotiv von Koaktivatoren der nukleären Hormonrezeptoren (Heery et al., 1997; McInerney et al., 1998). Die ausgebildete α-Helix des L-X-X-X-I-X-X-X-I/L Motivs ist um eine Helixwindung länger als die der Koaktivatoren. Die Präferenz der Bindung von SMRT an den Retinsäurerezeptor (RAR) und N-CoR an den Thyroidhormonrezeptor (T3R) beruht auf den flankierenden Sequenzen des L-X-X-X-I-X-X-X-I/L Motivs der Korepressoren (Hu et al., 2001). Zusätzlich interagiert der T3R über eine weitere Domäne mit N-CoR, aber nicht mit SMRT (Cohen et al., 2001). Die Korepressoren enthalten ferner drei unabhängige Repressionsdomänen (RI, RII, RIII); diese Domänen können aktiv eine heterologe DNA-Bindungsdomäne reprimieren (Chen und Evans, 1995; Hörlein et al., 1995; Ordentlich et al., 1999; Park et al., 1999). SANT A B NIDR I R II R III 1 2453 80% 60% 40% 20% Homology Plot B A Abb. 1.4: Domänenstruktur von N-CoR und Homologie Plot zwischen N-CoR und SMRT (A) N-CoR hat ein Molekulargewicht von 270 kDa. Der Korepressor enthält eine Interaktionsdomäne (NID) für nukleäre Hormonrezeptoren in seinem C-Terminus und drei autonome Repressionsdomänen (RI-RIII). Zwischen RI und RII sind zwei SANT-Domänen lokalisiert. (B) Bei den Korepressoren N-CoR und SMRT handelt es sich um homologe Proteine. Besonders der N-Terminus mit Repressionsdomäne I und SANT-Domänen ist starkt konserviert. Im C-Terminus ist die Interaktionsdomäne der nukleären Hormonrezeptoren konserviert. 7 1. Einleitung Weiterhin enthält der Korepressor N-CoR zwei SANT-Domänen, die zwischen Repressionsdomäne I und II lokalisiert sind (Aasland et al., 1996). Der Name der SANT-Domäne leitet sich von den vier Proteinen ab, in denen diese Domäne zuerst beschrieben wurde. Bei diesen Proteinen (SWI2, ADA2, N-CoR und TFIIIB) handelt es sich um Transkriptionsfaktoren oder um chromatinassoziierte Proteine (Tab. 1.1). Die aus etwa 50 Aminosäuren bestehende SANT-Domänen werden in N-CoR von einer Linkerregion separiert, in deren Bereich sich ein coiled-coil Motiv befindet. Dieses Motiv ist ein häufiges Proteinfaltungs- und Aufbaumotiv, welches aus α- Helices besteht, die umeinander gewunden sind und so ein Supercoilmotiv bilden. Die Sequenz des coiled-coils besteht aus sieben Wiederholungseinheiten, den Heptaden, die Polymer-ähnlich sind. Aufgrund der Homologie der SANT-Domäne zu der Myb- ähnlichen-Domäne wurde lange eine DNA-Bindung für die SANT-Domäne diskutiert (Aasland et al., 1996). Die Myb-ähnliche-Domäne ist verwandt mit der DNA- Bindungsdomäne der c-Myb Aktivatoren. Diese DNA-Bindungsdomäne besteht Funktion Protein SANT- Domänen Repressor N-CoR 2 SMRT 2 CoREST 2 Smrter 2 MTA1,MTA2 1 Chromatin Modifizierer Swi3 1 ADA1,ADA2 1 ISWI 1 SNF2 1 Transkriptions- faktoren TFIIIB 1 TTF1 2 typischerweise aus drei Tandemwiederholungen, woh Domäne meist nur eine oder zwei Kopien aufweist. Üb ähnliche Motive erfolgt Bindung von telomerischer Mensch: TTAGGG). Für N-CoR und viele andere Pr enthalten konnte jedoch keine DNA-Bindung nachg konnte gezeigt werden, daß die Enzymaktivität der H Bindung von SMRT und N-CoR, welche mittels ei Tab.1.1: Aufstellung einiger SANT-Domänen enthaltender Proteine Die SANT-Domäne ist in 135 humanen Proteinen enthalten und damit vergleichbar häufig vorkommend in der Anzahl, wie die Chromodomäne (83 mal) oder die Bromodomäne (134 mal). SANT-Domänen enthaltende Proteine sind in die Transkription oder in die Chromatinmodifizierung involviert. Interessanterweise enthalten einige Proteine eine und manche bis zu vier SANT- Domänen. Sie kommen in Koaktivator- und Korepressor- komplexen vor. ingegen die Myb-ähnliche- er zwei Myb/homeodomain- DNA (Pflanze: TTTAGGG; oteine, die SANT-Domänen ewiesen werden. Allerdings istondeacetylase 3 über die ner Deacetylaseaktivierungs- 8 1. Einleitung domäne (DAD) mit dem Enzym interagieren, reguliert wird (Guenther et al., 2001). Die volle DAD Funktion benötigt den N-terminalen Bereich der SANT1 Domäne, wohingegen die SANT2 Domäne für die Enzymaktivität und Bindung von HDAC3 überflüssig ist (Guenther et al., 2001; Zhang et al., 2002). Die SANT1 und SANT2 Domänen von N-CoR/SMRT besitzen lediglich 30% Übereinstimmung in der Aminosäureabfolge (Park et al., 1999; Tsai et al., 1999). Der Homologieplot der Korepressoren zeigt jedoch die hohe Homologie, die zwischen den beiden SANT1 Domänen von SMRT/N-CoR einerseits und den SANT2-Domänen von N-CoR und SMRT andererseits besteht (Abb. 1.4). Proteine, die SANT-Domänen enthalten, sind Komponenten verschiedener transkriptioneller und chromatinmodifizierender Komplexe (Tabelle 1.1). Für die SANT1-Domäne von CoREST konnte, ähnlich wie für die DAD von N-CoR/SMRT, gezeigt werden, dass eine Aktivierung der HDAC1 mit der SANT1-Domäne erfolgt (You et al., 2001). Das ADA2 Protein hingegen ist in dem chromatinmodifizierendem SAGA Komplex enthalten. Dieses SANT-Domänen Protein interagiert mit der Histonacetyltransferase Gcn5 und über die SANT-Domäne, mit Histonen und stimuliert die HAT-Aktivität des Proteins (Boyer et al., 2002). Die Funktion der SANT-Domäne, sowie der Unterschied zwischen den einfach und doppelt auftretenden SANT-Domänen der Koaktivatoren und Korepressoren ist bisher noch nicht ausreichend geklärt. 1.3 Interaktionen der Korepressoren N-CoR / SMRT N-CoR und SMRT fungieren als Korepressoren für verschiedene Mitglieder der Superfamilie der Nukleären Hormonrezeptoren. Die Rolle der Korepressoren in der Repression der T3R-RXR und RAR-RXR Heterodimere in Abwesenheit ihrer Liganden wurde zuerst publiziert (Chen und Evans, 1995; Hörlein et al., 1995; Zamir et al., 1996). N-CoR/SMRT interagieren ebenfalls mit v-ErbA, RevErb, COUP, PPARα und PPARδ und DAX1 (Busch et al., 2000; Chen und Evans, 1995; Crawford et al., 1998; Dowell et al., 1999; Shibata et al., 1997; Zamir et al., 1996). Steroidhormonrezeptoren scheinen in Abwesenheit des Liganden nicht mit N-CoR und SMRT zu interagieren (Chen und Evans, 1995; Hörlein et al., 1995). Der Östrogenrezeptor (ER), der Glukokortikoidrezeptor (GR) und der Progesteronrezeptor (PR) interagieren mit den Korepressoren in Gegenwart von Antagonisten und reprimieren so die Transkription (Jackson et al., 1997; Lavinsky et al., 1998; Smith et al., 1997; Xu et al., 1996, Schulz et al., 2002). In Chromatinimmunopräzipitations (ChIP) Tests waren N-CoR und SMRT auf dem Promotor des Östrogenregulators 9 1. Einleitung Cathepsin D und dem pS2 Promotor in Gegenwart des Antagonisten Tamoxifen anwesend, aber nicht in Gegenwart von Estrogen (Shang et al., 2000). Abhängig von der Reinigungsstrategie wurden verschiedene Histondeacetylasen, beispielsweise HDAC1, HDAC2 und HDAC3, in N-CoR und SMRT Komplexen identifiziert (Guenther et al., 2001; Jones et al., 2001; Li et al., 2000; Underhill et al., 2000; Wen et al., 2000). Manche beschriebene N-CoR Komplexe enthalten Faktoren, die in dem SAP-Komplex (Sin-associated protein) enthalten sind, wie HDAC1, HDAC2 und mSin3 (Heinzel et al., 1997; Zhang et al., 1997; Zhang et al., 1998c). HDAC1 und HDAC2 sind neben dem SAP-Komplex (Zhang et al., 1997; Zhang et al., 1998c) auch in dem NURD (nucleosome remodeling und histone deacetylation) Komplex enthalten (Tong et al., 1998; Xue et al., 1998; Zhang et al., 1998b; Zhang et al., 1999). In beiden Komplexen sind die Rb-assozierten Proteine (retinoblastoma protein) RbAp-46 und RbAp-48 vorhanden sowie jeweils komplexspezifische Faktoren. Der NURD Komplex enthält beispielsweise noch MTA2, die ATPase Mi-2, und MBD2 (methyl-CpG-binding domain protein) und/oder MBD3 (Humphrey et al., 2001). Die HDACs sind mit verschiedenen Faktoren assoziiert, und diese Zusammensetzung resultiert in einer unterschiedlichen Funktion. HDAC1 und HDAC2 sind ebenfalls als Teil des CoREST Komplexes identifiziert worden (Humphrey et al., 2001; You et al., 2001). Weiterhin konnten Histone, Chromatin Modifizierung Nukleäre Rezeptoren T3R, RAR, RevErb, RXR, PPAR, ER, PR Leukämie Fusionsproteine AML1-ETO; PML-RAR N-CoR / SMRT Repressoren Sin3, SHARP Klasse II Histondeacetylasen HDAC4, 5 und 7 HDAC3 Homeobox Proteine, Zinkfinger Proteine PBX, BCl6, PLZF Signalwege STAT5, GPS2 WD40 Proteine TBL1, TBLR1 Basale TXN-Faktoren TAFIIB, TFII32, TFII70 Abb. 1.5: In der Literatur beschriebene Interaktionen mit dem N-CoR-HDAC3 Komplex Der N-CoR-HDAC3 Komplex interagiert mit einer Fülle von Proteinen. Zu diesen zählen unter anderem Nukleäre Hormonrezeptoren, basale Transkriptionsfaktoren, Histondeacetylasen, Homeoboxproteine, Leukämie-Fusionsproteine und andere Repressoren. Ferner besteht eine Verbindung zu Signaltransduktionswegen und chromatinmodifizierenden Komplexen. verschiedene Arbeitsgruppen zeigen, dass die Repressionsdomäne III von N-CoR und SMRT direkt mit HDAC4, HDAC5 und HDAC7 interagiert (Huang et al., 2000; Kao 10 1. Einleitung et al., 2000). Eine biochemische Reinigung über N-CoR oder HDAC3 Antikörper ergab weitere unterschiedlich zusammengesetzte Komplexe, die HDAC3, N-CoR oder SMRT und TBL1 (transducin (beta)-like Protein) enthielten (Guenther et al., 2000; Li et al., 2000; Underhill et al., 2000; Wen et al., 2000). TBL1 enthält sechs WD-40 Motivwiederholungen (Bassi et al., 1999). Dieses Motiv ist ebenfalls in den Hefe Korepressoren Tup1 und Groucho enthalten und homolog zu dem Drosophila Protein ebi, welches in die Signalübertragung des epidermalen Wachstums Faktorrezeptors (EGF-Rezeptor) involviert ist (Dong et al., 1999). Unter bestimmten Bedingungen existiert ebenfalls ein N-CoR-SMRT-HDAC3 Komplex, der das Krab- assoziierte-Protein (KAP-1) enthält (Underhill et al., 2000). N-CoR und SMRT agieren aber auch als Korepressoren für unterschiedliche, nicht mit den nukleären Hormonrezeptoren verwandte Proteine, die in die unterschiedlichsten zellulären Prozesse involviert sind (Abb. 1.5). SMRT interagiert beispielsweise mit dem SR-Faktor (serum response factors), dem Aktivator Protein-1 (AP-1) und dem nukleären Faktor–κB (NFκB). Diese Transkriptionsfaktoren übernehmen Aufgaben in der Stimmulierung der Zellproliferation (Lee et al., 2000). N-CoR und SMRT beeinflussen ferner die Transkription der evolutionär verwandten POU-Homeodomänenfaktoren Pit-1 und Oct1 (Kakizawa et al., 2001; Xu et al., 1998). Diese Transkriptionsfaktoren übernehmen bedeutende Rollen in der embryonalen Entwicklung. Ferner interagieren die Repressoren mit dem Homeobox Protein PBX (Asahara et al., 1999; Shanmugam et al., 1999), welches ein bedeutender Faktor bei der Segmentierung ist. Eine Interaktion konnte ebenfalls zu dem BCL-6 Protein, einem POZ/Zinkfinger Transkriptionsfaktor nachgewiesen werden. Dieser Faktor zeigt eine mögliche Rolle der Korepressoren in der Apoptose auf (Dhordain et al., 1998; Huynh und Bardwell, 1998; Wong und Privalsky, 1998). Das bHLH Protein MAD, MyoD und das HES verwandte Repressorpotein (HERPs) (Bailey et al., 1999; Heinzel et al., 1997; Iso et al., 2001) liegen ebenfalls im Komplex mit N-CoR/SMRT vor. Hier unterdrücken die Repressoren die Proliferation oder induzieren die terminale Differenzierung. Das Notch-akivierte Adaptorprotein Su(H)/RBP-J/CBF1 beeinflusst die Differnzierung, Proliferation und Apoptose in vielen Entwicklungssystemen und interagiert ebenfalls mit N-CoR und SMRT(Kao et al., 1998). Für SMRT konnte ebenfalls die Interaktion mit STAT5 (Signal transducer and activator of transcription 5), welches eine zentrale Rolle im Cytokinsignalweg spielt, gezeigt werden (Maurer et al., 2002; Nakajima et al., 2001). 11 1. Einleitung 1.4 Regulation der Korepressoren N-CoR/SMRT Die Funktion eines Proteins kann durch Veränderung der Konformation, der Lokalisation oder durch Interaktion mit anderen Proteinen beeinflußt werden. Ein weiterer effektiver Weg ist die Veränderung des Proteins nach seiner Synthese durch kovalente Modifiationen. Beispielsweise bewirkt die Polyubiquitinierung die proteosomale Degradation eines Proteins (Hochstrasser, 2000). N-CoR und SMRT scheinen durch verschiedene Mechanismen reguliert zu werden. Der N-Terminus von N-CoR interagiert mit mSiah2, einem Säugerhomolog des Drosophila Proteins Seven in absentia (Zhang et al., 1998a). mSiah2 ist in die proteosomale Degradation von Proteinen involviert (Hu et al., 1997; Li et al., 1997b; Tang et al., 1997). Kotransfektion von N-CoR und mSiah2 in neuronalen Zellen resultiert demnach in einer starken Verminderung der N-CoR Konzentration in der Zelle, ein Effekt, der in Gegenwart eines proteasomalen Inhibitors nicht auftritt (Zhang et al., 1998a). Die Regulierung der Korepressoren kann ebenfalls durch die Assoziation mit anderen Repressoren erfolgen, um neue Korepressorkomplexe auszubilden. Mitglieder der Ski Protoonkogenfamilie, welche die Ski und Sno Proteine umfassen, bilden Komplexe mit N-CoR, SMRT, HDACs und mSin3 und regulieren die Repression der Transkription durch MAD und T3Rβ (Nomura et al., 1999). Ein Korepressorkomplex der N-CoR und Ski oder Sno enthält, wurde als ein negativer Regulator des TGFβ Signalweges beschrieben (Luo et al., 1999; Stroschein et al., 1999). Ski oder Sno bilden mit N-CoR und den SMAD Proteinen Komplexe, die so die TGFβ-aktivierte Transkription reprimieren (Luo et al., 1999; Moustakas et al., 2001; Stroschein et al., 1999). SMRT interagiert ebenfalls mit dem transkriptionellen Repressor SHARP (SMRT/HDAC1 associated repressor protein) (Shi et al., 2001). Dieses Protein bindet den RNA Koaktivator SRA der Steroidrezeptoren und supprimiert die Aktivität der SRA-aktivierten Steroidrezeptor Transkription. Möglicherweise könnte SMRT so die Transkription eines Rezeptors in Anwesenheit des entsprechenden Liganden beeinflussen (Shi et al., 2001). Im Fall der Regulation von nukleären Hormonrezeptoren wird die Assoziation von N-CoR und SMRT durch die Hormonbindung kontrolliert. Signaltransduktions- ereignisse regulieren ebenfalls die Assoziation der Korepressoren mit den Rezeptoren. Werden MCF-7 oder HeLa Zellen mit Forskolin oder mit EGF (epidermal growth factor) behandelt, resultiert dies in Anwesenheit von Tamoxifen in einer verminderten Assoziation der Korepressoren mit dem Östrogenrezeptor (Lavinsky et al., 1998). Forskolin stimuliert den den PKA (protein kinase A) und EGF den ERK Mitogen- aktivierten Protein (Map) Kinase und PKC (protein kinase C) Weg. In 12 1. Einleitung Mikroinjektionsversuchen konnte darüberhinaus gezeigt werden, dass die Behandlung mit Forskolin oder EGF unter transkriptionellen Gesichtpunkten den Antagonisten Tamoxifen zu einem Agonisten der ER-Regulation konvertiert (Lavinsky et al., 1998). Davis und Koautoren konnten zeigen, dass die Aktivierung des ERK MAP Kinasewegs durch Thyroxin (T4) in einer Serin-Phosphorylierung des T3Rβ1- Rezeptores resultiert und dies zur Dissoziation von SMRT in einer Hormon- unabhängigen Weise führt (Davis et al., 2000). SMRT wird seinerseits durch die MAP Kinase Kinase MEK-1 und MEK-1 Kinase (MEKK-1) phosphoryliert. Diese Modifikation von SMRT inhibiert die Interaktion zwischen SMRT und dem Thyroidhormonrezeptor sowie dem PLZF Protein (promyelocytic leukemia zinc finger) (Hong und Privalsky, 2000). Im Gegensatz dazu stabilisiert die Phosphorylierung von SMRT durch CK2 (Casein Kinase II), die SMRT-Rezeptor Interaktion (Zhou und Hayward, 2001). Signaltransduktionswege haben neben dem direkten Einfluss auf die Protein-Protein Interaktion auch einen Einfluß auf die Lokalisation und Verteilung der Korepressoren N-CoR und SMRT in der Zelle. Die Phosphorylierung der NFκB p65 Untereinheit durch CamKIV (calmodulin-dependent kinase IV) resultiert in einem Austausch des Korepressors SMRT durch die Histonacetyltransferase CBP im Komplex und einer Translokation von SMRT in das Zytoplasma (Jang et al., 2001). MEK-1 und MEKK-1 Phosphorylierung von SMRT im Nukleus führen ebenfalls zu einer Verlagerung von SMRT in den Perinukleus oder das Zytoplasma (Hong und Privalsky, 2000). Die Korepressoren bringen beim Pendeln zwischen Zytoplasma und dem Nukleus selbst assoziierte Proteine mit. Dies trifft für das Protein Su(H)/RBP-J/CBF1 und verschiedene Histondeacetylasen zu (Wu et al., 2001). 1.5 N-CoR/SMRT in der Embryonalentwicklung und in Krankheiten Die Studien von Jepsen und Mitarbeiter mit N-CoR Knockoutmäusen zeigten eine fundamentale Rolle des Korepressors N-CoR in der Embryonalentwicklung auf (Jepsen et al., 2000). Die N-CoR Knockoutmäuse starben in der mittleren Phase der Embryonalenentwicklung und zeigten Defekte in der Reifung von Erythrozyten, Thymozyten und in der Entwicklung verschiedener neuraler Strukturen. Die Blockade in der korrekten Bildung der Erythroid Blast-Forming Unit (BFU-E) liegt möglicherweise an einer gestörten Regulation des Thyroidhormonrezeptors. Untersuchungen der onkogenen Form von T3R, des v-ErbA Rezeptors, unterstützten diese Vermutung. v-ErbA kann im Vergleich zu T3R kein Hormon mehr binden (Munoz et al., 1988; Sap et al., 1986) und wirkt deshalb als ein konstitutiver 13 1. Einleitung Transkriptionsrepressor (Damm et al., 1989). v-ErbA induziert ferner Erythroleukämie und Fibrosarcome in Hühnern und kann erythroide Zellen und Fibroblasten in Zellkultur transformieren (Gambacorta et al., 1996). Die konstitutive Repression der v-ErbA Zielgene erfolgt durch die Rekrutierung von N-CoR und HDACs und ist die Ursache für die Transformation in AEV-(Avian Erythroblastoses Virus) induzierter Leukämie (Busch et al., 2000; Ciana et al., 1998). N-CoR-/- Erythroblasten besitzen einen erhöhten Level des v-ErbA Zielgenes CAII (carbonic anhydrase II). Diese Tatsache läßt vermuten, dass N-CoR in Abwesenheit des Liganden für den T3R absolut essentiell ist und für die korrekte Entwicklung der Erythroblasten benötigt wird. Feng und Koautoren setzten eine N-CoR Mutante zur Klärung der biologischen Rolle der Korepressors ein, die eine Deletion der N-terminalen Repressionsdomäne besaß, aber noch die Rezeptorinteraktionsdomäne enthielt (Feng et al., 2001). Transgene Mäuse, die dieses dominant-negative N-CoR Protein in Hepatocyten exprimierten, zeigten eine erhöhte Proliferation der Hepatocyten und eine Herabsetzung der Thyroidhormon-vermittelten Transkription regulierter Zielgene (Feng et al., 2001). Verschiedene Krankheiten sind auf molekulare Defekte zurückzuführen, an denen die Repressoren N-CoR und SMRT beteiligt sind. Die RTH (resistance to thyroid hormone) ist beispielsweise eine genetische Krankheit, die sich in einer verminderten Antwort auf Thyroidhormon äußert. Molekularbiologisch liegt ein mutierter T3R-β in der Zelle vor, der eine starke Interaktion mit N-CoR/SMRT eingeht. Die Korepressoren dissozieren auch in Gegenwart des spezifischen Ligandens nicht mehr von dem mutierten Rezeptor (Kopp et al., 1996; Safer et al., 1998; Yoh et al., 1997). Ein Zusammenhang zwischen dem Korepressors N-CoR und dem Nervensystem wurde von Boutell und Koautoren beschrieben (Boutell et al., 1999). Die Autoren fanden heraus, dass der C-Terminus von N-CoR mit dem N-Terminus des Huntington Genprodukts, Huntingtin, interagiert. In Gehirnzellen von an Huntigtons verstorbenen Patienten ist N-CoR ausschließlich im Zytoplasma lokalisiert, wohingegen die Verteilung des Proteins in normalen Gehirnzellen sowohl zytoplasmatisch als auch nukleär ist. Die Lokalisation des Korepressors N-CoR scheint daher in der Pathologie dieser Krankheit involviert zu sein. Die Korepressoren N-CoR und SMRT spielen ebenfalls eine Rolle in verschiedenen Leukämien. APL (Acute promyelocytic leukemia) führt zu einem Reifungsstop der myeoliden Entwicklung. Diese Krankheit entsteht durch die Fusion des RAR-α Rezeptors mit dem PML Gen (promyelocytic leukemia) oder dem PLZF Gen (Lin et al., 1999). Die aus der Translokation resultierenden Fusionsproteine sind beide in der Lage mit N-CoR oder SMRT zu interagieren (Hong et al., 1997). Im Fall von PLZF- 14 1. Einleitung RAR ist die Interaktion so stark, dass selbst durch Zugabe des Liganden Retinsäure und eines Histondeacetylaseinhibitors keine therapeutische Wirkung auf die Leukämie erzielt wird. N-CoR und SMRT sind ebenfalls an der AML (acute myeloid leukemias) Leukämie beteiligt. 12-15 % aller AMLs entstehen durch eine t (8;21) Translokation zwischen den Genen AML1 und ETO. N-CoR oder SMRT interagieren sowohl mit ETO als auch mit dem AML1-ETO Fusionsprotein. Das Protein AML1 reguliert verschiedene Gene, die für eine normale Hämatopoiese kritisch sind. Das Fusionsprotein hingegen reprimiert die Transkription dieser Gene. In Zellen in denen das Fusionsprotein AML1-ETO exprimiert ist, kommt es daher zu einem Verlust der Repression spezifischer hämotopoietischer Gene und als Folge zur Inhibition der Differenzierung hämatopoietischer Vorläuferzellen (Gelmetti et al., 1998; Lutterbach et al., 1998; Wang et al., 1998). In ETO wurde eine 196 Aminosäuren umfassende Domäne identifiziert, die die NHR2-Domäne und die daran angrenzenden C- und N-terminal gelegenen Bereiche beinhaltet. Diese sogenannte CRD-Domäne (Core repressor domain) bindet an mSin3A und vermittelt transkriptionelle Repression unabhängig von N-CoR. ETO-Konstrukte, denen bestimmte strukturelle Elemente der CRD-Domäne fehlten, bildeten Komplexe mit niedrigerem Molekulargewicht aus. Die aus der Strukturfunktionsanalyse gewonnenen Daten ließen daraufschließen, dass es sich bei ETO um ein Protein mit modulartigem Aufbau handelt, wobei mehrere Regionen miteinander kooperieren, um maximale transkriptionelle Repression zu induzieren (Hildebrand et al., 2001). Als dritte Klasse von Leukämien, in der die Korepressoren SMRT, mSin3A und HDAC3 eine Rolle spielen, ist die aus der chromosomalen Translokation des TEL Gens (E26-transforming specific (ETS)- related) entstehende Leukämie zu nennen. Das TEL Protein kodiert einen starken Repressor (Chakrabarti und Nucifora, 1999; Wang und Hiebert, 2001). Zusammenfassend läßt sich sagen, dass der molekularen Wirkung der Korepressoren N-CoR und SMRT in Leukämien die Rekrutierung von Histondeacetylasen zugrunde liegt. Dies führt zu einem Differenzierungblock hämatopoietischer Zellen und zu unkontrolliertem Wachstum resultierend in der Entstehung der beschriebenen Krankheitsbilder. 1.6 Das SUMO Protein Neben der Transkription wird auch die Funktion von Proteinen durch verschiedene posttranslationale Modifikationen in der Zelle gesteuert. Die Konzentration eines Proteins in der Zelle wird durch die Kontrolle der Expression, der Aktivität, der Lokalisation und der Interaktion durch konstitutive oder reversible Modifikationen beeinflußt. Bei diesen handelt es um teilweise schon beschriebene Modifikationen, wie Acetylierung, Methylierung, Phosphorylierung, ADP Ribosylierung, 15 1. Einleitung Carboxylierung, Adenylierung und Glykosylierung oder Prenylierung von Aminosäureseitenketten. Weiterhin gehören die Ubiquitinierung und Sumoylierung zu diesen posttranslationalen Modifikationen. Die Ubiquitinierung ist in die Proteindegradation durch das 26S Proteasom involviert. Bei der Ubiquitinierung wird enzymatisch eine Isopeptidbindung zwischen dem C-Terminus des 9 kDa Polypeptides Ubiquitin und der ε–Aminogruppe eines Lysins des Akzeptorproteins hergestellt. Die Reaktion ist reversibel und kann durch Deubiquitinierung (Isopeptidasen) wieder umgekehrt werden. (Bonifacino und Weissman, 1998). Beispielsweise kann mit dem HDAC Inhibitor Valproinsäure (VPA), neben der Hemmung der katalytischen Aktivität von Klasse I HDACs, die proteosomale Degradation der HDAC2 induziert werden [Krämer, 2003 #1337]. Eine Anzahl Ubiquitin-verwandter Proteine wurde identifiziert. Diese können in zwei Klassen zusammengefaßt werden. Erstens Proteine, die nicht konjugiert werden können (Rad23, Dsk2p, Elongin B) und zweitens solche, die wie Ubiquitin auf Akzeptorproteine übertragen werden. Zu dieser zweiten Gruppe gehören die Interferon-induzierbaren Ubiquitin querreaktiven Proteine UCRP/ISG15, das Nedd8 Protein und SUMO1 (Small ubiquitin-related modifier), welche 36, 57 und 18% Homologie zur Aminosäuresequenz von Ubiquitin aufweisen. SUMO besitzt demnach nur eine geringe Sequenzhomologie zu dem Ubiquitinprotein, ist aber strukturell mit Ubiquitin verwandt. NMR-Strukturanalysen ergaben, dass SUMO1 die charakteristische ββαββαβ Ubiquitinfaltung enthält und in der dreidimensionalen Faltung mit Ubiquitin übereinstimmt (Bayer et al., 1998). Das GlyGly Motiv am C-Terminus beider Proteine, die Stelle der Verknüpfung zwischen SUMO und Akzeptorprotein ist ebenfalls strukturell bei beiden Proteinen gleich exponiert. Beide Proteine haben ferner annähernd das gleiche Molekulargewicht (11 und 9 kDa), und beide werden über eine Peptidbindung mit einer Lysin Aminosäure ihres Zielproteinens verknüpft. In Säugern existieren drei SUMO-Familienmitglieder, SUMO-1/Smt3C, SUMO-2/Smt3A und SUMO-3/Smt3B (Melchior, 2000; Muller et al., 2001). Wie für die Ubiquitinierung konnte man für SUMO-2 und SUMO-3 neben der Monosumoylierung auch Polysumoylierung feststellen (Saitoh und Hinchey, 2000; Tatham et al., 2001). Mit der Entdeckung der Akzeptoren RanGAP1 für SUMO1 (Mahajan et al., 1997; Matunis et al., 1996) und Cdc53 für Nedd8/Rub1 (Lammer et al., 1998; Liakopoulos et al., 1998) wurde klar, dass es sich bei den Ubiquitin verwandten Modulatoren nicht um Varianten von Ubiquitin handelt, sondern dass diese in der Zelle andere Aufgaben, als die der Proteindegradation übernehmen. 16 1. Einleitung 1.7 Der SUMO-Konjugationsweg Der SUMO-Konjugationsweg ist analog zu der Ubiquitinierungsreaktion, allerdings sind SUMO-spezifische Proteine bei der Sumoylierungsreaktion involviert (Verger et al., 2003). Wie Ubiquitin wird SUMO erst als Vorläuferprotein exprimiert und muß vor der Reaktion proteolytisch durch C-terminale Hydrolasen prozessiert werden (Abb. 1.6). Das C-terminale Gly-Gly Motiv wird so für die Konjugationreaktion frei. Das so entstandene SUMO Protein wird dann in einer ATP-abhängigen Reaktion durch die E1-Enzyme AOS1-UBA2 aktiviert. Anschließend wird das aktivierte SUMO Protein auf das E2-Konjugations-Enzym übertragen. Im Gegensatz zur Ubiquitinierungsreaktion existiert für den SUMO Konjugationsweg nur das Ubc9 Protein als einziges E2-Enzym. Als letzter Schritt unterstützen oder ermöglichen E3- Ligations-Enzyme die Übertragung von SUMO auf ein Akzeptorprotein. Drei SUMO- E3-Ligase Klassen sind bekannt. Klasse I setzt sich aus den Hefeproteinen Siz1 und Siz2 und verschiedenen verwandten Mitgliedern der PIAS Protein Familie (protein inhibitor of activated STAT) zusammen (Johnson und Gupta, 2001; Kahyo et al., 2001; Sachdev et al., 2001). Diese Proteine enthalten eine RING-ähnliche Domäne, die der RING-Fingerdomäne der Ubiquitin-E3-Ligasen ähnelt. Die zweite Klasse besteht lediglich aus RanBP2/Nup358, einer Proteinkomponente des GGHSTV C-terminale Hydrolasen AMP + PPI Aktivierungs- Enzym E1 + PIAS1, Pc2 Ligations- Enzym E3 Konjugations- Enzym E2 Substrat ψKXE HNC =O SUMO SC =O SUMO SAE1 SAE2 Substrat ψKXE NH2 SCUbc9 SH SAE1 SAE2 + ATP C-O - =O SUMOSUMO SC =O Ubc9 SUMO C-O - =O SUMO Protease Dekonjugation Abb. 1.6: SUMO-Übertragungsreaktionsweg SUMO wird als Vorläuferprotein synthetisiert und durch Hydrolasen prozessiert, um das carboxy- terminale Doppelgycinmotiv für die Konjugation freizulegen. Anschließend wird es dann durch die E1- Aktivierungsenzyme (SAE1(AOS1)/SAE2(UBA2)) aktiviert, durch das Ubc9 und E3-Ligations-Enzym auf das Substratprotein übertragen. Die resultierende Isopeptidbindung ist stabil und muß durch entsprechende Enzyme gespalten werden (verändert nach Verger et al., 2003). nukleären Kernporenkomplexes. RanBP2 interagiert über spezifische Domänen mit RanGTP und RanGDP. Das Protein weist jedoch keine Homologie zu anderen E3- Ligasen auf. Das Polycomb Protein Pc2 wurde als letzte SUMO-E3-Ligase identifiziert und bildet eine dritte Klasse. Pc2 interagiert mit dem transkriptionellen Repressor CtBP Protein (C-terminal binding protein) und dem Ubc9 Protein. In 17 1. Einleitung nukleären Polycomb-Aggregaten stimuliert Pc2 die Sumoylierung des CtBP (Kagey et al., 2003). Die E3-Ligations-Enzyme erhöhen möglicherweise die Affinität zwischen Ubc9 und dem Substrat und bringen diese so in eine optimale strukturelle Position für die Sumoylierungsreaktion. Für die Sumoylierung konnte eine Konsensussequenz (Ψ- K-X-E) in Substratproteinen ermittelt werden. Hierbei steht (ψ) für eine hydrophobe Aminosäure, (K) für Lysin, (X) für eine beliebige Aminosäure und (E) für Glutaminsäure. Die Konsensussequenz ist allerdings nicht hoch konserviert, da neben einer Glutaminsäure an Position 4 auch eine Asparaginsäure möglich ist. Die Asparaginsäure tritt aber in der Sequenz bekannter SUMO-Stellen deutlich seltener auf. Zusätzlich enthalten viele Substratproteine zwei bis fünf Aminosäuren aufwärts oder abwärts des Lysins, ein oder mehrere Proline oder Glycine. 1.8 Funktion der SUMO-Modifikation Die SUMO-Modifikation wurde für eine große Anzahl von Proteinen in verschiedenen Signalwegen beschrieben (Abb. 1.7). Es erstaunt daher nicht, dass SUMO im Zusammenhang mit der Regulierung von Protein-Protein-Interaktionen (Matunis et al., 1998), subzellulärer bzw nukleärer Lokalisationen von Proteinen (Pichler und Melchior, 2002; Seeler und Dejean, 2001), von Protein-DNA Interaktion (Goodson et al., 2001; Hong et al., 2001), und der Regulierung der enzymatischen Aktivität (Hardeland et al., 2002) gesehen wurde. Ferner kann SUMO als Antagonist der Ubiquitinierung wirken (Desterro et al., 1998; Hoege et al., 2002). Die bis jetzt beschriebenen SUMO-Zielproteine gehören zu verschiedenen Proteinkategorien wie Transkriptionsfaktoren, Signaltransduktionsfaktoren, Enzymen oder virale Proteinen. Dennoch besteht ein direkter Zusammenhang der Proteinsumoylierung mit der Genregulation. Mutationen in der Sumoylierungsstelle von Aktivatoren verstärken deren transkriptionelle Aktivität (Abdel-Hafiz et al., 2002; Bies et al., 2002; Eloranta und Hurst, 2002; Muller et al., 2000; Nishida und Yasuda, 2002; Poukka et al., 2000; Ross et al., 2002; Sapetschnig et al., 2002). Eine mögliche Erklärung besteht darin, dass SUMO als negativer Regulator der Transaktivationsdomäne fungieren könnte. Die Überexpression von SUMO1 unterdrückt beispielsweise spezifisch die AP2 und AP2-vermittelte Transkription über den Koaktivator CBP (CREB-binding protein)/p300 (Eloranta und Hurst, 2002). Ferner wird die Androgenrezeptor vermittelte Transkription in Abhängigkeit von der Expression von SUMO1 und der E3 RING-Finger-ähnlichen-Domäne von PIAS1 und PIASxα reprimiert (Nishida und Yasuda, 2002). Diese Beobachtung trifft jedoch nicht 18 1. Einleitung Protein-Protein Interaktion Substrat SUMO Antagonist für Ubiquitin subnukleäre Lokalisation Aktivität von Transkriptions- faktorenRegulation der DNA Bindung PML/Pc2 subnukleäre Aggregate nukleärer Kernkomplex Transport Organisation der Chromatinstruktur Abb. 1.7: Funktionen von SUMO Die Funktion der Protein-Sumoylierung ist noch nicht vollständig geklärt. Die Fülle von Substratproteinen haben unterschiedliche funktionelle Rollen der SUMO-Modifikation aufgezeigt (verändert nach Verger et al., 2003). für alle Proteine zu, da die Aktivität von p53 und LEF-1 nicht durch Sumoylierung beeinflusst zu sein scheint (Sachdev et al., 2001; Schmidt und Muller, 2002). Mutationsexperimente zeigten, dass das Lysin oder die Glutaminsäure im Elk-1 Protein essentiell für die Repression ist (Snowden et al., 2000; Yang et al., 2002). Die Bindung entweder von SUMO oder Ubc9 ist für diesen Effekt ausschlaggebend. Die transkriptionelle CRD1 Repressionsdomäne von p300 unterliegt ebenfalls einer SUMO-Modifikation. In vitro konnte gezeigt werden, dass die SUMO-Modifikation für die Interaktion zwischen HDAC6 und p300 elementar ist. Die durch p300 vermittelte Repression konnte durch Zugabe einer SUMO-spezifischen Protease oder durch die heterologe Expression einer katalytisch inaktiven SUMO-E2-Konjugase (Ubc9) aufgehoben werden (Girdwood et al., 2003). SUMO-Modifikation von CtBP1 bewirkt eine Lokalisationsänderung zwischen Nukleus und Zytoplasma. Darüberhinaus zeigte CtBP1, mit einer mutierten SUMO-Konsensussequenz, eine verminderte Repression der E-Cadherin Promotoraktivität (Lin et al., 2003). Zusammenfassend läßt sich feststellen, dass für die Sumoylierung am häufigsten negative Effekte in der Transkription beobachtet wurden. 19 1. Einleitung 20 1.9 Aufgabenstellung und Zielsetzung Studien mit N-CoR Knockoutmäusen zeigten, dass der Korepressor N-CoR für die Embryonalentwicklung essentiell ist. Der Korepressor ist darüberhinaus an der kurzzeitigen Repression von nukleären Hormonrezeptoren (Hörlein et al., 1995) oder der langfristigen Repression durch REST/NRSF involviert (Jepsen et al., 2000). Verschiedene Krankheiten, die auf molekulare Defekte zurückzuführen sind, werden ebenfalls durch N-CoR beeinflußt. N-CoR liegt in der Zelle in verschiedenen Proteinkomplexen vor, in denen unter anderem Histondeacetylasen (HDACs) enthalten sind. Eine direkte Wechselwirkung des Korepressors N-CoR mit Chromatin, bzw. Histonen war zu Beginn dieser Arbeit nicht bekannt. Der Korepressor N-CoR enthält zwei weitgehend uncharakterisierte SANT-Domänen. Das Ziel dieser Arbeit war die Identifikation von Interaktionspartnern der N-CoR SANT-Domänen und deren anschließende Charakterisierung im Korepressorkomplex. Hierfür sollte zunächst untersucht werden, ob die N-CoR SANT-Domänen an Protein-Protein Interaktionen beteiligt sind. Darauf aufbauend, sollte mit einem geeigneten Screen (Far-Western Hybridisierung oder Hefe-Zwei-Hybrid) eine Expressionsdatenbank mit den N-CoR SANT-Domänen untersucht werden. Potentielle Interaktionspartner sollten mit in vitro und in vivo Methoden auf die Assoziation des Korepressors N-CoR getestet werden. In Repressionstests sollte ferner überprüft werden, inwiefern die Interaktion mit N-CoR oder eine Modifikation des Korepressors die Repression beeinflußt. Die SANT-Domänen von N-CoR wurden ebenfalls im Zusammenhang der Histonkodehypothese betrachtet. In Bindungsstudien sollte eine mögliche Interaktion der N-CoR SANT-Domänen mit Histonen untersucht werden. Die enzymatische Aktivität rekombinanter HDACs wurde ebenfalls unter dem Gesichtspunkt der Histonbindung der N-CoR SANT-Domäne experimentell untersucht. Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Chemikalien und Materialien β-Mercaptoethanol Sigma, Karlsruhe Acrylamidlösung mit 0,8 % Bisacrylamid (37,5:1) Roth, Karlsruhe Agarose (Electrophoresis Grade) LifeTech., USA Ammoniumsulfat Merck, Darmstadt Ampicillin AppliChem, Darmstadt APS (Ammoniumpersulfat) 10% in H2O Sigma, Steinheim Bradford-Reagenz BIO-RAD, München Bromphenolblau Fluka, Buchs (CH) DOPA (drop out agar, für Hefe) BIO 101/ CA, USA CSM/SD (synthetic minimal medium, für Hefe) BIO 101/ CA, USA DMSO (Dimethyl Sulfoxid) Merck, Darmstadt DTT (Dithiothreitol) Sigma, Steinheim ECL-Lösung 1 + 2 AmershamPharmacia EDTA (Ethylen Diamin Tetra Acetat) Sigma, Steinheim EtOH (Ethanol) Roth, Karlsruhe Ethidium Bromid Roth, Karlsruhe Glyzerin Roth, Karlsruhe Glutathion-Agarose Sigma, Steinheim H2O Milli-Q gereinigt und autoklaviert IPTG (Isopropylthio-beta-D-galactoside) Roth, Karlsruhe KCl (Kaliumchlorid) Roth, Karlsruhe Li-Ac (Lithium Acetat) Sigma, Steinheim MgCl (Magnesiumchlorid) Fluka, Buchs (CH) Milchpulver Ja, Köln NaCl (Natriumchlorid) Roth, Karlsruhe NaOH (Natronlauge) AppliChem, Darmstadt PAA (Polyacrylamid) 30% Acrylamid / Roth, Karlsruhe 1% Bisacrylamid-Lösung PEG 4000 (Polyethylenglykol) AppliChem, Darmstadt Protease-Inhibitor Mix (COMPLETE) Roche, Mannheim Phenol/Chloroform Roth, Karlsruhe SDS (Sodium-Dodecyl-Phosphat) Roth, Karlsruhe TEMED (N, N, N`, N`-Tetramethylethylendiamin) Roth, Karlsruhe Thiamin Sigma, Steinheim Tris AppliChem,Darmstadt Triton-X 100 Fluka, Buchs (CH) Tween 20 PharmaciaBiotech, Schweden Trichostatin A (TSA) Sigma YPD (Vollmedium für Hefe) BIO 101/ CA, USA X-Gal (5-Bromo-4-Chloro-3-Indolyl-β- D-Galactopyranosid) Sigma, Steinheim BenchMark prestained protein ladder Life Technologies Smartladder Eurogentec 21 Material und Methoden Enzyme und Puffer für die Molekularbiologie wurden von den Firmen New England Biolabs (Schwalbach) oder MBI bezogen. Weitere Grundchemikalien stammten von den Firmen Roth (Karlsruhe), Fluka (Neu-Ulm), Sigma (Deisenhofen) oder Serva (Heidelberg). Affinitätsmedien wurden von den Firmen Amersham Pharmacia Biotech (Freiburg), Sigma oder Invitrogen (NV Leek, Niederlande) bezogen. Plastikwaren und Filtersysteme für das Labor und die Zellkultur wurden von den Firmen Greiner (Frickenhausen), Schleicher & Schuell (Dassel), Becton Dickinson (Heidelberg) oder Nalgene (Rochester, NY, USA) geliefert. Zellkulturmedien, Glutamin, Trypsin/EDTA-Lösungen und Antibiotika für die Zellkultur wurden von Serva bezogen, fötales Kälberserum von Biowhittaker (Verviers, Belgien). Bestandteile von Nährmedien zur Anzucht von Hefen wurden bei BIO101 gekauft. Falls nicht anders vermerkt, wurden gängige Methoden sowie die Rezepte für Puffer aus Sambrook et. al., 1989 oder dem Buch „Short protocols in Molecular biology“ Ausubel et. al., 1995, entnommen. Etwaige Modifikationen sind an entsprechender Stelle vermerkt. 2.1.1 Radioaktive Reagenzien [35S]Methionin (>1.000 Ci/mmol; 10 mCi/ml) Amersham Pharmacia Biotech [γ-32P]ATP (>150 mCi/ml) Amersham Pharmacia Biotech [3H] Na-Acetat (25 mCi) NEN Life Science 2.2 Plasmide 2.2.1 Hefe-Expressionsvektoren Name Insert Referenz pACT2 Murine embryonale Tag 17 cDNA Expressionsbank Matchmaker Yeast- Two-Hybrid Sytem, Clontech Inc. pGBKT7 Bait-Vektor fusioniert mit Gal4 DNA- Bindungsdomäne Matchmaker Yeast- Two-Hybrid Sytem, Clontech Inc. pGBKT7 N-CoR SANT1+2 Bait-Konstrukt (Köder, N-CoR As 429-683) fusioniert mit Gal4 DNA-Bindungsdomäne diese Arbeit. 2.2.2 Expressionsbanken Name Insert / Diversität Referenz pBluescript SK (+/-) murine cDNA Expressionsbank, embryonaler Tag 13,5 aus Gewebe der Hirnanhangdrüse Diversität: 5*108 Stratagene PBluescript SK (+/-) murine cDNA Expressionsbank aus Milzgewebe, 8.-12. Woche Diversität: 5*108 Stratagene pACT2 murine embryonale Matchmaker II Library cDNA Tag 17e Diversität: 3,5*106 Clontech 22 Material und Methoden 2.2.3 Bakterielle Expressionsvektoren Name Insert Primer Ref. pGEX 2TDK GST AG Heinzel pGEX KGK N-CoR 429-758 GST-SANT1+2-Domäne EcoRI BamH1 pGEX AHK N-CoR 435-683 GST-SANT1+2-Domäne 2 + 5 pGEX AHK N-CoR 435-492 GST-SANT1-Domäne 2 + 3 pGEX AHK N-CoR 435-628 GST-SANT1-Domäne+Linker 2 + 11 pGEX AHK N-CoR 493-628 GST-Linker 10 + 11 pGEX AHK N-CoR 622-683 GST-SANT2-Domäne 4 + 5 pGEX AHK N-CoR 599-707 GST-SANT2+-Domäne 7 + 8 pGEX AHK N-CoR 493-683 GST-Linker-SANT2-Domäne 10 + 5 pGEX AHK ADA2 67-107 GST-SANT 14 + 15 pGEX AHK MTA2 282-341 GST-SANT 12 + 13 pGEX AHK N-CoR 398-492 DAD SANT1-Domäne 9 + 3 pGEX AHK N-CoR 398-492 N1 DAD SANT1-Domäne N1 22 pGEX AHK N-CoR 398-492 N2 DAD SANT1-Domäne N2 23 pGEX AHK N-CoR 398-492 N3 DAD SANT1-Domäne N3 24 pGEX AHK N-CoR 1017-1506 N-CoR 435-492 N-CoR HID+SANT1 16 + 17 2 + 3 pGEX AHK N-CoR 1017-1506 N-CoR 622-683 N-CoR HID+SANT2 16 + 17 4 +5 pGEX AHK mSin3 436-899 N-CoR 435-492 mSin3A PAH HID N-CoR SANT1 18 + 19 2 + 3 pGEX AHK mSin3 436-899 N-CoR 622-683 mSin3A PAH HID N-CoR SANT2 18 + 19 4 + 5 pGEX AHK mSin3 524-899 N-CoR 435-492 mSin3A HID N-CoR SANT1 20 + 18 2 + 3t pGEX AHK mSin3 524-899 N-CoR 622-683 mSin3A HID N-CoR SANT2 20 + 18 5 + 4 pGEX AHK mSin3 524-899 N-CoR 435-683 mSin3A HID N-CoR SANT1+2 20 + 18 2 +5 pGEX JDK N-CoR 1-393 GST- Repressionsdomäne I AG Heinzel pGEX AHK N-CoR 94-393 GST- Repressionsdomäne I AG Heinzel pGEX AHK N-CoR 970-1258 GST- Repressionsdomäne II + III AG Heinzel pGEX AHK N-CoR 1679-2453 GST-NID AG Heinzel pGEX AHK N-CoR 2218-2453 GST-C´-Terminus AG Heinzel pGEX KGK CBP 1065-1460 Bromodomäne AG Heinzel 23 Material und Methoden 2.2.4 Eukaryontische Expressionsvektoren Name Insert Referenz /Primer pCMX GAL4-DBD N-CoRFlag-Epitop As 1-2453 AG Heinzel (Heinzel et al., 1997) pCMX GAL4-DBD Gal-DBD AG Heinzel (Heinzel et al., 1997) pSP Vektor - AG Heinzel (Heinzel et al., 1997) pCMX N-CoR∆Sumo2Ala (S2) Flag-Epitop K 152 → A diese Arbeit pCMX N-CoR∆Sumo3Ala (S3) Flag-Epitop K 194 → A diese Arbeit pCMX N-CoR∆Sumo5Ala (S5) Flag-Epitop K 1117 → A diese Arbeit pCMX N-CoR∆Sumo6Ala (S6) Flag-Epitop K 1330 → A diese Arbeit pCMX N-CoR∆Sumo8Ala (S8) Flag-Epitop K 1443 → A diese Arbeit pCMX N-CoRFlag-Epitop As 1-2453 AG Heinzel (Heinzel et al., 1997) pCMX N-CoR ∆SANT1Flag-Epitop As 1-2453 ∆436-484 diese Arbeit pCMX N-CoR ∆SANT2Flag-Epitop As 1-2453 ∆618-679 diese Arbeit pCMX N-CoR ∆SANT1+2Flag-Epitop As 1-2453 ∆436-484 +∆618-679 diese Arbeit pTβ human TAFII250 As 1-1872 AG Heinzel pmT Sin3A As 1-1282 AG Heinzel pCDNA3.1 cDNA Hefeklon 102 Pc2 As 263-551 diese Arbeit pCDNA3.1 cDNA Hefeklon 916 CGBP As 32-660 diese Arbeit pCDNA3.1 cDNA Hefeklon 283 PIAS1 As 1-651 diese Arbeit pCDNA3.1 cDNA Hefeklon 628 Ubc9 As 1-158 diese Arbeit pCDNA3.1 cDNA Hefeklon 25 RanBP9 diese Arbeit pCDNA3.1 cDNA Hefeklon 180 PIAS1 As 99-651 diese Arbeit pCDNA3.1 cDNA Hefeklon 1044 cDNA I/ PAP7 - diese Arbeit pCDNA3.1 cDNA Hefeklon 646 TDG As 1-397 diese Arbeit pEF Dest V5-Epitop TDG TDG As 1-397 AG Zörnig pCMV5PIAS1Flag-Epitop PIAS1 As 1-651 2xUAS Thyminkinasepromotor (TK) Luziferasegen Reporterplasmid - AG Heinzel (Heinzel et al., 1997) 24 Material und Methoden 2.2.5 Vektorkarten A B pcDNA3 pGEX-AHK C D GAL4-N-CoRFlag-Epitop 12360 bp N-CoR1-2543 pCMX-GAL4 pCMX-GAL4-N-CoRFlag-Epitop pCMX-GAL4 25 Material und Methoden E pCM5-PIAS1Flag-Epitop 8428 bp PIAS1 1-651 F pCMV5-PIAS1Flag-Epitop Matchmaker pGBKT7 G Matchmaker pACT2 Abb. 1.1: Vektorkarten: A, C, D. und E Eukaryotische Expressionsvektoren. A Vektor wurde für die Klonierung der cDNA aus dem Hefevektor pACT2 genutzt. Die Klonierungen erfolgten über die Hind III / Xho I Stellen. B Bakterieller Expressionsvektor welcher für die Klonierung von GST-Fusionsproteinen verwendet wurde. Lag ebenfalls noch in den MCS KGK vor. D Vektor lag ebenfalls ohne Gal-DBD Fusion vor. E Expressionsvektor aus der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Mirey. F und G Hefeexpressionsvektoren der Firma Clontech. P CMV = CMV-Promotor; T7 = T7- Promotor; MCS = “multiple cloning site“; poly A = Polyadenylierungssignal; SV40 poly A = “simian virus 40”-Polyadenylierungssignal; Neomycin (neo) = Neomycin- Resistenzgen; Amp = Ampicillin-Resistenzgen; Kan = Kanamycin-Resistenzgen GAL4-DBD = DNA-bindende Domäne (AS 1 – 147) des hefespezifischen Transkriptionsfaktors GAL4; P lac = Lac-Promotor; GST = Glutathion-S-Transferase; AD = Aktivierungsdomäne; bps = Basenpaare. 26 Material und Methoden 2.3 Antikörper Spezifität Spezies Hersteller TAFII250 Maus, monoklonal Upstate N-CoR Kaninchen, polyklonal Upstate HDAC3 Ziege, polyklonal Santa Cruz GMP-1 Maus, monoklonal Zymed Ubc9 (N-15) Ziege, polyklonal Santa Cruz Gal4-DNA-Bindungsdomäne (RK5C1) Maus, monoklonal Santa Cruz SUMO-1 (D-11) Maus, monoklonal Santa Cruz TDG Ratte, polyklonal Biozol Flag M2 Maus, monoklonal Sigma V5/ V5-HRP Maus, monoklonal Invitrogen HDAC2 (H-54) Kaninchen, polyklonal Santa Cruz Goat IgG Kaninchen, polyklonal Sigma Mouse Ig, HRP-linked Sheep Amersham Biosciences, N-CoR C-terminal Kaninchen, polyklonal AG Heinzel N-CoR C-terminal affinitätsgereinigt Kaninchen, polyklonal AG Heinzel N-CoR C-terminal Meerschweinchen, polyklonal AG Heinzel 2.4 Spezielle Enzyme und Enzymkits Name Zweck Referenz RNAsin Ribonuclease Inhibitor Inhibierung von RNAsen Promega, Madison QuikChange® Multi Site-Directed Mutagenesis Kit Gerichtete PCR Mutagenese Stratagen TNT® T7 Coupled Reticulocyte Lysate System in vitro Transkriptions- Translations Reaktion; Proteinexpression Promega First-Strand cDNA Synthesis Kit Umschreiben von RNA in cDNA Amersham Bioscience RNeasy Mini Kit Isolierung von RNA aus Extrakten/ Gewebe Qiagen GmbH Platinum Pfx DNA Polymerase PCR Reaktion Invitrogen Die Protokolle der Hersteller wurden befolgt. 27 Material und Methoden 2.5 Peptide Spezifität Sequenz Hersteller human Histon H2A Peptid, biotinyliert As 1-22 SGRGKQGGKARAKAKTRSSRAG-GK-biotin Upstate Biotechnologie human Histon H2B Peptid, biotinyliert As 1-21 PEPSKSAPAPKKGSKKAITKA-GGK-biotin Upstate Biotechnologie human Histon H 3 Peptid, biotinyliert As 1-21 ARTKQTARKSTGGKAPRKQLA-GGK-biotin Upstate Biotechnologie Acetyl-human Histon H 3 (K9) Peptid, biotinyliert As 1-21 ARTKQTAR[ACK]STGGKAPRKQLA-GGK- biotin Upstate Biotechnologie human Dimethyl-Histon H 3 (K9) Peptid, biotinyliert As 1-21 ARTKQTAR[dimethylK]STGGKAPRKQLA- GGK-biotin Upstate Biotechnologie Phospho(S10)-Acetyl(K14)- human HistoneH3 Peptid, biotinyliert As 1-21 ARTKQTARK[PS]TGG[ACK]APRKQLAG- GK-biotin Upstate Biotechnologie Histon H4 Peptid, biotinyliert As 2-24 SGRGKGGKGLGKGGAKRHRKVLR- GSGSK-biotin Upstate Biotechnologie 2.6 Primer Nr. Oligo Sequenz Spezies 1 Gal DBD 5´ CGG AAG GAG GTG GTA CAA AGG 2 SANT1 5´ GTT GAA TTC AAG GTT TAT AAA GAC AGA CAG Maus 3 SANT1 3´ TTT GTT CTC GAG CTA TCC ATA ATT CCT TCT CAC G Maus 4 SANT2 5´ GTT GAA TTC TCT ACA GAA CCT GTT GAG AC Maus 5 SANT2 3´ GC TTT CTC GAG CTA CTG TTT ATG TTG CTG CAA AAG Maus 6 SANT2 3´ ohne stop TTT GTT CTC GAG CTG TTT ATG TTG CTG CAA AAG Maus 7 SANT 2+ 5´ GTT GAA TTC ATG ACA AGT GAA GCT GCA GC Maus 8 SANT 2+ 3´. TTT GTT CTC GAG TCA GGC AGA AAC AGT GGA AGC Maus 9 DAD SANT1 GTT GAA TTC ATG CGT CAG CTT TCT GTG ATT CCA CCT Maus 10 SANT-Linker 5´ GTT GAA TTC ATG GTG AGA AGG ATT TAT GGA AAA CG Maus 11 SANT-Linker 3´ TTT GTT CTC GAG TCA AGT CTC AAC AGG TTC TGT AG Maus 12 SANT MTA2 5´ GTT GAA TTC CCG GTG CTC TGT CGG G Maus 13 SANT MTA2 3´ TTT GTT CTC GAG CTA TGC TTC AGC AGC TTT CAA TC Maus 14 SANT ADA2 5´ GTT GAA TTC ATG ACC TCA GAC TTC CCT Maus 28 Material und Methoden 15 SANT ADA2 3´ TTT GTT CTC GAG CTA CAG TTG CTT CAG GTT CAG Maus 16 N-CoR RIII 5´ CGG GGA TCC GAA GRC CTC CAA CCT GCT CC Maus 17 N-CoR RIII 3´ TTT GTT CTC GAG TCC ATA ATT CCT TCT CAC G Maus 18 Sin3A PAH III Hid 3´ GTT GAA TTC GAG TCG CAT AAA GAT ATA CC Maus 19 Sin3A PAH III Hid 5´ CGG GGA TCC GGA GCC ACA CCT CCA GTG Maus 20 Sin3A III 5´ CGG GGA TCC GGC TAT AAG GAG TCT GTA CAT CAT C Maus 21 GST 5´ CGT TTG GTG GTG GCG ACC Mutagenese Oligo Sequenz 22 N-CoR N1 GAA AAG GAG ATC TTT GCG GCC GCG TTT ATC CAG CAT CC Maus 23 N-CoR N2 GCA TCC TAT TTG GCA GCG GCG AGT GTT CCT GAT TGT G Maus 24 N-CoR N3 GG AAG AGT GTT CCT GCT TGT GCT GCA TAT TAC TAT TTA ACC Maus 25 N-CoR∆Sumo2Ala (S2) CCG GCA TTT GGA GTC GCC CAT GAA GCT CCT TCC Maus 26 N-CoR∆Sumo3Ala (S3) GTC GAT CGA GAA ATT GCG GCC GTA GAA CAG CAG ATC C Maus 27 N-CoR∆Sumo5Ala (S5) CCT TTG ACC TAC ATC GCG CAG GAA GAA TTT TCT CCG Maus 28 N-CoR∆Sumo6Ala (S6) C CCC AAA CAG ATA GCC AGG GAG AGC CCT CCC ATC C Maus 29 N-CoR∆Sumo8Ala (S8) GTA GTA GAA CGG GGA GCC TAT GAG GAT GTG AAA GCA GGC Maus 2.7 E.coli Stämme und Anzuchtbedingungen Stamm Genotyp Referenz BL-21 Codon Plus (DE3) F- ompT hsdSB (rB - mB - ) dcm Tetr galλ (DE3) endA Hte [argU ileY leuW Camr] Stratagene DH10B F- mcrA∆(mrr-hsdRMS-mcrBC)φ80d lacZ∆M15 ∆lacX74 deoR recA endA1 araD139 ∆(ara,leu)7697 galU galK λ-  rpsL nupG Life Technologies XL-1Blue MRF´ ∆(mcrA)183(mcrCB-hsdSMR-mrr)173 endA1 supE44 thi-1 recA1 gyrA96 relA1 lac [F´proAB lacIqZ∆15M TZTn10(Telr)] Stratagene Plasmidhaltige Bakterien werden über Nacht bei 37°C und 220 rpm in LB-Medium mit entsprechenden Antibiotika angezogen. Die langfristige Lagerung der plasmidhaltigen Stämme erfolgte bei –80°C in LB-Medium mit 25% Glyzerin. 29 Material und Methoden 2.8 Zelllinien und Medien Zelllinie Herkunft/Eigenschaften DSMZ-Nr./ Referenz Jurkat humane T-Zell-Leukämie Zelllinie, wurde aus dem Blut eines 14jährigen Junges mit akuter lymphatischer Leukämie (ALL) etabliert. Suspensionszelllinie. runde Zellen, die einzeln oder in kleinen Klümpchen wachsen. ACC 282; (Schneider et al., 1990) HeLa human Zervix Karzinoma Zelllinie, wurde aus dem epithelialem Zervix einer 31jährigen Frau etabliert, späterer Diagnose lautete auf Adenokarzinom ACC 57 Scherer et al., J. Exp. Med. 97: 695 (1953); Gey et al., Cancer Res. 12: 264 (1952) 293T Nierenzelllinie, aus primärem embryonalem Nierengewebe etabliert. Zellen sind mit dem E1A-Genprodukt transformiert und exprimieren SV40 „large T“ Antigen. Zellen wachsen adhärent als Monolayer. ACC 305 (Graham et al., 1977) MCF7 humane Brustkrebszelllinie. Etabliert aus einer 69-jährigen Patientin mit metastasierendem Brustkrebs. Zellen sind positiv für die zytoplasmatische Lokalisation des Estrogenrezeptors ACC 115 (Soule et al., 1973) Cos7 Zelllinie der Grünen afrikanischen Meerkatze. Durch Transformation mit einem origin- mutierten SV-40 entwickelt aus CV-1 Zellen, einer Affenzelllinie (cercopithecus aethiops) entwickelt ACC 60 (Gluzman, 1981) Die verwendeten Säugerzelllinien werden im Brutschrank bei 37°C und 5% CO2 kultiviert, zweimal wöchentlich mit Trypsin (5 min, 37°C) abgelöst und verdünnt wieder ausgesät. Dem Medium wird 10% hitzeinaktiviertes FCS, 2 mM L-Glutamin, 100U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin zugegeben. Die Langzeit- aufbewahrung erfolgt in flüssigem Stickstoff in einem Medium aus 70% DMEM/20% FCS/10% DMSO. 2.9 Hefestamm und Anzuchtbedingungen Stamm Genotyp Referenz AH109 MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3- 200, gal4∆, gal80∆, LYS2::GAL1UAS- ‘GAL1TATA-HIS3, GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MELTATA-lacZ (James et al., 1996) Die Anzucht der Hefen erfolgt in den entsprechenden Voll- oder Selektionsmedien bei 30°C für 24-40h. Die langfristige Lagerung erfolgt bei –80°C in YPDA-Medium mit 50% Glyzerin. 30 Material und Methoden 2.10 Lösungen und Puffer DNA-Gel Ladepuffer (6x): Ficoll EDTA Bromphenolblau Xylencyanol 15% 25 mM 0,05% 0,05% PBS (1x): NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 137 mM 2,7 mM 4,3 mM 1,4 mM SOC-Medium Hefeextrakt Trypton NaCl KCl MgCl2 MgSo4 + Glukose (steril) 0,5% (w/v) 2% (w/v) 10 mM 2,5 mM 10 mM 20 mM 20 mM TE (1x) Tris-HCl pH 7,4 EDTA 10 mM 1 mM TAE (1x) Tris-Acetat EDTA 40 mM 1 mM 2.11 Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) Spezifische DNA-Segmente wurden mit einer Biometra T-Gradient PCR-Maschine amplifiziert. Die Reaktion wird in einem 50 µl Ansatz bestehend aus DNA-Template, DNA-Polymerase-Puffer, je 10 pmol der entsprechenden Primer (3´und 5´ Primer), 40 pmol des dNTP-Mix und 2 U DNA-Polymerase durchgeführt. Die Denaturierung der DNA-Matrize erfolgt für eine Minute bei 95°C, während für die 0,5 minütige Hybridisierung der Primer eine Temperatur ca. 5°C unterhalb des Tm-Wertes gewählt wird. Die Polymerasereaktion wird bei 72°C (Taq-Polymerase) oder 68°C (Pfx- Polymerase) mit einer Minute pro Kilobasenpaar durchgeführt. Es erfolgten 18-30 Zyklen, die durch eine abschließende 10 minütige Synthesephase bei 72°C (68°C) abgeschlossen werden. Die PCR-Produkte werden mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt, analysiert und mit dem QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen) oder Jet Sorb Extraction Kit aus dem Gel eluiert. 2.12 DNA Methoden 2.12.1 DNA-Spaltung mit Restriktionsendonukleasen Doppelsträngige DNA kann durch Restriktionsendonukleasen an für diese Nukleasen spezifischen Sequenzmotiven geschnitten werden. Dazu werden 1-10 Einheiten des jeweiligen Enzyms pro µg DNA in dem vom Hersteller empfohlenen Puffer (New England BioLabs/ MBI Fermentas) eingesetzt. Die Reaktionszeit beträgt 1-20 h bei der vom Hersteller empfohlenen Inkubationstemperatur. Die Reaktion wird durch Zugabe von 6x DNA-Ladepuffer abgestoppt. 31 Material und Methoden 2.12.2 Dephoshorylierung von 5´Enden Um die Selbstligation von linearisierten Vektoren in nachfolgenden Klonierungen zu verhindern, werden im Anschluß an den Restriktionsverdau 1-2 Einheiten Alkalische Phosphatase (New England BioLabs) pro µg DNA zugeben und für 1 h bei 37°C inkubiert. Die Alkalische Phosphatase entfernt 5´Phosphatgruppen, so daß eine Ligation nur noch mit dem Insert erfolgen kann, was die Ligationseffizienz erheblich erhöht. 2.12.3 Ligation von DNA-Fragmenten Bei einer Ligation kommt es zur Verknüpfung zweier DNA-Enden. Die Reaktion wird durch DNA-Ligasen katalysiert, wobei Phosphodiester-Bindungen zwischen einer freien 5‘-Phosphatgruppe und einer freien 3‘-OH-Gruppe gebildet werden. Ein Standard-Ligationsansatz bestehend aus 10–50 ng Vektor-DNA, 3–10 fachem molaren Überschuß an Insert-DNA, Ligasepuffer und 400 U T4-DNA-Ligase und wurde in einem Volumen von 20 µl angesetzt. 0,5-1µl geschnittener Vektor und Insert werden mit der SMART DNA-Leiter auf ein Agarose-Gel aufgetragen und die DNA-Konzentrationen pro µl berechnet. Die einzusetzende Insertmenge bei vorgegebener Vektormenge wird nach folgender Formel berechnet Insert [ng] = ] Die Reaktion erfo nachfolgenden T Ligation ohne Ins die Transformatio 2.12.4 Auft Gel- Die Agarose-Ge fragmenten, zur Konzentrationen Anode ist dabei p abgeschätzt werd (Auftrennungsber werden, welches Der Gellauf erfo 10 mV/cm Gellän sichtbar gemacht u Vektor [ng] • Insertgröße [kb • molares Verhältnis Insert/Vektor Vektorgröße [kb] lgt bei 22 °C für 1 bis 2 Stunden. Um die Qualität des Vektors in der ransformation abschätzen zu können, wird als Kontrolle eine ert durchgeführt. 2 µl des Ligationsansatzes wird anschließend für n von E.coli eingesetzt. rennung von DNA-Fragmenten durch Agarose- Elektrophorese lelektrophorese wird zur Auftrennung von DNA-Restriktions- Reinigung von PCR-Produkten und zur Abschätzung von DNA- eingesetzt. Die Wanderungsgeschwindigkeit der Fragmente zur roportional zur Größe, welche anhand eines DNA-Längenstandards en kann. Es werden in der Regel 1%ige TAE-Gele verwendet eich 0,5-6 kb), die mit 0,002 % (v/v) Ethidiumbromid versetzt in die DNA interkaliert und unter UV-Bestrahlung Licht emittiert. lgt in 1xTAE-Puffer bei einer kontinuierlichen Spannung von ge. Anschließend werden die Fragmente unter UV-Licht (366 nm) nd mit einer Videokamera photographiert. 32 Material und Methoden 2.12.5 DNA-Konzentrationsbestimmung Die Messung der Extinktion von DNA-Lösungen bei 260 und 280 nm gibt Auskunft über deren Konzentration und Reinheit. Eine OD260 entspricht 50 µg/ml doppelsträngiger DNA. Da aber auch aromatische Aminosäuren bei dieser Wellenlänge absorbieren wird zusätzlich die Extinktion bei 280 nm bestimmt, bei der Proteine stärker als DNA absorbieren. Ist der Quotient aus OD260 und OD280 kleiner als 1,8, so deutet dies auf Verunreinigungen mit Proteinen oder Phenol hin. 2.13 Transformation von Plasmiden in E.coli Um neuklonierte Plasmide zu selektieren und zu vervielfältigen mußten sie in Bakterien eingebracht werden. 2.13.1 Herstellung transformationskompetenter E.coli-Zellen A.) Chemokompetente Bakterien (XL-1 blue): Lösung 1: 100 mM RbCl2 , 50 mM MnCl2, 30 mM KaAc, 10 mM CaCl2, 13% Glyzerol(v/v) pH 5,8; steril filtrieren Lösung 2: 10 mM MOPS (pH 7,0), 10 mM RbCl2 , 75 mM CaCl2 , 13 % Glyzerin (v/v) pH 7,0; steril filtrieren 600 ml Bakterienkultur werden bis zu einer OD600.von 0,48-0,5 angezogen und die Zellen anschließend durch Zentrifugation (10 min, 4°C, 2000 rpm) geerntet. Die Zellen werden in 200 ml kalter Lösung 1 resuspendiert und für 1-2 h auf Eis inkubiert. Die Bakterien werden erneut durch Zentrifugation pelletiert und in 15 ml Lösung 2 resuspendiert. Aliquots von 200 µl der Bakteriensuspension werden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei - 80 °C gelagert. B.) Elektrokompetente Bakterien (DH10B): Eine Einzelkolonie der Bakterien wird über Nacht in 5 ml LB-Medium angezogen und am nächsten Tag in 500 ml LB bis zu einer OD600 von 0,5-0,6 wachsen gelassen. Die Zellen werden anschließend für 10-15 min auf Eis gekühlt und 20 min bei 5.000 xg und 2 °C zentrifugiert. Die Zellen werden in 5 ml Eiswasser resuspendiert und 500 ml Eiswasser hinzugegeben. Es erfolgte erneut eine Zentrifugation und die Zugabe von 5 ml und 500 ml Eiswasser. Die Zellen werden wie oben zentrifugiert, der Überstand verworfen und das Pellet in der verbleibenden Flüssigkeit gelöst. Die Zellen werden frisch verwendet oder zur Lagerung mit 10 % Glyzerin versetzt, aliquotiert und bei –80 °C aufbewahrt. Die Transformationseffizienz dieser Zellen beträgt ≥ 109 pro µg DNA. 2.13.2 Transformation in chemokompetente Bakterien 10 ng eines GST-Expressionsvektors wird zu den chemokompetenten Zellen (Bl21 codon+) gegeben, welche auf Eis aufgetaut wurden. Die Aufnahme der Fremd-DNA in die Zellen wird durch Kältestreß (30 min auf Eis) und anschließendem Hitzeschock (60 s, 42°C) forciert. Die Zellen werden kurz auf Eis abgekühlt und dann mit 500 µl 33 Material und Methoden LB-Medium (ohne Antibiotika) 0,5 h bei 37°C vorkultiviert. Das Ansatzvolumen wird durch Zentrifugation halbiert, auf LB-Agarplatten mit den entsprechenden Antibiotika ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert. Mit den angewachsenen Kolonien können dann zur Expression Flüssigkulturen inokuliert werden. 2.13.3 Transformation in elektrokompetente Bakterien Die Transformation in elektrokompetente Zellen (DH10B) wird zur Amplifikation von gering-konzentrierten Plasmidpräparationen, z.B. solchen aus Hefezellen oder Ligationsansätzen, verwendet. Von anderen Gruppen zugesandte DNA wurde ebenfalls auf diese Weise eingebracht. Die Elektroporations-Apparatur wird auf 2,5 kV und 25 µF eingestellt mit einem Pulse-Kontroller von 200 Ω. Es werden 5 µl der Hefe-Plasmid Präparation oder 1 pg Vektor zu 50 µl eisgekühlten elektrokompetenten Zellen gegeben und für 1 min auf Eis inkubiert. Der Ansatz wurde in vorgekühlte Elektroküvetten gegeben und wie oben beschrieben gepulst. Die Zellen werden in 700 µl SOC-Medium aufgenommen und 30-60 min bei 37 °C inkubiert. Die Zellen werden abzentrifugiert, in 80 µl SOC-Medium aufgenommen und auf LB-Platten ausplatiert. 2.14 Isolierung von Plasmid-DNA aus E.coli 2.14.1 Plasmidisolierung in analytischem Maßstab (Mini- Präparation) Für analytische Zwecke wird Plasmid-DNA mit dem NucleoleoSpin Plasmid Kit der Firma Macherey-Nagel isoliert. Es wird nach dem Protokoll des Herstellers vorgegangen. 2.14.2 Plasmidisolierung in präparativem Maßstab (Maxi- Präparation) Größere Mengen Plasmid-DNA werden aus 300 ml Kulturen mittels des Plasmid Maxi Kit der Firma Genomed präpariert. Dabei wird nach dem Protokoll des Herstellers vorgegangen. 2.15 Proteinbiochemische Methoden 2.15.1 Proteinexpression in E. coli Zur Proteinproduktion werden die entsprechenden Expressionsvektoren in den E.coli Stamm BL21 codon Plus (DE3) transformiert und in 0,5 l bis 1 l LB- Medium bis zu einer OD600 von ca. 0,5-0,7 angezogen. Da die Multiple Cloning Site dieser Vektoren unter der Kontrolle eines vom Laktose-Operon abgeleiteten Promotor steht, kann die Expression durch Glukose reprimiert und durch IPTG induziert werden. Die Induktion erfolgt mit 0,5 bis 1 mM IPTG für 1 h bei 37°C oder für 3 h bei 30°C. 34 Material und Methoden 2.16 Verifikation von Proteininteraktionen in vitro mittels GST-Pulldown Proteinexpression und Zelllyse unter nativen Bedingungen 1 x LysS-Puffer: 50 mM Tris pH 7,8, 0,4 M NaCl, 0,5 mM EDTA, 10 % Glycerin, 0,1 % NP-40, 5 mM β-Mercaptoethanol, 0,5 mM PMSF, 1:1000 Protease-Inhibitoren-Mix ½ LysS-Puffer: 1:1 LysS +H2O PPI-Puffer: 20 mM Hepes pH 7,9, 100 mM NaCl, 0,02% NP-40, 1 mM DTT, 4 mM MgCl2, 10 % Glycerin, 0,5 mM PMSF, 1:1000 Protease-Inhibitoren-Mix Nach Induktion (0,5 mM IPTG) und Expression (1 h 37°C) werden die Bakterien durch Zentrifugation pelletiert und in Lysispuffer resuspendiert. Nach 30 minütiger Zentrifugation mit 10.000 xg bei 4 °C, wird der Überstand bei -80 °C eingefroren. 2.16.1 GST-Aufreinigung Die Glutathion-Agarose-Matrix wird in Wasser gequollen und anschließend in PPI Puffer äquilibriert. 500 µl UZ-Expressionsüberstand werden 50 µl Glutathion- Agarose-Beads zugegeben und anschließend für eine Stunde bei 4°C auf einem Drehrad inkubiert. Die Matrix wird 3 mal mit ½ LysS-Puffer gewaschen. Durch Zentrifugation wird das gebundene GST-Fusionsprotein (2500 rpm, 5 min) pelletiert. Die Expression wird durch Auftragen auf ein SDS-Gel verifiziert und durch Coommassie-Blau-Färbung eine Proteinabschätzung durchgeführt. Für eine große Aufreinigung werden entsprechende Volumina Bakterienlysat mit entsprechenden Beads versetzt und in gleicher Weise aufgereinigt. 2.16.2 GST-Pulldown Zur Bindung des möglichen Interaktionspartner werden auf Glutathion-Agarose- Beads gebundene GST-Fusionsproteine mit TNT translatierten Proteinen für eine Stunde bei 4 °C inkubiert. Die Beads werden anschließend fünfmal mit 1 ml PPI- Puffer gewaschen und in 20 µl SDS-Ladepuffer resuspendiert. Nach 5 minütigem Aufkochen der Proben bei 95°C und 3 minütigem Abzentrifugieren bei 14.000 upm, wird der flüssige Überstand auf ein Gel aufgetragen. Das Gel wird zur Kontrolle gleichmäßiger Beladung mit Coomassie-Blau gefärbt und nach Entfärbung auf einer Whatmanmembran vakuumgetrocknet. Interaktionen werden durch Auflegen eines Röntgenfilms sichtbar gemacht. 2.16.3 Kolorimetrische Proteinbestimmung nach Bradford Die quantitative Bestimmung der Proteinkonzentration von Zelllysaten erfolgt mit dem Protein Assay Kit der Firma Biorad, welcher auf der Methode von Bradford basiert. 35 Material und Methoden 2.16.4 SDS-Polyacrylamid-Elektrophorese SDS-Gel Laufpuffer: 25 mM Tris, 250 mM Glycin, 0,1 % SDS Die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ist ein kontinuierliches Verfahren zur Auftrennung von Proteinen nach Molekulargewicht. Die Proben werden für 5 min bei 95°C in 2 x SDS-Ladepuffer (Roth) inkubiert und durch das SDS mit einer kontinuierlichen negativen Ladung versetzt. Der Gellauf erfolgte in Form von vertikalen Plattengelen mit 6 bis 12%igen Trenn- und 5%igen Sammelgelen in SDS- Laufpuffer. Die Gelelektrophorese erfolgte bei einer Stromstärke von 40 mA pro Gel. 2.16.5 Coomassieblau-Färbung von Polyacrylamidgelen Coomassie-Färbelösung: 0,1% Coomassie G250, 40% Ethanol, 10% Eisessig Entfärbelösung: 25% Ethanol, 10 % Eisessig Zur Sichtbarmachung aller im SDS-Gel aufgetrennten Proteine wird das Gel für 30 min in Coomassie-Färbelösung auf einem Schüttler gefärbt. Überschüssiger Farbstoff wrd durch mehrfaches Wechseln der Entfärberlösung aus dem Gel entfernt. Das Gel wird zur Dokumentation auf einem Whatman-Papier getrocknet oder zwischen zwei Plastikfolien der Firma Bio-Rad getrocknet. 2.16.6 Ponceau-Färbung von Nitrocellulosemembranen Zum Nachweis der erfolgreichen Blottingprozedur, sowie der Überprüfung gleicher Proteinmengen in den einzelnen Spuren, wird die Membran für 5 min in Ponceau S- Lösung (Sigma) gefärbt und durch Waschen mit Wasser entfärbt. 2.17 Immunoblot (Western Blot) TBS (1x): 10 mM Tris (pH 7,5), 150 mM NaCl TBS-T: TBS mit 0,05% Tween 20 Der Western Blot dient dem qualitativen und quantitativen Nachweis von Proteinen durch Antikörper. Die durch SDS-Gel Elektrophorese aufgetrennten Proteine werden in einem Naßtransfer auf Nitrocellulose-Membranen bei 100 mA über Nacht bei 4°C übertragen. Dazu wurden 2 Lagen Whatmann 3MM Papier, 2 Lagen synthetisches Papier und die Nitrocellulosemembran in Transferpuffer eingeweicht. Das SDS-Gel wird auch die Nitrozellulosemembran gelegt und beidseitig Whatmann 3MM Papier und ein synthetisches Papier aufgebaut. Nach dem Blotten wurde die Membran für 1 h in 5% Milchpulver/BSA in PBS-T geblockt. Die Inkubation des 1. Antikörpers erfolgt für mindestens 1 h bei RT oder über Nacht bei 4°C. Die Membran wird dreimal je 10 min mit PBS-T gewaschen und mit dem 2. Antikörper, an den eine Peroxidase gekoppelt ist, für 30 min bei RT inkubiert. Nach drei erneuten Waschschritten erfolgt 36 Material und Methoden die Detektion der Peroxidase-Aktivität mit dem ECL-System der Firma Amersham und Nachweis der Lichtemission mit einem Röntgenfilm . 2.18 Immunopräzipitation (IP) Bei der Immunopräzipitation kann ein spezifisches Protein aus einem Totallysat isoliert werden. Dabei wird das Protein an einen spezifischen Antikörper gebunden, welcher wiederum über den FC-Teil an Protein A bindet. Protein A ist an eine Sepharose- oder Agarose-Matrix fixiert, die IP des Proteins kann so durch Zentrifugation der Protein A Matrix gewonnen werden. Zum Zellextrakt wird 1µg des spezifischen Antikörpers gegeben und für 30 min auf Eis inkubiert. Es folgt die Zugabe von 60 µl der Protein-A/G Sepharose-Beads und eine erneute Inkubation für eine Stunde bei 4 °C auf einem Drehrad. Die Matrix wird dreimal mit NETN-Puffer (0,05% NP-40) gewaschen und dabei jeweils für 30 sec bei 2.000 rpm zentrifugiert. Das gebundene Protein wird durch Zugabe von SDS-Gelladepuffer eluiert und der Überstand auf ein SDS-Gel aufgetragen. 2.19 Methoden der Zellkultur 2.20 Transfektion von Säugerzellen Säugerzellen können unter bestimmten Bedingungen von außen zugesetzte Fremd- DNA aufnehmen (Transfektion) und die von dieser DNA kodierten Gene exprimieren. Transfektion Dazu werden 3*106 293 T Zellen in einer 10cm-Platte in einem Volumen von 10 ml DMEM Vollmedium ausgesät. 20 µg DNA und 61 µl 2 M CaCl2 werden in 500 µl angesetzt. Zu diesem Ansatz werden 500 µl 2x HBS vorsichtig zugetropft und mit einer 1ml-Pipette durch Ausblasen gemischt (ca. 15 sec). Das Medium wird von den Zellen entfernt und die Zellen mit 3 ml DMEM, welches 25 µM Chloroquine enthält überschichtet. Das Präzipitat wird im Anschluss vorsichtig auf die vorbereiteten Zellen getropft. Nach 8 h Inkubation bei 37 °C im Brutschrank wird der Präzipitationsmix von den Zellen abgenommen und die Zellen mit 10 ml DMEM Vollmedium für weitere 48 h wachsen gelassen. Die Zellen werden mit PBS gewaschen und in entsprechendem Lysispuffer geerntet. Die Expression des transfizierten Gens wurde im Immunoblot untersucht. Transfektion für einen Luziferasereportertest Harvest-Puffer: 1,25 ml 1 M MesTris pH 7,8; 25 µl 1 M DTT; 250 µl 10% Triton X-100; 2,5 ml Glycerin (10%) Für einen Luziferasereportertest werden 5*105 293 T Zellen/Loch in 12-Loch Platten ausgesät. 1,5 µg 2xUAS TK Luziferasereporter und 0,1 µg pSV40 β-Galactosidase werden mit 7,63 µl 2M CaCl2 in einem 62,5 µl Volumen aufgenommen. Zu diesem Ansatz wurden 62,5 µl 2x HBS vorsichtig zugetropft und mit einer 1 ml-Pipette durch Ausblasen gemischt (ca. 15 sec). Das Medium wird von den Zellen entfernt und die Zellen mit 375 µl DMEM je Loch, welches 25 µM Chloroquine enthält, überschichtet. Das Präzipitat wird im Anschluss vorsichtig auf die vorbereiteten Zellen getropft. Nach 8 h Inkubation bei 37 °C im Brutschrank wird der Präzipitationsmix von den 37 Material und Methoden Zellen abgenommen und die Zellen mit 5 ml DMEM Vollmedium für weitere 48 h wachsen gelassen. Die Zellen werden mit PBS gewaschen und in 150 µl Harvest- Puffer geerntet. Die Extrakte werden 10 min auf Eis inkubiert. Unlösliche Zellbestandteile werden durch Zentrifugation entfernt und der Überstand weiterverwendet. 2.21 β-Galactosidasetest 100x Mg: 100 mM MgCl2, 4,5 M β-Mercaptoethanol ONPG: 4 mg/ml ONPG in 100 mM NaPi pH 7,5 (o-Nitrophenyl-β-D-Galactopyranosid) NaPi 41 ml 200 mM Na2PO4 + 9 ml 200 mM NaHPO4 (Natriumphosphat-Puffer pH7,5) Die Kotransfektion des SV-40-β Galactosidase Vektors bei einer Transfektion erlaubte die Durchführung eines β-Gal-Tests. Hierfür wird 1 µl 100x Mg Lösung, 22 µl ONPG (Substrat), 72 µl 100 mM NaPi pH 7,5 mit 10 µl Zellextrakt in eine Mikrotiterplatte pipettiert und 30 min bei 37 °C inkubiert. Die Reaktion wird mit 200 µl 1 M Na2Co3 gestoppt und sofort danach bei einer OD von 420 nm in einem Photometer gemessen. 2.22 Messung der Luziferase-Aktivität/Repressionstest Luziferin: 16,7 ml 5 mM KHPO4, 5 mg Luziferin (Endkonzentration 3000µg/ml) Luziferinpuffer: 1,25 ml 1 M MesTris, 250 µl 1M MgCl2, 24 mg ATP, 8,25 ml H2O Substratpuffer: 1:1 Verhältnis von Luziferin und Luziferinpuffer Die Zellen werden mit PBS gewaschen. In einer 96 Loch Platte werden 10 µl Zelllysat je Loch des Transfektionsansatzes pipettiert. Das Luminometer wird so programmiert, dass 50 µl Substratpuffer je Loch dazugeben wird. Nach Zugabe des Substratpuffers erfolgt nach 20 sec die Messung. Die exprimierte Luziferase katalylsiert nach Zugabe des Luziferinsubstrats eine Reaktion bei der Licht emittiert wird, welches durch einen Photoelektronenvervielfacher detektiert werden kann. Das emittierte Licht ist somit proportional zur Transaktivierungsaktivität des Faktors. 2.23 Immunofluoreszenzanalyse Die Färbung zellulärer und heterolog exprimierter Proteine erfolgt mittels Immunofluoreszenz. Dazu werden die Zellen auf Deckgläser in einer Zellkulturschale ausgesät und zum gegebenen Zeitpunkt mit 3% Formaldehyd für 10 min bei Raumtemperatur fixiert. Die Zellen werden zweimal je 5 Minuten mit PBS gewaschen. Um die Zellmembran für die Aufnahme der Antikörper zu permeabilisieren, wird das Präparat mit 0,1% Triton X-100/PBS 5 min inkubiert. Nach erneutem Waschen wird das PBS abgesaugt, und nach Trocknung des Glases der Ort der Färbung mit einem Wachsstift eingegrenzt. Nach 1 h Blocken (3% BSA in PBS) erfolgt die Inkubation mit Primärantikörper (verdünnt in Blocklösung) bei 4°C über Nacht. Nicht gebundener Antikörper wird durch dreimaliges Waschen mit PBS entfernt und mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelten Sekundärantikörper (1:1000) 38 Material und Methoden 1 h bei RT im Dunkeln gefärbt. Nach erneutem Waschen werden die Salze mit Aqua dest. weggewaschen, das Präparat getrocknet und mit Vectashield/DAPI auf einem Objektträger aufgebracht. Nach Trocknen und Fixierung mit Nagellack können Bilder mit einem Fluoreszenzmikroskop (Konfokal Scanning Laser Mikroskop, Leica DM IRBE) aufgenommen werden. 2.24 In vitro SUMO-Modifikation TB Puffer: 20 mM Hepes, pH 7.3, 110 mM KOAc, 2 mM Mg(OAc)2, 0.5 mM EGTA, 1 mM DTT und 1 µg/mL jeweils von Leupeptin, Aprotinin und Pepstatin Der Kit (AG Melchior/ MPI für Biochemie, Martinsried, Germany) beinhaltet die folgenden Reagenzien (rekombinante aus Bakterien gereinigte Proteine) die für ungefähr 1000 Reaktionen in den angegebenen Konzentrationen ausreichen (SUMO trägt ein Flag-Epitop und besitzt ein freies GlyGly-Motiv an dem C-Terminus) - Ziege α-RanGap1 Antikörper (100 µl Serum, Konzentration 1:7000 in 5% Milch- PBS-0.2% Tween. Nitrozellulosemembranen eignen sich besser als PVDF Membranen für die Detektion von RanGap1 im Western Blot) - Aos1/Uba2: 2 x 50 µl; Konzentration: 0.5 mg/ml, - Ubc9: 3 x 20 µl; Konzentration: 0.5 mg/ml, - SUMO1(aa 1-97): 1 x 200 µl; Konzentration: 1.0 mg/ml, - RanGap1: 1 x 50 µl; Konzentration: 1.0 mg/ml, - Gst-BP2∆FG 2 x 20 µl; Konzentration: 1.0 mg/ml Alle Proteine waren in TB Puffer (TB) aufgenommen und wurden jeweils in 1µl Aliquots (Ubc9, Aos1/Uba2 und RanBP2) bei –80°C gelagert und nur einmal benutzt. RanGAP und SUMO können häufiger aufgetaut und wieder eingefroren werden. Alle Verdünnungen müssen in TB Puffer mit 0.05% Tween 20 + 0.2 mg/ml Ovalbumin durchgeführt werden. Unter diesen Bedingungen können die angefertigten Verdünnungen öfters benutzt werden. 2.24.1 Bedingung für RanGap1-SUMO Modifikation (SUMO-Modifikation von RanGAP > 50% in 30 min) RanGap1 100 ng (für eine 20 µl Reaktion, 1 µl einer 1:10 Verdünnung in TB) SUMO1 40 ng (für eine 20 µl Reaktion, 1 µl einer 1:25 Verdünnung in TB) Aos1/Uba2 20 ng (für eine 20 µl Reaktion, 1 µl einer 1:25 Verdünnung in TB) Ubc9 10 ng (für eine 20 µl Reaktion, 1 µl einer 1:50 Verdünnung in TB) ATP 1 mM Tween 20 0.05% Ovalbumin 0.2 µg/µL Das Tween und Ovalbumin verhindert eine unspezifische Absorption der Proteine an das Reaktionsgefäß. Die Reaktion wird bei 30°C für 30 Minuten durchgeführt. durch Aufkochen mit SDS Ladepuffer wird die Reaktion gestoppt. Ein Viertel des Reaktionsansatzes wird auf ein 8% SDS-Gel aufgetragen und in einem Western Blot mit αRanGap1 Antikörper nachgewiesen. Typischerweise werden 100% SUMO- Modifikation von RanGap1 unter diesen Bedingungen erreicht (mit 5 ng Aos1/Uba2 sind es lediglich 50% Modifikation in 30 min). 39 Material und Methoden 2.24.2 Bedingung für PIAS1-SUMO Modifikation Das SUMO1 Protein und das Substratprotein müssen in großem Überschuß zur SUMO-E3-Ligase in der Reaktion vorliegen. Der Nachweis erfolgt mit einem spezifischen Antikörper gegen das Zielprotein oder bei Verwendung