Einfluss von synthetischen Nitromoschusduftstoffen und Substanzen mit östrogener Wirkung auf ausgewählte Funktionsparameter von Sertoli- Zellen der Ratte. Entwicklung und Evaluierung eines In-vitro-Testsystems Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Humanmedizin des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen vorgelegt von Kathrin Bittorf aus Dermbach Gießen 2005 Aus dem Zentrum für Dermatologie und Andrologie des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Ausbildungszentrum der Europäischen Akademie für Andrologie Direktor: Prof. Dr. Dr. med. habil. W.- B. Schill 1. Gutachter: PD Dr. Monsees 2. Gutachter: PD Dr. Steger Tag der Disputation: 08.05.2006 Folgende Teile der vorliegenden Arbeit wurden bereits veröffentlicht oder zur Veröffentlichung eingereicht: Proceedings: 1. Monsees TK, Hinkel S, Mihm K, Endo F, Schill W-B, Hayatpour J (2001). Effects of environmental hormones on the function of testicular cells. Proceeedings of the Second status-seminar “Endocrine Disruptors”, Berlin, 02.- 04.04.2001. Umwelt Bundesamt Berlin, 133-136 2. Monsees TK, Mihm K, Hinkel S, Endo F, Akaza H, Franz M, Gebhardt S, Pflieger-Bruss S, Schill W-B, Hayatpour J (2001). Effects of xenobiotics on male reproduction. In: Proceedings of the 10th Congress of the European Academy of Dermatology and Venerology, Munich Germany, 10.-14.10.2001; 995-999 Publizierte Abstracts: x Monsees TK, Mihm K, Hinkel S, Endo F, Franz M, Gebhardt S, Schill WB, Hayatpour J (2001). Influence of xenobiotics on male reproduction. J Eur Acad Dermatol Venerol 15:19 Weitere Abstracts: x Monsees TK, Hinkel S, Mihm K, Endo F, Schill WB, Hayatpour J (2001). Effects of environmental hormones on the function of testicular cells. Abstract book, p. 43, second status-seminar “Endocrine Disruptors”, Berlin, 02.-04.04.2001 x Bittorf K, Henkel R, Hayatpour J, Monsees TK (2005) Effects of Xenoöstrogens on primary rat Sertoli cell functions. Molecular Andrology, Giessen, 07-09.10.2005 Diese Arbeit wurde gefördert durch: x Umweltbundesamt, Sachgebiet Umweltchemikalien Schadstoffwirkung (Projektnummer: 297 65 001/09) Hinweis: Die Änderung des Familiennamen Mihm erfolgte durch Heirat. INHALTSVERZEICHNIS 1 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung 3 1.1. Vorkommen und Wirkung von Xenoöstrogenen, Östrogenen und synthetischen Nitromoschusduftstoffen 12 1.1.1. Bisphenol-A, Daidzein, 17- -Ethinylöstradiol, 17 -Östradiol 12 1.1.2. Synthetische Nitromoschusduftstoffe Moschus Keton und Moschus Xylol 15 1.2. Untersuchte Zellparameter (Vitalität (MTT), Laktatproduktion und Inhibin-B-produktion) zur Überprüfung der Wirksamkeit von Östrogenen und Nitromoschusduftstoffen auf Sertoli-Zellen 17 2 Aufgabenstellung 19 3 Material und Methoden 21 3.1. Verwendete Noxen 21 3.2. Verwendete Medien 22 3.3. Präparation der Sertoli-Zellen 23 3.3.1. Rattenhodenpräparation 23 3.3.2. Enzymatische Zellisolation 23 3.3.3. Anlegen der Zellkultur 25 3.3.4. Behandlung der Zellen mit hypotoner Lösung 25 3.3.5. Überprüfung der Reinheit der Zellkultur 26 3.4. Toxikologische Untersuchung der zu testenden Substanzen 28 3.4.1. MTT-Messung 29 3.4.2. Laktatbestimmung 29 3.4.3. Inhibinbestimmung 32 3.4.4. Proteinbestimmung 35 3.5. Optimierungen 35 3.6. Statistik 37 4. Ergebnisse 38 4.1. Darstellung der primären Sertoli-Zellkultur nach Präparation, vor und nach Behandlung mit hypotoner Lösung 38 4.2. Darstellung angefärbter peritubulärer Myoidzellen und Sertoli-Zellen 39 4.3. Vitalität der Sertoli-Zellen nach Zugabe der zu untersuchenden Substanzen 40 4.4. Laktatproduktion der Sertoli-Zellen nach Zugabe der zu untersuchenden Substanzen 44 4.5. Inhibin-B-Sekretion der Sertoli-Zellen nach Zugabe der zu untersuchenden Substanzen 48 5 Diskussion 53 5.1. Methodische Aspekte 53 5.2. Diskussion der Ergebnisse 56 INHALTSVERZEICHNIS 2 6 Zusammenfassung 64 7 Literaturverzeichnis 66 8 Lebenslauf 76 9 Danksagung 77 EINLEITUNG 3 1 Einleitung: Die Wirkung von Umweltschadstoffen auf die männliche Reproduktion ist derzeit Gegenstand intensiver Diskussion. Besonders auffallend ist der mehrfach beschriebene markante Rückgang von Spermatozoenzahl und -motilität bei Männern während der vergangenen 30-50 Jahre. Die umfangreichste Arbeit zu diesem Thema zeigt anhand der retrospektiven Metaanalyse von 61 Untersuchungen an einem Gesamtkollektiv von 14947 Männern einen durchschnittlichen Rückgang der Spermienzahl um etwa 50% sowie eine Abnahme des Ejakulatvolumens um etwa 20% innerhalb der letzten 50 Jahre (Carlsen et al., 1992). Im Vergleich zu den 50er Jahren tritt heute Hodenkrebs etwa 2- bis 3mal so häufig auf. Auch stieg die Inzidenz für das Auftreten von Hodenkrebs beispielsweise in Deutschland von 1962 bis 1988 um das Dreifache (Adami et al., 1994). Darüber hinaus wird über eine steigende Zahl von Missbildungen der männlichen Reproduktionsorgane, wie Hypospadie und Kryptorchismus, berichtet (Aitken und Sawyer, 2003). Beobachtungen bezüglich der Reproduktionsfähigkeit wildlebender Tiere unterstützen die Annahme, dass das gehäufte Auftreten von Missbildungen und Dysfunktionen des männlichen Urogenitaltraktes zumindest teilweise auf Umweltfaktoren anthropogenen Ursprungs zurückzuführen ist (Facemire et al., 1995). Die regelmäßige Präsenz dieser Fragen und Themen in den Medien zeigt, dass es sich dabei um einen Sachverhalt von außerordentlichem gesellschaftlichem Interesse handelt. Ging man lange davon aus, dass die Ursache von Unfruchtbarkeit bei Paaren bei der Frau liegt, so ist mittlerweile anzunehmen, dass in etwa 50% der Fälle die Gründe beim Mann zu suchen sind (Nieschlag, 2000). Diese und weitere Studien haben zu einer breiten wissenschaftlichen und gesellschaftlichen Diskussion über die Umweltfaktoren geführt, die für all diese Phänomene verantwortlich gemacht werden (Boekelheide, 1993). Eine besondere Rolle scheinen dabei Schadstoffe zu spielen, die über die Nahrungskette, durch die Atemluft oder die Haut in den menschlichen Organismus gelangen. Die Wirkung dieser Schadstoffe auf die Reproduktionsorgane des Mannes steht derzeit im Mittelpunkt des Interesses. Zahlreiche Untersuchungen zeigen eine Schädigung bei Männern, die chronisch solchen Schadstoffen exponiert waren. Der jahrelange Umgang mit dem Pestizid DBCP (1,2- Dibrom-3-Chlorpropan) führte beispielsweise zu Infertilität bei Arbeitern eines Chemieunternehmens in den USA (Eaton et al., 1986). Eine Schädigung der Sertoli-Zellen während der Embryonalphase oder während der Pubertät durch anthropogene Schadstoffe EINLEITUNG 4 könnte für einen Teil der beobachteten Effekte verantwortlich sein (Carlsen et al., 1992; Sharpe und Skakkebaek, 1993; Toppari et al., 1996). Die Entwicklung und morphologische Differenzierung der Samenzellen wird als Spermatogenese bezeichnet und läuft in den Samenkanälchen (Tubuli seminiferi contorti) des Hodens ab. Sie ist ein komplexer Prozess, der nur durch das Zusammenspiel aller Zellpopulationen des Hodengewebes, der somatischen Zellen und der Keimzellen möglich wird. Die wichtigsten somatischen Zellen sind hier die Leydig-Zellen und Sertoli-Zellen. Leydig´sche Zwischenzellen sind die endokrin aktivsten Zellen des Hodens. Die von ihnen, unter dem Einfluss von in der Hypophyse produzierten LH (Luteinisierendes Hormon), freigesetzten Androgene sind essentiell für die Hodenfunktion. Peritubuläre Zellen umgeben die Hodentubuli und tragen so zu deren strukturellen Integrität bei. Getrennt werden diese von den Sertoli-Zellen durch eine Basalmembran. Als „Ammenzellen“ der Spermatogenese besitzen die Sertoli-Zellen eine zentrale Bedeutung bei der Entwicklung der Keimzellen. Die etwa 500-800 Samenkanälchen sind in etwa 250-350, durch Septen getrennte, Hodenläppchen untergebracht. Die Gesamtlänge der Kanälchen im Hoden eines 30-jährigen Mannes wird auf etwa 300-350 m pro Hoden geschätzt. Die Samenkanälchen münden in das Spaltraumsystem des Rete testis, das zusammen mit zahlreichen Blut- und Lymphgefäßen in einen bindegewebigen Körper (Corpus Highmory) eingeschlossen ist. Aus den Tubuli contorti fließt ein steter Spermatozoen-enthaltender Flüssigkeitsstrom in das Rete testis, dessen Spalträume am oberen Hodenpol Anschluss an die Ductuli efferentes des Nebenhodens haben. Diese sind ca. 10-12 cm lang, stark aufgeknäuelt und münden End-zu-Seit in den Ductus epididymidis, der ebenfalls stark geknäuelt und ca. 5-6 m lang ist. Der Nebenhoden liegt an der Hilusseite dicht am Hoden an und reicht als 5-10 mm dickes, längliches Organ vom kranialen bis zum kaudalen Hodenpol. Hoden und Nebenhoden sind durch das Skrotum hindurch tastbar und somit der palpatorischen klinischen Untersuchung zugänglich. Mit Hilfe kleiner Bänder ist der Nebenhodenstrang am Boden fixiert. Am kaudalen Hodenpol knickt der Nebenhoden um, zieht nach kranial und geht in den Ductus deferens über. Aufgrund histologischer Untersuchungen lassen sich mehrere Gangabschnitte mit unterschiedlichem Wandaufbau, unterschiedlich weitem Lumen und unterschiedlicher Funktion erkennen (Waites und Gladwell, 1982). Als wesentlicher Teil der ableitenden Samenwege ist der Nebenhoden zugleich auch Samenspeicher und produziert gemeinsam mit dem hochdifferenzierten EINLEITUNG 5 Drüsenapparat, Samenblase, Prostata etc. Sekrete, die in ihrer Gesamtheit das notwendige biochemische Milieu für die bei der Ejakulation ausgestoßenen Samenzellen schaffen. Hier werden Nährstoffe zur Verfügung gestellt, um ein vorzeitiges Absterben der Spermien zu verhindern (Weinbauer und Nieschlag, 1993). Die Tubuli contorti sind mit einem 60-80 µm hohen Keimepithel ausgekleidet und von einer 7-10 µm dicken, myofibrösen Hülle umgeben (Lamina propria). Das Keimepithel besteht aus Keimzellen und Stützzellen, den sogenannten Sertoli-Zellen. Die Keimzellen vermehren sich im Keimepithel und machen die Reifeteilungen durch. Anschließend differenzieren sie sich zu Samenzellen. Die Entwicklung beginnt mit den Spermatogonien, die außen an der Basalmembran der Samenkanälchen liegen, und schreitet über Spermatozyten 1. und 2. Ordnung bis zu den Spermatiden fort, wobei die reifen Spermatiden das Lumen der Kanälchen säumen. Die Keimzellen unterscheiden sich durch einige Merkmale von den allgemeinen Körperzellen. Sie stehen durch Interzellularbrücken miteinander in Verbindung, so dass Zellgruppen gleichen Entwicklungsstadiums und weitgehend identischen genetischen Bestandes resultieren, sog. Klone (Sharpe, 1994). Aus einer Spermatogonie entsteht somit ein Klon von 4 Spermatozyten. In besonders frühen Stadien besitzen die Keimzellen eine elektronenoptisch erkennbare granuläre, osmophile Substanz, die als nuage (Wolke) bezeichnet wird. Um ihren Chromosomensatz auf den haploiden Satz zu reduzieren, machen sie Reifeteilungen (Meiose) durch, mit der gleichzeitigen Möglichkeit, das genetische Material neu zu kombinieren. Während ihrer hochgradigen Differenzierung finden Transformationen der Zellorganellen statt, z.B. die des Golgi-Apperates zum Akrosom. Auf ihrer höchsten Entwicklungsstufe werden sie als funktionstüchtige, freie Zellen aus dem Gewebsverband entlassen. Sertoli-Zellen sind somatische, im adulten Zustand teilungsinaktive Zellen, die im Keimepithel angesiedelt sind. Sie sind nach ihrem Erstbeschreiber Enrico Sertoli (1842-1910) benannt, der die Zellen wegen ihrer zytoplasmatischen Fortsätze und Ramifikationen 1865 als „cellule ramificate„ bezeichnete. Diese Zellen sitzen auf der Basalmembran, reichen bis zum Lumen und können, in übertragenem Sinne, als das Stützgerüst des Keimepithels angesehen werden. Entlang den Zellkörpern, die sich über die gesamte Höhe des keimtragenden Epithels erstrecken, verlaufen die morphologische und physiologische Differenzierung und Reifung der Keimzellen bis zum Spermium. Die Sertoli-Zellen koordinieren den Ablauf der Spermatogenese sowohl in topographischer als auch in funktioneller Hinsicht. Dafür spricht EINLEITUNG 6 die Produktion und Sekretion einer Vielzahl von Faktoren durch die Sertoli-Zellen: Proteine, Zytokine, Wachstumsfaktoren, Opioide, Steroide, Prostaglandine, Modulatoren der Zellteilung etc. (Waites und Gladwell, 1982). Die Morphologie der Sertoli-Zelle korreliert mit ihren vielfältigen physiologischen Funktionen. Im Zytoplasma finden sich endoplasmatisches Retikulum des glatten (Steroidsynthese) und rauhen Typs (Proteinsynthese), ein prominenter Golgi-Apparat (Verpackung und Transport sekretorischer Produkte), lysosomale Granula (Phagozytose) sowie Mikrotubuli und intermediäre Filamente (Anpassung der Zellform während der verschiedenen Phasen der Keimzellentwicklung) (Weinbauer und Nieschlag, 1993). Die Sertoli-Zelle hat in dem lumenseitigen Abschnitt des Keimepithels auch mit den Spermatiden besondere Zellkontakte, über die vermutlich ein kontrollierter Stofftransport stattfindet (Sylvester und Griswold, 1995). Sie besitzt auch Ernährungsfunktionen für die reifen Keimzellen. Die Sertoli-Zellen spielen im Hormonmetabolismus eine wichtige Rolle. Sie sind in der Lage Testosteron, mit Hilfe des Enzyms 5D-Reduktase, zu dem stark wirksamen 5-D-Dihydrotestosteron (DHT) zu reduzieren (Hiort, 2002). Darüber hinaus sind sie aber auch selbst sekretorisch tätig. Bei der Ratte wurde die Bildung eines Androgen- bindenden Proteins (ABP) nachgewiesen, das für die Kontrolle der Spermatogenese und für die Funktion der ableitenden Samenwege verantwortlich ist (Hinton und Setchel, 1993). Außerdem sezernieren Sertoli-Zellen Inhibin, das die FSH-Ausschüttung aus der Hypophyse hemmt (Robertson et al., 1993). Unreife Sertoli-Zellen haben sogar die Fähigkeit Testosteron in Östradiol umzuwandeln (Carreau et al., 2002). Da eine Sertoli-Zelle nur eine bestimmte Anzahl von Keimzellen ernähren kann, ist die Anzahl der Sertoli-Zellen der Menge der produzierten Spermatozoen proportional (Johnson et al., 1992). Diese Zahl ist speziesabhängig und beträgt beim Mann etwa 4 Spermien pro Zelle (Schlatt et al., 1995). Im Vergleich dazu liegen die Werte bei der Laborratte um 10. Dies bedeutet, dass innerhalb der Spezies eine höhere Anzahl an Sertoli-Zellen eine größere Produktion an Spermien mit sich bringt. Faktoren, welche das Proliferationsmuster der Sertoli-Zellen und damit die Hodengröße der Erwachsenen steuern können, werden im Folgenden beschrieben. EINLEITUNG 7 In präpubertären Java- und Rhesus-Affen sind die Sertoli-Zellen in geringem Ausmaß teilungsaktiv; deren proliferative Aktivität wird jedoch durch trophische Faktoren wie Androgene und follikelstimulierendes Hormon (FSH) deutlich stimuliert (Schlatt et al., 1995). Dies betrifft sowohl die Anzahl der Sertoli-Zellen als auch die Expression von Zellteilungsmarkern. Die Teilungen der Sertoli-Zellen enden zu Beginn der Pubertät mit dem Auftreten der ersten meiotischen Keimzellen. Zu diesem Zeitpunkt haben die Sertoli-Zellen untereinander „tight junctions“ ausgebildet, die sogenannte Blut-Hoden-Schranke (siehe unten) (Pelletier und Byers, 1992). Bei Laborratten bewirkt die Prolongation der Teilungsphase der Sertoli-Zellen, hervorgerufen durch eine Veränderung im Gleichgewicht der Schilddrüsenhormone, eine Erhöhung des Hodengewichts und der Spermienproduktion um 80% (Haaster et al., 1992). Patienten mit Laron-Zwerg-Syndrom leiden an einer Störung der Schilddrüsenfunktion und haben häufig überdurchschnittlich große Hoden (Hoffmann et al., 1991). Sertoli-Zellen produzieren und sezernieren Flüssigkeit und bilden dadurch das Tubuluslumen (Waites und Gladwell, 1982). Über 90% der Flüssigkeitsabgabe erfolgt in das tubuläre Lumen. Spezielle Strukturelemente der Blut-Hoden-Schranke verhindern den Rückfluss der sezernierten Flüssigkeit. Der daraus resultierende flüssigkeitsbedingte Druck hält das Lumen aufrecht. In dieser Tubulusflüssigkeit werden auch die Samenzellen transportiert. Die Zusammensetzung der tubulären Flüssigkeit ist im Detail bislang nur bei Ratten bekannt (Hinton und Setchel, 1993). Gegenüber dem Blut enthält die tubuläre Flüssigkeit wesentlich mehr Kaliumionen und entsprechend weniger Natriumionen. Andere Bestandteile sind Carbonat, Magnesium und Chloridionen, Inositol, Glukose, Carnitin, Glyzerylphosphorylcolin, Aminosäuren, Androgene und verschiedene Proteine (Hinton und Setchel, 1993). Damit befinden sich die Keimzellen in einem einzigartigen Flüssigkeitsmilieu. Im basolateralen Bereich benachbarter Sertoli-Zellen finden sich leistenförmige Memranspezialisierungen („occluding tight junctions“), welche den Interzellularspalt verschließen und somit die Blut-Hoden-Schranke aufbauen. Die Ausbildung dieser Blut- Hoden-Schranke koinzidiert mit dem Beginn der ersten Meiose der Keimzellen (Präleptotän- Zygotän) und dem Arrest der Proliferation der Sertoli-Zellen und existiert in allen bislang untersuchten Spezies. Durch die Blut-Hoden-Schranke wird das Keimepithel in zwei Regionen geteilt, die histologisch und funktionell völlig verschieden sind. Im basalen Bereich befinden sich die frühen Keimzellen und im adluminalen Bereich die weiterentwickelten und EINLEITUNG 8 die ausgereiften Keimzellen. Während der Entwicklung der Keimzellen werden diese durch die Blut-Hoden-Schranke regelrecht durchgeschleust. Für die Blut-Hoden-Schranke werden 2 Hauptfunktionen postuliert; die physikalische Isolierung der haploiden und damit antigenen Keimzellen, um deren Erkennung durch das Immunsystem zu verhindern (Prävention einer Autoimmunorchitis) und die Bereitstellung eines speziellen Milieus für den Ablauf der Meiose und der Spermienentwicklung (Pelletier und Byers, 1992). Einige Autoren halten die Bereitstellung eines spezifischen metabolischen Milieus für die entscheidende Rolle der Blut- Hoden-Schranke, da beispielsweise bei saisonal fortpflanzungsaktiven Tieren der Abbau und Wiederaufbau der Schranke nicht von der Entwicklungsphase der Keimzellen, sondern eher mit der Aktivität der Sertoli-Zellen zusammenhängt (Pelletier und Byers, 1992). Die Ausbildung der Blut-Hoden-Schranke und deren Selektivität im Ausschluss von Molekülen bedingt, dass für die, im adluminalen Kompartiment lokalisierten Zellen, kein direkter Zugang zu Metaboliten aus der Peripherie oder aus dem Interstitium besteht. Damit sind diese Keimzellen auf eine Versorgung ausschließlich durch die Sertoli-Zellen angewiesen. Diese „Ernährungsfunktion“ kann wahrscheinlich über unterschiedliche Mechanismen erfolgen: selektiver Transport und Transzytose sowie Synthese und vektorielle Sekretion. So erfolgt die Versorgung der Keimzellen mit Eisen über selektiven Transport und Transzytose von Transferrin (Sylvester und Griswold, 1995). Synthese und vektorielle Sekretion wurde für eine Reihe von Substanzen beschrieben: beispielsweise das androgenbindende Protein, ein Produkt der Sertoli-Zelle, das sich jedoch auch in Keimzellen und sogar im Lumen des Nebenhodens findet; die Hormone Inhibin und Aktivin; und Plasminogenaktivator, eine proteolytische Substanz, die wahrscheinlich an der Freisetzung der Samenzellen in das Tubuluslumen beteiligt ist (Weinbauer und Nieschlag, 1992). Die Produktion von Laktat, als wichtigsten Energieträger für die sich entwickelnden Keimzellen, stellt eine wesentliche metabolische Funktion der Sertoli-Zelle dar. Bei der Untersuchung von Morphologie, Sauerstoffverbrauch und Proteinsynthese der Spermatozyten und Spermatiden zeigte sich eine direkte Abhängigkeit dieser Parameter vom Laktatangebot in der Umgebung. Laktatmangel führt zu frühzeitiger Degeneration und irreversiblem Abfall der Proteinsynthese, während sich bei ausreichender Laktatproduktion keine Veränderung dieser Messgrößen einstellt (Jutte et al., 1981). Eine Vielzahl von Stoffen führt zu einer Stimulation der Laktatproduktion durch die Sertoli- Zellen. Dazu gehört nicht nur das FSH, sondern auch z.B. cAMP, Insulin, IGF-I, EGF und EINLEITUNG 9 TGF-ß (Jutte et al., 1981). Alle diese Stoffe werden schon unter physiologischen Bedingungen in mehr oder weniger großen Mengen vom Körper produziert und haben damit Einfluss auf die Spermatogenese. FSH wird in der Hypophyse produziert und erreicht über das Blut den Hoden und somit die Sertoli-Zellen, die im Hodengewebe die einzige Zellart sind, die in nachweisbarer Größenordnung FSH Rezeptoren besitzen (Fakunding et al., 1976). FSH steigert dadurch die metabolische Aktivität der Sertoli-Zellen. Die Vermittlung der Wirkung vollzieht sich dabei über die Aktivierung der Adenylatcyclase und die Produktion von cAMP (Fakunding et al., 1976; Steinberger et al., 1978). Die enzymatische Ausstattung der Sertoli-Zellen umfasst neben den für die Laktatproduktion entscheidenden Enzymen der Glykolyse (unter anderem verschiedene LDH-Isoenzyme) auch die Alkalische Phosphatase, die Creatinkinase und die Gamma-Glutamyl-Transpeptidase (GGT) (Carreau et al, 1996). Die GGT scheint dabei in Hinblick auf die im Hoden vorkommenden Zellpopulationen recht spezifisch für die Sertoli-Zellen zu sein (Carreau et al, 1996). Durch die Abgabe verschiedener Proteine u.a. Transferrin (Skinner und Griswold, 1980), Plasminogen Aktivator (Lacroix et al., 1977), Androgen-Binding-Protein (ABP; Fritz et al., 1974) und Inhibin (Moore et al., 1993) zeigt sich die sekretorische Leistung dieser Zellen. ABP, das zur Vermittlung der Androgenwirkung im Hodengewebe notwendig ist, wurde in zahlreichen Studien als Sertoli-Zell Marker beschrieben. Ein Abfall der ABP Produktion wurde dabei als Indikator für eine gestörte Sertoli-Zell Funktion angesehen (Chapin et al., 1988). Das Wissen um die parakrine Funktion der Sertoli-Zellen, also insbesondere ihre Interaktion mit den Keimzellen oder auch den Leydig-Zellen via Botenstoffe, ist insgesamt gesehen allerdings noch sehr lückenhaft. Während die einzelnen Sekretionsprodukte und deren Produktionsort bekannt ist, weiß man doch sehr wenig über die Wirkungsmechanismen. EINLEITUNG 10 Zur Verdeutlichung der oben genannten Interaktionen zwischen Sertoli-Zellen, Leydig-Zellen und Keimzellen soll das in Abbildung 1 dargestellte Schema dienen: Abb.1: Schema der „cell-to-cell“ Interaktionen im menschlichen Hoden (aus: Carreau, 1995) ABP=Androgenbindendes Protein; NGF=Nervaler Wachstumsfaktor; EGF=Epidermaler Wachstumsfaktor; IGF=Insulinähnlicher Wachstumsfaktor; LDH=Laktat- dehydrogenase; AP=Alkalische Phosphatase; CK=Kreatinkinase; GGT=Gammaglutamyltranspeptidase Die Zellen selbst produzieren das Hormon Inhibin, das durch einen negativen Feedback- Mechanismus zu einer Abnahme der Gonadotropin Produktion in der Hypophyse führt (Moore et al., 1993). FSH führt demzufolge zu einer Steigerung der Inhibinsekretion der Sertoli-Zellen (in vitro um etwa 40%; Carreau, 1995). Die chemische Struktur des Inhibins ist seit etwa zehn Jahren bekannt (Eramaa et al., 1992). EINLEITUNG 11 Inhibin ist ein Polypeptidhormon, welches aus zwei verschiedenen, durch Disulfidbrücken verbundenen Untereinheiten, besteht (D-Untereinheit und entweder ßA-Untereinheit oder ßB- Untereinheit). Die D-Kette ist bei beiden Inhibin-Formen identisch, die ß-Kette unterscheidet Inhibin-A und Inhibin-B voneinander). Inhibin wird vom Ovar der Frau und Sertoli-Zellen des Mannes sezerniert. Es unterdrückt selektiv die Sekretion von FSH (Follikel- stimmulierendes-Hormon) und hat lokale Wirkung in den Gonaden. Dadurch spielt es eine große Rolle in der männlichen und weiblichen Reproduktionsphysiologie. Während des Menstruationszyklus der Frau steigt und fällt es z.B. unterschiedlich in den einzelnen Phasen (Moore et al., 1993). Es existiert jedoch noch eine weitere Substanz aus den oben genannten Strukturen, deren Wirkung der des Inhibins entgegengesetzt ist, das Aktivin. Es ensteht durch die Kombination zweier Beta-Untereinheiten und existiert daher in drei möglichen Formen: EA/EA; EA/EB und EB/EB (Moore et al., 1993). Aktivin führt zur Stimulation der FSH-Produktion von hypophysären Zellen, sowohl in-vitro (Ling et al., 1986) als auch in-vivo (McLachlan et al., 1989). Inhibin und Aktivin scheinen zudem entscheidende Bedeutung in der parakrinen Regulation der Spermatogenese zu haben (Mather et al., 1992). Beide führen zur Modulation der Funktion der interstitiellen Zellen und zum Anstieg der Spermatogonienproliferation in- vitro (Moore et al., 1993). Eine Schädigung der Sertoli-Zellen könnte somit für einen Teil der beobachteten negativen Effekte auf die männliche Fertilität verantwortlich sein. Unterschiedliche Substanzen wurden in den letzten Jahren auf ihren Einfluss auf die Sertoli-Zell-Funktion hin untersucht. Besonderes Augenmerk wurde dabei auf sogenannte Umweltgifte gelegt, d.h. Stoffe anthropogenen Ursprungs, die teils bei industriellen Prozessen freigesetzt, teils als Inhaltsstoffe von Verpackungsmaterialien verwendet werden oder aber als Pestizide bzw. Herbizide in die Umwelt gelangen und dort aufgrund ihrer oft inerten chemischen Zusammensetzung in den Nahrungsketten und im menschlichen Organismus kumulieren (Nolte et al., 1994; Pont und Albrecht, 1997; Schuurs , 1999; Monsees et al., 2000). Zu diesen Substanzen gehören beispielsweise Schwermetalle wie Cadmium, Quecksilber oder Blei aber auch Phthalatester, chlorierte Kohlenwasserstoffe und Nitroaromate (Nolte et al., 1994). Stachel et al. (1989) hatten das Vorkommen dieser und anderer Umweltschadstoffe in der Samenflüssigkeit nachgewiesen und stellten einen Zusammenhang zwischen deren Konzentration und beruflicher Exposition bzw. außergewöhnlicher Umweltbelastung her. EINLEITUNG 12 1.1. Vorkommen und Wirkung von Xenoöstrogenen, Östrogenen und synthetischen Nitromoschusduftstoffen 1.1.1. Bisphenol-A, Daidzein, 17D-Ethinylöstradiol, 17E-Östradiol Beobachtungen bezüglich der Reproduktionsfähigkeit wildlebender Tiere erhärten die Annahme, dass das gehäufte Auftreten von Missbildungen und Dysfunktionen des Urogenitaltraktes männlicher Individuen verschiedener Spezies zumindest teilweise auf Umweltfaktoren anthropogenen Ursprungs zurückzuführen ist. In Florida, USA, ist bei wildlebenden Panthern vermehrt Hodenhochstand und eine verminderte Qualität der Spermien zu verzeichnen (Facemire et al., 1995). Ebenso zeigen die dort lebenden Alligatoren Anzeichen einer Feminisierung, wie z.B. das gehäufte Auftreten von verkürzten Penissen. Eine erhöhte Exposition gegenüber Xenoöstrogenen wird hierbei als mögliche Ursache diskutiert (Colborn, 1995). Bei männlichen Fischen, die im Abflussbereich von Kläranlagen in England leben, wurde die Synthese von Vitelloginen nachgewiesen (Copeland et al., 1986). Diese Eidotterproteine werden normalerweise in der Leber weiblicher Fische unter Östrogeneinfluss synthetisiert und gelten als Bioindikator für eine Belastung mit Xenoöstrogenen. Über eine Feminisierung männlicher Nachkommen nach Belastung mit Xenoöstrogenen wird auch bei Schildkröten, Vögeln und Fledermäusen berichtet (Skakkebaek, 1995). Als Umwelthormone oder endokrine Modulatoren werden Chemikalien bezeichnet, die entweder wie körpereigene Hormone wirken oder aber deren Wirkung antagonisieren können. Xenoöstrogene, also endokrine Modulatoren mit östrogener Wirkung, stehen im Verdacht, für bestimmte Reproduktions- und Entwicklungsstörungen bei Tieren sowie für einen Rückgang der Spermatozoenzahlen bei Säugern, einschließlich des Mannes, verantwortlich zu sein (Carlsen et al., 1992; Sharpe und Skakkebaek, 1993; Toppari et al., 1996). Da jede Sertoli- Zelle nur eine definierte Anzahl von Keimzellen versorgen kann, ist die Menge der gebildeten Spermatozoen proportional zur Zahl der Sertoli-Zellen. Xenoöstrogene können bei embryonalen oder juvenilen Laborratten die FSH-Sekretion aus der Hypophyse vermindern und so die von diesem Hormon abhängige Teilungsrate der Sertoli-Zellen reduzieren (Sharpe et al., 1995). Das Xenoöstrogen Bisphenol-A und das Phytoöstrogen Daidzein haben eine um Zehnerpotenzen niedrigere Östrogenwirkung als das natürliche Hormon Östradiol. Daher ist jeder Einzelstoff für sich betrachtet bei der heutigen Exposition vermutlich für die Reproduktionsfähigkeit humaner Fortpflanzungsorgane tolerabel (Schäfer et al., 1996). Eine EINLEITUNG 13 additive oder gar synergistische Wirkung mehrerer Östrogen-wirkender Substanzen kann aber nicht ausgeschlossen werden. Xenoöstrogene binden in vitro und in vivo an Östrogenrezeptoren in Zielorganen wie Uterus, Brustdrüse etc. Östrogenrezeptoren werden aber auch in testikulären Leydigzellen exprimiert. Xenoöstrogene verdrängen in unterschiedlichem Ausmaß die endogenen Östrogene und beeinflussen damit das endokrine hormonelle Gleichgewicht (Korach et al., 1988; Thierfelder, 1995). Diese experimentell-toxikologischen Untersuchungen machen deutlich, dass Chemikalien mit östrogenartiger oder antiandrogener Wirkung eine mögliche Ursache für die beobachtete zunehmende Anzahl von Störungen der männlichen Fertilität darstellen können. Bei einigen expositionsrelevanten Stoffen mit nachgewiesener östrogener Aktivität ist bereits ein negativer Einfluss auf die männliche Fertilität nachgewiesen. Ein Beispiel ist Bisphenol- A. In vivo führt Bisphenol-A bei männlichen Ratten zu geringen morphologischen Änderungen des Reproduktionstraktes und zu einer Verringerung der Spermienproduktion (Vom Saal et al., 1998; Fisher et al., 1999; Welshons et al., 1999). Hardin et al. (1981) zeigten ein teratogenes Potential von Bisphenol-A nach Applikation an trächtigen Ratten. Das Xenoöstrogen Bisphenol-A z.B. wird aus der Plastikinnenverkleidung von Konserven- und Getränkedosen freigesetzt und durchschnittlich mit einer Konzentration von etwa 1µg/kg (# 4,4 nmol/l) Körpergewicht pro Tag mit der Nahrung aufgenommen. Daidzein dagegen bewirkt in vitro DNA-Schäden bei humanen Spermatozoen (Anderson et al., 1997). Das Isoflavon Daidzein kommt vorwiegend in Sojabohnen und daraus hergestellten Lebensmitteln vor. Die individuelle Exposition gegenüber Daidzein hängt von den Ernährungsgewohnheiten ab und ist wahrscheinlich in Japan wesentlich höher als in den USA. Eine Arbeit beschreibt den Nachweis von Daidzein im Urin des Menschen und diskutiert den theoretischen Einfluss auf die Fertilität (Bannwart et al., 1984). Bei peripubertären Rhesus-Affen ergaben Versuche mit spezieller Nahrung (mit/ohne Phytoöstrogene wie Daidzein und Genistein) keinen Einfluss auf den Plasmaspiegel der Sexualhormone oder auf die Organgewichte (Anthony et al., 1996). Nach pränataler Exposition mit Ethinylöstradiol zeigten männliche Mäuse Atrophien der Samenkanälchen und Hyperplasien der Leydig-Zellen (Yasuda et al., 1988). Bei 7 von 10 transsexuellen Männern (Phänotyp Mann, XY Sexchromosom), die über 6-13 Jahre mit EINLEITUNG 14 Östrogenen wie Ethinylöstradiol behandelt wurden, kam es zum Erliegen der Spermatogenese und zur Verminderung der Zahl der Leydig-Zellen. Die drei anderen hatten eine fokale oder normale Spermatogenese (Thiagaraj et al., 1987). Ethinylöstradiol ist ein Hauptbestandteil oraler Kontrazeptiva und gelangt über die Körperausscheidungen auch in das Trinkwasser, wo Dosen bis 22 ng/l nachgewiesen wurden (Rurainski et al., 1977). Neuere Untersuchungen zeigten, dass die Summe von freiem und konjugiertem Ethinylöstradiol im Oberflächenwasser bei maximal 2,5 ng/l liegt (Kalbfus, 1998). Dies sind relativ niedrige Mengen im Vergleich zu den in der Therapie üblichen Dosen an Steroidhormonen. Bei oralen Kontrazeptiva liegen diese bei Ethinylöstradiol zwischen 10- 50 µg pro Tag. Eine weitere Stoffgruppe, mit Wirkung auf Sertoli-Zellen, sind die Phthalate, die in großen Mengen als Weichmacher in Kunststoffen vorkommen. Sertoli-Zellen sind ein primäres Ziel von Phthalatestern. In Tierexperimenten (Ratte, Maus, Meerschweinchen) führten, über die Nahrung aufgenommene Phthalatester, zu spezifisch im Testis auftretenden histopathologischen Veränderungen, wie tubuläre Atrophie. Nach drei Wochen wurde eine reduzierte Fertilität beobachtet (Lindstrom et al., 1988). In testikulären Zellkulturen führten Phthalatester zu konzentrations-abhängigen (0,1-100 µM) Veränderungen in der Ultra- Struktur sowie in der sekretorischen und biochemischen Funktion von Sertoli-Zellen (Boekelheide, 1993) als auch von Leydig-Zellen (Jones et al., 1993). Alkylphenole, die als Additive für Kunststoffe eingesetzt werden, besitzen im Vergleich zu anderen Xenoestrogenen ein relativ hohes östrogenes Potential (White et al., 1994). Wird Oktylphenol (0,01-1 mg/l), Butyl-Benzylphthalate (1mg/l) oder Diethylstilbestrol (0,1 mg/l) männlichen Ratten während der ersten 2-12 Lebenstage verabreicht, zeigen diese später eine reduzierte Testesgröße sowie eine verringerte tägliche Spermatozoenproduktion (Sharpe et al., 1995). EINLEITUNG 15 1.1.2. Synthetische Nitromoschusduftstoffe Moschus Keton und Moschus Xylol Natürlicher Moschus ist ein stark riechendes Sekret der exokrinen Duftdrüsen des männlichen Moschustieres (Moschus moschiferus). Neben der Markierung des Territoriums dient Moschus zur Anziehung der weiblichen Artgenossen. Bereits im Altertum erlangte der natürliche Moschus große Bedeutung. Er galt als wirksames Aphrodisiakum und als Arzneimittel bei Fieber, Krämpfen, Keuchhusten und anderen Erkrankungen. Des Weiteren fand er bereits damals als Duftstoff bei der Parfümherstellung Verwendung. Natürlicher Moschus ist sehr kostbar, da die exokrinen Drüsen eines Moschustieres nur etwa 30-50 Gramm der Substanz enthalten. Der Chemiker Albert Baur entdeckte 1888 bei der Suche nach neuen Sprengstoffen zufällig, dass bestimmte nitrierte Benzolderivate Moschusgerüche mit bemerkenswert niedrigen Geruchsschwellenwerten entfalten. Diese di- und tri-Nitro-substituierten Aromaten zeichnen sich durch eine preiswerte und einfache, jedoch das Abwasser belastende, Herstellung aus. Im Laufe des 20. Jahrhunderts fanden diese Substanzen als Vertreter der ersten Generation der Moschus-Ersatzstoffe in der Parfüm-, Waschmittel- und Kosmetikindustrie vielfach Verwendung. Synthetische Moschusduftstoffe besitzen in den Produkten keine reinigenden oder pflegenden Eigenschaften, sondern erfüllen ausschließlich ästhetische Bedürfnisse. Bei der Anwendung in Waschmitteln, Reinigern und Kosmetika gelangen sie über das Abwasser in großen Mengen in die Umwelt. Sie sind biologisch schlecht abbaubar und werden in Kläranlagen nur teilweise zurückgehalten. Yamagishi et al., (1981) entdeckten erstmals Vertreter der Nitro-Moschusverbindungen in japanischen Gewässerproben. Bis heute sind synthetische Moschusduftstoffe sowohl in allen Umweltkompartimenten als auch in tierischen und humanen Geweben, im Blut und in der Muttermilch, nachgewiesen worden (Liebl und Ehrenstorfer, 1993; Fooken et al., 1997; Rimkus et al., 1999; Liebl et al., 2000). Moschus Xylol (MX, Abb.2) und Moschus Ketone (MK, Abb.2) sind die ökonomisch bedeutsamsten Vertreter der Stoffklasse der Nitro- Moschusverbindungen (UBA-Pressemitteilung Nr. 14/00). MX verbreitet einen süßlichen Duft und hat, die unter Produktionsgesichtspunkten, wertvolle Eigenschaft, wegen seiner geringen Flüchtigkeit, für andere Duftstoffe als Fixativ und Stabilisator zu fungieren. Der lang anhaltende Duft hat die größte Bedeutung in der Parfümierung von Waschpulver und Reinigungsmitteln. MK ist für das pudrige Aroma vieler bekannter Parfüms verantwortlich und findet außerdem breite Anwendung in Kosmetikprodukten. EINLEITUNG 16 Abb. 2: Strukturen des Moschus Keton und Moschus Xylol Strukturell sind die synthetischen Nitromoschusverbindungen nicht mit dem natürlichen Moschus verwandt. Natürliche Moschusverbindungen sind makrozyklische Ketone, Alkohole und Pyridinderivate. Demgegenüber sind Nitromoschusverbindungen nahezu vollständig substituierte di- und tri-Nitrobenzolverbindungen, die sich durch Nitrierung der entsprechenden Aromaten herstellen lassen. Die bisherigen Erkenntnisse belegen den persistenten und lipophilen Charakter der synthetischen Moschusduftstoffe. Sie besitzen ein hohes Bioakkumulationspotential in Fischen und anderen aquatischen Organismen (Rimkus und Brunn, 1996; Heberer et al., 1999). Dies bedeutet, dass auch kleine, kontinuierlich in die Umwelt abgegebene Stoffmengen in Lebewesen angereichert werden können und sich über die Nahrungskette in vergleichsweise hohen Konzentrationen in Tieren und Menschen wiederfinden (Heberer et al., 1999). Derzeit liegen für viele der synthetischen Moschusduftstoffe noch keine vollständigen Bewertungen ihres toxikologischen Potentials für Mensch und Umwelt vor. Nachgewiesen wurde jedoch, dass besonders die Nitro-Moschusduftstoffe Moschus Xylol und Keton allergische Reaktionen hervorrufen können. Aufgrund der hohen Fettlöslichkeit dieser Substanzen liegt die Vermutung nahe, dass sie direkt über die Haut in den Körper gelangen, wenn kosmetische Produkte verwendet werden oder Waschmittelrückstände an der Kleidung mit der Haut in Berührung kommen. In Tierversuchen wurde eine „gute“ dermale Aufnahme des Moschus Xylol bereits nachgewiesen (Hawkins und Ford, 1999). Moschus Keton und Moschus Xylol scheinen nicht östrogen wirksam zu sein, wohl aber die Metabolite von Moschus Xylol (Chou und Dietrich, 1999a, b; Christian et al., 1999; Siol, 2002). EINLEITUNG 17 Moschus Xylol induzierte in Fütterungsversuchen mit Ratten, Lebertumore (Goodman et al., 1991). Moschus Xylol kann ferner verschiedene, zum Fremdstoffmetabolismus gehörende Enzymsysteme, aktivieren (Goodman et al., 1991). Eine Abschätzung über die Langzeit- Giftigkeit für Mensch und Tier ist derzeit aber noch nicht möglich (Käfferlein und Angerer, 2000). Eine strukturelle Verwandtschaft besteht zwischen den Nitromoschusduftstoffen und den Sprengstoffen TNT, Hexyl und Pikrinsäure, deren öko-toxikologisches Potential bereits belegt ist (Krass, 1997). Ferner sind die Nitromoschusduftstoffe einigen nitroaromatischen Herbiziden (Pendimethalin und Trifluralin) ausgesprochen ähnlich. Im Jahr 1979 wurden erstmals im Bezug auf die Nitromoschusduftstoffe gesundheitliche Bedenken geäußert. Moschus Ambrette (MA), ein weiterer Vertreter dieser Stoffgruppe, erwies sich als Auslöser von Photoallergien und seine Verwendung in der Kosmetikindustrie wurde 1996 verboten. Aber auch für die anderen Vertreter der Nitromoschusduftstoffe wurden sporadisch beunruhigende Daten veröffentlicht. Seit Mitte der 90cer Jahre ist die Verwendung der mittlerweile als persistent und toxikologisch bedenklich geltenden Nitromoschusverbindungen im europäischen Raum rückläufig, in den USA und Kanada (Gatermann et al., 1999) hingegen nicht. 1.2. Untersuchte Zellparameter (Vitalität, Laktatproduktion und Inhibinproduktion) zur Überprüfung der Wirksamkeit von Östrogenen und Nitromoschusduftstoffen auf die Sertoli-Zellen Zur Messung der Vitalität wurde der MTT [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5- diphenyltetrazolium bromide]-Assay gewählt, da er eine relativ sensitive Methode ist, um die Zytotoxizität der getesteten Substanzen auf die Sertoli-Zelle zu ermitteln. Als metabolischer Parameter wurde die Laktatproduktion der Zellen bestimmt. Laktat ist ein Nebenprodukt des Kohlenhydrat-Stoffwechsels und wird zusammen mit Pyruvat von den Sertoli-Zellen als lebensnotwendiges Produkt an die Keimzellen geliefert. Die Laktat- und Pyruvatwerte sind z.B. ein Indikator für die Schwere von Kreislaufversagen. Es sind verschiedene Typen der Laktatazidose bekannt, die in Verbindung mit Gewebehypoxie, systemischen Störungen sowie angeborenen Stoffwechselstörungen auftreten können (Field et al., 1966; Frommer, 1983). Der Laktatstoffwechsel sowie der Sauerstoffverbrauch im Anschluss an körperliche Betätigung wurden bereits seit 1900 eingehend erforscht (Loomis, 1961; Gloster und Harris, 1962; Marbach und Weil, 1967). Der derzeitige Stand der Wissenschaft besagt, dass der Laktatstoffwechsel unabhängig von den Wegen zu jeder Zeit EINLEITUNG 18 stattfindet und daher keine Assoziation mit einer bestimmten VO2-Phase im Anschluss an körperliche Betätigung hergestellt werden kann (Gaesser und Brooks, 1984). Laktat gilt, wie oben bereits angeführt, als bevorzugtes Energiesubstrat für Spermatozyten und Spermatiden (Jutte et al., 1981). Der Nachweis von Laktat mit Hilfe eines gekoppelten Enzym-Assays ist ein in der klinischen Chemie seit langem verwendetes und standardisiertes Verfahren (Noll, 1984). Die Veränderung der Laktatproduktion ist ein sensitiver Marker für die Störung der Sertoli-Zellfunktion in vitro (Williams und Foster, 1988). Die potentesten Noxen in Bezug auf die Schädigung des Reproduktionssystems führen zu den größten Veränderungen des Zellmetabolismus. Interessanterweise kommt es dabei ausschließlich zu einer Steigerung der Laktatproduktion, ein Phänomen, das auch bei Gossypol (Moss et al., 1988), 1,2-Dibromo-3-chloropropan (Miller et al., 1985) und weiteren Substanzen zu beobachten ist. Inhibin als Referenz für die endokrine Funktion der Zellen kann erst seit einigen Jahren nachgewiesen werden (Moore et al., 1993). Inhibin-B hemmt über eine negative Rückkopplung mit der Hypophyse die Ausschüttung des Follikel-stimulierenden Hormons (FSH) (Anderson und Sharpe, 2000). Die Detektion dieses nur in minimalen Konzentrationen produzierten, aber für die Sertoli-Zelle hochspezifischen Hormons, erforderte früher die Verwendung eines Radioimmuno-Assays. Heute werden dagegen hochsensitive ELISA (Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay) eingesetzt. Neueste Untersuchungen zeigen, dass nur Inhibin-B beim Mann biologisch aktiv ist (De Kretser und McFarlane, 1996; Illingworth et al., 1996). AUFGABENSTELLUNG 19 2 Aufgabenstellung In dieser Arbeit soll der Einfluss von ausgewählten Umwelthormonen mit östrogener bzw. anti-androgener Wirkung sowie von Nitromoschusverbindungen auf wesentliche Funktionen (Vitalität, Laktat- und Inhibinproduktion) testikulärer Zellen im Rattenmodell untersucht werden. Eine mögliche Veränderung, der für die Spermatogenese essentiellen Sertoli- Zellfunktionen, kann zu einer Reifungsstörung der Samenzellen und damit zu einer Beeinträchtigung der männlichen Fertilität führen. Hierzu werden etablierte biochemische Testmethoden eingesetzt, um über Konzentrations- Wirkungs-Kurven, quantitative Aussagen über die Toxizität des jeweiligen Schadstoffes zu machen. Als hormonell aktive Substanzen sollten das oral wirksame Östrogen Ethinylöstradiol, als Xenoöstrogen Bisphenol-A, als natürliches Östrogen 17ß-Östradiol sowie das Phytoöstrogen Daidzein untersucht werden. Moschus Keton (C14H18N2O5) und Moschus Xylol (C12H15N3O6) sind Nitromoschusverbindungen, welche häufig in der Kosmetikindustrie als Duftstoffe zur Anwendung kommen. Die untersuchten Parameter sollten möglichst umfassend die Zellfunktionen repräsentieren und deren Modulation darstellen können. In vitro Studien sind ein wichtiges Instrument, um zu prüfen, ob eine Substanz direkt schädigend auf eine Zielzelle wirkt oder ob es ein Metabolit dieser Substanz ist und eignen sich auch hervorragend für die Analyse des Schadmechanismus. Die Auswahl der untersuchten Zellparameter sollte der komplexen Funktion und der Aufgabe der Sertoli-Zelle gerecht werden, ohne dabei praktische Gesichtspunkte wie Reproduzierbarkeit, Möglichkeit der Standardisierung, Untersuchung einer großen Anzahl von Proben und Wirtschaftlichkeit außer Acht zu lassen. Dies ist in vivo nicht oder nur eingeschränkt möglich. Bei reproduktionstoxikologischen Studien haben sich insbesondere Sertoli-Zellen in Primärkultur als ein nützliches in vitro System herausgestellt (Übersicht in Boekelheide, 1993). Einige sekretorische Parameter der Sertoli-Zelle, wie z.B. das Kohlenhydrat Laktat und das Proteinhormon Inhibin-B, zeigen oftmals signifikante Änderungen nach einer Exposition mit Noxen, die auch in vivo schädigend auf die männliche Fertilität bzw. die Spermatogenese wirken. Anhand der gewonnenen Ergebnisse sollte es möglich sein, eine Aussage darüber zu treffen, ob die Sertoli-Zelle eine potentielle Zielzelle für die jeweils untersuchte Substanz darstellt. Das Fernziel stellt dabei die Etablierung eines effizienten reproduktionstoxikologischen in AUFGABENSTELLUNG 20 vitro Screenings dar, um die Wirkung von hormonell aktiven Substanzen und von synthetischen Nitromoschusverbindungen auf das Reproduktionssystem zu beurteilen. Die Wichtigkeit dieser Erkenntnisse begründet sich durch das Vorkommen der zu testenden Noxen in vielen chemischen Substanzen in unmittelbarer Umgebung des Menschen. Deshalb kann diese Arbeit dazu dienen, eine mögliche Beeinflussung der Fertilität des Menschen durch diese Substanzen, aufzudecken. MATERIAL & METHODEN 21 3 Material und Methoden Für die Zellkultur wurden Sertoli-Zellen von etwa 21 Tage alten Spraque-Dawley Ratten (Fa. Harlan Winkelmann, Borchen) verwendet. Die Ratten wurden jeweils unmittelbar vor der Präparation geliefert. Die Versuche waren beim Regierungspräsidium Gießen unter dem Geschäftszeichen 17a-19c 20/15(c) gemäß § 8 Abs. 1 Tierschutzgesetz angezeigt worden. Alle Chemikalien wurden, soweit nicht explizit erwähnt, in der höchsten erhältlichen Qualität eingesetzt (pro analysi oder biochemisch rein). Für die Primärkultur der Sertoli-Zellen wurden speziell für die Zellkultur getestete Medien und Zusätze eingesetzt. 3.1. Verwendete Noxen Östrogene: Bisphenol A (Nr. I-0635, Sigma, Deisenhofen) 17-D Ethinylöstradiol (Nr. E-4876, Sigma) Daidzein (Nr. D-7802, Sigma) 17-ß Östradiol (Nr.E-2758, Sigma) Ausgehend von einer Stammlösung wurden die Östrogene in Dimethylsulfoxid (DMSO) (Sigma, Steinheim) mit dem Zellkulturmedium auf die benötigte Konzentration (siehe 3.4.) eingestellt. DMSO hatte im Medium sowie in der Kontrolle eine Maximalkonzentration von 0,1%. Nitromoschusduftstoffe: Moschus Xylol: (Nr. NIT 129, Promochem, Wesel) Moschus Keton: (Nr. NIT 130, Promochem, Wesel) MATERIAL & METHODEN 22 3.2 Verwendete Medien 1. Basismedium (Medium zum Herstellen der Kulturmedien unter Verwendung entsprechender Zusätze, Waschmedium): Dullbecco’s Modified Eagle’s Medium:Ham’s F-12 Medium (DMEM:Ham’s F-12; 1:1, 31330-038, Gibco, Berlin) 2. Kulturmedium A 500 ml Basismedium mit folgenden Zusätzen (angegeben ist die jeweilige Endkonzentrationen im Basismedium): x Cytosin Arabinosid (2µg/ml; Sigma, C-1768) x L-Glutamin (2mM; Gibco, 04305030-H) x Penicillin-Streptomycin Lsg. (100 µg/ml; Sigma, P-3539) x Epidermal Growth Factor (EGF; 10 ng/ml; Sigma, E-1257) x Apo-Transferrin (5 µg/ml; Sigma, T-1147) x Humaninsulin (2 µg/ml; Sigma, 1-1882 ) x Hydrocortison (10-8 M; Sigma, H-0135) x D-D-Tocopherol (Vitamin E; 200ng/ml; Serva, Heidelberg, 3656) x All-trans-Retinol (Vitamin A; 200 ng/ml; Serva, Heidelberg, 38280) x Testosteron (10-7 M; Sigma, T-5641) x FSH (100 ng/ml; Sigma, F-4520) 3. Kulturmedium B Entspricht Medium A ohne Zusatz von Cytosin-Arabinosid 4. Kulturmedium C Entspricht Medium A ohne Cytosin-Arabinosid und ohne FSH Bei der enzymatischen Isolation der Sertoli-Zellen wurden die nachfolgenden Medien verwendet: 1. Isolationsmedium A 20 ml Basismedium unter Zusatz von x 20 mg Kollagenase (Sigma, C-0130) und x 0,4 mg DNAse (Sigma, DN-25) MATERIAL & METHODEN 23 2. Isolationsmedium B 20 ml Basismedium mit x 40 mg Kollagenase x 40 mg Hyaluronidase (Sigma, H-3506) und x 0,4 mg DNAse 3. Stopmedium 50 ml Basismedium mit x 20 mg Trypsininhibitor aus Sojabohnen (Sigma, T-9003) x 100 mg Rinderserumalbumin (Sigma, H-7825) 3.3. Präparation der Sertoli-Zellen Bei der Präparation und im Umgang mit der Zellkultur wurde besonders auf die Verhinderung möglicher mikrobieller Kontamination geachtet. Dies bedeutet keimarmes Arbeiten unter der Sicherheitswerkbank (Klasse 2), Verwendung von sterilen Einmalartikeln bei Kunststoffröhrchen, Petrischalen, Pipettenspitzen, Pinzetten, Skalpellen, Handschuhen und Zellkulturschalen. Alle Kulturmedien und sonstige verwendete Lösungen wurden durch Sterilfiltration (Sterilfilterflaschen, Nalgene, New York, USA) sterilisiert. Die Sertoli- Zellkulturen wurden im Wesentlichen nach den Methoden von Hadley et al. (1985) und Onoda et al. (1990) angelegt, und dies ist im Folgenden beschrieben. 3.3.1. Rattenhodenpräparation Die Tiere wurden in einen geschlossenen Kunststoffbehälter gesetzt, für ca. 10 min mit CO2 begast und anschließend durch Eintauchen in 70% Ethanol äußerlich desinfiziert, um bei der Präparation mikrobielle Kontamination zu vermeiden. Danach wurde die Bauchhöhle eröffnet, die noch nicht deszendierten Hoden entnommen und in mit Gentamycin versetztem Basismedium (2ml Medium + 1ml Gentamycin, Sigma, G-3527) gewaschen. Schließlich wurde die Tunica albuginea der Hoden entfernt und der herausgeschabte Inhalt mit dem Skalpell zu einem feinen Brei zerkleinert. 3.3.2. Enzymatische Zellisolation Kollagenase spaltet das Kollagen der Interzellularverbindungen, ohne die einzelnen Zellen allzu stark zu schädigen, während Hyaluronidase besonders kollagenreiche Zellverbände der Bindegewebszellen auftrennt. Die DNAse hydrolysiert freigesetzte DNA, die sonst die Aggregation von Einzellzellen fördern würde. Der im Stopmedium enthaltene Trypsin- MATERIAL & METHODEN 24 Inhibitor und das Rinderserumalbumin stoppen die Aktivität des Enzyms Kollagenase. Dieser Vorgang der Isolierung der Zellen erfolgt durch die folgenden Arbeitsschritte. 1. Schritt x Gabe des zerkleinerten Hodengewebes in ein 50 ml Zentrifugationsröhrchen (Falcon, Lincoln Park, New Yersey, USA) mit 20 ml Isolationsmedium A x 15 min Schüttelwasserbad (37°C) x Herausnehmen, 7 min bei Raumtemperatur sedimentieren lassen und Absaugen des Überstandes 2. Schritt x Zugabe von 25 ml Stopmedium auf das Pellet x Schütteln und 7 min stehen lassen x Absaugen des Überstandes 3. Schritt x Zugabe von 20 ml Isolationsmedium B zum Pellet x Mischen und für 30 min ins Schüttelwasserbad stellen x Zentrifugieren für 30 s bei 500 U/min (35xg) x Absaugen des Überstandes 4. Schritt x Zugabe von 25 ml Stoplösung zum Pellet x Mischen und bei 500 U/min (35xg) 1 min zentrifugieren x Absaugen des Überstandes 5. Schritt x Zugabe von 20 ml Isolationsmedium B zum Pellet x Mischen und für 15 min ins Schüttelwasserbad stellen x 45 s bei 1000 U/min (130xg) zentrifugieren x Absaugen des Überstandes MATERIAL & METHODEN 25 6. Schritt x Zugabe von 30 ml Kulturmedium A x Mischen x Gabe der gesamten Menge in einen Homogenisator (sog. „Potter“, ein Glaszylinder mit einem teflonüberzogenen Edelstahlstab) zum Aufbrechen von Zellklustern x Homogenisieren durch 10maliges Auf- und Abbewegen des „Potters“ 7. Schritt x Filtrieren der Zellsuspension durch ein 70 µm Nylon Sieb (Falcon, BD Bioscience, Heidelberg) Die letzten beiden Schritte dienten der nochmaligen mechanischen Trennung der Zellen und der Gewinnung möglichst vieler Einzelzellen. 3.3.3. Anlegen der Zellkultur Die Zellzahl wurde in einer handelsüblichen Zählkammer nach Neubauer bestimmt und durch Zugabe einer entsprechenden Menge Kulturmedium A auf eine Dichte von 106 Zellen pro ml Suspension eingestellt. Anschließend wurden die Zellen auf 24er Kulturplatten (Primaria, Falcon) mit je 1 ml Suspension pro Vertiefung (Well) ausplattiert (entsprechend 106 Zellen/Well bzw. 0.5x106 Zellen/cm2). Das in Kulturmedium A enthaltene Mitosegift Cytosin-Arabinosid hemmt die Proliferation und unterdrückt damit das Wachstum von kontaminierenden Zellpopulationen (hauptsächlich Peritubular-Zellen). Die Reinheit der Zellkultur wurde regelmäßig morphologisch und histochemisch überprüft (s.a. Kapitel 3.3.5.). Dazu wurde ein Teil der Zellsuspension in geringer Dichte (400.000 Zellen/ml) in separate 24er Kulturplatten gegeben und auch in diesen Platten histochemisch analysiert. 3.3.4. Behandlung der Zellen mit hypotoner Lösung Nach 48 Stunden wurden die Zellen mit einer hypotonen Lösung (20 mM Tris-HCl, pH 7,5) behandelt. Die Osmolarität dieses Tris-Puffers beträgt nur 90 mOsmol/kg gegenüber 300 mOsmol/kg des normalen Zellkulturmediums. Dieser sogenannte „hypotone Schock“ lässt die Sertoli-Zellen relativ unbeeinflusst, führt jedoch zum Absterben der in der Kultur vorhandenen Keimzellen (Spermatogonien und Spermatozyten; Galdieri et al., 1981). MATERIAL & METHODEN 26 Die Behandlung der Zellen wurde folgendermaßen durchgeführt: x Auflösen von 240 mg Tris (Tris(hydroxymethyl)aminomethan; Sigma 6791) in Aq. dest zur Herstellung einer 20mM Tris-Lösung x Titrieren der 20 mM Tris-Lösung auf den pH Wert von 7,5 mit HCl x Sterilfiltration x Erwärmen auf 34°C im Schüttelwasserbad x Absaugen des Mediums von den Zellkulturschalen und Zugabe von 1ml 20mM Tris-HCl pro Well x Inkubation für 5 min x Absaugen der Lösung x Waschen der Zellen mit 1 ml Basismedium pro Well x Zufügen von je 1 ml Kulturmedium B (ohne Cytosin Arabinosid) Die Zellen wurden anschließend wieder in den Brutschrank gegeben. 3.3.5. Überprüfung der Reinheit der Zellkultur Zur Überprüfung der Reinheit der Zellkultur wurden die mit geringer Dichte auf 24-Well Kulturplatten ausplattierten Sertoli-Zellen verwendet. An Tag 1-6 erfolgten mit diesen Zellen Behandlungen wie Mediumwechsel, Aufbewahrung im Brutschrank und hypotoner Schock nach 48 Std.. Am sechsten Tag wurde die Kultur dann durch spezifische Färbung und Mikroskopie auf das Vorhandensein von fremden Zellpopulationen untersucht. Leydig-Zellen wurden durch Färbung auf 3ß-Hydroxysteroid Dehydrogenase (Welsh und Wiebe, 1975) nachgewiesen. Das Färbemedium setzte sich folgendermaßen zusammen: x 2 ml PBS (Phosphate Buffered Saline, 10 mM Na2HPO4/KH2PO4, 136 mM NaCl, 2,6 mM KCl, 1,42 mM CaCl2, 1 mM MgCl2, pH 7,3; Oxoid, Ltd, Basingstoke, Hampshire, UK) x 0,25 ml Nitro-Blue Tetrazolium (NBT; 0,25 mg/0,25 ml Aq. Dest; Sigma, N-6876) x 0,5 ml NAD (2,5 mg/0,5 ml Aq. dest.; Sigma, H-7825) x 0,25 ml Etiocholan-3ß-ol-17-one (0,4 mg/ml Propyleneglycol-ethanol, 1:1; Sigma, E-5251) x Einstellen des pH Wertes auf 7,7 mit ca. 200 µl 0,1 M Na2HPO4 Das Kontrollfärbemedium enthielt Aq. dest. anstelle von NBT. Die mit Zellsuspension versehenen Wells wurden bei Raumtemperatur für 40 min in einer feuchten Kammer angefärbt und anschließend mit PBS gewaschen. MATERIAL & METHODEN 27 Peritubuläre Myoidzellen wurden durch diese Färbung auf alkalische Phosphatase (Anthony et al., 1987), die im Wesentlichen auf diesen Zellen lokalisiert ist, dargestellt. Das Färbemedium wurde folgendermaßen angesetzt: x 10 mg Naphtol AS-2-Phosphorsäure (Sigma, N 2250) werden in 40 µl DMSO (Serva) gelöst und mit 5 ml Aq. dest. verdünnt x Zugeben von 5 ml 2-Amino-2-methyl-1-propanol (AMP)-Puffer: 25 mM AMP (1,11 g /500 ml Aq. dest.; Sigma) mit 1,25 mM MgCl2 (0,127 g/500ml), pH 8,9 (mit 37% HCl einstellen) x Kurz vor der Inkubation werden 10 mg Fast Red Violet LB (Sigma, F-3381) hinzugefügt und das gesamte Medium durch einen 0,2 µm Spritzenfilter (Sigma) gegeben. Vor der Färbung wurden die Zellen bei Raumtemperatur für 10 min mit einer Lösung aus 4% (V/V) Formaldehyd in 100mM Phosphatpuffer fixiert. Zur Färbung wurden 600µl Reagenzlösung pro Well appliziert und dann für 30 min in die Feuchtkammer gegeben. Danach wurden die Zellen mit PBS gewaschen. Bei der Mehrzahl der Präparationen war der Anteil der Zellen, welche sich anfärbten, d 5%. Sertoli-Zellen wurden durch Anfärben des intermediären Filamentproteins Vimentin nachgewiesen (Wrobel et al., 1995). Vimentin kommt in allen somatischen Zellen vor, d.h. im Testis werden neben Sertoli-Zellen auch Peritubular- und Leydig-Zellen angefärbt. In isoliertem Keimepithel allerdings wird Vimentin nur von Sertoli-Zellen exprimiert. Keimzellen zeigen dagegen keine immunhistochemische Anfärbung. Dazu waren folgende Schritte notwendig: 1.Tag: x Nach Absaugen des Mediums, Spülen mit PBS (pH 7,5) x Inkubation in 3%igem H2O2 für 5 min bei Raumtemperatur x 3-maliges Waschen mit PBS für 5 min x Präinkubation der Kulturschalen für 60 min bei Raumtemperatur in normalem Kaninchenserum (Dako, X-902) 1:5 in PBS verdünnt plus 5% BSA. x Inkubation der Zellen über Nacht mit dem 1.Antikörper: 1:1000 Monoklonaler Anti- Vimentin Antikörper von Mäusen (Sigma, V-6630) in PBS plus 1% BSA bei 4°C. 2. Tag x 3-maliges Waschen in PBS je 5 min MATERIAL & METHODEN 28 x Inkubation der Zellen für 60 min bei Raumtemperatur mit dem 2. Antikörper: Peroxidase- konjugierter Kaninchen-Anti-Maus-IgG (Dako, P-260) 1:100 mit PBS plus 1% BSA x 3-maliges Waschen in PBS, 5 min x Einmaliges Waschen in Tris-HCl (pH 7,3) für 5 min x Inkubation in DAB (Sigma, D-5905), 1 Tbl. in 15ml Tris-HCl plus 1% NiCl2 3.4. Toxikologische Untersuchung der zu testenden Substanzen Am 6. Tag wurde das Medium abgesaugt und durch 500 µl Kulturmedium C pro Well, in dem verschiedene Konzentrationen der jeweiligen zu testenden Substanz enthalten waren, ersetzt. Die Nitromoschusverbindungen Moschus Keton und Moschus Xylol sowie 17-D- Ethinylöstradiol, 17ß-Östradiol und 4,4-Isopropylidendiphenol (Bisphenol-A) wurden für jede Versuchsreihe frisch gewogen und in 1ml Dimethylsulfoxid (DMSO) gelöst. Daraus wurden jeweils 5 Lösungen zu je 0,1/1/10/100/1000 ng/ml Kulturmedium C oder 1/10/100/1000/10000 ng/ml Kulturmedium C hergestellt. Die Kontrollreihen der 24-Well-Kulturplatten wurden nur mit Kulturmedium C + DMSO behandelt (In 1ml Kulturmedium C wurde 1µl DMSO gelöst). Die Kulturplatten mit 24 Wells wurden folgendermaßen behandelt: x Absaugen des Mediums x Well 1 – 4 (Kontrollen): 500 µl Kulturmedium C + dem darin gelösten DMSO (1µl DMSO/1ml Kulturmedium C) x Well 5 –24: 500 µl Kulturmedium C + die jeweils zu testende Substanz (vorher gelöst in 1 ml DMSO) in 5 unterschiedlichen Konzentrationen (4 Wells/Konzentration) Sertoli-Zellen wurden danach im Brutschrank bei 34°C inkubiert. Nach 24 h, 48 h und 72h wurden Proben der Kulturplatten, für die Laktat (500µl/Well) oder für die Inhibinbestimmung (250µl/Well), entnommen (weiteres Vorgehen siehe Laktat- und Inhibinbestimmung). Es erfolgte die vorsichtige Absaugung des restlichen Mediums (bei Inhibinbestimmung) und die Bestimmung des Proteingehaltes der Sertoli-Zellen (siehe Proteinbestimmung). Für die MTT-Messung wurden 96-Well-Kulturplatten verwendet, dabei ohne vorherige Probenentnahme, das gesamte Medium abgesaugt, und die Zellen entsprechend weiterbehandelt (siehe MTT-Messung). MATERIAL & METHODEN 29 3.4.1. MTT-Messung Die Vitalität der Zellen wurde mit dem MTT-Assay bestimmt. MTT (3-[4,5-Dimethylthiazol- 2-yl]-2,5-diphenyl-2H-tetrazolium Bromid), ein gelber wasserlöslicher Farbstoff, wird durch mitochondriale Dehydrogenasen zu einem blauen wasserunlöslichem Formazan-Produkt reduziert. Diese Umwandlung vollzieht sich ausschließlich in lebenden Zellen. Die Konzentration des reduzierten blauen Farbstoffes wird photometrisch gemessen. Die Ausbeute an blauem Farbstoff ist ein direktes Maß für die Vitalität der untersuchten Zellpopulation. Sie ist direkt proportional zur Zellzahl und zur Zahl der Mitochondrien und nimmt in nichtvitalen Zellen/Zellverbänden rapide ab. Da die Zahl der Mitochondrien in der Sertoli-Zellkultur relativ stabil bleibt (Kelly et al., 1991), reflektiert eine Veränderung der Farbstoffmenge eine Veränderung der Zellzahl, der Zellvitalität oder beider Parameter. Für diese Bestimmung wurden die Zellen für 24 Std. bei 34°C mit verschiedenen Konzentrationen der zu untersuchenden Substanzen inkubiert und folgendermaßen weiterbehandelt. 1. Absaugen des Mediums und Zugabe von je 200 µl PBS (pH 7,3) und 20 µl MTT Lösung (Serva, 5 mg/ml in PBS gelöst); Verwendung von 96-Well Mikrotiterplatten 2. Inkubation für 1 Std. bei 34°C 3. Absaugen des Überstandes und Auflösen des reduzierten MTT mit je 200µl/Well Dimethylsulfoxid (DMSO). 4. Entnahme von je 80µl Probe und Messung der Absorption in Doppelbestimmung bei 550 nm unter Subtraktion der Hintergrundabsorption bei 620 nm in Mikrotiterplatten im MTP Reader EAR 400 ATC (SLT Labinstruments, Wien, Österreich). Je höher der gemessene Extinktionswert, desto größer die Konzentration des Farbstoffes und damit der Anteil an vitalen Zellen in der untersuchten Probe. Die Ergebnisse wurden als prozentualer Anteil vitaler Zellen im Vergleich zur Kontrollgruppe unbehandelter Zellen dargestellt: % ( ) ( ) Vitalität Extinktion Test Extinktion Kontrolle x 100 3.4.2. Laktatbestimmung Seit der Verfügbarkeit von hochgereinigtem Nikotinsäureamidadenindinukleotid (NAD) und Laktatdehydrogenase (LDH) konnte ein hochspezifischer Test für Laktat entwickelt werden. Die katalytischen Charakteristka von LDH ermöglichen eine spektralphotometrische Messung von Laktat bei einer Wellenlänge von 340 nm anhand des nachstehend beschriebenen Testverfahrens der NADH (reduziertes Nikotinsäureamidadenindinukleotid)- Produktion (Noll et al., 1984). MATERIAL & METHODEN 30 Grundlagen des Verfahrens: LDH Laktat + NAD ������! Pyruvat + NADH ( niedriger A 340 –Wert ) ( hoher A 340 - Wert ) Um den Verlauf der Reaktion in der gewünschten Richtung zu erzielen, muss das gebildete Pyruvat durch Hydrazin gebunden werden, wodurch es aus der Reaktionsgleichung entfernt wird. Die erhöhte Extinktion bei 340 nm aufgrund der Bildung von NADH gibt Aufschluss über die ursprünglich vorhandene Laktat-Konzentration. Die große Anzahl von Proben bei dieser Arbeit machte es notwendig, die in der Literatur beschriebene Methode wie folgt zu modifizieren: Nach 48-stündiger Inkubation (synthetische Nitromoschusduftstoffe) und 72-stündiger Inkubation (Bisphenol-A, Daidzein, 17E-Östradiol, 17D-Ethinylöstradiol) mit frischem bzw. schadstoffhaltigem Medium wurden je 250µl des Zellüberstandes entnommen, für 5 min auf 95°C erhitzt, zentrifugiert und bei -18°C tiefgefroren. Die Proben wurden dann innerhalb einer Woche weiterverarbeitet. Für die Laktatbestimmung wurden folgende Lösungen benötigt : Reagenzien: Laktat-Kit (Sigma Diagnostics) Laktatdehydrogenase (Nr. 826-6): LDH (aus Rinderherz)-Suspension in Ammoniumsulfat. LDH-Aktivität bei der Herstellung ca. 1000 U/ml Glycinpuffer (Sigma-Aldrich, Nr.826-3): Glycin ( 0,6 mol/l ) und Hydrazin; pH-Wert 9,2 bei 25° C. NAD (Sigma-Aldrich, Nr. 260-110): Nikotinamidadenindinukleotid. Grad 3. 10 mg in vorgewogenen Röhrchen. Laktatstandardlösung (Sigma-Aldrich, Nr. 826-10): L(+)-Milchsäure. 40 mg/dl (4,44 mmol/l). Enthält 0,1� Natriumazid als Konservierunsmittel. MATERIAL & METHODEN 31 Verfahren: x Die benötigte Anzahl der NAD-Röhrchen (Sigma-Aldrich, Nr.260-110) wurden durch Einbringen der folgenden Flüssigkeitsmengen vorbereitet: 2,0 ml Glycinpuffer, 4,0 ml Aqua dest. 0,1 ml Laktatdehydrogenase (LDH) Anschließend wurden alle Röhrchen verschlossen und NAD durch mehrmaliges Umkehren der Röhrchen aufgelöst. Die Lösung ist bei Zimmertemperatur 4 Stunden lang stabil, bei gekühlter Lagerung (2 – 8° C) 24 Stunden lang. x 0,9 ml dieser Lösung wurden in jeweils eine 1ml-Kunststoffküvette gefüllt x Den Küvetten wurden 0,1 ml des Zellüberstandes unterschiedlicher Konzentrationen (8 Küvetten / Konzentration = 4 Doppelbestimmungen / Konzentration bei 24-Well- Platten) zugefügt. Danach erfolgte sorgfältiges Mischen. x Als Blank (A2) wurde 0,1 ml H2O zugegeben, anstelle des Zellkulturüberstandes x Küvetten wurden nun 15 Minuten bei 37° C inkubiert. x Bestimmung der Extinktionen (jeweils Doppelbestimmungen einer Messprobe) bei 340 nm am Spektralphotometer DU 68 (Beckmann, München). Bei jeder Bestimmung wurde der Laktatgehalt zweier Lösungen mit standardisierter Konzentration (siehe Laktatstandardlösung) mitbestimmt. Die Messung verlief linear im Konzentrationsbereich von 2 bis 20 mg Laktat/100 ml (= 20-200 µg/ml). Die endgültige Laktatkonzentration wurde mittels folgender Formel ermittelt: Laktat (mmol/l) = ' A 340 * 1,0/6,22 * 0,1 * 1 = ' A340 * 1/0,622 x ' A340 = endgültige maximale Extinktion bei 340 nm (A1 – A2) x 1,0 = Reaktionsvolumen (ml) x 6,22 = millimolares Absorptionsvermögen von NADH bei 340 nm x 0,1 = Volumen (ml) der jeweiligen Probe in der Küvette x 1 = Messweg in cm. (beträgt der Messweg nicht 1 cm, so ist dieser Wert (in cm) in der obigen Gleichung entsprechend anzupassen. MATERIAL & METHODEN 32 Umrechnung der Laktatwerte in mg/Well: x 1/0,622 * 90/2000 1/0,622 = oben definierter Faktor 90 = Molekulargewicht der Milchsäure 2000 = Umrechnung der Ergebnisse von 1l in 500 µl (Menge des Kulturmedium C + die jeweils zu testende Substanz od. DMSO für 24-Well-Platten ) x Um eine größere Anzahl an Proben zu gewinnen, wurden bei der Laktatbestimmung teilweise 96-Well-Kulturplatten verwendet. Faktoren für die Umrechnungen der Ergebnisse : Laktat in mg/Well x 24 - Well - Platte: 1/0,622 * 90/2000 x 96 - Well - Platte: 1/0,622 * 90/4000 3.4.3. Inhibinbestimmung Die Bestimmung der Inhibinkonzentration im Medium erfolgte mit dem Inhibin-B Immunassay-Kit (Serotek, Oxford, UK) und wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt (Groome et al., 1996). Der hier verwendete ELISA weist die ß-Kette des Inhibin selektiv und äußerst sensitiv nach. Prinzip des Inhibin-B Assay’s (ELISA): Mikrotiterplatten, welche Antikörper gegen die ß-Untereinheit des Inhibins enthielten, wurden mit Standardlösungen, Kontrolllösungen und fötalem Kälberserum gefüllt. In der darauffolgenden Inkubationszeit band das Antigen (Inhibin-B) durch seine ß-Untereinheit an den immobilisierten Antikörper auf den Mikrotiterplatten. Nach zwei Waschvorgängen wurde ein weiterer Antikörper hinzugegeben. Dieser war gegen die D-Untereinheit des Inhibins gerichtet und mit einer alkalischen Phosphatase markiert. Ein weiterer Waschvorgang entfernte Material, welches nicht gebunden hatte. Durch Zugabe eines speziellen Substrates für das Enzym alkalische Phosphatase ist die Reaktion durch eine Rotfärbung in verschiedenen Farbtiefen sichtbar geworden. Die Farbergebnisse aus den Reaktionen der Kontrolllösungen waren direkt proportional zu den Farbergebnissen der Standardlösungen (enthielten Inhibin B Standard). MATERIAL & METHODEN 33 Reagenzien: Inhibin B Kit (Serotec) x 2 Inhibin B-Mikrotiterplatten (MCA1312K) x 6 ml 6% (SDS) Sodium Dodecyl-Sulfat-Solution (SDS1312) x 2x5 ml fötales Kälberserum (CO1312) x Inhibin B Standard (2000 pg/ml) (HPS1312) x 40 ml Lösungsmittel (BUF1312) x 2x0,1 ml Inhibin B Antikörper (MCA1312A) x 100 ml Waschpuffer (25 x konzentriert) (WB1312) x 1 x Substrat + Lösung (13 ml) (SB011) (DS011) x 1 x Amplifier + Lösung (13 ml) (AMP011) (DA011) x 13 ml Stop-Lösung (STPO011) x Wasserstoffperoxid (30%) Durchführung des Verfahrens: x Vorbereitung der Probelösungen in Eppendorf-Röhrchen (4 Stck/ Konzentration der jeweils zu testenden Substanz (a = 100 µl). x Vorbereitung der Standardlösungen: - Verdünnung des fötalen Kälberserums mit 5 ml destiliertem Wasser (10 minütiges Auflösen durch Schütteln) - 1,3 ml des Kälberserums wurden zum Inhibin-B Standard gegeben und vermischt (2000 pg/ml) - Herstellung der Standardreihe von Inhibin B (1000; 500; 250; 125; 62,5; 31,25 und 15,6 pg /ml) durch Verdünnung mit Kälberserum - von jeder der 7 Standardlösungen wurden 100 µl abgenommen und in Eppendorf-Röhrchen gefüllt x je 100 µl Kälberserum wurden in 2 Eppendorf -Röhrchen gegeben (Blank) x Behandlung der Standardlösungen, Kälberseren und Proben jeweils mit 50 µl 6% SDS x Erhitzen bei 96° C für 5 min x Abkühlen x 100 µl Lösungsmittel in jedes Eppendorf-Röhrchen geben x danach Zugabe von je 50 µl Wasserstoffperoxid (6%, Verdünnung aus 30%), Inkubation bei Raumtemperatur für 30 Minuten MATERIAL & METHODEN 34 x Umfüllung in Mikrotiterplatten (je Mikrotiterplatte 14x80 µl Standardlösungen, 4x80 µl Kälberserum, Proben mit je 80 µl); es wurden jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt x Inkubation über Nacht in einer feuchten Kammer x am folgenden Tag wurde zu je 0,1 ml Inhibin-B Antikörper 1ml Lösungsmittel gegeben; Umfüllung in zwei 15 ml Röhrchen und Auffüllung mit 5 ml Lösungsmittel x Mikrotiterplatten 4 x waschen und anschließend über Kopf auf Filterpapier trocken klopfen x Pro Well wurden dann 50 µl des verdünnten Inhibin-B Antikörpers eingefüllt x Inkubation der Mikrotiterplatten 3 h bei Raumtemperatur in einer feuchten Kammer x 8x Waschen der Mikrotiterplatten, beim letzten Waschgang wird der Waschpuffer nicht entfernt, sondern 15 min in den Wells belassen x Substratlösung (13 ml), 5 min mischen x 3x Waschen der Mikrotiterplatten x Zugabe des gelösten Substrates (pro Well = 50 µl) x 1 Stunde Inkubationszeit in feuchter Kammer x Verstärkerlösung (13 ml), 5 min Mischen x Zugabe des gelösten Verstärkers (pro Well = 50 µl) x Messung der Absorption in Doppelbestimmung bei 420 nm unter Subtraktion der Hintergrundabsorption bei 620 nm in Mikrotiterplatten im MTP Reader EAR 400 ATC (SLT Labinstruments). Umrechnung der Ergebnisse: x Inhibin (IHB) wurde in pg/ml am Photometer gemessen x Inhibin/Well (pg/ 0,5 ml) = IHB (pg/ml) / 2 x Protein (mg/Well) = Protein (mg/Well) / 5 (siehe Proteinbestimmung) x IHB (pg/100 µg Protein) = 100 µg Protein x IHB (pg/Well) / Protein (mg/Well) Aus den Werten der Standards wurde eine Eichkurve bestimmt, aus der die Inhibinkonzentration der einzelnen Proben ermittelt werden konnte. Die Sensitivität dieses Assays betrug 1 pg Inhibin/Probe bzw. 0,2 pg Inhibin/100µg Protein/24Std. MATERIAL & METHODEN 35 3.4.4. Proteinbestimmung Der Proteingehalt der Zellen wurde als Bezugswert für die Parameter Laktat und Inhibin verwendet. Die Proteinbestimmung erfolgte mit dem BIO-Rad Protein Assay (Bio Rad; 500- 0116, Hercules, CA, USA), basierend auf der Methode von Lowry et al. (1951). Dazu wurde das Kulturmedium entfernt und die Zellen mit jeweils 200 µl 1 M NaOH unter Zusatz von 0,1% SDS pro Well versetzt. Nach 2 Stunden Inkubation bei Raumtemperatur wurde jeweils eine Probe von 20 µl für die Messung in Doppelbestimmung auf Mikrotiterplatten verwendet. Zu diesem Zeitpunkt waren mikroskopisch keine Zellbestandteile mehr nachweisbar. Die Messung verlief wie folgt: 1. Zugabe von 200 µl Reagenz A zu je 20 µl Probe. Dabei bindet der Farbstoff unspezifisch an die Aminogruppen der in der Probe enthaltenen Proteine. 2. Zugabe von je 25 µl Reagenz B und damit Auslösen einer Farbreaktion, die umso stärker ausfällt, je mehr Protein vorhanden ist. 3. Inkubation für 30 min bei Raumtemperatur 4. Messung der Absorption der Lösung am MTP-Reader EAR 400 ATC (SLT- Labinstruments) bei O=690 nm und Bestimmung des Proteingehaltes mittels Standardkurve. Die Standardkurve wurde mit in NaOH+SDS (s.o.) gelöstem Rinderserumalbumin (BSA, H- 9568 Sigma) in den Konzentrationen 1000, 500, 250, 125, 62,5, 31,25 und 15,6 pg/ml ermittelt und verlief im Bereich von 200-1400 pg/ml linear. Die untere Nachweisgrenze lag bei 200 pg/ml. Die gemessenen Proteinmengen lagen zwischen 50 und 80 µg Zellprotein pro Well bzw. pro 106 Zellen. 3.5. Optimierungen Beim Anlegen der Zellkulturen und der Durchführung der verschiedenen Assays traten immer wieder Probleme auf, die teils umfangreiche Vorversuche bzw. Veränderungen, der in der Literatur beschriebenen Methoden, notwendig machten. Beim Ausplattieren fiel auf, dass die Sertoli-Zellen möglicherweise aufgrund ihrer Oberflächeneigenschaften zu Klusterbildung neigen. Dies hatte zur Folge, dass beim Auszählen einzelner Proben einer Präparation (s. Kpt. 3.3.3.) die Zelldichte stark variierte. MATERIAL & METHODEN 36 Die gewonnenen Daten wurden zwar auf die jeweilige Proteinmenge bezogen, dennoch ist davon auszugehen, dass sich das Verhalten der Zellen in Abhängigkeit von der Struktur und Größe des Zellverbandes verändert. Die Klusterbildung führte zudem zu einer mikroskopisch sichtbaren inhomogenen Verteilung der Zellen auf den einzelnen Vertiefungen der Zellkulturschale. Dies hatte weiterhin zur Folge, dass die gemessenen Werte (Protein, Laktat, Inhibin) stark variierten, was die Erstellung verschiedener Standardkurven notwendig machte, bzw. dass die Proben entsprechend verdünnt werden mussten. Im ungünstigsten Fall lagen die Werte außerhalb der Nachweisgrenze. Um dieses Problem zu beheben, wurden sterile Einmal- Siebe der Firma Falcon mit einer Maschenweite von 70 µm verwendet. Als Referenzgröße für die Stoffwechselparameter wurde der Proteingehalt der Zellen bestimmt. Zur Anwendung kam das Verfahren nach Lowry et al. (1951). Zur Trennung der Zellen wurde Natronlauge verwendet. Da sich einige Zellen sehr schlecht in der verwendeten Natronlauge voneinander lösten, wurde das Detergenz Natriumdodecylsulfat (SDS) zugesetzt. Bei der Vitalitätsbestimmung mittels MTT-Assay wird in der Originalvorschrift das Voneinanderlösen der Zellen und das Lösen des Formazanproduktes in salzsaurem Isopropanol empfohlen. Nach einigen Versuchen zeigte sich, dass schon nach kurzer Zeit durch Verdunstung Fehler in der photometrischen Bestimmung des Poteingehaltes auftraten. Daher wurde letztlich DMSO als Lösungsmittel verwendet. Aufgrund des wesentlich höheren Siedepunktes sind hier Fehler durch Verdunstung des Lösungsmittels zu vernachlässigen. Zur Laktatmessung wurde ein handelsüblicher Kit (Sigma Diagnostics) verwendet. Die Messung wurde in 1 ml Kunstoffküvetten durchgeführt. Für eine 24-Well-Zellkulturplatte waren dabei etwa 52 Einzelmessungen (Doppelbestimmung+Standards) nötig. Die Vorbehandlung des Überstandes mit Perchlorsäure zum Ausfällen von Proteinen erwies sich als unnötig. Durch Erhitzen der Proben auf 95°C, anschließendes Zentrifugieren sowie Lagerung bei –18°C, konnten relevante Enzyme inaktiviert werden. Bei der Durchführung des Inhibin-Assays fiel auf, dass die Konzentration des Hormons bei vielen Proben so gering war, dass es nicht mehr detektiert werden konnte. Die Ursache sahen wir zum einen in der unterschiedlichen Herkunft und Lebenshaltung der Versuchstiere (s. Kpt. 5) und zum anderen in der Lagerung der Proben vor der Durchführung des Assays. Die Proben wurden daher unmittelbar nach Versuchsende bzw. innerhalb einer Woche nach Gewinnung weiterverarbeitet. MATERIAL & METHODEN 37 Für die eigentlichen Experimente wurde das Endvolumen pro Well auf 500 µl verringert, wodurch sich die Konzentration des Inhibins deutlich erhöht. Beide Maßnahmen führten zu einer optimierten Bestimmung der Inhibin-Werte. Das Vorlösen in DMSO war dank deren guter Wasserlöslichkeit unproblematisch. 3.6. Statistik Die Experimente zur Laktat-, MTT- und Inhibin-Messung wurden mindestens dreimal wiederholt. Dabei ergaben sich vergleichbare Ergebnisse. Die dargestellten Resultate entsprachen jeweils einem repräsentativen Experiment; durchgeführt an je zwei Kulturplatten mit insgesamt acht Wells pro untersuchter Schadstoffkonzentration. Für die MTT-Messung wurden 96-Well-Kulturplatten verwendet mit insgesamt 10 Wells pro untersuchter Schadstoffkonzentration. Die Experimente zur Untersuchung der Inhibinsekretion unter Einwirkung von Nitromoschusverbindungen wurden an Kulturplatten mit vier Wells pro Konzentration durchgeführt. Die Normalverteilung der Proben wurde vorher getestet (Chi2- Test, Microsoft Exel). Wenn keine Normalverteilung vorlag wurde der Mann-Whitney-Test angewandt (Graph PAD In Stat. Dr. Saunders, Graph PAD Software vers. 1.11a, 1990, San Diego, Californien, USA). Die einzelnen Messreihen wurden durch Experimente an unterschiedlichen Präparationen der primären Sertoli-Zellen durchgeführt. Teilweise lagen daher variierende Ergebnisse der Kontrollen vor, z.B. schwankt der Laktatwert zwischen 20 und 60 µg/100 mg Protein. Die jeweiligen Messwerte konnten daher nicht zusammengelegt werden, um eine größere Stichprobe zu erhalten. Die Werte in den Diagrammen des Ergebnisteils (Kpt. 4) entsprechen dem Mittelwert r der Standardabweichung. Die Symbole (xxx), (xx) und (x) kennzeichnen dabei ein Signifikanzniveau von (p<0,001), (p<0,01) bzw. (p<0,05) im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle. Die Anzahl der Messwerte (n) ist jeweils angegeben. Die EC50-Werte wurden durch graphische Extrapolation aus den entsprechenden Dosis-Wirkungs-Diagrammen ermittelt. Der EC50-Wert entspricht derjenigen Schadstoffkonzentration, bei der eine Abnahme der Messgröße auf 50% des Kontrollwertes (unbehandelte Probe) beobachtet wurde. ERGEBNISSE 38 4. Ergebnisse 4.1. Darstellung der primären Sertoli-Zellkultur nach Präparation, vor und nach Behandlung mit hypotoner Lösung Abbildung 3 zeigt die primäre Sertoli-Zellkultur vor und nach dem sogenannten „hypotonen Schock“ (siehe 3.3.4.). In Abb. 3A ist die Keimzellkontamination noch deutlich zu erkennen, während in Abb. 3B vermehrt Spermatogonien und Spermatozyten abgestorben sind. A B Abb. 3: Primäre Sertoli-Zellkultur am zweiten Tag nach Präparation, vor (A) und nach (B) Behandlung mit hypotoner Lösung (Vergrößerung 310 fach). ERGEBNISSE 39 4.2. Darstellung angefärbter peritubulärer Myoidzellen und Sertoli-Zellen Peritubuläre Myoidzellen wurden durch Färbung auf alkalische Phosphatase (Anthony et al., 1987), die im wesentlichen auf diesen Zellen lokalisiert ist, dargestellt (Abb. 4). Der Sertoli-Zellrasen zeigt keine Anfärbung auf alkalische Phosphatase. Nur sehr wenige Zellen (< 5%) waren positiv für dieses Enzym, so dass es sich dabei um eine geringfügige Kontamination mit peritubulären Zellen handelt. Abb. 4: AP-Färbung zur Darstellung von peritubulären Myoidzellen (Vergrößerung 190fach). Durch Anfärbung des intermediären Filamentproteins Vimentin wurden Sertoli-Zellen in Abbildung 5 dargestellt (siehe 3.3.5.). Der Sertoli-Zellrasen weist eine einheitliche positive Färbung für Vimentin auf. Es sind nur ganz vereinzelt (1-2%) Keimzellen zu detectieren. ERGEBNISSE 40 Abb. 5: Anfärbung der Zellkultur auf Vimentin sieben Tage nach Präparation (Vergrößerung 310fach). 4.3. Vitalität der Sertoli-Zellen nach Zugabe der zu untersuchenden Substanzen Die Sertoli-Zellkultur wurde 24 Stunden mit verschiedenen Konzentrationen des jeweiligen Schadstoffes inkubiert. Danach erfolgte die Bestimmung der Vitalität der Sertoli-Zellen mit Hilfe des MTT-Assays. MTT, ein gelber Farbstoff, wird von Zellen aufgenommen und zu einem blauen unlöslichen Formazanprodukt reduziert. Dieser Prozess findet ausschließlich in lebenden Zellen statt und benötigt die Aktivität von mitochondralen Dehydrogenasen. Bisphenol-A zeigte im Konzentrationsbereich 0-43 µM (0-10000 ng/ml) keinen Einfluss auf die Vitalität der Sertoli-Zellen (Abb. 6). ERGEBNISSE 41 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 0,00438 0,043 0,438 4,38 43,85 Bisphenol-A [µM] V it al it ät [ % ] Abb. 6: Vitalität der Sertoli-Zellen nach 72 Stunden Inkubation mit Bisphenol-A. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 6 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=6). Abbildung 7 zeigt die Vitalität der Sertoli-Zellen nach Inkubation mit verschiedenen Konzentrationen Daidzein. Es zeigte sich im niedrigen Konzentrationsbereich von 0-0,036 µM nur ein geringer Einfluss auf die Vitalität. Im Messbereich von 3,6-36 µM (1000-10000 ng/ml) wirkte Daidzein jedoch zytotoxisch. Ab einer Konzentration von 3,6 µM Daidzein verringerte sich die Vitalität der Sertoli-Zellen um etwa 20%. Eine signifikante Verringerung der Vitalität der Sertoli-Zellen wurde ab einer Konzentration von 36 µM Daidzein erreicht (um etwa 40%). [xx] 0 20 40 60 80 100 120 140 160 0 0,0036 0,036 0,36 3,6 36 Daidzein [µM] V ita lit ät [ % ] Abb. 7: Vitalität der Sertoli-Zellen nach 72 Stunden Inkubation mit Daidzein. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 6 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=6), (xx) kennzeichnet ein Signifikanzniveau von (p� 0,01). ERGEBNISSE 42 In fast allen Konzentrationsbereichen führte Ethinylöstradiol nicht zu einer negativen Beeinflussung der Zellaktivität der Sertoli-Zellen. Eine Minderung der Vitalität auf 65% ist, ab einer Konzentration von 0,0033 µM (1 ng/ml) Ethinylöstradiol nach 72 Stunden Inkubationszeit, zu erkennen, welche aber nicht signifikant ist (Abb. 8). 0 20 40 60 80 100 120 140 0 0,00033 0,0033 0,033 0,33 3,3 Ethinylöstradiol [µM] V ita lit ät [ % ] Abb 8: Vitalität der Sertoli-Zellen nach 72 Stunden Inkubation mit Ethinylöstradiol. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 6 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=6). Wie Abbildung 9 erkennen lässt, wirkte sich 17ß-Östradiol in allen angegebenen Konzentrationsbereichen nicht auf die Vitalität der Sertoli-Zellen aus. 0 20 40 60 80 100 120 140 0 0,00036 0,0036 0,036 0,36 3,6 17ß-Östradiol [µM] V ita lit ät [ % ] Abb. 9: Vitalität der Sertoli-Zellen nach 72 Stunden Inkubation mit 17ß-Östradiol. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 6 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=6). ERGEBNISSE 43 Im untersuchten Konzentrationsbereich (0-3,3 µM) zeigte Moschus Keton keinen messbaren Einfluss auf die Zellvitalität (Abb. 10). 0 20 40 60 80 100 120 140 0 0,000339 0,0033 0,033 0,3 3,3 Moschus Keton [µM] V ita lit ät [ % ] Abb. 10: Vitalität der Sertoli-Zellen nach 48 Stunden Inkubation mit Moschus Keton. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 10 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=10). Unter der Einwirkung von Moschus-Xylol ergaben sich keine Veränderungen der Vitalität der Sertoli-Zellen (Abb. 11). 0 20 40 60 80 100 120 140 0 0,000339 0,0033 0,033 0,3 3,3 Moschus Xylol [µM] V it al it ät [ % ] Abb. 11: Vitalität der Sertoli-Zellen nach 48 Stunden Inkubation mit Moschus Xylol. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 10 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=10). ERGEBNISSE 44 4.4. Laktatproduktion der Sertoli-Zellen nach Zugabe der zu untersuchenden Substanzen Die Laktatproduktion der Zellen wurde mit Hilfe eines gekoppelten Enzymassays bestimmt. Dafür wurde die Sertoli-Zellkultur 72 Stunden mit Bisphenol-A, Daidzein, Ethinylöstradiol und 17ß-Östradiol inkubiert. Bei den Sertoli-Zellen, die mit Nitromoschusverbindungen inkubiert wurden, betrug die Inkubationszeit nur 48 Stunden (s. Kpt. 3.4.1.). Unter Bisphenol-A zeigte sich eine signifikante Erhöhung der Laktatproduktion im Konzentrationsbereich 0,00438 µM (1 ng/ml) um 20%. Im Allgemeinen jedoch zeichnen sich nur geringfügige Änderungen der Laktatproduktion im Kurvenverlauf unter dem Einfluss von Bisphenol-A ab (Abb. 12). [x] 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0 0,00438 0,043 0,438 4,38 43,85 Bisphenol-A [µM] L ac ta t [m g /1 00 µ g P ro t] Abb. 12: Laktatproduktion der Sertoli-Zellen nach 72 Stunden Inkubation mit Bisphenol-A . Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 8 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=8), (x) kennzeichnet ein Signifikanzniveau von (p<0,05). Unter dem Einfluss von Daidzein konnte innerhalb von 72 Stunden keine signifikante Änderung der Laktatproduktion festgestellt werden (Abb. 13). ERGEBNISSE 45 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0,045 0,05 0 0,0036 0,036 0,36 3,6 36 Daidzein [µM] L ak ta t [m g /1 00 µg P ro te in ] Abb. 13: Laktatproduktion der Sertoli-Zellen nach 72 Stunden Inkubation mit Daidzein. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 5 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=5). Niedrige Konzentrationen bis 0,0033 µM (1 ng/ml) Ethinylöstradiol zeigen im Kurvenverlauf nur geringfügige Änderungen der Laktatproduktion, nach 72 Stunden Inkubationszeit, an. Höhere Konzentrationen ab 0,033 µM Ethinylöstradiol jedoch führten nach 72 Stunden zu einer hochsignifikanten Zunahme der Laktatkonzentration im Zellkulturüberstand. 0,33 µM (100 ng/ml) Ethinylöstradiol steigerten die Laktatproduktion um das 1,5fache und 3,3 µM (1000 ng/ml) um das 4,3fache gegenüber der Kontrolle (Abb. 14). [xx] [xxx] [xx] 0 0,02 0,04 0,06 0,08 0,1 0,12 0,14 0,16 0 0,00033 0,0033 0,033 0,33 3,3 Ethinylöstradiol [µM] L ak ta t [m g /1 00 µ g P ro te in ] Abb. 14: Laktatproduktion der Sertoli-Zellen nach 72 Stunden Inkubation mit Ethinylöstradiol. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 6 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=6), (xxx) und (xx) kennzeichnen ein Signifikanzniveau von (p�0,001), (p� 0,01). ERGEBNISSE 46 17ß-Östradiol wirkte sich dagegen nicht signifikant auf die Laktatproduktion der Sertoli- Zellen aus, was man dem Kurvenverlauf in Abb. 15 entnehmen kann. 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0,08 0 0,00036 0,0036 0,036 0,36 3,6 17ß-Östradiol [µM] L ak ta t [m g /1 00 µ g P ro te in ] Abb. 15: Laktatproduktion der Sertoli-Zellen nach 72 Stunden Inkubation mit 17ß- Östradiol. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 8 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=8). Die Untersuchung mit Nitromoschusverbindungen (Moschus Keton und Moschus Xylol) zeigte nach 48 Stunden Inkubation nur einen geringen Einfluss beider Noxen auf die Laktatproduktion der Sertoli-Zellen. In Abbildung 16 zeichnet sich mit steigenden Konzentrationen an Moschus Keton eine sinkende Laktatproduktion ab, welche ab 0,3 µM (100 ng/ml) Moschus Keton signifikant wurde. Hier reduzierte Moschus Keton die Laktatkonzentration der Sertoli-Zellen um 39% gegenüber der Kontrolle. [x] 0 0,005 0,01 0,015 0,02 0,025 0,03 0,035 0,04 0 0,000339 0,0033 0,033 0,3 3,3 Moschus Keton [µM] L ak ta t [m g /1 00 µ g P ro te in ] Abb. 16: Laktatproduktion der Sertoli-Zellen nach 48 Stunden Inkubation mit Moschus Keton. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 4 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=4), (x) kennzeichnet ein Signifikanzniveau von (p�0,05). ERGEBNISSE 47 Moschus Xylol führte sowohl im niedrigen wie auch im höheren Konzentrationsbereich nicht zu einem Anstieg der Laktatproduktion der Sertoli-Zellen im Vergleich zur Kontrolle. Der Kurvenverlauf (Abb. 17) zeigt zwar eine marginale Steigerung der Laktatproduktion unter Moschus Xylol im hohen Konzentrationsbereich, jedoch keinen signifikanten Anstieg. 0 0,01 0,02 0,03 0,04 0,05 0,06 0,07 0 0.000339 0,0033 0,033 0,3 3,3 Moschus Xylol [µM] L ak ta t [m g /1 00 µ g P ro te in ] Abb.17: Laktatproduktion der Sertoli-Zellen nach 48 Stunden Inkubation mit Moschus Xylol. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 4 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=4). ERGEBNISSE 48 4.5. Inhibin-B-Sekretion der Sertoli-Zellen nach Zugabe der zu untersuchenden Substanzen Für die Funktion der Sertoli-Zelle ist das Protein Inhibin ein spezifischer Parameter. Dieses Hormon wird nur in sehr geringen Mengen produziert und abgegeben. Es wurde ein hochsensitives ELISA zur Detektion verwendet. Die Sensitivität des Assays betrug 0,2 pg Inhibin/100 µg Protein/24 Std (s. Kpt. 3.4.2.). Niedrige Konzentrationen von Bisphenol-A bis 0,438 µM beeinflussten die Inhibinproduktion der Sertoli-Zellen nicht. Ab dem Konzentrationsbereich von 100 ng/ml (4,38 µM) kam es dann mit steigender Konzentration des Bisphenol-A zu einer Verringerung der Inhibinsekretion der Sertoli-Zellen. Eine reduzierte Inhibinkonzentration um 24% (im Vergleich zur Kontrolle) zeigte sich nach 24 Stunden Inkubation der Sertoli-Zellen mit 10 000 ng/ml (43,85 µM) Bisphenol-A. Dieser Abnahme (bei 43,85 µM) ist als hoch signifikant einzustufen (Abb. 18) [xxx] 0 100 200 300 400 500 600 0 0,00438 0,0438 0,438 4,38 43,85 Bisphenol-A [µM] In h ib in -B ( p g /1 00 µ g P ro te in ] Abb. 18: Inhibinproduktion der Sertoli-Zellen nach 24 Stunden Inkubation mit Bisphenol-A. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 6 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=6). (xxx) kennzeichnet ein Signifikanzniveau von (p�0,001). ERGEBNISSE 49 Daidzein zeigte im Gegensatz dazu weder im niedrigen noch im hohen Konzentrationsbereich signifikante Abweichungen der Inhibinsekretion (Abb. 19). Unter niedrigen Daidzein-Konzentrationen tendiert die Inhibinsekretion zu leichtem Anstieg, während unter höheren Konzentrationen die Werte für Inhibin-B eher sinken. 0 100 200 300 400 500 600 700 0 0,0036 0,036 0,36 3,6 36 Daidzein [µM] In h ib in -B [ p g /1 00 µ g P ro te in ] Abb. 19: Inhibinproduktion der Sertoli-Zellen nach 24 Stunden Inkubation mit Daidzein. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 6 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=6). Im Konzentrationsbereich von 0 bis 0,033 µM Ethinylöstradiol (nach 24 Stunden Inkubationszeit) zeigte sich keine Veränderung der Inhibin-B-Werte. Eine signifikante bis hoch signifikante Steigerung der Inhibin-B-Sekretion der Sertoli-Zellen konnte ab 100 ng/ml (0,33 µM) Ethinylöstradiol erkannt werden (Abb. 20). So ist eine Steigerung der Inhibin-B-Sekretion um 72% nach einer 24-stündigen Inkubation der Sertoli-Zellen mit 3,3 µM (1000 ng/ml) Ethinylöstradiol zu verzeichnen. ERGEBNISSE 50 [xxx] [xx] 0 100 200 300 400 500 600 700 0 0,00033 0,0033 0,033 0,33 3,3 Ethinylöstradiol [µM] In h ib in -B [ p g /1 00 µ g P ro te in ] Abb. 20: Inhibinproduktion der Sertoli-Zellen nach 24 Stunden Inkubation mit Ethinylöstradiol. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 8 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=8), (xx) und (xxx) kennzeichnen ein Signifikanzniveau von (p�0,001), (p� 0,01). Dagegen zeigt Abbildung 21 unter Einwirkung von 17ß-Östradiol nur geringfügige Abweichungen der Inhibin-B-Werte im Kurvenverlauf. Unter zunehmenden Konzentrationen von 17ß-Östradiol (0-1000 ng/ml) ergaben sich keine Veränderungen in der Inhibin-B- Sekretion der Sertoli-Zellen. 0 100 200 300 400 500 600 700 800 0 0,00036 0,0036 0,036 0,36 3,6 17ß-Östradiol [µM] In h ib in -B [ p g /1 00 µ g P ro te in ] Abb. 21: Inhibinproduktion der Sertoli-Zellen nach 24 Stunden Inkubation mit 17ß-Östradiol. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 8 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=8). ERGEBNISSE 51 Als Reaktion der Sertoli-Zellen auf die Zugabe von Moschus Keton kam es zu keiner konzentrationsabhängigen Veränderung der Inhibin-B Konzentration. Nur bei der am höchsten getesteten Konzentration von Moschus Keton (1000 ng/ml 3,3 µM) zeigte sich ein Rückgang der Inhibin-B Konzentration um 13% gegenüber der Kontrolle, der allerdings nicht signifikant war (Abb. 22). 0 50 100 150 200 250 0 0,00038 0,0033 0,033 0,3 3,3 Moschus Keton [µM] In h ib in -B [ p g /1 00 µ g P ro te in ] Abb. 22: Inhibinproduktion der Sertoli-Zellen nach 48 Stunden Inkubation mit Moschus Keton. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 4 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=4). Bei Moschus Xylol zeigte sich dagegen im hohen Konzentrationsbereich ab 10 ng/ml (0,033 µM) eine leichte Abnahme der Inhibin-B Menge im Zellkulturüberstand, die bei der getesteten Konzentration signifikant war (Abb. 23). ERGEBNISSE 52 [x] 0 50 100 150 200 250 300 350 0 0,00038 0,0033 0,033 0,3 3,3 Moschus Xylol [µM] In h ib in -B [ p g /1 00 µ g P ro te in ] Abb. 23: Inhibinproduktion der Sertoli-Zellen nach 48 Stunden Inkubation mit Moschus Xylol. Gezeigt sind die Mittelwerte (r SD) von 4 eigenständigen Versuchen in Doppelbestimmung (n=4), (x) kennzeichnet ein Signifikanzniveau von (p�0,05). DISKUSSION 53 5 Diskussion 5.1. Methodische Aspekte Primäre Aufgabe dieser Arbeit war es, ein in vitro Testsystem als mögliches Sreening- Verfahren zu etablieren, das es ermöglicht, die reproduktionstoxische Potenz einer Noxe innerhalb kurzer Zeit beurteilen zu können. Bei der Bewertung eines Testsystems werden Probleme der praktischen Tätigkeit berücksichtigt. Zu Beginn der Diskussion soll daher eine Betrachtung dieser Probleme stehen, die vor allem im Bereich der Standardisierung und Optimierung auftraten. Beim Anlegen der Zellkultur konnte auf die schon bestehenden Erfahrungen der Arbeitsgruppe zurückgegriffen werden. Das wesentliche Problem lag in der Zellseparation. Die Gewinnung von Einzelzellen stellte sich zu Beginn als schwierig dar, war aber notwendige Voraussetzung, um eine möglichst gleich große Zellpopulation in den einzelnen Kulturschalen zu erhalten. Die Verwendung eines 70 µm Nylonsiebes nach enzymatischer und grober mechanischer Trennung führte zwar zu einer Reduktion der Gesamtzahl gewonnener Zellen, resultierte aber in einer Eliminierung der Zellkluster, so dass im wesentlichen Einzelzellen gewonnen wurden. Daher wurde dieser Schritt bei der Zellpräparation hinzugefügt, der so in bisherigen Publikationen nicht beschrieben ist (Hadley et al., 1985; Onoda et al., 1990; Monsees et al., 1996). Bei der Anwendung der einzelnen Assays ergaben sich kleinere Probleme. Die Detektion von Laktat ist eine seit vielen Jahren in der Biochemie verwendete Methode. Bisherige Testkits arbeiteten mit weitaus größeren Probenvolumina, als sie für diese Arbeit zur Verfügung standen. Der Testkit (Sigma Diagnostics), welcher hier Verwendung fand, arbeitete mit geringen Volumina. Das wesentliche Problem bei der Inhibinbestimmung lag zum einen in der äußerst geringen Konzentration des Inhibins in den Proben, zum anderen in der, durch das komplizierte und langwierige Testverfahren, verursachten Störanfälligkeit des Assays. In Vorversuchen zeigte sich, dass es trotz Einhaltung der vom Hersteller des Assays angegebenen Methode zur Konservierung der Proben durch Einfrieren bei -80°C, zu einem relevanten Abbau des Inhibins nach etwa 14 Tagen gekommen war. Die Proben wurden daher möglichst unmittelbar nach Versuchsende bzw. spätestens innerhalb einer Woche weiter bearbeitet. Je nach Zellpräparation zeigte sich außerdem, dass die basale Inhibinsekretion der Zellen stark variierte, wobei die Standardabweichung des Inhibingehaltes der Proben einer Präparation DISKUSSION 54 aber konstant blieb. Zum Teil lagen die gesamten Messwerte einer Versuchsreihe unterhalb der Nachweisgrenze. Es konnte gezeigt werden, dass junge Ratten eine deutlich höhere Inhibinproduktion haben als ältere Tiere (Rivier et al., 1988). Da die für die Versuche eingesetzten Tiere zwischen 18 und 21 Tage alt waren und gerade in dieser Alterstufe relativ starke Unterschiede im Inhibinspiegel auftreten, wird dies die wahrscheinliche Ursache für die Variation der basalen Inhibinsekretion sein. Die Proteinbestimmung erfolgte mit der Methode nach Lowry et al. (1951). Die Werte lagen relativ konstant (allerdings abhängig von der jeweiligen Präparation) zwischen 60 und 100 µg pro Well in einem Volumen von 1ml und bei einer Zellzahl von 106 Zellen/ml (s. Kpt. 3.3.3). Wie in Kpt. 3.5 schon angedeutet, kann es durch mehrfachen Mediumwechsel zu Zellverlusten kommen, die am sinkenden Proteingehalt abzulesen sind. Mit Schwankungen der Proteinkonzentrationen (durch Zellverluste) musste also während der Experimente gerechnet werden, so dass die Ergebnisse der MTT-, Laktat- und Inhibinmessung dadurch beeinflusst wurden. In vorausgegangenen Studien wurde meist mit größeren Zellzahlen gearbeitet. Williams und Forster (1988) verwendeten beispielsweise 4-5x106 Zellen pro ml Medium, allerdings ohne die Angabe der Proteinmenge. Chapin et al. (1988) arbeiteten bei einer Studie über den Einfluss von Phthalatestern auf Sertoli-Zellkulturen mit einem Volumen von 26 ml pro Well und einem Proteingehalt von 1,8-2,5 mg. Dies entspricht 70-100 µg Protein/ml. Leider finden sich hier keine Angaben zur Zellzahl. Das gesamte Testsystem „Sertoli-Zelle“ zeigte sich insgesamt wenig störanfällig. Im praktischen Umgang erwies es sich, was Handhabung, Zeitaufwand und Wirtschaftlichkeit angeht, den Anforderungen gewachsen. Es ist möglich, innerhalb von etwa 10 Tagen das gesamte Testsystem mit einer Testsubstanz durchzuführen. Dabei entfallen etwa 6 Tage auf die Präparation und das Anlegen der Zellkultur, die verbleibenden 4 Tage auf die Durchführung der einzelnen Assays. Der Inhibin-Assay verursacht aber durch lange Inkubationszeiten den größten Zeitaufwand. Um statistisch sichere Ergebnisse zu erhalten, wurden diese Experimente aber noch mindestens dreimal wiederholt. Abgesehen von den praktischen Belangen zeigt sich bei der Interpretation der Ergebnisse, dass sich die Auswahl und vor allem die Kombination der Testparameter vorteilhaft auf die Aussagekraft des Testsystems auswirkte. In vorausgegangenen Studien (Williams und Foster, DISKUSSION 55 1988; Chapin et al., 1988) wurden meis