Institut für Ernährungswissenschaft Molekulare Ernährungsforschung Justus-Liebig-Universität Gießen Transportcharakteristika des Sulfat Anionen Transporter 1, sat-1, und seine Regulation durch Vorstufen des Oxalats Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades (Dr. oec. troph.) am Fachbereich Agrarwissenschaften, Ökotrophologie und Umweltmanagement vorgelegt von Dipl. oec. troph. Nina Schnedler aus Göttingen Gießen 2010 Dissertation am Fachbereich Agrarwissenschaften, Ökotrophologie und Umweltmanagement der Justus-Liebig-Universität Gießen Tag der Disputation: 17.09.2010 Prüfungskommission: Vorsitzender: Prof. Dr. S. Hoy 1. Gutachter: Prof. Dr. U. Wenzel 2. Gutachterin: Prof. Dr. B.C. Burckhardt Prüfer: Prof. Dr. K. Eder Prüfer: Prof. Dr. J. M. Geyer für Tobias INHALTSVERZEICHNIS I INHALTSVERZEICHNIS INHALTSVERZEICHNIS………………………………………………………….I ABBILDUNGSVERZEICHNIS…………………………………………………..V TABELLENVERZEICHNIS……………………………………………………VIII ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS…………………...……………………………IX 1. EINLEITUNG…………………………………………………………………...………1 1.1 Oxalat……………………………………………………….…………………..……..1 1.1.1 Oxalatzufuhr…………………...……………………….…………………………..1 1.1.2 Oxalatresorption im Gastrointestinaltrakt………........………………………….2 1.1.3 Mögliche Synthesewege des Oxalats……………………………………………3 1.1.4 Oxalatmetabolismus……………………………………...………………..………5 1.1.5 Regulation der Oxalatsynthese…………………………………………………...6 1.1.6 Störungen des Oxalatstoffwechsels - Primäre und sekundäre Hyperoxalurie……………………………………………………………………….6 1.1.7 Oxalatausscheidung……………………………………………………………….8 1.1.8 Nierensteine………………………………………………………………………...8 1.2 Sulfatmetabolismus…………………………………………………………………10 1.3 Die solute carrier (SLC) Transporterfamilie………………………………………11 1.3.1 Der natriumabhängige Sulfattransporter, NaSi-1……………………………13 1.3.2 Die SLC26 Transporterfamilie…………………………………………………..14 1.3.3 Sulfat Anionen Transporter 1 (sat-1)……………………………………………16 1.3.3.1 Lokalisation des sat-1………………………………………………………….18 1.3.3.2 Sat-1 Transport…………………………………………………………………19 1.3.3.3 Regulation des sat-1…………………………………………………………...21 1.3.3.4 Die sat-1 knock-out Maus……………………………………………………..23 1.4 Zellen…………………………………………………………………………………23 1.4.1 Xenopus laevis Oozyten…………………………………………………………23 1.4.2 HepG2-Zellen…….……………………………………………………………….24 1.5 Aufgabenstellung und Zielsetzung.……………………………………………….26 2. MATERIAL……………………………………………………………………………27 2.1 Oligonucleotidprimer………………………………………………………………..27 2.2 Real-time PCR Assays……………………………………………………………..27 INHALTSVERZEICHNIS II 2.3 Zellen…………………………………………………………………………………28 2.4 Antikörper……………………………………………………………………………28 2.5 Plasmidvektor……………………………………………………………………….29 2.6 Kits……………………………………………………………………………………29 2.7 Enzyme………………………………………………………………………………29 2.8 Medien, Lösungen und Puffer……………………………………………………..29 2.9 Chemikalien………………………………………………………………………….32 2.10 Software…………………………………………………………………………….32 2.11 Geräte………………………………………………………………………………33 3. METHODEN…………………………………………………………………………..36 3.1 Gewinnung von cRNA für die Expression in Oozyten…………………………..36 3.1.1 Transformation der Plasmid-DNA in E. coli Zellen……………………………36 3.1.2 DNA-Isolierung und Aufreinigung……………………………………………….37 3.1.3 Restriktionsverdau mit NOTI……………………………………………………37 3.1.4 cRNA Synthese…………………………………………………………………...38 3.2 Expression des rsat-1 in Xenopus laevis Oozyten………………………………39 3.2.1 Präparation der Oozyten…………………………………………………………39 3.2.2 Injektion der Oozyten…………………………………………………………….39 3.2.3 Aufnahmeexperimente…………………………………………………………...41 3.3 Zellzucht mit HepG2-Zellen………………………………………………………..43 3.4 Isolierung der RNA mit TRIzol®………………………………………………….43 3.5 Reverse Transkription (cDNA Synthese)…………………………………………44 3.6 Polymerase-Kettenreaktion………………………………………………………..45 3.7 Real-time PCR………………………………………………………………………46 3.8 Agarosegel-Elektrophorese………………………………………………………..47 3.9 Präparation der Zellmembranproteine…………………………………………48 3.10 Proteinbestimmung nach Bradford……………………………………………...48 3.11 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese…………………………………………49 3.12 Western Blot……………………………………………………………………….49 3.12.1 Proteintransfer auf die PVDF Membran………………………………………50 3.12.2 Proteindetektion auf Western Blots……………………………………………50 3.13 Sulfattransport in HepG2-Zellen…………………………………………………51 3.14 Statistik……………………………………………………………………………..51 INHALTSVERZEICHNIS III 4. ERGEBNISSE………………………………………………………………………..52 4.1. Zeitabhängigkeit der Sulfataufnahme in An- und Abwesenheit von Ca2+……52 4.2 Bestimmung der Km für Sulfat……………………………………………………..53 4.3 Cis-Inhibition der Sulfataufnahme…………………………………………………54 4.4 Hemmung der Sulfataufnahme durch aufsteigende Oxalatkonzentrationen…55 4.5 Trans-Stimulation mit Sulfat und Oxalat…………………………………………56 4.6 Bestimmung der Km von Oxalat…………………………………………………...57 4.7 Hemmung der Oxalataufnahme durch aufsteigende Sulfatkonzentrationen....58 4.8 Bestimmung der maximalen Sulfat- und Oxalataufnahme……………………..59 4.9 Cis-Inhibition der Sulfat- und Oxalataufnahme mit physiologischen Oxalat-, Sulfat- und Bicarbonatkonzentrationen…………….…………………60 4.10 Interaktionen des rsat-1 mit Bicarbonat……………………………………….62 4.11 Chloridabhängigkeit des rsat-1………………..…………………………………64 4.12 Interaktionen von Phosphat mit dem rsat-1……………………………………66 4.13 Interaktionen von Glycolat mit dem rsat-1…………………………………….68 4.14 Interaktionen von Glyoxylat mit dem rsat-1……………………………………69 4.15 Nachweis von hsat-1 RNA in HepG2-Zellen……………………………………71 4.16 Inkubation von HepG2-Zellen in Oxalat und Oxalatvorstufen………………72 4.17 Zeitreihe der Inkubation von HepG2-Zellen in Glyoxylat……………………75 4.18 Konzentrationsreihe der Inkubation von HepG2-Zellen in Glyoxylat………...78 4.19 Sat-1 Proteinexpression in HepG2-Zellen nach Inkubation in Glyoxylat……81 4.20 Funktionelle Analyse des erhöhten hsat-1 Proteins………………………….82 4.21 Weitere Transporter in HepG2-Zellen…………………………………………..83 4.22 Verhalten der HepG2-Zellen unter Glyoxylatinkubation………………………84 5. DISKUSSION…………………………………………………………………………86 5.1 Substrattransport über den sat-1………………………………………………….86 5.2 Die Bedeutung des sat-1 für den Anionentransport im proximalen Tubulus der Niere……………….…………………………………………………..89 5.3 Die Aufgabe des sat-1 in der Leber……………………………………………….90 5.4 Die Bedeutung des sat-1 für die Translokation von Vorstufen des Oxalats….92 5.5 Stimulation der sat-1 Expression durch Glyoxylat………………………………93 5.6 Möglicher Wirkmechanismus des Glyoxylats……………………………………95 5.7 Schlussfolgerung und Ausblick……………………………………………………97 INHALTSVERZEICHNIS IV 6. ZUSAMMENFASSUNG…………………….…………………………………….....98 7. LITERATUR……………………...………………………………………………….100 DANKSAGUNG………........................................................................................112 ERKLÄRUNG……………………………………………………………………...…..113 VERÖFFENTLICHUNGEN………………………………….………………………..114 KONFERENZEN…………………………………………………………………….…115 LEBENSLAUF.....................................................................................................116 ABBILDUNGSVERZEICHNIS V ABBILDUNGSVERZEICHNIS Abbildung 1.1 Struktur des Oxalatanions……………………………………….……1 Abbildung 1.2 Oxalatsynthese in Hepatozyten…………………………..…………3 Abbildung 1.3 Oxalatmetabolismus in Hepatozyten……………………..…………5 Abbildung 1.4 Struktur des Glyoxylat- und Glycolatanions………………………..6 Abbildung 1.5 Calciumoxalatkristalle………………………………………………....9 Abbildung 1.6 Strukturformel des Sulfatanions………………………………….…10 Abbildung 1.7 SLC Transporter……………………………………………………..12 Abbildung 1.8 Modell des rsat-1…………………………………………………….17 Abbildung 1.9 hsat-1 Spleißvarianten 1-3………………………………………….18 Abbildung 1.10 Lokalisation des sat-1 in Niere und Leber…….……………………19 Abbildung 1.11 Die sechs Stadien der Oogenese von Xenopus laevis Oozyten...24 Abbildung 1.12 HepG2-Zellen………………………………………………...……….25 Abbildung 3.1 cRNA-Gewinnung für die Expression in Oozyten………………..36 Abbildung 3.2 Schematische Darstellung des Versuchsablaufs von der cRNA-Injektion bis zur radiochemischen Untersuchung der rsat-1-exprimierenden Xenopus laevis Oozyten…….……….…...40 Abbildung 3.3 Schematische Darstellung des Versuchsablaufs der Transportexperimente mit radioaktiv markierten Substanzen…..42 Abbildung 3.4 Das Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR)……………...45 Abbildung 4.1 Zeitabhängigkeit der Sulfataufnahme……………………………..53 Abbildung 4.2 Konzentrationsabhängigkeit der Sulfataufnahme und Linearisierung nach Eadie-Hofstee………………………………..54 Abbildung 4.3 Cis-Inhibition der Sulfataufnahme durch verschiedene Anionen..55 Abbildung 4.4 Hemmung der Sulfataufnahme durch aufsteigende Oxalatkonzentrationen (Dixon Plot Oxalat)……………………….56 Abbildung 4.5 Trans-Stimulation mit Sulfat und Oxalat…………………………..57 Abbildung 4.6 Konzentrationsabhängigkeit der Oxalataufnahme und Linearisierung nach Eadie-Hofstee…………...……………….58 Abbildung 4.7 Hemmung der Oxalataufnahme durch aufsteigende Sulfatkonzentrationen (Dixon Plot Sulfat)…………………………59 Abbildung 4.8 Maximale Aufnahme von Sulfat und Oxalat……….………………60 ABBILDUNGSVERZEICHNIS VI Abbildung 4.9 Cis-Inhibition der Sulfataufnahme durch physiologische Oxalat- und Bicarbonatkonzentrationen….………………………...61 Abbildung 4.10 Cis-Inhibition der Oxalataufnahme durch physiologische Sulfat- und Bicarbonatkonzentrationen……..………….…………..61 Abbildung 4.11 Cis-Inhibition der Sulfataufnahme durch Bicarbonat……………62 Abbildung 4.12 Trans-Stimulation der Sulfat- und Oxalataufnahme durch Bicarbonat…………………….………………………………..63 Abbildung 4.13 Sulfatefflux in Gegenwart von Bicarbonat………………………….63 Abbildung 4.14 Sulfataufnahme in An- und Abwesenheit von Chlorid und Linearisierung nach Eadie-Hofstee…………………………………65 Abbildung 4.15 Sulfat- und Oxalatefflux in An- und Abwesenheit von Chlorid..….66 Abbildung 4.16 Cis-Inhibition und trans-Stimulation der Sulfataufnahme durch Phosphat………………………………………………………………67 Abbildung 4.17 Sulfatefflux in Gegenwart von Phosphat…………………………...67 Abbildung 4.18 Cis-Inhibition der Sulfataufnahme durch Glycolat…………………68 Abbildung 4.19 Trans-Stimulation der Sulfataufnahme durch Glycolat…………68 Abbildung 4.20 Cis-Inhibition der Sulfataufnahme durch Glyoxylat……………….69 Abbildung 4.21 Trans-Stimulation der Sulfataufnahme durch Glyoxylat………….70 Abbildung 4.22 Trans-Stimulation der Oxalataufnahme durch Glyoxylat…………70 Abbildung 4.23 Sulfatefflux in Gegenwart von Glyoxylat……………………………71 Abbildung 4.24 hsat-1 mRNA-Expression in HepG2-Zellen………………………..72 Abbildung 4.25 hsat-1 mRNA-Expression in HepG2-Zellen nach Inkubation mit verschiedenen Substanzen…..…………………………………73 Abbildung 4.26 Relative hsat-1 mRNA-Expression (Spleißvarianten 1 und 3) in HepG2-Zellen nach Inkubation mit verschiedenen Substanzen...74 Abbildung 4.27 Relative hsat-1 mRNA-Expression (Spleißvariante 2) in HepG2- Zellen nach Inkubation mit verschiedenen Substanzen………...75 Abbildung 4.28 hsat-1 mRNA-Expression in HepG2-Zellen nach Inkubation für 1-6 Tage in Glyoxylat…………………….…………………………..76 Abbildung 4.29 Relative hsat-1 mRNA-Expression (Spleißvarianten 1 und 3) in HepG2-Zellen nach Inkubation für 1-6 Tage in Glyoxylat…..…77 Abbildung 4.30 Relative hsat-1 mRNA-Expression (Spleißvariante 2) in HepG2-Zellen nach Inkubation für 1-6 Tage in Glyoxylat………..77 ABBILDUNGSVERZEICHNIS VII Abbildung 4.31 hsat-1 mRNA-Expression in HepG2-Zellen nach Inkubation für 3 Tage in verschiedenen Glyoxylatkonzentrationen…………..78 Abbildung 4.32 Relative hsat-1 mRNA-Expression (Spleißvariante 2) in HepG2-Zellen nach dreitägiger Inkubation in aufsteigenden Glyoxylatkonzentrationen…..…………………………………….….79 Abbildung 4.33 hsat-1 mRNA-Expression in HepG2-Zellen nach Inkubation für 4 Tage in verschiedenen Glyoxylatkonzentrationen………….…..79 Abbildung 4.34 Relative hsat-1 mRNA-Expression (Spleißvarianten 1 und 3) in HepG2-Zellen nach viertägiger Inkubation in aufsteigenden Glyoxylatkonzentrationen……………………………………………80 Abbildung 4.35 Relative hsat-1 mRNA-Expression (Spleißvariante 2) in HepG2-Zellen nach viertägiger Inkubation in aufsteigenden Glyoxylatkonzentrationen……………………………………………81 Abbildung 4.36 hsat-1 Proteinexpression in HepG2-Zellen nach Inkubation in Glyoxylat……………………….………………………………………82 Abbildung 4.37 Sulfataufnahme in HepG2-Zellen nach Glyoxylatinkubation…….83 Abbildung 4.38 mRNA-Expression verschiedener Transporter in HepG2-Zellen..84 Abbildung 4.39 Medienfärbung nach Glyoxylatinkubation………………………….85 Abbildung 4.40 Relative hsat-1 mRNA-Expression (Spleißvarianten 1, 2 und 3) in unterschiedlich dicht gewachsenen HepG2-Zellen……………85 Abbildung 5.1 Modell des Sulfat- und Oxalattransports in Leber und Nieren….91 TABELLENVERZEICHNIS VIII TABELLENVERZEICHNIS Tabelle 1.1 Ausgewählte Lebensmittel und deren Oxalatgehalt…………………….2 Tabelle 1.2 Ausgewählte Transporter der SLC Familie……………………………..13 Tabelle 1.3 Transporter der SLC26 Familie………………………………………….14 Tabelle 1.4 Substrate und Effektoren des sat-1……………………………………..20 Tabelle 2.1 RT-PCR Primer……………………………………………………………27 Tabelle 2.2 Real-time PCR Assays…………………………….……………………..28 Tabelle 3.1 Zusammensetzung des Sammel- und Trenngels für SDS-Page……49 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS IX ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ABC ATP-binding cassette AGT Alanin:Glyoxylat-Aminotransferase ATP Adenosintriphosphat BSA bovines Serumalbumin cDNA komplementäre Desoxyribonucleinsäure CFEX Chlorid Formiat Austauscher CFTR Cystic Fibrosis Transmembrane Conductance Regulator cRNA Ribonucleinsäure mit Capstruktur DAO D-Aminosäureoxidase DTT Dithiotreitol ΔCt Differenz der Schwellenwert Zyklen (Cycle Treshold) DIDS Diisothiocyanostilbendisulfonat DMEM Dulbecco’s Modified Eagle Medium DMSO Dimethylsulfoxid DNA Desoxyribonucleinsäure dNTP Desoxyribonucleosidtriphosphate DRA Down regulated in Adenoma DTDST diastrophischer Dysplasie Sulfat Transporter ECL erhöhte Chemiluminescence (enhanced Chemiluminescence) EDTA Ethylendiamintetraacetat ESWL extrakorporale Stoßwellenlithotripsie FCS fetales Kälberserum GAPDH Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase GO Glycolatoxidase GR Glyoxylatreduktase Hepes Hydroxyethylpiperizinylethansulfonsäure IgG Immunglobulin G Km Michaelis-Menten-Konstente Ki Inhibitionskonstante LB Luria Broth LDH Laktatdehydrogenase MCT Monocarboxylattransporter M-MuLV Moloney Maus Leukämievirus ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS X NaSi-1 natriumabhängiger Sulfattransporter 1 NBC1 Natrium Bicarbonat Cotransporter 1 NKCC2 Natrium Kalium Chlorid Cotransporter 2 ORi Oozyten Ringer PAPS Phosphoadenosylphosphosulfat PAGE Polyacrylamid-Gelelektrophorese PBS Phosphat-gepufferte Salzlösung (Phosphate buffered Saline) pCMBS p-Chlormercuribenzoesulfonsäure PCR Polymerase-Kettenreaktion (Polymerase Chain Reaction) PVDF Polyvenylidindifluorid PH primäre Hyperoxalurie RNA Ribonucleinsäure RT reverse Transkription sat-1 Sulfat Anionen Transporter 1 SDS Natriumlaurylsulfat (Sodium Dodecyl Sulfate) SEM Standardfehler des Mittelwerts SLC solute carrier Tat1 Testis Anionen Transporter 1 TBE Tris-Borat-EDTA-Puffer TMA Tetramethylammonium Tris Trishydroxymethylaminomethan UV Ultraviolett EINLEITUNG 1 1. EINLEITUNG Nierensteine sind eine Volkskrankheit, an der in Europa und Nordamerika jeder Zehnte erkrankt. 70-80 % der Nierensteine bestehen aus Calciumoxalat 117, daher ist der Oxalatmetabolismus und -transport im Körper von besonderem Interesse. Der Sulfat Anionen Transporter 1, sat-1, ist am Oxalat-, Bicarbonat- und Sulfattransport 72 in der Leber 107, den Nieren 62 und möglicherweise auch im Darm beteiligt 19. 1.1 Oxalat Oxalsäure ist die einfachste Dicarbonsäure und durch die Nachbarstellung der Carboxylgruppen eine starke Säure 139. Oxalat (Abb. 1.1), das Oxalsäureanion, hat keine bekannte Funktion im Stoffwechsel, ist toxisch, wird nicht gespeichert und nicht metabolisiert 14. Das mit dem Urin ausgeschiedene Oxalat stammt aus der Nahrung und aus der endogenen Synthese in der Leber 139. Abbildung 1.1 Struktur des Oxalatanions 1.1.1 Oxalatzufuhr Die Oxalatzufuhr über die Nahrung variiert sehr stark und liegt zwischen 44 und 351 mg am Tag 53. Bisher wurde angenommen, dass die Oxalatzufuhr einen geringen Einfluss auf den Oxalatgehalt des Harns hat und nur etwa 10 % der mit dem Harn ausgeschiedenen Oxalsäure aus der Nahrung kommt. Demgegenüber konnten HOLMES et al. allerdings zeigen, dass ausgeschiedenes Oxalat etwa zur Hälfte aus der Nahrung stammen kann. Bei niedriger Oxalataufnahme trägt das Oxalat aus der Nahrung zu 24 % zum Urinoxalat bei und der Anteil erhöht sich bei hoher Oxalataufnahme auf 42 % 50. Oxalatreiche Lebensmittel sind hauptsächlich Pflanzen und Pflanzenprodukte wie Spinat, Rhabarber, Rote Bete, Kakao- und Vollkornprodukte. Auch schwarzer Tee C C O O- O O- _ _ http://de.wikipedia.org/wiki/Carboxylgruppe http://de.wikipedia.org/wiki/S%C3%A4ure EINLEITUNG 2 und Pfefferminztee haben einen relativ hohen Oxalatgehalt 63,123. Tabelle 1.1 zeigt den Oxalatgehalt einer Auswahl an Lebensmitteln. Tabelle 1.1 Ausgewählte Lebensmittel und deren Oxalatgehalt 11,53 1.1.2 Oxalatresorption im Gastrointestinaltrakt Verschiedene Oxalattransporter (SLC26A1, SLC26A2, SLC26A3, SLC26A6 und SLC26A7, siehe 1.3.2 und 1.3.3) werden im Gastrointestinaltrakt exprimiert und sind dort möglicherweise am Oxalattransport beteiligt. Neben der Oxalatresorption findet wahrscheinlich außerdem eine Oxalatsekretion in das Lumen des Intestinaltrakts statt 19,85,118. Die Oxalatabsorption im Magen-Darm-Trakt variiert mit der aufgenommenen Oxalatmenge. Befindet sich wenig Oxalat in der Nahrung, so liegt die Absorption bei 55 %, bei einer hohen Oxalatzufuhr werden nur 10 % des in der Nahrung vorkommenden Oxalats resorbiert 50. Erkrankungen des Dünndarms können mit einer vermehrten Oxalatresorption einhergehen 63 (siehe 1.1.6 sekundäre Hyperoxalurie). Des Weiteren beeinflusst der Calciumgehalt der Nahrung das Ausmaß der Oxalatresorption, da sich Calcium mit Oxalat zu dem unlöslichen und damit nicht resorbierbaren Calciumoxalat verbindet. Die Aufnahme von Calcium vermindert folglich die Oxalatresorption 50,63,79. Die Oxalatresorption wird auch von der Besiedelung des Darms mit Oxalobacter formigenes bestimmt. Dieses oxalatabbauende Bakterium befindet sich ab dem 9. Lebensmonat in der normalen Darmflora. Im Alter von 6 bis 9 Jahren lässt sich Nahrungsmittel Oxalatgehalt (mg / 100 g) Spinat 774 Schokolade 34 Schwarze Oliven 27 Vollkornweizenbrot 27 Brezel 27 Kartoffeln 23 Pommes frites 21 Gemüsesuppe 7 Tomaten 7 Äpfel 1 Schwarzer Tee 3-16 mg / Tasse EINLEITUNG 3 Oxalobacter formigenes bei fast allen gesunden Kindern nachweisen. Bei wiederholter oder längerfristiger Behandlung mit Breitbandantibiotika kommt es zu einer erheblichen Reduktion bzw. zum Verschwinden dieses Bakteriums 63. Möglicherweise vermindert Oxalobacter formigenes die Oxalataufnahme nicht nur durch Abbau des freien Oxalats im Darm, sondern auch durch die Erhöhung der Sekretion ins Darmlumen 39. 1.1.3 Mögliche Synthesewege des Oxalats Oxalat entsteht im Stoffwechsel als Endprodukt im Glyoxylatmetabolismus 63. Als mögliche Vorstufen des Oxalats werden verschiedene Aminosäuren, Zucker und Ascorbinsäure diskutiert. Abbildung 1.2 zeigt die Bildung von Oxalat aus diesen Vorstufen. Abbildung 1.2 Oxalatsynthese in Hepatozyten (zusammengefasst und modifiziert nach HOLMES und ASSIMOS 1998 48) Es besteht kein Zusammenhang zwischen Proteinaufnahme und Oxalatausscheidung im Urin. Dies wurde bereits 1993 von HOLMES et al. für die westliche Ernährung gezeigt 51 und 2009 von KNIGHT et al. durch eine Studie mit kontrollierter Oxalataufnahme bestätigt 68. Diese Studien zeigen, dass der Abbau von aus der Nahrung stammenden Aminosäuren offensichtlich nicht zu einer erhöhten endogenen Oxalatsynthese führt. Hydroxyprolin, eine Aminosäure des Kollagens, ist eine mögliche Vorstufe des Glyoxylats. Tierisches Protein besteht zu ca. 30 % aus Kollagen und dieses enthält wiederum 10-13 % Hydroxyprolin. Im Tiermodell konnte gezeigt werden, dass die Gabe von Hydroxyprolin die Oxalatausscheidung erhöht 127. Auch beim D-Glucose D-Xylulose Xylulose-1P Glycolaldehyd Glycolat Glyoxylat Oxalat Glycin Serin 4-Hydroxy- 2-Keto- glutarat Hydroxyprolin Xylulose-5P Pentosephosphatweg Hydroxypyruvat 3-P-Glycerat 3-P-Hydroxy- pyruvat 3-P-Serin 2-P-Glycerat D-Glycerat EINLEITUNG 4 Menschen ist die Oxalatausscheidung mit dem Urin bei einer Gelatinediät um 43 % erhöht. Wenn pro Tag 2-5 g Kollagen bzw. Gelatine abgebaut werden, so könnte dies 5-20 % des endogen produzierten Oxalats ausmachen 69. Bei Glycin handelt es sich wahrscheinlich nicht um eine bedeutende Oxalatvorstufe. Unter Verwendung von Meerschweinchenperoxisomen und isolierter Laktatdehydrogenase (LDH) konnten POORE et al. zeigen, dass Glycin weniger als 5 % zur Bildung von Glycolat und damit zum Glyoxylat- und Oxalatpool beiträgt 105. Die Vorstellung, Oxalsäure entstehe beim Abbau von Ascorbinsäure und die Oxalatausscheidung im Harn werde folglich durch eine hohe Vitamin C-Zufuhr gesteigert, beruht möglicherweise auf methodischen Fehlern 63. ROBITAILLE et al. zeigten, dass bei einer sehr hohen intravenösen Ascorbinsäureinfusion (das 1 000fache der Zufuhrempfehlung) weniger als 0,5 % der aufgenommenen Ascorbinsäure als Oxalat mit dem Urin ausgeschieden werden 113. Allerdings führt die Gabe von 1 bis 2 g Ascorbinsäure am Tag zu einer erhöhten Oxalatausscheidung 5,131. Möglicherweise spielen auch Zucker und Zuckeralkohole eine Rolle im Oxalatmetabolismus 13. Glucose kann über Glucuronat in Xylulose umgewandelt werden, welches in Oxalat abgebaut werden kann 48. Die orale Gabe von 20 g Glucose hat keinen Effekt auf die Oxalatausscheidung 95, während die Oxalatausscheidung nach der Gabe von 75 g Glucose ansteigt, allerdings besteht keine Korrelation zwischen Serumglucosegehalt und der Oxalatausscheidung 97. Eine intravenöse Glucoseinfusion erhöht die Oxalatausscheidung nicht 96. Fructose wird in der Leber phosphoryliert und in Dihydroxyacetonphosphat und Glycerinaldehyd gespalten. Glycerinaldehyd wird möglicherweise zu Hydroxypyruvat oxidiert 13. Eine hohe Fructoseaufnahme korreliert mit einem erhöhten Nierensteinrisiko 128 und eine intravenöse Infusion von 35 g Fructose führt verglichen mit einer Glucoseinfusion zu einer 60 % erhöhten Oxalatausscheidung 96. Xylitol ist ein Zuckeralkohol, der als Zuckeraustauschstoff (E 967) verwendet wird. Xylitol wird über D-Xylose in Xylose-1-Phosphat umgewandelt, das in Dihydroxyacetonphosphat und Glycolaldehyd gespalten werden kann 13. Eine orale Dosis von 20 mg Xylitol führt zu einem vorübergehenden Anstieg der Urinoxalatausscheidung um 53 % 95. http://de.wikipedia.org/wiki/Zuckeralkohol http://de.wikipedia.org/wiki/Zuckeraustauschstoff http://de.wikipedia.org/wiki/E-Nummer EINLEITUNG 5 Ob Ascorbinsäure, Glucose, Fructose und Xylitol unter physiologischen Bedingungen die Oxalatausscheidung erhöhen bleibt unklar. 1.1.4 Oxalatmetabolismus Die Oxalatsynthese findet hauptsächlich in den Hepatozyten der Leber statt 26,78 und beträgt 10 bis 20 mg am Tag 3,50. Endogenes Glyoxylat wird dort hauptsächlich in den Mitochondrien und Peroxisomen gebildet (Abb. 1.3). Abbildung 1.3 Oxalatmetabolismus in Hepatozyten AGT: Alanin:Glyoxylat-Aminotransferase, DAO: D-Aminosäureoxidase, LDH: Laktatdehydrogenase, GO: Glycolatoxidase, GR: Glyoxylatreduktase (modifiziert nach BAKER et al. 2004 3) In den Peroxisomen wandelt die D-Aminosäureoxidase Glycin in Glyoxylat (Abb. 1.4) um, die Hauptvorstufe des Glyoxylats bildet allerdings Glycolat (Abb. 1.4) 105. In die Peroxisomen transportiertes Glycolat wird durch die Glycolatoxidase (GO) in Glyoxylat umgewandelt. Glyoxylat kann auch aus dem Cytoplasma in die Peroxisomen gelangen. Glyoxylat wird normalerweise zusammen mit Alanin durch die Alanin:Glyoxylat-Aminotransferase 1 (AGT1) zu Glycin und Pyruvat abgebaut. Überschüssiges Glyoxylat wird in Peroxisomen durch die GO in Oxalat umgewandelt oder nach dem Transport ins Cytoplasma durch die Laktatdehydrogenase (LDH) zu Oxalat konvertiert. Der Abbau des Glyoxylats durch die GO spielt normalerweise eine geringe Rolle 3,105. Glyoxylat entsteht Glycin Glyoxylat Oxalat Glycolat PEROXISOM CYTOPLASMA Alanin Pyruvat Glyoxylat Glycolat Oxalat GO GO AGT1 4-Hydroxy-L-prolin 4-Hydroxy-2-ketoglutarat Glyoxylat Glycolat Glycin Pyruvat Alanin MITOCHONDRIUM AGT2 Pyruvat GR GR LDH DAO EINLEITUNG 6 außerdem in den Mitochondrien aus dem Abbau von 4-Hydroxyprolin. Mitochondriales Glyoxylat wird entweder durch die Glycolatreduktase (GR) zu Glycolat oder durch die AGT2 zu Glycin konvertiert 14. Abbildung 1.4 Struktur des Glyoxylat- (links) und Glycolatanions (rechts) 1.1.5 Regulation der Oxalatsynthese Die Oxalatsynthese wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Pyridoxin (Vitamin B6) ist das Coenzym der Alanin:Glyoxylat-Aminotransferase, die Glyoxylat in Glycin umwandelt. Durch Pyridoxingabe wurde die Oxalatausscheidung in hyperoxalurischen Ratten um 50 % gesenkt 12. Die Pyridoxingabe hatte keinen Effekt auf die Oxalatausscheidung von Patienten mit Nierensteinleiden, obwohl bei diesen Patienten im Vergleich zu gesunden weniger Pyridoxalphosphat im Serum nachgewiesen wurde 61. Ob Glucagon die Oxalatausscheidung bei Menschen beeinflusst, konnte noch nicht geklärt werden, Tierversuche kommen diesbezüglich zu unterschiedlichen Ergebnissen 52,127. 1.1.6 Störungen des Oxalatstoffwechsels - Primäre und sekundäre Hyperoxalurie Hyperoxalurie beschreibt die Ausscheidung von mehr als 40 mg Oxalat am Tag. Die primäre Hyperoxalurie ist eine relativ seltene autosomal rezessive Erbkrankheit die zu einer Störung des Oxalatstoffwechsels führt. Die primäre Hyperoxalurie vom Typ 1 (PH1) wird durch einen Mangel an Alanin:Glyoxylat Aminotransferase (AGT1), primäre Hyperoxalurie vom Typ 2 (PH2) durch einen Mangel an Glyoxylatreduktase (GR) verursacht. Beide Enzyme AGT1 und GR sind notwendig, um den Abbau von Glyoxylat zu Oxalat zu vermeiden. PH1 und PH2 führen zu einer erhöhten Oxalatausscheidung und Bildung von Calciumoxalatkristallen und -steinen. Obwohl Oxalat hauptsächlich in der Leber gebildet wird, zeigen sich die toxischen Wirkungen der Oxalose in anderen C C O O- O H C C O- O- H HO H _ _ EINLEITUNG 7 Organen. PH1 führt nach mehreren Jahren möglicherweise zu einem Nierenversagen und unbehandelt zum Tod, während PH2 einen weniger schlimmen Verlauf hat 14,55. Die Behandlungsmöglichkeiten für Hyperoxalurie sind begrenzt: Besonders wichtig ist eine hohe Flüssigkeitsaufnahme von mehr als 3 l pro Tag. Um die Übersättigung des Urins mit Calciumoxalat zu verhindern, wird den Patienten Alkalicitrat verabreicht. Citrat bindet Calcium in einem löslichen Komplex und verhindert damit die Bildung von Calciumoxalatkristallen. Etwa 10-30 % der PH1 Patienten reagieren positiv auf eine Pyridoxinsupplementation. Eine Lebertransplantation ist bis heute die einzige kurative Behandlungsmöglchkeit für PH1, da AGT1 hauptsächlich in der Leber vorkommt 15,55. Die folgenden Therapieansätze werden noch nicht eingesetzt. Eine Pilotstudie zur oralen Gabe von Oxalobacter formigenes zeigte eine Verminderung der Urinoxalatausscheidung bei PH1 Patienten 54. Ansätze zur Gentherapie würden eine Transduktion des normalen AGT Gens in einem Großteil der Hepatozyten erfordern, und damit wäre nur eine Therapie der PH1 möglich, da die GR in verschiedenen Geweben exprimiert wird. Ein weiterer Therapieansatz beschreibt die Verwendung chemischer Chaperone um Proteine mit Mutationen zu stabilisieren. Allerdings sind PH1 und PH2 genetisch heterogen und viele der Mutationen ergeben kein Proteinprodukt oder die Mutation hat einen direkten Effekt auf die katalytische Wirkung des Enzyms 15,55. Bei der sekundären Hyperoxalurie tritt die erhöhte Oxalatausscheidung als Folge einer erhöhten Aufnahme an Oxalat oder Oxalatvorstufen auf. So wird beispielsweise aufgenommenes Ethylenglycol, das sich unter anderem in Frostschutzmitteln befindet, zu Glycolat und weiter zu Oxalat abgebaut 45. Verschiedene gastrointestinale Erkrankungen, z. B. zystische Fibrose oder Kurzdarmsyndrom führen zu einer erhöhten Oxalatabsorption 55. Durch den Verlust an Gallensäuren beim Kurzdarmsyndrom verzögert sich die Resorption von Fettsäuren, welche mit Calcium unlösliche Kalkseifen bilden. Da das Calcium nun nicht mehr zur Bildung von Calciumoxalat zur Verfügung steht, kann mehr freies Oxalat resorbiert werden 63. Eine lang andauernde Antibiotikabehandlung bei zystischer Fibrose kann zu einer verminderten Besiedlung des Darms mit Oxalobacter formigenes führen, wodurch die Oxalatabsorption erhöht wird 122. Allerdings könnte die Hyperoxalurie bei zystischer Fibrose auch auf die fehlende Interaktion zwischen dem defekten Chloridkanal (CFTR) und einem Oxalattransporter in den Nieren zurückzuführen sein 85. EINLEITUNG 8 1.1.7 Oxalatausscheidung Der Gesunde scheidet pro Tag unter Normalkost weniger als 40 mg Oxalat mit dem Harn aus 117. Oxalat wird im Glomerulus frei filtriert und im proximalen Tubulus zusätzlich absorbiert und sezerniert. Der bidirektionale Transport führt zu einer Nettosekretion von ca. 25 % der filtrierten Oxalatmenge 34,137. In den Nieren werden drei Oxalattransporter der SLC26 Familie exprimiert (SLC26A1, SLC26A6 und SLC26A7, siehe 1.3.2 und 1.3.3) 85. Die Serumoxalatkonzentration beträgt normalerweise 1-5 µM, im Urin ist sie allerdings etwa 100fach höher. Calciumoxalat ist bei einem physiologischen Urin- pH kaum löslich, bei pH 7 können nur 5 mg Calciumoxalat in 1 l Wasser gelöst werden 117. Obwohl der Urin häufig mit Calciumoxalat übersättigt ist, wird ein Ausfallen durch die Präsenz verschiedener Stoffe verhindert. Zu diesen Präzipitationsinhibitoren gehören Harnstoff, Citrat, Sulfat, Pyrophosphat, Laktat, Magnesium, Kupfer, Eisen, Zink, Adenin, bestimmte Kolloide und niedermolekulare Polypeptide 139. 1.1.8 Nierensteine 15 % der Männer und 6 % der Frauen in Industrieländern erkranken in ihrem Leben an Nephrolithiasis und die Häufigkeit von Nierensteinerkrankungen steigt 126. Im Jahr 2000 lag die Inzidenz in Deutschland bei 1,5 % und die Prävalenz bei 4,7 % der Bevölkerung 46. Bei der Hälfte der Patienten tritt die Erkrankung innerhalb der folgenden 10 Jahre erneut auf 132. Etwa 80 % der Nierensteine bestehen aus Calciumsalzen, meistens aus Calciumoxalat (Abb. 1.5) und seltener aus Calciumphosphat. Die übrigen 20 % der Steine bestehen aus Harnsäure, Struvit oder Cystin 102. EINLEITUNG 9 Abbildung 1.5 Calciumoxalatkristalle (GAINES und WAIBEL 2007 31) Die mit dem Urin ausgeschiedene Menge an Oxalat ist ein bedeutender Risikofaktor für die Nierensteinentstehung. Da der Urin normalerweise bedeutend weniger Oxalat (0,1-0,5 mM) als Calcium (1-5 mM) enthält, hat eine geringe Veränderung der Oxalatkonzentration einen viel größeren Einfluss auf die Übersättigung des Urins mit Calciumoxalat als ein vergleichbarer Anstieg der Calciumkonzentration 112. Bei 50 % der Steinbildner liegt allerdings auch eine Hypercalciurie vor 102. Die Gründe für eine Hyperoxalurie können (1) eine angeborene Störung des Oxalatmetabolismus, die zu einer erhöhten Oxalatproduktion führt (siehe 1.1.6), (2) ein erhöhtes Substratangebot durch die Aufnahme oxalatreicher Lebensmittel oder Oxalatvorstufen oder (3) eine erhöhte intestinale Oxalatabsorption sein 49,117. Das Überschreiten des Löslichkeitsprodukts steinbildener Substanzen erscheint nicht ausreichend, um die komplexen Vorgänge bei der Entstehung von Nierensteinen zu beschreiben. Die Ausgangspunkte der Nierensteinbildung sind wahrscheinlich Calciumphosphatablagerungen, die Harnkristalle an den Epithelzellen der Nierenpapillen verankern, diese werden als Randall-Plaques bezeichnet 117,138. Gehen Nierensteine nicht spontan ab, müssen sie entfernt werden. Bis Ende der 70er Jahre wurden Nierensteine operativ entfernt. Heute wird hauptsächlich eine Zertrümmerung der Steine durch die nichtinvasive, extrakorporale Stoßwellenlithotripsie (ESWL) durchgeführt. Sprechen Faktoren wie Größe, Lage oder Zusammensetzung des Steins gegen eine ESWL, so können Steine endoskopisch durch perkutane Nephrolitholapaxie oder ureterorenoskopisch entfernt werden 46,93. Um ein erneutes Auftreten von Nierensteinen zu vermeiden, EINLEITUNG 10 werden eine hohe Aufnahme an Flüssigkeit und diätetische Maßnahmen empfohlen und auch Medikamente eingesetzt 46. Die Ursache für die Bildung von Nierensteinen ist noch nicht geklärt, es werden verschiedene Ursachen diskutiert: Wahrscheinlich handelt es sich um eine polygenetische Erkrankung, mehrere Gene sind also an der Entwicklung der Erkrankung beteiligt 33. Steinbildner zeigen eine höhere Oxalat- und Calciumaufnahme im Darm 80. Die erhöhte Oxalataufnahme könnte durch das verminderte Auftreten von Oxalobacter formigenes in der Darmflora von unter Nierensteinen leidenden Patienten verursacht werden 117. Steinbilder unterscheiden sich auch dadurch von Gesunden, dass sich bei vermehrter Proteinaufnahme eine erhöhte Urinoxalatausscheidung einstellt 98. Möglicherweise hat außerdem der Östrogenspiegel einen Einfluss auf die Ausscheidung steinbildener Substanzen mit dem Urin und Frauen haben dadurch ein geringeres Risiko, Nierensteine zu bilden 42. Wahrscheinlich führt eine Kombination verschiedener Faktoren zur Nierensteinentstehung. 1.2 Sulfatmetabolismus Abbildung 1.6 Strukturformel des Sulfatanions Die Sulfatkonzentration im Plasma beträgt 300-400 µM 7,73. Sulfat entsteht beim Abbau der schwefelhaltigen Aminosäuren Methionin und Cystein. Methionin kann in verschiedenen Organen in Cystein umgewandelt werden. Beim Abbau von Cystein zu Kohlendioxid und Wasser wird Schwefelwasserstoff gebildet. Dieser kann nach enzymatischer Oxidation zu anorganischem Sulfat mit dem Urin ausgeschieden werden. Die ausgeschiedene Sulfatmenge beträgt in Abhängigkeit von der zugeführten Proteinmenge 30-60 mmol am Tag 23. Die Regulation der Sulfathomöostase findet hauptsächlich in den Nieren statt, wo ein Großteil des filtrierten Sulfats im proximalen Tubulus rückresorbiert wird. Sulfat wird von einem apikalen Transporter in die proximale Tubuluszelle aufgenommen und über einen basolateralen Transporter ins Blut abgegeben 87,94. Das nicht im Harn SO O- O O-_ _ EINLEITUNG 11 ausgeschiedene Sulfat wird mittels ATP zu Phosphoadenosylphosphosulfat (PAPS) „aktiviert“. Die Sulfatgruppe des PAPS kann durch Phosphotransferasen auf verschiedene Akzeptoren übertragen werden. Es dient der Biosynthese von Heparin in der Leber, Glucosaminoglucanen in Bindegewebe, Knorpel und Knochen und Sulfatiden im Gehirn. Zur Entgiftung und Verbesserung der Löslichkeit werden Steroide, Phenole und Alkohole in der Leber mit Sulfat konjugiert 23. 1.3 Die solute carrier (SLC) Transporterfamilie Transporter kontrollieren die Aufnahme und Abgabe verschiedener Stoffe wie beispielsweise Zucker, Aminosäuren, Peptide, Nucleotide, organische Kationen und Anionen oder Medikamente, um nur einige zu nennen. Aktive Transporter erzeugen über verschiedene energiegekoppelte Mechanismen einen Stoff- oder Ionengradienten über die Membran. Primär aktive, ATP-abhängige Transporter schließen die Mitglieder der „ATP-binding cassette“ (ABC) Transporterfamilie ein. Ionenpumpen hydrolysieren ATP, um Ionen wie Na+, K+, H+ oder Ca2+ aus der Zelle oder in Organellen zu transportieren und generieren dadurch elektrochemische Ionengradienten über die Membran. Diese Ionengradienten werden von sekundär aktiven Transportern verwendet, um Nährstoffe gegen ihren Gradienten über die Membran zu transportieren. Passive Transporter bzw. Uniporter und Kanäle ermöglichen die Membranpassage gelöster Stoffe (z. B. Glucose, Aminosäuren, Harnstoff) entlang ihres chemischen Gradienten. Während Transporter ihre Substrate mit einem bestimmten Zahlenverhältnis transportieren, wird der Substratfluß durch einen Kanal durch dessen Offenwahrscheinlichkeit bestimmt 41. Die „solute carrier“ (SLC) Familie besteht aus Uniportern, Symportern und Antiportern (Abb. 1.7). EINLEITUNG 12 Abbildung 1.7 SLC Transporter Zellmodell mit solute carrier (SLC) und nicht-SLC Transportern in der Membran der Zelle und von Zellkompartimenten. Transportproteine die nicht zur SLC- Familie gehören, können ebenfalls in Zellkompartimenten exprimiert werden (modifiziert nach HEDIGER et al. 2004 41). Die solute carrier (SLC) Superfamilie umfasst 55 Genfamilien mit insgesamt mindestens 362 mutmaßlich funktionellen proteincodierenden Genen 40. In der folgenden Tabelle sind einige ausgewählte Mitglieder aufgelistet. Wasserkanäle Ionenkanäle Pumpen ATP ADP ABC Transporter SLC Transporter mitochondriale Transporter Symporter Antiporter Uniporter vesikuläre Transporter andere Transportproteine EINLEITUNG 13 Tabelle 1.2 Ausgewählte Transporter der SLC Familie (aus SCHMIDT et al. 2005 119 und http://www.bioparadigms.org/slc/menu.asp) Gen Name Substrate Lokalisation SLC2A2 GLUT2 Glucose, Galactose, Fructose proximaler Tubulus, Dünndarm, Pankreas basolateral SLC2A5 GLUT5 Fructose Dünndarm, proximaler Tubulus apikal SLC4A4 NBC1 Na+, HCO3 - proximaler Tubulus, Pankreas, Leber, Darm basolateral SLC5A1 SGLT1 Na+, Glucose, Galactose Dünndarm, proximaler Tubulus S3 apikal SLC5A2 SGLT2 Na+, Glucose proximaler Tubulus S1 apikal SLC13A1 NaSi-1 Na+, SO2- Dünndarm, proximaler Tubulus apikal SLC13A3 NaDC3 Na+, Dicarboxylate proximaler Tubulus S1-S2, Leber basolateral SLC15A1 PepT1 H+, Di- und Tripeptide Dünndarm, proximaler Tubulus S1 apikal SLC15A2 PepT2 H+, Di- und Tripeptide proximaler Tubulus S2-S3 apikal SLC16A1 MCT-1 Laktat, Pyruvat, Ketonkörper ubiquitär SLC16A7 MCT-2 Pyruvat, Laktat, Ketonkörper Nieren, Gehirn 1.3.1 Der natriumabhängige Sulfattransporter, NaSi-1 Da der natriumabhängige Sulfattransporter, NaSi-1, sowohl im Darm als auch in der Niere am Sulfattransport beteiligt ist, hat er eine essentielle Rolle in der Sulfathomöostase und seine Expression ist notwendig, um eine Reihe physiologischer Funktionen zu gewährleisten 16,86. Durch das Fehlen des NaSi-1 in der knock-out Maus, ist auch die Expression des basolateralen Sulfattransporters, sat-1, in den Nieren stark vermindert 17. Die Transkription des NaSi-1 wird möglicherweise über Vitamin D und das Schilddrüsenhormon reguliert 18. Vitamin D-Mangel und experimentell induzierter Hypothyreoidismus senken die Expression des NaSi-1 in der Niere 27,116. EINLEITUNG 14 1.3.2 Die SLC26 Transporterfamilie Die SLC26 Transporter sind Anionentransporter mit facettenreicher Substratspezifität. SLC26A1 und SLC26A2 sind Sulfattransporter, SLC26A3, SLC26A4 und SLC26A6 sind Chlorid-Bicarbonat-Austauscher. Bei SLC26A7 und SLC26A9 handelt es sich um Chloridkanäle 21,100. In der folgenden Tabelle sind die Mitglieder der SLC26 Familie aufgelistet. Tabelle 1.3 Transporter der SLC26 Familie Gen Name Substrate Lokalisation SLC26A1 sat-1 SO4 2-, Oxalat2- 6 proximaler Tubulus 62, Darm 19 Leber 107 basolateral sinusoidal SLC26A2 DTDST SO4 2-, Cl- 118, Oxalat2- 43 Darm 118 Knorpel 37, ubiquitär 38 apikal SLC26A3 DRA SO4 2-, Cl-, HCO3 - 90,120, OH- 92, Oxalat2- Darm 85,124 luminal SLC26A4 Pendrin Cl-, HCO3 -, I- 121, Formiat- 24 Ohrspeicheldrüse 121, Niere 135 Innenohr 136, Schilddrüse 24 luminal SLC26A5 Prestin Innenohr 145 SLC26A6 CFEX SO4 2-, Cl-, HCO3 -, OH-, Oxalat2-, Formiat- 67,140 Magen, Dünndarm 85, Pankreas 82, Niere67 apikal SLC26A7 Cl- 64 Niere 83, Magen 71 hochendotheliale Venolen, Nasenepithel, Nebenhoden 21 basolateral SLC26A8 Tat1 SO4 2-, I- 83,130,133 Hoden 83,130 Spermien 83, Gehirn 133 luminal SLC26A9 Cl- 20 Lunge 83 Magen 141 apikal SLC26A10 Pseudogen 125 SLC26A11 SO4 2- 133 hochendotheliale Venolen, Plazenta, Niere, Gehirn 133 Auf SLC26A1 wird im Kapitel 1.3.3 genauer eingegangen. Der diastrophische Dysplasie Sulfat Transporter (DTDST, SLC26A2) ist der engste Verwandte des sat-1 und tauscht Sulfat und Chlorid gegeneinander aus. SLC26A2 ist ubiquitär verbreitet und hoch exprimiert im Knorpel und im Dünndarm 118. SLC26A2 liefert Sulfat, das für die Sulfatierung der Proteoglykane bei der Knorpelentwicklung benötigt wird. Mutationen des SLC26A2 führen zu diastrophischer Dysplasie, einer Erkrankung, die durch verkürzte Gliedmaßen, EINLEITUNG 15 Kleinwüchsigkeit oder Deformationen in Knochen und Gelenken gekennzeichnet ist 38. Das Protein des SLC26A3 wurde nach seinem Expressionsmuster „Down Regulated in Adenoma“ (DRA) genannt und ist ein Chlorid-Bicarbonat- Austauscher des Colonepithels 90,120, der Chlorid auch gegen Hydroxylionen austauschen kann 92. Mutationen des SLC26A3 führen zu erblich bedingter Chloriddiarrhoe 47. Pendrin (SLC26A4) arbeitet als Chlorid-Bicarbonat, Chlorid-Iodid oder Iodid- Bicarbonat-Austauscher 121. In den Nieren vermittelt Pendrin die chloridabhängige Bicarbonatsekretion 135. Durch eine Mutation des SLC26A4 kommt es zum Pendred-Syndrom, das durch eine Beeinträchtigung der Iodaufnahme in die Schilddrüse zur Kropfbildung führt 24. Außerdem wird das Pendred-Syndrom mit Schwerhörigkeit assoziiert, da SLC26A4 die Bicarbonatsekretion der Epithelzellen des Innenohrs vermittelt 136. Prestin (SLC26A5) wird in den äußeren Haarzellen der Cochlea des Innenohrs gebildet. Im Gegensatz zu den anderen Mitgliedern der SLC26 Familie handelt es sich bei Prestin nicht um einen Transporter, sondern um einen „molekularen Motor“, der als Reaktion auf das Membranpotential die Form der äußeren Haarzellen verändert 145. Chlorid- und Bicarbonationen binden an Prestin und dienen damit als extrinsische Spannungssensoren 101. Ein Spleißdefekt des SLC26A5 führt zu Taubheit 81. Der CFEX (SLC26A6) ist ein Chlorid Formiat Austauscher (Exchanger), der neben Formiat auch Oxalat, Hydroxylionen und Bicarbonat gegen Chlorid austauschen und auch Sulfat transportieren kann. Er wird in den Nieren und Pankreas exprimiert 67,82,140. Im Ileum transportiert CFEX Oxalat zurück ins Lumen 29. Durch ihre vermehrte Oxalataufnahme im Darm ist die CFEX knock-out Maus hyperoxalämisch und bildet Nierensteine 59,65. Der SLC26A7 wird in verschiedenen Geweben exprimiert 21 und ist ein pH- abhängiger Chloridkanal 64. Seine physiologische Bedeutung ist noch unbekannt, möglicherweise vermittelt er die Chloridaufnahme in die Parietalzellen des Magens 71. Der Testis Anionen Transporter 1 (Tat-1, SLC26A8) ist in Hoden und Gehirn zu finden und transportiert Sulfat und Iodid 83,130,133. Während die männliche Tat-1 knock-out Maus steril ist 129, wurde in unfruchtbaren Männern keine Mutation des SLC26A8 gefunden 84. EINLEITUNG 16 Wie der SLC26A7 ist auch der SLC26A9 ein Chloridkanal 20 und wurde in Epithelzellen von Bronchien und Alveolen und im Magen nachgewiesen 83,141. Die Expression des SLC26A9 ist in mit Heliobacter pylori infizierten Mäusen hochreguliert 44 und er hat möglicherweise eine entscheidende Bedeutung in der Magensäuresekretion 142. Beim SLC26A10 handelt es sich um ein Pseudogen 125. SLC26A11 ist ubiquitär verbreitet, eine Northern Blot Analyse zeigte eine besonders starke Expression in Plazenta, Nieren und Gehirn. Es wird vermutet, dass der SLC26A11 am Sulfattransport in den hochendothelialen Venolen beteiligt ist 133. 1.3.3 Sulfat Anionen Transporter 1 (sat-1) Das humane sat-1 Protein (hsat-1) besteht aus 701 Aminosäuren 109 das sat-1 Protein der Ratte (rsat-1) aus 703 (Abb. 1.8) 6 und das der Maus (msat-1) aus 704 Aminosäuren 77. Die errechnete Molekülmasse beträgt ungefähr 75 kDa. Das Molekül besitzt wahrscheinlich 12 Transmembrandomänen, der C- und N- Terminus liegen vermutlich intrazellulär 6,77,109. Die Aminosäuresequenz des hsat-1 stimmt mit anderen SLC26 Proteinen überein: zu 78 % mit rsat-1 und 77 % mit msat-1, 44 % mit hDTDST, 29 % mit hDRA, 30 % mit dem humanen Pendrin, 33 % mit hCFEX und zu 25 % mit den humanen SLC26A7, SLC26A8 und SLC26A9 109. EINLEITUNG 17 Abbildung 1.8 Modell des rsat-1 Y: N-Glycosylierungsstellen (modifiziert nach BISSIG et al. 1994 6) Das hsat-1 Gen umfasst ca. 5,9 kb und enthält vier Exons. Das Startcodon befindet sich im dritten Exon. Insgesamt sind drei humane Spleißvarianten identifiziert worden. Die Spleißvarianten 1 und 3 codieren die Isoform a. Das hsat- 1 Gen hat ein optionales zweites Exon, welches durch alternatives Spleißen entsteht und zu den Transkripten 1 und 3 führt, die sich in der Länge um 215 bp unterscheiden. Die Lokalisation dieses Exons im 5’-nichttranslatierten Bereich lässt darauf schließen, dass die Proteinaktivität wahrscheinlich nicht beeinflusst wird 109. Der Variante 2 fehlt ein Exon und sie enthält ein alternatives 3’ Exon. Die Variante 2 bildet die Isoform b, die im Vergleich zu a aus nur 224 Aminosäuren besteht und sich in der C-terminalen Sequenz unterscheidet (National Center for Biotechnology Information). V M S G L V I G I I L V P Q A I A Y S L L A G Q P LSYI G T S R H V N V G I F S L L C L M V G Q V V D V V T S V C L A V L L T A K A R C H E L R L D G Q L N Q C T D D G N N G A L N S L A T Q L D G G P S F T T D S P V N S Q V NA G V QR T I I Q L I L P L V D G P L D C V Q A VTL G L L R G H R Q S W T L H K H M L L GA F G MS A R Y S YE R HL D F G R Q L T H S P G H F S V NG A I V A L D A S L A L V G S A F I M S P Q P V F I A M I W S P D K G T M S H GR VF Y SA S S L A E Q N AE T A V S A TK S L G T A I K P A D A L V W V A T A A T C V L V S I E A G L L A G V F F S L L S L A G R T Q L S S V V V L L V L L V L A P D Q L L K P L D Q S R W L F R K V G L R S A G L L P P T R P E F L Q T F P R A L R L D A M G Y F A E E A D R F L G T P F I RD AG L R S F V S S V D G V G L N S V V G G E T V D R D K S L G N K A Y Y L D T L S Y S L R D S A Y G A T P E V E P L A A S C S E S P R C R K L V L D I T L L C L A D L R N K A Y R A S V E T H R L L E E A F D R T L V LG G T Q D E G K G F L M S A D A A S L S Y T F L G A Q L CA L P K K S C C T P S M L E T K L L A R P G Q L F V SQY E K G R Y L V V R I W L P Q K P Q R V R P Q L V L L A E P P M GG A S D T L G D STY MLF NAFF YIL TLAT AML LIG QYLG MLV PVPV LET SAI VIVL TAV KL CGVA VNC AF FAPL CHF LL CRQ CALV VII RLSV VKR LAG CDIV LPA TAM DLFL GAV VT A I R I A L L F M S A A V C F Y Y Y außen innen C-Terminus N-Terminus VV MM SS GG LL VV II GG II II LL VV PP QQ AA II AA YY SS LL LL AA GG QQ PP LLSSYYII GG TT SS RR HH VV NN VV GG II FF SS LL LL CC LL MM VV GG QQ VV VV DD VV VV TT SS VV CC LL AA VV LL LL TT AA KK AA RR CC HH EE LL RR LL DD GG QQ LL NN QQ CC TT DD DD GG NN NN GG AA LL NN SS LL AA TT QQ LL DD GG GG PP SS FF TT TT DD SS PP VV NN SS QQ VV NNAA GG VV QQRR TT II II QQ LL II LL PP LL VV DD GG PP LL DD CC VV QQ AA VVTTLL GG LL LL RR GG HH RR QQ SS WW TT LL HH KK HH MM LL LL GGAA FF GG MMSS AA RR YY SS YYEE RR HHLL DD FF GG RR QQ LL TT HH SS PP GG HH FF SS VV NNGG AA II VV AA LL DD AA SS LL AA LL VV GG SS AA FF II MM SS PP QQ PP VV FF II AA MM II WW SS PP DD KK GG TT MM SS HH GGRR VVFF YY SSAA SS SS LL AA EE QQ NN AAEE TT AA VV SS AA TTKK SS LL GG TT AA II KK PP AA DD AA LL VV WW VV AA TT AA AA TT CC VV LL VV SS II EE AA GG LL LL AA GG VV FF FF SS LL LL SS LL AA GG RR TT QQ LL SS SS VV VV VV LL LL VV LL LL VV LL AA PP DD QQ LL LL KK PP LL DD QQ SS RR WW LL FF RR KK VV GG LL RR SS AA GG LL LL PP PP TT RR PP EE FF LL QQ TT FF PP RR AA LL RR LL DD AA MM GG YY FF AA EE EE AA DD RR FF LL GG TT PP FF II RRDD AAGG LL RR SS FF VV SS SS VV DD GG VV GG LL NN SS VV VV GG GG EE TT VV DD RR DD KK SS LL GG NN KK AA YY YY LL DD TT LL SS YY SS LL RR DD SS AA YY GG AA TT PP EE VV EE PP LL AA AA SS CC SS EE SS PP RR CC RR KK LL VV LL DD II TT LL LL CC LL AA DD LL RR NN KK AA YY RR AA SS VV EE TT HH RR LL LL EE EE AA FF DD RR TT LL VV LLGG GG TT QQ DD EE GG KK GG FF LL MM SS AA DD AA AA SS LL SS YY TT FF LL GG AA QQ LL CCAA LL PP KK KK SS CC CC TT PP SS MM LL EE TT KK LL LL AA RR PP GG QQ LL FF VV SSQQYY EE KK GG RR YY LL VV VV RR II WW LL PP QQ KK PP QQ RR VV RR PP QQ LL VV LL LL AA EE PP PP MM GGGG AA SS DD TT LL GG DD SSTTYY MMLLFF NNAAFFFF YYIILL TTLLAATT AAMMLL LLIIGG QQYYLLGG MMLLVV PPVVPPVV LLEETT SSAAII VVIIVVLL TTAAVV KKLL CCGGVVAA VVNNCC AAFF FFAAPPLL CCHHFF LLLL CCRRQQ CCAALLVV VVIIII RRLLSSVV VVKKRR LLAAGG CCDDIIVV LLPPAA TTAAMM DDLLFFLL GGAAVV VVTT AA II RR II AA LL LL FF MM SS AA AA VV CC FF Y Y Y außen innen C-Terminus N-Terminus EINLEITUNG 18 In Leber und Nieren von Mäusen sind zwei sat-1 cDNA Varianten detektiert worden 77. In Ratten wurde nur ein Transkript einer sat-1 cDNA identifiziert 6. Abbildung 1.9 hsat-1 Spleißvarianten 1-3 (modifiziert nach dem National Center for Biotechnology Information) 1.3.3.1 Lokalisation des sat-1 Der sat-1 ist in der basolateralen Membran von Darm und Niere und in der sinusoidalen Membran der Leber lokalisiert: Beim Menschen wird die hsat-1 mRNA in Leber, Niere und Nebenniere stark exprimiert, eine geringere Expression konnte im Gehirn, Dickdarm, Thymus, Milz, Dünndarm, Leukozyten, Pankreas, Testis und Prostata nachgewiesen werden 99,109. Die mRNA-Expression in Leberproben unterschiedlicher Personen zeigte kaum interindividuelle Schwankungen 99. Sat-1 mRNA konnte bei Ratten in der Leber und den Nieren detektiert werden, Gehirn und Muskel zeigten ein deutlich schwächeres Signal, während Herz, Lunge, distales und proximales Colon, lleum und Duodenum keine sat-1 mRNA- Expression zeigten 6,76. Der rsat-1 konnte immunhistochemisch in der basolateralen Membran proximaler Tubuluszellen und in der sinusoidalen Membran von Hepatozyten der Ratte nachgewiesen werden 62,107. In der Maus wird sat-1 mRNA unter anderem in Herz, Gehirn, Leber, Skelettmuskel und Nieren exprimiert 77. Die mRNA-Expression des msat-1 ist in der Leber 40fach höher als in der Niere 9. BRZICA et al. lokalisierten den msat-1 mittels Immunhistochemie in der sinusoidalen Membran der Leber und in der basolateralen Membran des proximalen Konvoluts 9. Sat-1 mRNA konnte außerdem in der basolateralen Membran des distalen Darms der Maus detektiert werden. Die Western Blot Analyse bestätigte die Expression des msat-1 Proteins und der Oxalattransport in diesem Abschnitten ist bei der knock-out Maus vermindert 19. Spleißvariante 2 3 1 5’ 3’ - codierende Region - nicht-codierende Region http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ EINLEITUNG 19 Abbildung 1.10 Lokalisation des sat-1 in Niere und Leber Die Regionen, in denen sat-1 nachgewiesen wurde, sind schwarz eingekreist (modifiziert nach Klinke, Silbernagel 2005 66). 1.3.3.2 Sat-1 Transport Die Substrate des sat-1 sind in Tabelle 1.4 zusammengefasst. Der hsat-1 transportiert Sulfat, Oxalat und Chlorid, allerdings kein Formiat. Die Km für Sulfat beträgt 0,19 mM. Die Sulfataufnahme wurde durch Diisothiocyanostilbendisulfonat (DIDS), Phenolrot, Thiosulfat, Molybdat, Wolframat und Selenat signifikant gehemmt, während Citrat und Glucose keinen Effekt auf die Sulfataufnahme zeigten 109. EINLEITUNG 20 Tabelle 1.4 Substrate und Effektoren des sat-1 Versuchsbedingung Mensch Ratte Maus Aufnahme radioaktiv markierter Substrate Sulfat (Km) 0,19 mM 109 0,14 mM 6 0,31 mM 77 Oxalat (Km) + 109 + 62 / 53 µM 72 + 77,140 Chlorid + 109 + 77/ - 140 Formiat - 109 - 77,140 L-Leucin - 77 Succinat - 77 Estronsulfat - 107 Dehydroepiandrosteronsulfat - 107 Hemmung der Aufnahme von Sulfat Oxalat + 6,118 + 77 Molybdat + 109 + 77 Selenat + 109 + 77 Wolframat + 109 + 77 Diisothiocyanostilbendisulfonat (DIDS) + 109 + 6,118 + 77 Thiosulfat + 109 + 72,118 + 77 Phenolrot + 109 + 77 Probenecid + 77 Glucose - 109 - 77 Citrat - 109 - 77 Cholat - 6 Succinat - 6,118 Blei - 89 Chrom + 89 Cadmium + 89 Quecksilber + 89 Azetazolamid + 107 Furosemid - 107 Bumetanid - 107 Hydrochlorothiazid - 107 Sulfit + 72 Sulfid - 72 Sulfamat - 72 Abhängigkeit der Sulfataufnahme Chlorid + 118 + 77,140 Bicarbonat + 77 pH + 140 EINLEITUNG 21 rsat-1-exprimierende Sf9 Zellen transportieren Sulfat und Oxalat 62. Weder Estronsulfat noch Dehydroepiandrosteronsulfat sind Substrate des sat-1 107. Die Km des rsat-1 für Sulfat beträgt 0,14 mM und die Sulfataufnahme ist durch Oxalat, Thiosulfat, DIDS, Quecksilber (irreversible Hemmung), Chrom, Cadmium, Sulfit und Azetazolamid aber nicht durch Cholat, Blei, Succinat, Furosemid, Bumetanid, Sulfid, Sulfamat und Hydrochlorothiazid hemmbar. rsat-1 benötigt für den Sulfattransport extrazelluläres Chlorid 6,72,89,118. Der msat-1 transportiert Sulfat und Oxalat, aber nicht Formiat, L-Leucin und Succinat. Die Sulfataufnahme wurde durch Oxalat, Molybdat, Selenat, Wolframat, DIDS, Thiosulfat, Phenolrot und Probenecid gehemmt, nicht durch Glucose und Citrat. Die Km für Sulfat beträgt 0,31 mM 77,140. Versuche zum Chloridtransport des msat-1 und zur Chloridabhängigkeit des Sulfattransports kommen zu unterschiedlichen Ergebnissen. Während LEE et al. zeigten, dass der msat-1 Chlorid transportiert und in Abwesenheit von Chlorid und Bicarbonat kein Sulfat transportiert wird 77, konnten XIE et al. keine Chloridaufnahme über den msat-1 messen. Des Weiteren zeigten sie eine Stimulation der Sulfataufnahme in Anwesenheit von Chlorid, aber auch durch Iodid, Bromid, Formiat und Laktat und eine pH-Abhängigkeit der Sulfataufnahme. Auch die Oxalataufnahme war in Gegenwart von Chlorid, Iodid oder Formiat erhöht 140. 1.3.3.3 Regulation des sat-1 Bei der Analyse des hsat-1 und msat-1 Promoters konnte eine GC Box aber keine TATA oder CAAT Box identifiziert werden 77,109. Außerdem wurden in den Sequenzen von hsat-1 und msat-1 mögliche Bindungsstellen für Transkriptionsfaktoren und mögliche „responsive“ Elemente für das Schilddrüsenhormon und Vitamin D gefunden. Während im Luciferase Assay eine Stimulation der Transkription des msat-1 durch das Schilddrüsenhormon gezeigt werden konnte, hatte es keinen Effekt auf die Transkription des hsat-1. Vitamin D hatte weder einen Effekt auf msat-1 noch auf hsat-1 77,109. Experimentell induzierter Hypothyreoidismus zeigte bei Ratten keinen Einfluss auf den basolateralen Sulfattransport in den Nieren 116. Die Sulfattransporterfamiliendomäne (PF00916) und das Sulfattransportersignaturmotiv (PS00130) wurde in den ersten vier Mitgliedern der SLC26 Familie (sat-1, DTDST, DRA und Pendrin) nachgewiesen. Da Pendrin kein EINLEITUNG 22 Sulfat transportiert, sind diese Domänen offensichtlich nicht für den Sulfattransport erforderlich. Die in hsat-1 und msat-1 nachgewiesene STAS Domäne lässt vermuten, dass der Anionentransport durch intrazelluläre Konzentrationen von ATP und / oder GTP reguliert wird 6,77,109. Die C-terminale Sequenz des hsat-1 (AHL) entspricht einer C-terminalen Zielsequenz in peroxisomalen Proteinen, die Bedeutung dieser Sequenz im hsat-1 ist allerdings unklar 109. Die Sequenzanalyse des msat-1 und rsat-1 ergab eine C- terminale PDZ-bindende Domäne (SAL). PDZ Domänen spielen eine wichtige Rolle bei der Erhaltung von Polarität und Funktion der Zellen, bei der Verteilung asymmetrischer Rezeptoren, Transporter, Ionenkanäle und Lipide auf die apikale und basolaterale Membran 2,10,25. Das Entfernen der drei C-terminalen Aminosäuren hatte allerdings keinen Einfluss auf die Lokalisation und Transporteigenschaften des rsat-1. Für den Transport des sat-1 zur basolateralen Membran ist ein Dileucin Motiv, das sich C-terminal an der Position 26/27 befindet, notwendig 110. Die Bedeutung von Dileucin Motiven als Zielsequenzen, die für den Transport zur basolateralen Membran sorgen, konnte bereits für andere Transportproteine gezeigt werden 35,36,91. Die Sequenzen von rsat-1 und msat-1 weisen drei mögliche Glycosylierungsstellen auf 6,77, während die Sequenz des hsat-1 nur zwei mögliche Glycosylierungsstellen besitzt 109. Die Glycosylierung von Proteinen dient verschiedenen Funktionen: Sie schützt vor proteolytischem Abbau, verändert die Affinität für Bindungspartner (z. B. beim Insulinrezeptor), beeinflusst die Aktivität von Enzymen und Hormonen und den intrazellulären Transport (Proteintargeting) zwischen Organellen und Membran 111. Des Weiteren enthält die Sequenz des hsat-1 sieben mögliche Proteinkinase C Phosphorylierungsstellen, eine mögliche Tyrosinphosphorylierungsstelle und sieben mögliche Caseinkinase II Phosphorylierungsstellen 109. Die sat-1 Expression wird möglicherweise durch Geschlechtshormone reguliert. Das rsat-1 Protein ist bei männlichen Ratten in Leber und Nieren stärker exprimiert als bei weiblichen Tieren, in der mRNA-Expression in der Leber unterscheiden sich männliche und weibliche Tiere nicht 9, während die mRNA- Expression in der Niere zu unterschiedlichen Ergebnissen kommt 9,115. Die sat-1 Proteinexpression in der Leber wurde durch die weiblichen Geschlechtshormone Progesteron und Östrogen herunterreguliert, während diese Hormone keinen http://de.wikipedia.org/wiki/Proteinbiosynthese EINLEITUNG 23 Effekt auf die Expression in der Niere zeigten 9. Estronsulfat selbst ist kein Substrat des rsat-1 107. 1.3.3.4 Die sat-1 knock-out Maus 2010 wurde von DAWSON et al. eine sat-1 knock-out Maus generiert 19. Die sat-1 knock-out Mäuse unterscheiden sich optisch und im Gewicht nicht von Wildtypmäusen. Die histologische Untersuchung von Leber und Gehirn ergab keine Strukturunterschiede zwischen knock-out- und Wildtyptieren. Der Sulfat- und Oxalattransport in Leber und Nieren, sowie der Oxalattransport im distalen Ileum, Caecum und proximalen Colon ist in den knock-out Mäusen stark vermindert. Die sat-1-/--Mäuse zeigten eine Leukozyteninfiltration der kortikalen Nierengefäße, Calciumoxalatkristalle wurden im kortikalen Sammelrohr und in der Blase nachgewiesen. Sat-1-/- Mäuse weisen stark erhöhte Plasmaoxalatspiegel auf, während die Serumsulfatkonzentration vermindert ist. Sowohl die Oxalat- als auch die Sulfatausscheidung mit dem Urin ist signifikant erhöht. Außerdem konnte eine verminderte Oxalat- und erhöhte Sulfatausscheidung mit den Faeces registriert werden. Da in der Leber von sat-1-/- Mäusen durch das Fehlen des sat-1 kein Sulfat transportiert wird, somit also das Sulfat zur entgiftenden Sulfatierung fehlt, ist die durch Xenobiotika induzierte Lebertoxizität erhöht 19. 1.4 Zellen Für die im Rahmen dieser Arbeit durchgeführten Versuche wurden Xenopus laevis Oozyten und HepG2-Zellen verwendet. 1.4.1 Xenopus laevis Oozyten Die Oozyten des südafrikanischen Krallenfrosches Xenopus laevis werden für die Expression heterologer Proteine verwendet 134. Heterologe cRNA kann relativ einfach in die Oozyten injiziert und die Proteinexpression und Funktion mit verschiedenen Methoden untersucht werden. Da Xenopus laevis Oozyten aus ihrer natürlichen Umgebung keine Nährstoffe aufnehmen, bilden sie nur wenige endogene Transportsysteme an ihrer Oberfläche aus 134. EINLEITUNG 24 Die Oogenese der Xenopus laevis Oozyten verläuft asynchron, im Ovar treten alle Entwicklungsstadien zur gleichen Zeit auf 22,134. Die Oogenese kann in sechs Stadien (I-VI) unterteilt werden (Abb. 1.11): Die Oozyten im ersten Stadium sind farblos, haben ein transparentes Cytoplasma und einen Durchmesser von 50-100 µm. Im zweiten Stadium sind die Oozyten weiß, lichtundurchlässig und haben eine Durchmesser von bis zu 450 µm. Ab dem dritten Stadium beginnt die Pigmentsynthese und die Ablagerung von Dotterproteinen. Die Oozyten des dritten Stadiums sind an der gesamten Oberfläche schwach pigmentiert. Im vierten Stadium wachsen die Oozyten sehr schnell, die animalische, pigmentierte Hemisphäre und die vegetative Hemisphäre grenzen sich voneinander ab. Die Oozyten haben jetzt einen Durchmesser von 600-1000 µm. Oozyten im fünften Stadium (1000-1200 µm) haben ihre Maximalgröße fast erreicht und hören allmählich auf, Dottermaterial zu akkumulieren. Im sechsten Stadium sind die Oozyten mit einem Durchmesser von 1200-1300 µm ausgewachsen 22. Abbildung 1.11 Die sechs Stadien der Oogenese von Xenopus laevis Oozyten (nach DUMONT 22, http://www.luc.edu/faculty/wwasser/dev/xenoogen.htm) Die Kulturbedingungen für die Oozyten und die verwendeten Oozyten Ringer werden in 2.8 und 3.2.2 beschrieben. 1.4.2 HepG2-Zellen Die humane Zelllinie HepG2 stammt aus der Leberbiopsie eines 15-Jährigen, der an einem primären Hepatoblastom erkrankt war 1. In dieser Zelllinie sind viele für gesunde humane Hepatozyten typische Funktionen erhalten. In Kultur sezernieren HepG2-Zellen verschiedene Plasmaproteine, wie z. B. Albumin, Fibrinogen und α- Fetoprotein ins Medium 70. Des Weiteren besitzen HepG2-Zellen die Fähigkeit verschiedene Apolipoproteine, Kollagene und Gallensäuren zu synthetisieren 8,58. I II III IV V VI EINLEITUNG 25 Unter dem Lichtmikroskop erscheinen HepG2-Zellen flach und polygonal mit einem Durchmesser von 12-19 µm. Im Zellrasen zeigen HepG2-Zellen epitheloides Wachstum. Sie wachsen größtenteils als Monolayer, bei längeren Kultivierungszeiten kommt es zu einem dreidimensionalen Wachstum (siehe Abb. 1.12). In den Zellhaufen sind die interzellulären Verbindungen sehr intensiv, was die Dissoziation mit Trypsin erschwert. Die Morphologie von HepG2-Zellen ist der von humanen Hepatozyten in Kultur ähnlich 4. Die verwendeten Medien und die Bedingungen für die Zellkultur der HepG2-Zellen werden in 2.8 und 3.3 beschrieben. Abbildung 1.12 HepG2-Zellen Lichtmikroskopische Aufnahmen einer HepG2-Kultur in HepG2-Medium, (A) 50fache Vergrößerung und (B) 100fache Vergrößerung A B http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/chemie/muehlenfeld-katrin/HTML/chapter2.html#_Ref449172829#_Ref449172829 http://edoc.hu-berlin.de/dissertationen/chemie/muehlenfeld-katrin/HTML/chapter2.html#_Ref449172829#_Ref449172829 EINLEITUNG 26 1.5 Aufgabenstellung und Zielsetzung Da das Auftreten von Nierensteinerkrankungen zunimmt 126, ist der Transport und Metabolismus des Oxalats, dem häufigsten Bestandteil von Nierensteinen 102, von besonderem Interesse. Während die Mechanismen des Oxalattransports in den Nieren weitgehend bekannt sind, sind diese in Darm und Leber nur unzureichend geklärt. Bis jetzt sind zwei Anionenaustauscher identifiziert worden, die für den Transport von Oxalat und Sulfat verantwortlich sein könnten: der Sulfat Anionen Transporter 1 (sat-1, slc26a1) und der Chlorid Formiat Austauscher (CFEX, slc26a6). Im Rahmen dieser Arbeit soll der sat-1 der Ratte im Oozytenexpressionssystem funktionell charakterisiert und der Einfluss von Oxalatvorstufen auf die Expression des hsat-1 in HepG2-Zellen, einem etablierten System für die Analyse der Synthesewege des Oxalats 3, untersucht werden. MATERIAL 27 2. MATERIAL 2.1 Oligonucleotidprimer Sequenzspezifische Primer für die reverse Transkription mit anschließender Polymerase Kettenreaktion (RT-PCR) wurden von Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) bezogen und sind in Tabelle 2.1 aufgelistet. Tabelle 2.1 RT-PCR Primer Protein (Gen) Primer Sequenz 5’-3’ Produkt- länge Anneal. Temp. Zyklen Gel 334for TCA CCA TCT TCC AGG AGC G GAPDH 905rev CTG CTT CAC CAC CTT CTT GA 572 bp 58°C 22 1,5 % 1681for TGT GGC AGA GTA CTC AGA GGC CA CFEX (SLC26A6) 2608rev ATG CAC CAG TTC CCT CCC TGT ACC 927 bp 68°C 25 1 % 1183for GTA TTT CTT TGC GGC TTC CG TTG MCT-1 (SLC16A1) 1694rev AGA CTG GAC TTT CCT CCT CCT TG 512 bp 58°C 30 1,5 % 334for GGT TGG ATT GTG GTT GGA GC MCT-2 (SLC16A7) 897rev CTT AGA AGT GGT TTG ATT GG GTC C 564 bp 56°C 40 1,5 % 165for TTT GGC TCA CAG AAG CAT TG NaSi-1 (SLC13A1) 393rev AGC CAT GCA GGA TTT ACA CC 228 bp 55°C 40 2 % 700for GCC AAC CTC ATC TAC TTC CTC sat-1 (SLC26A1) 953rev TGG TAA AGC CCG GTC ATC AG 254 bp 56°C 35 2 % Genspezifische Primer, ihre Position und Sequenz in 5’-3’ Richtung, die Länge des PCR-Produkts, „Annealing“ Temperatur, Anzahl der Zyklen und die Agarosekonzentration, welche zur Trennung des PCR-Produkts verwendet wurde, die CFEX Primersequenzen wurden der Arbeit von LOHI et al. 82 entnommen, GAPDH: Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, CFEX: Chlorid Formiat Austauscher, MCT: Monocarboxylattransporter, NaSi-1: natriumabhängiger Sulfattransporter 1, sat-1: Sulfat Anionen Transporter 1. 2.2 Real-time PCR Assays Assays für die „real-time“ PCR wurden bei Applied Biosystems (Foster City, CA, USA) erworben und sind in Tabelle 2.2 zusammengefasst. MATERIAL 28 Tabelle 2.2 Real-time PCR Assays Protein (Gen) Assay Spleißvariante hGAPDH Hs99999905_m1 NM_002046.3 hCFEX (SLC26A6) Hs00370470_m1 NM_022911.2 NM_134263.2 NM_134426.2 NM_001040454.1 Hs00758179_m1 (1) NM_022042.2 (3) NM_213613.2 (2) NM_134425.1 hsat-1 (SLC26A1) Hs00758185_m1 2.3 Zellen HepG2 zur Verfügung gestellt von Prof. Dr. D. Katschinski, Zentrum Physiologie und Pathophysiologie, Abteilung Herz- und Kreislaufphysiologie, Universitätsmedizin Göttingen E. coli XL1 blue zur Verfügung gestellt von PD Dr. N. A. Wolff, (Hitzeschock Institut für Physiologie und Pathophysiologie, kompetent) Private Universität Witten/Herdecke Xenopus laevis Oozyten Nasco, Fort Atkinson, WI, USA 2.4 Antikörper Antikörper Konzentration Anbieter / Katalognummer β-Aktin 0,1 mg / ml Dianova / DLN-07274 monoclonales Maus-IgG Ziege anti-Maus IgG 1 mg / ml Calbiochem / 401215 SLC26A1 1 mg /ml Aviva Systems Biology / polyklonales ARP 44028_P050 QC 14168 Kaninchen-IgG Ziege anti-Kaninchen IgG 0,4 mg / ml Santa Cruz Biotechnology / sc-2004 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NM_022911.2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NM_134263.2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NM_134426.2 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/viewer.fcgi?val=NM_001040454.1 MATERIAL 29 2.5 Plasmidvektor rsat-1 cDNA in pSport 1 zur Verfügung gestellt von (GIBCO / 15382-013) Dr. Daniel Markovich, School of Biomedical Sciences, University of Queensland, Brisbane, Australien 2.6 Kits Name Anbieter / Katalognummer NucleoSpin® Plasmid Macherey Nagel / 40588.50 Moloney Maus Leukämievirus (M-MuLV) AppliChem / A5211,50000 Reverse Transkriptase, RNase H minus T7 mMESSAGE mMACHINE Ambion / 1344 2.7 Enzyme Name Anbieter / Katalognummer NotI Restriktionsenzym New England Biolabs / R0189 Taq-Polymerase in eigener Arbeitsgruppe isoliert 2.8 Medien, Lösungen und Puffer Alle Zellkulturmedien wurden autoklaviert. Medium, Lösung, Puffer Zusammensetzung Agarosegel-Elektrophorese Ladepuffer (5x) 6,3 g Glycerol 2 ml 0,5 M Ethylendiamintetraacetat (EDTA) pH 8.0 50 µl Trishydroxymethylamino- methan (Tris) HCl pH 7,6 0,001 % (w/v) Bromphenolblau 0,001 % (w/v) Xylencyanol FF mit nucleasefreiem aqua dest. auf 10 ml aufgefüllt Ampicillin (Stammlösung) USB / US11259 100 mg / ml in aqua dest. MATERIAL 30 Bradford Lösung (4x) 0,4 g Coomassie Brilliant Blau G-250 200 ml Ethanol 400 ml Phosphorsäure mit aqua dest. auf 1 l aufgefüllt Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) Applichem / A13169050 High Glucose (HG) 13,44 g DMEM-HG 3,7 g NaHCO3 mit aqua dest. auf 1 l aufgefüllt Enhanced Chemiluminescence (ECL)- 100 mM Tris/HCl pH 8,5 Lösung 2,65 mM H2O2 1,25 mM Luminol in Dimethylsulfoxid (DMSO) 0,225 mM Coumarsäure in DMSO Ethidiumbromid (Stammlösung) Sigma / E1510 10 mg / ml in nucleasefreiem aqua dest. Luria Broth (LB) Medium 10 g NaCl 10 g Trypton 5 g Hefeextrakt mit aqua dest. auf 1 l aufgefüllt pH mit 5 N NaOH auf 7,0 eingestellt LB-Agar LB-Medium 1,5 % (w/v) Agarose 1 µl / ml Ampicillinstammlösung Mammalian Ringer (SO4 2--frei) 130 mM NaCl 4 mM KCl 1 mM CaCl2 1 mM MgCl2 20 mM HEPES 1 mM TMAPO4 18 mM Glucose pH mit NaOH auf 7,4 eingestellt Marker (Agarosegel-Elektrophorese) Fermentas / SM0321 100 µl Marker 100 µl 6x Ladepuffer (Fermentas / R0611) 400 µl nucleasefreies aqua dest. Invitrogen / 15628-050 10 µl Marker 40 µl 5x Agarosegel-Elektrophorese Ladepuffer 150 µl nucleasefreies aqua dest. MATERIAL 31 HepG2-Medium DMEM-HG 2 mM Glutamin 1,25 mM Pyruvat 100 U / ml Penicillin 100 µg /ml Streptomycin 10 % fetales Kälberserum (FCS) Membranpuffer 150 mM NaCl 50 mM Tris-HCl 5 mM EDTA 100 µl / 10ml Phenylmethylsulfonyl- fluorid 4 µl / 10 ml Aprotinin 4 µl / 10 ml Leupeptin Oozyten Ringer (ORi) 110 mM NaCl 3 mM KCl 2 mM CaCl2 5 mM Hepes pH mit Tris auf 7,5 eingestellt ORi (Ca2+-frei), 110 mM NaCl Aufnahmemedium für radio- 3 mM KCl chemische Untersuchungen 5 mM Hepes an Oozyten pH mit Tris auf 7,5 eingestellt ORi (Ca2+-und Cl--frei) 110 mM Natriumgluconat 3 mM Kaliumgluconat 5 mM Hepes pH mit Tris auf 7,5 eingestellt ORi ORi zur Aufbewahrung der Oozyten 2,5 mM Pyruvat während der Proteinexpression 50 µM Gentamycin pH mit Tris auf 7,5 eingestellt PBS Applichem / A0964,9100 (Phosphat-gepufferte Salzlösung) 9,55 g in 1 l aqua dest. SDS-PAGE Laufpuffer (10x) 30,3 g Tris-Base 144 g Glycin 10 g SDS mit aqua dest. auf 1 l aufgefüllt SDS-PAGE Sammelgel Puffer 0,5 M Tris-HCl, pH 6,8 0,4 % SDS in aqua dest. SDS-PAGE Trenngel Puffer 1,5 M Tris-HCl, pH 8,8 0,4 % SDS in aqua dest. MATERIAL 32 SDS-PAGE Ladepuffer 5 mM Tris-HCl, pH 6,8 10 % Glycerol (v/v) 1 % SDS 1 % β-Mercaptoethanol SOC-Medium 20 g Trypton 5 g Hefeextrakt 0,5 g NaCl 10 ml 0,25 M KCl 5 ml 2 M MgCl2 20 ml 1 M Glucose mit aqua dest. auf 1 l aufgefüllt pH mit NaOH auf 7,5 eingestellt Tris-Borat-EDTA (TBE)-Puffer (5x) 54 g Tris-Base 27,5 g Borsäure 20 ml 0,5 M EDTA pH 8,5 mit aqua dest. auf 1 l aufgefüllt Western Blot Puffer 25 mM Tris-HCl 192 mM Glycin 20 % (v/v) Methanol 2.9 Chemikalien Die Chemikalien wurden von AppliChem (Darmstadt, Deutschland), Invitrogen (Karlsruhe, Deutschland), Merck (Darmstadt, Deutschland), Roche (Grenzach- Wyhlen, Deutschland), Roth (Karlsruhe, Deutschland) und Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland) bezogen und hatten den Reinheitsgrad „zur Analyse“. Radioaktiv markiertes Oxalat (100 mCi / mmol) stammt von Biotrend (Köln, Deutschland), radioaktiv markiertes Sulfat (1200 Ci / mmol) von Hartmann (Braunschweig, Deutschland). 2.10 Software Im Folgenden sind die Software und die Online Server aufgelistet, die zum Zeichnen der Strukturformeln, zur Analyse der Rohdaten, zum Sequenzvergleich und „Designen“ der Primer verwendet wurden. MATERIAL 33 Programm Verwendung Bezug ChemWindow Strukturformeln Cherwell Scientific Publishing Microsoft Exel Auswertung der Microsoft Corporation Aufnahme- experimente SigmaPlot Bestimmung der Systat Software Transport- parameter Onlineserver zur Sequenzanalyse Programm Verwendung Referenz Entrez Browser Abfrage der http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ Sequenz MAP Sequenz- http://genome.cs.mtu.edu/map.htm alignment Blast Sequenz- http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ alignment Blast.cgi 2.11 Geräte Gerät Modell Hersteller Blotabbildung LAS 3000 Imager Fujifilm (Düsseldorf, Deutschland) Brutschrank Function Line Heraeus BB16 (Hanau, Deutschland) Elektrophorese EPS 3500 XL Pharmacia (Uppsala, Schweden) Feinwaage 2002 MP1 Sartorius (Göttingen, Deutschland) Geldokumentation Gel Print 2000 I Biophotonics (Ann Arbor, MI, USA) Gelkammer Midi Eurofins MWG Operon (Ebersberg, Deutschland) Homogenisator Labsonic 3000 B. Braun (Melsungen, Deutschland) Inkubationsschüttler 3031 GFL (Burgwedel, Deutschland) http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Entrez/ http://genome.cs.mtu.edu/map.htmalignment http://genome.cs.mtu.edu/map.htmalignment http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/ MATERIAL 34 Inkubator für Oozyten Kühlschrank Liebherr (Biberach an der Riss, Deutschland), Umbau durch die institutseigene Werkstatt Kapillarziehgerät PE-II Narishige (Tokio, Japan) Mikroinjektor Nanoliter 2000 World Precision Instruments (Sarasota, FL, USA) Magnetrührer KM02 electronic IKA Labortechnik (Staufen, Deutschland) Mikroskop 500052 World Precision Instruments (Sarasota, FL, USA) Telaval 31 Zeiss (Oberkochen, Deutschland) Mikrowelle Privileg 8521 Quelle Schikedanz (Fürth, Deutschland) Minizentrifuge C-1200 Woodbridge (NJ, USA) PCR Zykler GeneAmp Perkin Elmer PCR System 2400 (Waltham, MA, USA) RoboCycler Stratagene Gradient 96 (La Jolla, CA, USA) pH-Meter CG820 Schott (Mainz, Deutschland) 611 Orion Research (Beverly MA, USA) Photometer Novaspec II Pharmacia Biotech (Freiburg, Deutschland) Real-time PCR Mx3005p Stratagene Thermozykler (Waldbronn, Deutschland) RNA / DNA Calculator GeneQuant II Pharmacia Biotech (Photometer) (Freiburg, Deutschland) Szintillationszähler 1500 Tri-Carb Packard Instrument (Meriden, CT, USA) Schüttler KS 250 basic IKA Labortechnik (Staufen, Deutschland) MATERIAL 35 Spektralphotometer GeneQuant II Pharmacia (Uppsala, Schweden) Sterile Werkbank Microflow nunc (Langenselbold, Deutschland) Ultrazentrifuge OTD65B Thermo Fisher Scientific Rotor TFT6513 (Waltham, MA, USA) UV Transilluminator TM40 UVP (Upland, CA, USA) Vortex MS1 IKA (Staufen, Deutschland) Waage LC6215 Satorius (Göttingen, Deutschland) Wasserbad D8 Haake (Karlsruhe, Deutschland) 1083 GFL (Burgwedel, Deutschland) Wärmehaube B15 Heraeus (Hanau, Deutschland) Western Blot Kammer Bio-Rad (München, Deutschland) Western Blot Netzgerät ST606T Gibco (Karlsruhe, Deutschland) Zählkammer hell-linig Saaringia (Neubauer) (Saarlouis, Deutschland) Zentrifugen Biofuge fresco, Heraeus Labofuge 400R (Hanau, Deutschland) 5417R , 5415 D Eppendorf (Hamburg, Deutschland) METHODEN 36 3. METHODEN 3.1 Gewinnung von cRNA für die Expression in Oozyten Der methodische Ablauf vom Plasmid zur cRNA-Synthese ist in Abbildung 3.1 zusammenfassend dargestellt. Die für rsat-1 codierende DNA wurde in einem Plasmid in E. coli Zellen transformiert. Nach Selektion der transformierten Zellen wurden diese vermehrt und das rsat-1 DNA-enthaltene Plasmid isoliert. Die DNA wurde linearisiert, in cRNA umgeschrieben und in Xenopus laevis Oozyten injiziert. Abbildung 3.1 cRNA-Gewinnung für die Expression in Oozyten a) Transformation von rsat-1 in E. coli, b) Vermehrung der Zellen, c) Isolierung des Plasmids, d) Schneiden mit NotI Restriktionsenzym, e) Transkription 3.1.1 Transformation der Plasmid-DNA in E. coli Zellen Unter Transformation versteht man die nicht-virale Aufnahme freier DNA in kompetente Bakterienzellen, Algen, Hefen, Pilze oder Pflanzen. 20 ng des pSport Vektors, der die für rsat-1 und Ampicillinresistenz codierende DNA enthielt, wurden zusammen mit 50 µl hitzekompetenten E. coli Zellen (XL1 blue) in ein Inkubationsgefäß gegeben und 30 min auf Eis inkubiert. Anschließend wurde das Gefäß für 45 s in ein 42 °C warmes Wasserbad gehalten (Hitzeschock) und 2 min auf 4 °C abgekühlt. Die Zellen wurden in 500 ml SOC-Medium gegeben und 1 h bei 220 rpm und 37 °C inkubiert. Nun wurde die Zelllösung auf zwei Selektivagarplatten (LB-Agar), die Ampicillin enthielten, in verschiedenen Konzentrationen ausplattiert und über Nacht bei 37 °C bebrütet. Auf dem Agar sollten nur Kolonien wachsen, die das pSport Plasmid enthalten und damit gegen Ampicillin resistent wären. pSport sat-1 E. coli cRNA NotI a b c d e METHODEN 37 3.1.2 DNA-Isolierung und Aufreinigung E. coli Kolonien mit dem rsat-1-enthaltenden pSport Plasmid wurden über Nacht in 8 ml LB-Medium angezogen, welches 100 µg / ml Ampicillin enthielt. Abhängig von der Dichte der Kultur wurden 4-6 ml durch Zentrifugieren geerntet. Die Plasmid- DNA wurde nach dem Prinzip der SDS / alkalischen Lyse, gemäß der Anleitung des Herstellers (NucleoSpin® Plasmid Kit, Macherey Nagel) isoliert. Die Zellen wurden in 250 µl RNAse-haltigem Puffer A1 resuspendiert und durch die Zugabe von 250 µl SDS-haltigem Puffer A2 lysiert. Nach vollständiger Lyse der Zellen wurden durch Zugabe von 300 µl Neutralisationspuffer (A3) die Bedingungen für die Bindung der Plasmid-DNA an die Silica-Membran verbessert und das SDS ausgefällt. Um ausgefallenes SDS und Zelltrümmer zu entfernen, wurde 10 min bei 11 000 x g zentrifugiert und der Überstand auf eine NucleoSpin® Säule gegeben. Durch das Waschen und Zentrifugieren mit 500 µl auf 50 °C erwärmten AW Puffer und mit 600 µl ethanolhaltigem Puffer A4 wurden Kontaminationen wie Salze, Metabolite oder lösliche makromolekulare Zellbestandteile entfernt. Das verbliebene Ethanol wurde durch erneutes Zentrifugieren für 2 min entfernt. Schließlich wurde die Plasmid-DNA mit 50 µl Puffer AE (5 mM Tris-HCl, pH 8,5) und durch 1 min Zentrifugieren bei 11 000 x g eluiert. 3.1.3 Restriktionsverdau mit NOTI Vor der cRNA Synthese muss die doppelsträngige DNA vollständig mit einem passenden Restriktionsenzym distal des Promotors stromabwärts des zu transkribierenden Inserts gespalten werden. NotI ist hier das Enzym der Wahl. Zum Verdau wurden 10 µg Plasmid, 5 µl 10x BSA und 5 µl NotI Restriktionsenzym (New England Biolabs) in 1x NE Puffer 3 (100 mM NaCl, 50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM Dithiotreitol, pH 7,9 bei 25 °C, New England Biolabs) mit nucleasefreiem aqua dest. aufgefüllt auf 50 µl und für 3 h bei 37 °C inkubiert. Das linearisierte Produkt wurde durch Ethanolfällung aufgereinigt. Zum Produkt wurden 250 µl eiskaltes Ethanol (100 %) und 10 µl 3 molares Natriumacetat gegeben. Um die DNA auszufällen, wurde diese Lösung für 20 bis 60 min auf -20 °C abgekühlt. Anschließend wurde für 20 min bei 12 000 x g zentrifugiert und METHODEN 38 der Überstand vorsichtig abgenommen, ohne das Pellet zu zerstören. Das Pellet wurde mit 900 µl 70%igem Ethanol gewaschen und erneut 5 min bei 12 000 x g zentrifugiert. Nach dem Abnehmen des Überstands wurde das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Die DNA wurde schließlich in 20 µl nucleasefreiem aqua dest. aufgenommen. 3.1.4 cRNA Synthese cRNA wurde mit Hilfe des T7 mMESSAGE mMACHINE Kits (Ambion) synthetisiert. Dieses Kit ermöglicht die Synthese großer Mengen an Cap-RNA aus lineariesierter DNA durch das Einfügen eines Cap Analogons während der Polymerisationsreaktion. Durch seine 7-Methyl-Guanosin-Cap-Struktur am 5’- Ende imitiert die Cap-RNA die meisten in vivo gefundenen eukaryontischen mRNAs. Das Cap-Analogon wird nur als das erste oder 5’ terminale G des Transkripts eingebaut, da seine Struktur einen Einbau an anderen Positionen des RNA-Moleküls verhindert. Um die Transkriptionsreaktion durchzuführen wurden 2 µl 10x Reaktionspuffer, 10 µl 2x Ribonucleotidgemisch (NTP / CAP), 1,1 µg linearisierte, aufgereinigte DNA, und 2 µl Enzymgemisch eingesetzt und mit nucleasefreiem aqua dest. auf 20 µl aufgefüllt. Die cRNA-Synthese wurde für 2 h bei 37 °C durchgeführt. Anschließend wurde die DNA durch Zugabe von 1 µl RNAse freier TURBO DNAse und einer Inkubation von 15 min bei 37 °C abgebaut. Die cRNA wurde nun durch die Zugabe von 30 µl nucleasefreiem aqua dest., 30 µl 7,5 molarer LiCl- Fällungslösung und Abkühlen auf -20 °C für mindestens 1 h ausgefällt. Danach wurde 30 min bei 4 °C und 13 000 x g zentrifugiert, das Pellet mit 200 µl 70 %igem Ethanol gewaschen und erneut für 5 min bei 13 000 x g zentrifugiert. Nach dem Abnehmen des Überstands wurde das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet und in 15 µl nucleasefreiem aqua dest. aufgenommen. Mit Hilfe des RNA / DNA Calculators wurde die RNA-Konzentration photometrisch bestimmt und anschließend mit nucleasefreiem aqua dest. auf 1 µg / µl eingestellt. Die cRNA wurde bis zur Injektion in Oozyten bei -80 °C aufbewahrt. METHODEN 39 3.2 Expression des rsat-1 in Xenopus laevis Oozyten Zur funktionellen Charakterisierung des rsat-1 wurden Xenopus laevis Oozyten als Expressionssystem verwendet. Die Oozyten wurden mit rsat-1 cRNA injiziert. Nach einer Expressionszeit von 3 Tagen schloss sich die funktionelle Charakterisierung des in die Oozytenmembran eingebauten rsat-1 Proteins an. Der [14C]Oxalat- und [35S]Sulfattransport der rsat-1-exprimierenden Oozyten und Wasser-injizierten Kontrollen (mocks) wurde unter verschiedenen experimentellen Bedingungen gemessen. In Abbildung 3.2 ist der Versuchsablauf schematisch dargestellt. 3.2.1 Präparation der Oozyten Die Oozyten wurden von einer Mitarbeiterin des Instituts zur Verfügung gestellt. Um die Oozyten von dem sie umgebenden Bindegewebe und Follikelzellen zu befreien, wurden sie mit Kollagenase (Typ II, Biochrom) behandelt. Mehrere Ovarlappen wurden zerkleinert, in 20 ml ORi gelegt und 7 mg Kollagenase hinzugefügt. Am folgenden Tag wurde die Kollagenase durch Waschen mit Ca2+- freiem ORi entfernt. Die Oozyten wurden anschließend für 10 min in Ca2+-freiem ORi inkubiert. Danach wurden die Oozyten mit ORi gewaschen, darin aufbewahrt, die Stadien V und VI unter dem Lichtmikroskop selektiert und für die Injektion der cRNA verwendet. 3.2.2 Injektion der Oozyten Sat-1 cRNA wurde mit Hilfe eines Nanoliter Mikroinjektors unter Verwendung von Sodaklarglaskapillaren in die Oozyten injiziert. In die Oozyten wurden 23 nl RNA mit einer Konzentration von 1 µg / µl injiziert oder das entsprechende Volumen nucleasefreies aqua dest. als Kontrolle. Die Wasser-injizierten Oozyten werden im Folgenden als mocks bezeichnet. Oozyten wurden zum Injizieren auf eine spezielle Kammer mit Rinnen gegeben, um das Injizieren zu erleichtern. Sie waren mit ORi bedeckt, um das Austrocknen zu verhindern. Nach dem Injizieren wurden sie für 3 Tage bei 16 °C in ORi (zur Aufbewahrung) inkubiert. Dieser wurde täglich METHODEN 40 gewechselt und Oozyten, deren Abgrenzung der Pole nicht eindeutig erkennbar war, wurden verworfen. Abbildung 3.2 Schematische Darstellung des Versuchsablaufs von der cRNA-Injektion bis zur radiochemischen Untersuchung der rsat-1- exprimierenden Xenopus laevis Oozyten. Sat-1 cRNA wurde in Xenopus laevis Oozyten injiziert. In den folgenden drei Tagen fand die Translation und der Einbau des Proteins in die Membran statt. Danach konnten die Funktionen des rsat-1 untersucht werden: als cis-Inhibition, bei der die Aufnahme von [35S]Sulfat oder [14C]Oxalat durch unterschiedliche Substanzen gehemmt wurde, durch trans-Stimulationsexperimente, bei denen mögliche Substrate in die Oozyte injiziert und die Aufnahme von [35S]Sulfat oder [14C]Oxalat bestimmt wurde oder durch Effluxexperimente. Um einen Efflux durchzuführen, wurden [35S]Sulfat oder [14C]Oxalat in die Oozyten injiziert, um anschließend den Efflux von markiertem Sulfat oder Oxalat in Abhängigkeit unterschiedlicher Komponenten im Medium zu messen. Substratinjektion Einbau des Transporters Injektion mit [35S]Sulfat oder [14C]Oxalat Protein RNA Protein trans-Stimulation cis-Inhibition Efflux sat-1 sat-1 sat-1 [35S]- Sulfat [14C]- Oxalat [35S]Sulfat [14C]Oxalat sat-1 sat-1 [35S]Sulfat [14C]Oxalat Translation Injektion der sat-1 cRNA RNA sat-1 Substanz Substanz Substanz [35S]Sulfat [14C]Oxalat METHODEN 41 3.2.3 Aufnahmeexperimente Der Versuchsablauf der Transportexperimente mit radioaktiv markierten Substraten ist in Abbildung 3.3 schematisch dargestellt. Die Oozyten wurden mit ORi gewaschen, um Pyruvat und Gentamycin zu entfernen, in Gruppen von bis zu 12 Oozyten aufgeteilt und in ein 10 ml Schnappdeckelglas mit 1 ml Aufnahmemedium überführt. Im Aufnahmemedium befanden sich verschiedene Substanzen zusammen mit radioaktiv markiertem Sulfat oder Oxalat. Vor der Durchführung der Versuche wurden die entsprechenden Substanzen in Ca2+- freiem ORi gelöst und der pH auf 7,5 eingestellt. Um ein Ausfallen von Calciumoxalat zu vermeiden, wurden die Versuche unter nominal Ca2+-freien Bedingungen durchgeführt. Die Aufnahme wurde, wenn nicht anders erwähnt für 5 min in Ca2+-freiem ORi und bei Raumtemperatur durchgeführt. Bei cis-Inhibitionsversuchen wurden den Oozyten im Aufnahmemedium verschiedene Substanzen angeboten um die Hemmung der [35S]Sulfat- oder [14C]Oxalataufnahme durch diese Verbindungen zu untersuchen. Die Konzentrationen an [35S]Sulfat und [14C]Oxalat sind bei den jeweiligen Versuchen angegeben. Die Oozyten wurden für 5 min im Aufnahmemedium inkubiert. Die [35S]Sulfat- oder [14C]Oxalataufnahme aus dem ORi ohne Zugabe weiterer Substanzen wurde als Kontrolle verwendet. Für die trans-Stimulation wurden die Oozyten vor der Inkubation im Aufnahmemedium mit verschiedenen Substanzen vorbeladen. Dazu wurden in die Oozyten 23 nl von 50 mM Lösungen dieser möglichen Substrate in Ca2+-freiem ORi injiziert. Als Kontrolle wurden Oozyten mit Ca2+-freiem ORi injiziert. Um die Aufnahme zu beenden, wurde das Aufnahmemedium abgesaugt und die Oozyten drei Mal mit 3 ml eiskaltem ORi gewaschen. Die Oozyten wurden nun einzeln in Szintillationröhrchen gegeben. Um einen [35S]Sulfat- oder [14C]Oxalatefflux durchzuführen, wurden Oozyten mit 23 nl [35S]Sulfat oder [14C]Oxalat injiziert und diese anschließend einzeln in je 150 µl Ca2+-freiem ORi, dem verschiedene Substanzen zugesetzt waren, inkubiert. Nach einer Inkubationszeit von 30 min wurde das Medium in ein Szintillationsröhrchen überführt, 150 µl Medium zum Waschen auf die Oozyte gegeben, die Oozyte in ein weiteres Szintillationsröhrchen gegeben und das Waschmedium mit dem Medium im ersten Röhrchen vereint. METHODEN 42 Die Oozyten wurden durch die Zugabe von 250 µl 1 M NaOH und zweistündiges Schütteln (150 / min) bei Raumtemperatur aufgelöst. Nach dem Neutralisieren mit 250 µl 1 M HCl und der Zugabe von 2,5 ml Lumasafe Szintillationsflüssigkeit, wurde der [14C]- bzw. [35S]-Gehalt im Szintillationszähler bestimmt. Abbildung 3.3 Schematische Darstellung des Versuchsablaufs der Transportexperimente mit radioaktiv markierten Substanzen. In jedem Schnappdeckelglas befinden sich 10-12 Oozyten, exemplarisch ist der Versuchsablauf hier an nur einer Oozyte dargestellt. Die Oozyten wurden in radioaktivem Aufnahmemedium inkubiert, nach 5 min wurde das Aufnahmemedium entfernt und die Oozyten drei Mal mit eiskaltem ORi gewaschen. Anschließend wurden die Oozyten einzeln in Szintillationsröhrchen überführt und durch Zugabe von NaOH aufgelöst. Nach 2 h wurde die Oozytenlösung durch HCl neutralisiert und nach der Zugabe von Szintillationsflüssigkeit der Gehalt an Radioaktivität der Proben im Szintillationszähler gemessen. Szintillations- flüssigkeit 5-minütige Inkubation in den Versuchsbedingungen angepasstem ORi plus [35S]Sulfat oder [14C]Oxalat Absaugen der Lösungen 3 x Waschen mit eiskaltem ORi Überführen der Oozyten in Szintillationsröhrchen und Lösen in NaOH 2 h Neutralisieren mit HCl, Zugabe von Szintillationsflüssigkeit und Bestimmung des [35S]- und [14C]-Gehalts mock sat-1-exprimierende Oozyte METHODEN 43 3.3 Zellzucht mit HepG2-Zellen HepG2-Zellen wurden auf 20 cm Kulturschalen im Inkubator bei 37 °C und 5 % CO 2 / 95 % Raumluft angezogen und alle 7 Tage im Verhältnis 1 : 5 aufgeteilt. Vor dem Teilen wurden die Zellen mit 10 ml PBS gewaschen. Anschließend wurden 3 ml Trypsin (0,1 % in PBS) auf die Zellen gegeben. Sie wurden für ca. 3 min bei 37 °C inkubiert, um sie von der Platte zu lösen. Die Zellen wurden mit 10 ml PBS von der Platte gespült. Um den Trypsinverdau zu stoppen, wurde die Zellsuspension zusammen mit 3 ml HepG2-Medium 5 min bei 195 x g und Raumtemperatur zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 10 ml HepG2-Medium aufgenommen und die Zelldichte in einer Neubauerzählkammer bestimmt. Für die RNA-Isolierung wurden die HepG2-Zellen mit einer Dichte von 1·105 Zellen / ml Medium in 6-Wellplatten ausgesät (2 ml pro Well) und sieben Tage lang inkubiert. Das Medium wurde täglich gewechselt. Die Zellen wurden für vier Tage in 1 mM Glycin, Hydroxyprolin, Sulfat, Glycolat, 20 mM Glycolat, 0,1 mM Oxalat, 0,1, 0,5, 1 oder 2 mM Glyoxylat inkubiert bzw. für 1-6 Tage in 1 mM Glyoxylat. Je ein Well diente als Kontrolle und wurde ohne Substanzzugabe inkubiert. Um die Sulfataufnahme in HepG2-Zellen zu untersuchen, wurden 24-Well-Platten mit Polylysin vorbehandelt, um das Anhaften der Zellen am Plattenboden zu verbessern. Die Zellen wurden mit einer Dichte von 5·104 / ml ausgesät (500 µl pro Well) und sechs Wells wurden vier Tage lang in 1 mM Glyoxylat inkubiert. Zellen in weiteren sechs Wells dienten als Kontrolle. Die Kontrollzellen wurden analog, jedoch ohne Zugabe von Glyoxylat behandelt. 3.4 Isolierung der RNA mit TRIzol® Zur Isolierung der RNA aus HepG2-Zellen wurde TRIzol®-Reagenz (Invitrogen / 15596-018) verwendet. Am Tag der Ernte wurde das Medium von den Zellen abgesaugt und sie wurden zwei Mal mit eiskaltem PBS gewaschen. Je 1 ml TRIzol® pro Well wurde auf die Zellen gegeben und sie wurden darin für 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. 200 µl Chloroform wurden in Eppendorfgefäßen vorgelegt, die Zellen durch Auf- und Abpipettieren von den Platten gelöst und auf das Chloroform gegeben. Nach 15 s manuellen Schüttelns wurden die Proben für METHODEN 44 2-3 min bei Raumtemperatur inkubiert und anschließend für 15 min bei 12 000 x g zentrifugiert. Es bildeten sich drei Phasen: in der unteren, pinkfarbenen, Phenol- Chloroform-Phase befanden sich die Proteine, die mittlere, die sogenannte Interphase enthielt die DNA und in der oberen wässrigen Phase fand man die RNA. Die obere Phase wurde vorsichtig abgenommen und, um die RNA auszufällen, mit 500 µl Isopropanol versetzt. Das RNA-Isopropanolgemisch wurde 10 min bei Raumtemperatur inkubiert und bei 4 °C für 20 min mit 12 000 x g zentrifugiert, um ein Pellet der ausgefallenen RNA zu erhalten. Zum Waschen wurde das Pellet in 1 ml 75 %igem Ethanol gevortext und 5 min bei 4 °C und 7 500 x g zentrifugiert. Das Ethanol wurde abgenommen und das Pellet bei Raumtemperatur getrocknet. Das trockene Pellet wurde in 30 µl nucleasefreies aqua dest. aufgenommen und entweder sofort zur reversen Transkription verwendet oder bei -80 °C eingefroren. 3.5 Reverse Transkription (cDNA Synthese) Complementary DNA (cDNA) ist das Ergebnis der reversen Transkription der RNA mit Hilfe einer DNA-Polymerase, die als „Reverse Transkriptase“ bezeichnet wird. 5 µg der RNA aus den HepG2-Zellen wurden mit 1 µl Random Primer Oligo dT versetzt. Oligo dT Primer binden an den Poly-A-Schwanz von mRNAs. Mit nucleasefreiem aqua dest. wurde auf 8 µl aufgefüllt, 10 min bei 70 °C inkubiert, um die Sekundärstrukturen der RNA aufzuschmelzen und 15 min auf 4 °C abgekühlt. Nach der Denaturierung wurden 6 µl Wasser, 4 µl 5x Puffer, 1 µl 10 mM Desoxyribonucleosidtriphosphate (dNTPs) und 1 µl Reverse Transkriptase des Moloney Maus Leukämievirus (M-MuLV) zugegeben und die Reverse Transkription für 1 h bei 37 °C durchgeführt. Danach wurde die Reverse Transkriptase durch 10 min bei 70 °C inaktiviert und die Probe auf 4 °C abgekühlt. Die erhaltene cDNA wurde bis zum weiteren Gebrauch für die PCR oder real-time PCR bei -20 °C eingefroren. METHODEN 45 3.6 Polymerase-Kettenreaktion Die Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ist ein dreistufiger Prozess, der es ermöglicht, beliebige DNA-Abschnitte zu vermehren. Man benötigt zwei Oligonucleotide (Primer), die mit jeweils einem der Stränge auf beiden Seiten des zu amplifizierenden DNA-Abschnitts hybridisieren, die vier Desoxynucleosid- triphosphate und eine hitzestabile DNA-Polymerase. Jeder PCR-Zyklus besteht aus der Denaturierung, dem Trennen der DNA-Stränge, dem Annealing, dem Anlagern der Primer und der Elongation, der Synthese neuer DNA-Stränge. In Abbildung 3.4 ist der Ablauf von drei PCR-Zyklen schematisch dargestellt. Abbildung 3.4 Das Prinzip der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) Im Denaturierungsschritt trennen sich die DNA-Stränge, beim anschließenden Annealing wird die Temperatur gesenkt um die Hybridisierung der Primer an die DNA zu ermöglichen, in der Elongationsphase wird die Temperatur auf das Optimum der Polymerase erhöht, um die Synthese des zweiten DNA-Stranges zu ermöglichen Zur PCR wurden 2,5 µl (verschiedene Transporter) oder 5 µl (GAPDH) der cDNA verwendet. Diese wurden mit 8 µl 1,25 mM dNTPs, 5 µl 10x PCR-Puffer, je 1 µl des Forward- und Reverse-Primers (20 pmol / ml) und 1 µl Taq-Polymerase Denaturierung Annealing Elongation Annealing Elongation Annealing Elongation Denaturierung Denaturierung METHODEN 46 versetzt und mit nucleasefreiem aqua dest. auf 50 µl aufgefüllt. Das Temperaturprofil der PCR für GAPDH lautete wie folgt: Initiale Denaturierung 2 min 94 °C Denaturierung 40 s 94 °C Annealing 50 s 58 °C 22 Zyklen Elongation 1 min 72 °C Finale Elongation 5 min 72 °C Bei der sat-1 PCR betrug die Annealingtemperatur 56 °C und es wurden 35 Zyklen durchgeführt. Die Annealingtemperaturen und Zyklenzahlen der PCRs weiterer Transporter sind in Tabelle 2.1 aufgelistet. Um die Qualität der reversen Transkription zu überprüfen, wurde vor der real-time PCR eine qualitative PCR durchgeführt und die Produkte auf einem Ethidiumbromidgel visualisiert. 3.7 Real-time PCR Die real-time PCR ist eine Methode zur Quantifizierung von Nukleinsäuren. Sie beruht auf der Ausnutzung des Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfers. Ein Fluoreszenzfarbstoff wird mit Licht einer bestimmten Wellenlänge angeregt und gibt anschließend Licht in einer anderen Wellenlänge wieder ab. Der Fluoreszenzfarbstoff hat ein für ihn charakteristisches Anregungs- und Emissionsspektrum. Bringt man nun einen weiteren Fluoreszenzfarbstoff in seine Nähe, dessen Anregungsspektrum dem Emmissionsspektrum des ersten entspricht, kann man durch die Messung der Lichtstärke der emittierten Wellenlänge ermitteln, ob sich die Fluorochrome getrennt oder beieinander befinden. Für die real-time PCR wurde das Taqman-Prinzip verwendet. Beide Fluoreszenzfarbstoffe befinden sich auf demselben Oligonukleotid. Solange das Oligonukleotid intakt ist, ist die vom ersten Fluorochrom emittierte Lichtstärke gering, werden die Fluoreszenzfarbstoffe durch die Polymerase freigesetzt, steigt die Lichtproduktion bei dieser Wellenlänge an. Je mehr DNA synthetisiert wird, desto mehr Fluorochrome werden freigesetzt und die Signalstärke steigt. METHODEN 47 Für die real-time PCR wurden 12,5 µl 2x Reaktionspuffer, 1,25 µl 20x Taqman Primer, 1-2,5 µl cDNA verwendet und mit nucleasefreiem aqua dest. auf 25 µl aufgefüllt. Der Thermozykler wurde wie folgt programmiert: 2 min 50 °C 10 min 95 °C 15 s 95 °C 1 min 60 °C Für die Datenanalyse der Taqman-basierten real-time PCR wurde die ΔCt (Cycle Treshold, Schwellenwert Zyklus) Methode verwendet. Die mRNA-Expression wurde auf GAPDH normiert und ΔCt gibt die Differenz zwischen unbehandelten und behandelten Zellen an: ΔCt = (Ct(sat-1)unbeh. – Ct(GAPDH)unbeh.) – (Ct(sat-1)be