SALAH ALDIN HAMODEH VVB VVB LAUFERSWEILER VERLAGVVB LAUFERSWEILER VERLAGédition scientifiqueédition scientifique E S A H H M D H L A A O N R U L E S N W R U N O B T Y A T A F E N P X U M Y E T E R C S I K G V U D I U VVB LAUFERSWEILER VERLAG G L E I B E R G E R W E G 4 D - 3 5 4 3 5 W E T T E N B E R G Tel: +49-(0)6406-4413 Fax: -72757 Emai l : vvb - ips@t-on l ine .de w w w . d o k t o r v e r l a g . d e VVB LAUFERSWEILER VERLAGédition scientifique 9 7 8 3 8 9 6 8 7 6 9 3 5 ISBN 3-89687-693-7 INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Mechanismus der Wirkung von Butyrat auf das Membranpotential von kultivierten Neuronen aus dem Plexus myentericus der Ratte ÑeÌ� `Ýu Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzulässig. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch elektronische Systeme. 1. Auflage 2004 All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without the prior written permission of the Author or the Publishers. st1 Edition 2004 © 2004 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Wettenberg Printed in Germany VVB LAUFERSWEILER VERLAG édition scientifique GLEIBERGER WEG 4, D-35435 WETTENBERG Tel: 06406-4413 Fax: 06406-72757 Email: VVB-IPS@T-ONLINE.DE www.doktorverlag.de Aus dem Institut für Veterinär-Physiologie der Justus-Liebig-Universität Giessen Betreuer: Prof. Dr. Martin Diener Mechanismus der Wirkung von Butyrat auf das Membranpotential von kultivierten Neuronen aus dem Plexus myentericus der Ratte Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Giessen Eingereicht von Salah Aldin Hamodeh Tierarzt aus Damaskus (Syrien) Giessen 2004 Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Giessen Dekan: Prof. Dr. Dr.h.c. B. Hoffmann 1. Berichtserstatter: Prof. Dr. M. Diener 2. Berichtserstatter: Prof. Dr. K. Doll Tag der mündlichen Prüfung: 26.08.2004 Inhaltsverzeichnis Seite Abkürzungen 1 I. EINLEITUNG 1. Kurzkettige Fettsäuren im Kolon 2 1.1 Bildung und Resorption 2 1.2 Wirkungen auf den Elektrolyttransport 5 1.3 Wirkungen auf die Motilität 5 2. Bedeutung des enteralen Nervensystems für die Regulation des intestinalen Ionentransportes und der Motität 6 3. Wirkung von kurzkettigen Fettsäuren auf das enterische Nervensystem 10 4. Fragestellung 11 II. MATERIAL UND METHODEN 1. Versuchstiere 13 2. Die Präparation des Plexus myentericus der Ratte 13 3. Die Patch-Clamp-Technik 17 4. Die Lösungen 4.1 Die Zellkultur und Präparationslösungen 20 4.2 Perfusionslösungen bei den Patch-Clamp-Versuchen 20 4.3 Pipettenlösungen 20 4.4 Lösungen für die Fura-2-Messungen 21 5. Der Patch-Clamp Messstand 5.1 Mikroskop 21 5.2 Die optischen Komponenten 22 5.3 Messkammer und Perfusionssystem 23 5.4 Mechanische Abschirmung: Der Messtisch 23 5.5 Elektrische Abschirmung: Der Faraday-Käfig 23 5.6 Der Mikromanipulator 24 5.7 Elektrische Komponenten 25 5.8 Elektroden und Patchpipetten 26 6. Datenerfassung 27 7. Ablauf eines Patch-Clamp-Experimentes 27 8. Berechnungen 30 9. Messung der Intrazellulären Ca2+-Konzentration mit Fura-2 9.1 Struktur von Fura-2 31 9.2 Flureszenzemission von Fura-2 31 9.3 Der Imaging-Messstand 9.3.1 Fluoreszenzmikroskopie und elektronische Komponenten 34 9.3.2 Messkammern und Perfusionssystem 36 9.4 Versuchdurchführung 37 9.5 Datenerfassung 38 10. Chemikalen 39 11.Auswertung 39 III.ERGEBNISSE 1. Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von Butyrat auf das Membran 40 2. Charakterisierung der durch Butyrat stimulierten Kaliumleitfähigkeit 44 3. Intrazelluläre Vermittlung der Wirkung von Butyrat 47 4. Zusammenfassung der Inhibitor-Experimente 52 5. Fura-2-Messungen 5.1 Ryanodinrezeptoren 53 5.2 Einfluss hoher Ryanodinkonzentration 55 5.3 Beeinflussen der Ca-Freisetzung durch Permeabilisation 57 IV. DISKUSSION 63 V. ZUSAMMENFASSUNG 73 VI. SUMMARY 74 VII. LITERATURVERZEICHNIS 75 VIII.DANKSAGUNG 85 IX. EIDESSTATTLICHE VERSICHERUNG 86 Liste der verwendeten Abkürzungen 4-AP 4-Aminopyridin ATP Adenosintriphosphat BSA Bovines Serum Albumin [Ca2+]i intrazelluläre Ca2+-Konzentration CHTX Charybdotoxin CICR Ca2+-induzierte Ca2+-Freisetzung (engl: Ca2+-induced Ca2+-release) DMEM Dulbecco's Modified Eagle`s Medium DMSO Dimethylsulfoxid EGTA Ethylenglycol-bis(2-aminoethyl)-tetraessigsäure ENS Enterales Nervensystem FKS Fetales Kälberserum G-Protein Guaninnucleotid-bindendes Protein HEPES N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N'-(2-ethanolsulfonsäure) IP3 Inositol-1,4,5-trisphosphat KD Dissoziationskonstante Km Michaelis-Menten-Konstante PLC Phospholipase C RyR Ryanodinrezeptor SCFA Short-chain fatty acid (kurzkettige Fettsäure) SEM Standard error of of the mean = Standardfehler des Mittelwertes SERCA Sarcoplasmatische-endoplasmatische-Retikulum Ca2+-ATPase TEA Tetraethylammonium TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan . I. EINLEITUNG 1. Kurzkettige Fettsäuren im Kolon 1.1. Bildung und Resorption Kurzkettige Fettsäuren (englisch: Short Chain Fatty Acid: SCFA) sind schwache Säuren, die aus einer Kette von zwei bis fünf Kohlenstoffatomen bestehen. Sie entstehen haupt- sächlich aus dem bakteriellen Metabolismus von Strukturkohlenhydraten und Proteinen (Engelhardt et al. 1994). Im Kolon kommen die Fettsäurenanionen Azetat, Propionat und Butyrat im Verhältnis 60 : 25 : 15 vor (Bugaut 1987). Obwohl es Unterschiede bezüglich ihrer Rolle als Nährstoff und ihrer Metabolisierung gibt, haben die verschiedenen kurzkettigen Fettsäuren ähnliche Effekte auf Transportvorgänge und Motilität im Dickdarm. Kurzkettige Fettsäuren sind schwache Säuren. Deshalb gibt es ein Gleichgewicht zwischen der jeweiligen Säure (HA) und deren Anion (A-). Bei physiologischen pH- Werten liegen die kurzkettigen Fettsäuren zu 99 % als Anion vor. Im Gegensatz zur undissoziierten Säure, die frei durch die Lipidschicht der Membran diffundieren kann, benötigt das Säureanion einen spezifischen Transporter für die Passage der Zellmembran. In vivo werden die Anionen der kurzkettigen Fettsäuren schnell im Verbund mit Na+-Ionen resorbiert, gleichzeitig wird die Sekretion von Bikarbonat angeregt (Umesaki et al. 1979, Dohgen et al. 1994). In vitro-Untersuchungen zeigen, dass es mehrere unterschiedliche Möglichkeiten der Resorption von kurzkettigen Fettsäuren gibt (Abb. 1). Die Resorption dieser Substanzen erfolgt vor allem transzellulär, die parazelluläre Diffusion tritt im Vergleich dazu in den Hintergrund. 2 Abb. 1: Modell für den Transport kurzkettiger Fettsäuren (SCFA) durch die apikale Membran. Es existieren zwei Möglichkeiten zur Aufnahme von kurzkettigen Fettsäuren in die Darmepithelzelle: ein Anionenaustauscher, der Fettsäureanionen im Austausch gegen HCO3 - in die Zelle einschleust (oben), oder die Aufnahme von nichtdissoziierten kurzkettigen Fettsäuren durch nichtionische Diffusion (unten). Die letztere Form der Resorption ist von der Fähigkeit des Epithels, H+-Ionen zu sezernieren (z.B. über einen Na+/H+-Austauscher (NHE)), abhängig. Bei beiden Formen der Resorption resultiert ein Abfall des intrazellulären pH (pHi). Die erste Form der Resorption kurzkettiger Fettsäuren erfolgt durch nichtionische Diffu- sion, die durch die hohe Lipophilität der ungeladenen, freien Fettsäuren möglich ist. Transporter, die Protonen in das Darmlumen gelangen lassen, regen dementsprechend die Resorption von kurzkettigen Fettsäuren an. Im proximalen Kolon erhöht die Stimula- tion des apikalen Na+/H+-Austauschers (NHE) die Resorption der kurzkettigen Fettsäu- ren (Sellin und DeSoignie 1990). Hemmung des Na+/H+-Austauschers durch Amilorid oder Theophyllin hingegen verursacht eine Abnahme der Resorption kurzkettiger Fettsäuren. Im distalen Kolon besteht die gleiche Wechselbeziehung zwischen Tätigkeit der K+-H+-ATPase und der Aufnahme von kurzkettigen Fettsäuren (Engelhardt 1994). 3 Eine Erhöhung des pH-Wertes direkt oberhalb der Mucosa durch HCO3--Ionen führt zu einer erhöhten Bildung von Fettsäureanionen, da das Gleichgewicht durch Entfernen der Protonen zu Gunsten der Anionen verschoben wird (Sellin 1999). Die Diffusion kurzkettiger Fettsäuren durch die Membran erhöht sich mit Zunahme der Kettenlänge, weil deren Lipidlöslichkeit zunimmt (Sehested et al. 1999, Sellin 1999, Busche et al. 2002). Untersuchungen der apikalen Membran von Dünn- und Dickdarmepithelien zeigten, dass auch Fettsäureanionen durch die apikale Membran transportiert werden können, und zwar durch einen SCFA-/HCO3 --Austauscher (Harig et al. 1991). Dieser Austauscher ist durch hohe Konzentrationen des Stilbens 4,4-Diisothiocyanostilben-2,2- 2,2'-disulfonsäure (DIDS) hemmbar. Dieser Transport lässt sich durch Mercaptopropionat, ein Strukturanalogon der physiologischen Substrate, d.h. der kurz- kettigen Fettsäuren, am distalen Kolon der Ratte hemmen (Stein et al. 1995, Schroder et al. 2000). Der Transport von Fettsäuren ist in zwei Teilschritte untergliedert: die apikale Aufnahme in die Zelle und die basolaterale Abgabe ins Blut. Die weitere Umwandlung von kurzkettigen Fettsäuren, einmal innerhalb der Zelle, ist komplex und nicht näher untersucht. Durch das Gleichgewicht, welches zwischen Lumen und Zelle besteht, kann die intrazelluläre Konzentration von kurzkettigen Fettsäuren bis zu 50 mmol.l-1 betragen (Sellin 1999). Begrenzte apikale Permeabilität und zellulärer Abbau können ohne weiteres diese Konzentration verringern. Ein möglicher basolateraler Transporter für die nachfolgende Ausschleusung von kurz- kettigen Fettsäuren aus der Epithelzelle ist ein SCFA-/HCO- 3–Austauscher ähnlich dem apikalen Anionenaustauscher. Voraussetzung dafür, dass er als SCFA-Exportmecha- nismus arbeitet, ist, dass die intrazelluläre Konzentration an kurzkettigen Fettsäuren höher ist als diejenige im Blut (Reynolds et al. 1993, Tyagi et al. 2002). 4 1.2. Wirkungen auf den Elektrolyttransport Kurzkettige Fettsäuren beeinflussen massiv den Transport anderer Ionen durch die Darmschleimhaut. Obgleich die meisten Studien belegen, dass kurzkettige Fettsäuren den elektroneutralen Transport von NaCl stimulieren, verringern mukosal applizierte kurzkettige Fettsäuren konzentrationsabhängig den Kurzschlussstrom (ein Maß für die Nettoionenbewegung) im Rattenkolon, was zeigt, dass auch elektrogene Transportpro- zesse durch diese Substanzen verändert werden (Diener et al. 1994). Dieser Effekt ist mit einer erhöhten NaCl-Resorption verbunden. Der Mechanismus besteht darin, dass die Aufnahme von Fettsäuren in die Zelle über eine intrazelluläre Ansäuerung (siehe oben) zu einer Stimulation des Na+/H+-Austauschers (NHE) führt, der für die elektroneu- trale Aufnahme von Na+ hauptverantwortlich ist. Die resultierende Zellschwellung führt zu einem Öffnen volumensensitiver basolateraler Cl--Kanäle, wodurch der Cl--Austritt aus der Zelle erleichtert wird (Diener et al. 1994). Außerdem scheint der Metabolismus der kurzkettigen Fettsäuren zu einer vermehrten intrazellulären Produktion von HCO3- zu führen, wodurch es zu einer Stimulation des apikalen Cl-/HCO3--Austauschers kommt, der für die elektroneutrale Aufnahme von Cl- aus dem Darmlumen verantwort- lich ist. Außerdem können kurzkettige Fettsäuren über eine Stimulation von enterischen Neuronen (siehe weiter unten) eine transiente Chloridsekretion am Dickdarm (Yajima 1988) und am Ileum (Diener et al. 1996) der Ratte auslösen. 1.3. Wirkungen auf die Motilität Kurzkettige Fettsäuren können in Abhängigkeit von der untersuchten Spezies und der eingesetzten Konzentration die Darmmotilität stimulieren (Yajima 1985), verringern (Squires et al. 1992) oder unbeeinflusst lassen (Flourie et al. 1989). Kurzkettige Fettsäuren können über verschiedene Mechanismen Einfluss auf die Kolon- motilität nehmen. Zum einen können sie chemosensitive Schleimhautsensoren erregen, die mit enterischen Neuronen oder dem Nervus vagus kommunizieren. Solch ein Modell wurde von Yajima (1985) vorgeschlagen. Die Erregung enterischer Neurone soll dabei für die Stimulation der Motilität durch kurzkettige Fettsäuren, beobachtet beispielsweise am Rattenkolon (Yajima 1985), verantwortlich sein, während die Hemmung der Motilität, die bei Wiederkäuern beobachtet wurde, über einen vago-vagalen Reflex vermittelt wer- 5 den soll. Zweitens können kurzkettige Fettsäuren direkt mit der glatten Muskulatur des Darmes interagieren, wie Cherbut et al. (1996, 1998) an isolierten Muskelstreifen des Ileums der Ratte zeigten. Schließlich können kurzkettige Fettsäuren auch gastrointes- testinale Polypeptide freisetzen, die die Darmmotilität beeinflussen können (Plaisancie et al. 1996). Solche Peptide hemmen zum Beispiel die Magenentleerung und Dünndarmbewegung bei Hunden, Ratten und Menschen. 2. Bedeutung des enteralen Nervensystems für die Regulation des intestinalen Ionentransportes und der Motilität Viele Funktionen des Magen-Darmkanals werden durch autonome Steuerungen geregelt, die unabhängig vom Zentralnervensystem (ZNS) arbeiten. Das Zentrum der Steuerung des Darmes ist das so genannte enterische Nervensystem. Neurone kommen an verschiedenen Orten innerhalb der Darmwand vor. Diese Neurone sind als Plexen organisiert. Dies sind im einzelnen: 1. Der Plexus myentericus, der sich zwischen der Ring- und der Längsschicht der Muscularis Propia befindet (Auerbach 1862). 2. Der Plexus submucosus, der innerhalb des Bindegewebes der Submukosa liegt (Meissner 1857). 3. Der Plexus mucosus, der direkt unterhalb der Epithelzellen in der Lamina propria der Mukosa lokalisiert ist (Drasch 1880). Die Gesamtheit der Neurone in diesen Plexen wird als enterisches Nervensystem (auch „Darmgehirn“ genannt) bezeichnet. Eine modellhafte Darstellung zeigt die folgende Abbildung (Abb. 2). 6 Abb. 2: Lokalisation der verschiedenen Anteile des enteralen Nervensystems (ENS). Die Plexen bestehen aus Ganglien, das sind Gruppen von bis zu 50 Neuronen, die durch Dendriten und Axone miteinander und mit den Neuronen benachbarter Ganglien verbunden sind. In den meisten Teilen des Darms enthält der Plexus mucosus keine Nervenzellsomata, sondern besteht lediglich aus Nervenfasern, die von den Somata der Plexus submucosus Neurone entspringen, welche das Epithel innervieren. In einigen Teilen des Darms jedoch, zum Beispiel dem distalen Kolon der Ratte (Bridges et al. 1986) oder des Menschen (Langmann 1975), kann man auch Ganglien in der Mukosa mit einer speziellen Funktion (Hemmung der NaCl-Resorption) finden. Die Zahl der Neurone innerhalb des Darms ist sehr hoch. Bei mittelgroßen Säugetieren, wie dem Mensch oder dem Schwein, wird die Gesamtzahl der einzelnen Nervenzellen innerhalb der Wand des Magen-Darm-Trakts auf 50 bis 100 Millionen geschätzt, das ist in etwa genauso viel wie die Anzahl der Neurone im Rückenmark. Die enterischen Neurone sind für die Steuerung vieler Magen-Darm-Funktionen verant- wortlich. Zum Beispiel vermittelt der Plexus myentericus den peristaltischen Reflex, der für die Weiterleitung des Darminhalts verantwortlich ist. Andere Funktionen, die durch das enterale Nervensystem kontrolliert werden, sind die Steuerung der Durchblutung der Mukosa oder die Steuerung des Ionentransportes durch das Darmepithel (Surprenant 1994, Wood 1994). 7 Histochemische Untersuchungen, die in den letzten drei Jahrzehnten durchgeführt wurden, zeigten, dass praktisch alle Neurotransmitter, die im Gehirn vorhanden sind, auch im enterischen Nervensystem gefunden werden können (Furness und Costa 1987). Die Abbildung 3 gibt einen Überblick der verschiedenen Transmitter im enterischen Nervensystem: Die klassischen Neurotransmitter wie Acetylcholin oder die Katecholamine Noradrenalin und Dopamin kommen im Darmnervensystem ebenso vor wie die Neuropeptide Bombesin, Cholezystokinin, Neuropeptid Y, Somatostatin, Substanz P oder das Vasoaktive Intestinale Peptid. Auch andere Substanzen wie ATP, NO oder Serotonin dienen hier als neuronale Überträgersubstanzen. Abb. 3: Überblick der verschiedenen Transmitter im enteralen Nernensystem. Auf Grund ihrer elektrophysiologischen Eigenschaften können enterische Neurone in verschiedene Gruppen unterteilt werden. Wird ein Einwärtsstrom in Neurone injiziert und diese dadurch überschwellig erregt, so werden Aktionspotentiale mit unterschiedli- cher Charakteristik ausgelöst. Einige Neurone antworten mit einer Salve von Aktionspo- tentialen (S-Neurone), während andere ein Aktionspotential mit einem hyperpolarisierten Nachpotential generieren (AH-Neurone) (Nishi und North 1973, Hirst et al. 1974). Physiologischerweise können Aktionspotentiale an den S-Neuronen durch Erregung der benachbarten Neurone erzeugt werden. Folglich müssen diese Zellen einen synaptischen Eingang besitzen, daher die Bezeichnung S-Neurone. Das Aktionspotential in den S-Neuronen wird durch schnelle spannungsabhängige Na+- 8 Transmitter im enterischen Nervensystem: Klassische Transmitter: Acetylcholin, Noradrenalin, Dopamin Neuropeptide: Bombesin, Cholezystokinin, Neuropeptid Y (NPY), Somatostatin, Substanz P, Vasoaktives Intestinales Peptid (VIP)... Andere: ATP, NO, Serotonin (5-HT) Kanäle, die durch den neuronalen Giftstoff des Kugelfischs (Tetrodotoxin) blockiert wer- den, getragen. AH-Neurone hingegen haben ihren Namen von der mehrere Sekunden andauernden Nachhyperpolarisation, die jedem Aktionspotential an diesen Zellen folgt (AH steht für afterhyperpolarization). Diese Neurone erzeugen Aktionspotentiale nicht über Na+-Kanäle, sondern verwenden eine phylogenetisch sehr alte Art der Form der Erregungsbildung, die beispielsweise auch im denervierten Muskel gefunden wird, näm- lich durch einen Einstrom von Ca2+, der sich durch Tetrodotoxin nicht beeinflussen lässt (Wood 1994). Die S-Neurone haben häufig eine Morphologie, die dem Typ I der Neurone ähnlich ist, die durch Dogiel Ende des 19. Jahrhunderts beschrieben wurde (Dogiel 1899) mit aus- gedehnten Dendriten und einem langen Axon. Demgegenüber ähneln AH-Neurone dem Typ II in der Dogiel-Nomenklatur mit mehreren langen Dendriten (Hodgkiss und Lees 1983). Vermutlich haben diese AH-Neurone sensorische Funktionen in der Darmwand. Abb. 4: Differenzierung der enterischen Neurone in S-Neurone (Typ I) und AH-Neurone (Typ II). Die Aktionspotentiale der S-Neurone sind vom Einstrom von Na+-Ionen abhängig, welcher sich durch Tetrodotoxin blockieren lässt. Die Aktionspotentiale der AH-Neurone sind dagegen Na+-unabhängig und zeigen eine lang andauernde Nachhyperpolarisation (Wood 1994). 9 3. Wirkung von kurzkettigen Fettsäuren auf das enterische Nervensystem Kurzkettige Fettsäuren haben direkte Effekte auf das Membranpotential und die diesem zugrunde liegenden Ionenströme an enterischen Neuronen. Am Meerschweinchenileum ist gezeigt worden, dass das Aufbringen der kurzkettigen Fettsäure Azetat auf die Schleimhautoberfläche Aktionspotentiale an den Neuronen des Plexus myentericus induziert (Bertrand et al. 1997). Diese Erregungsphase ist nur transient; ihr folgt eine langandauernde Hyperpolarisation, d.h. eine Hemmung der Erregbarkeit (Neunlist et al. 1999). Dieser zweite Effekt wurde von Haschke et al. (2002) an dissoziierten Plexus myenteri- cus Neuronen der Ratte in Zellkultur näher charakterisiert. Zu diesem Zweck wurden myenterische Plexen von neugeborenen Ratten durch enzymatische Behandlung mit Kollagenase und mechanische Dissoziation in Einzelzellen zerlegt und mit Hilfe der Whole-Cell Patch-Clamp Technik (siehe Material und Methoden) untersucht. An diesen Zellen führte die Zugabe von Natriumbutyrat zu einer Hyperpolarisation der Membran um circa 10 mV. Dieser Effekt ließ sich durch einen intrazellulär applizierten K+ Kanalblocker, das Cs+, hemmen, geht also auf das Öffnen von K+-Kanälen zurück. Cäsium ist ein unspezifischer K+-Kanalblocker. Eine genauere Bestimmung des durch kurzkettige Fettsäuren stimulierten K+-Kanals konnte nicht erfolgen, da die weiter ver- wendeten K+-Kanal-Blocker (4-Aminopyridin, Tetraethylammonium, Ba2+) keine Effekte auf die Hyperpolarisation der Neurone zeigten (Haschke et al. 2002). Außerdem war eine leichte Hemmung des dem Aktionspotential zugrunde liegenden spannungsabhän- gigen Na+-Einwärtsstrom zu beobachten, der sich auf die Ansäuerung des Zytosols (siehe oben) nach Aufnahme der kurzkettigen Fettsäure in die Zelle zurückführen ließ. Die Aktivierung dieser K+-Leitfähigkeit war mit einem Anstieg der intrazellulären Ca2+- Konzentration verbunden, der sich messen ließ, wenn die Neurone mit einem Ca2+-sen- sitiven Fluoreszenzfarbstoff, dem Fura-2, aufgeladen wurden (Haschke et al. 2002). Dieser Anstieg war völlig unabhängig von der Anwesenheit von extrazellulärem Ca2+. Wurden hingegen intrazelluläre Ca2+ -Speicher durch Zugabe eines Blockers von SERCA-ATPase (SERCA = sarcoplasmatic endoplasmatic calcium ATPase), dem 10 Thapsigargin, entleert, war die Wirkung des Butyrats stark abgeschwächt, was zeigt, dass Butyrat eine Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Speichern enterischer Neu- rone hervorruft. Der Mechanismus, der diesem Effekt zugrunde liegt, ist völlig unbekannt. Diese Beobachtungen, die die Grundlage für die von mir durchgeführten Experimente bilden, führten zu der Vermutung, dass die Ca2+-Freisetzung zu einer Stimulation von Ca2+-abhängigen K+-Kanälen an der Zellmembran führt. 4. Fragestellung Ziel meiner Arbeit ist es, zum Verständnis der Wirkungsweise von kurzkettigen Fettsäu- ren, die aus pflanzlichen Faserstoffen in großen Mengen beim Menschen und bei Tieren insbesondere im Dickdarm produziert werden, auf das enterale Nervensystem am Modell des Plexus myentericus in Kultur mit Hilfe von elektrophysiologischen Methoden (Whole-Cell Patch-Clamp Ableitungen) und zellbiologischen Methoden (Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration mit dem Fluoreszenzfarbstoff Fura-2) näher zu charakterisieren. Wie oben geschildert, scheint Butyrat eine Freisetzung von intrazellulär gespeichertem Ca2+ auszulösen und darüber die Membraneigenschaften der Neurone zu verändern. Prinzipiell kommen dazu mehrere Wege in Betracht. Eine Möglichkeit, intrazelluläre Ca2+-Speicher zu entleeren, besteht in der Stimulation der Bildung des second messengers Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) durch das Enzym Phospholipase C. IP3 sti- muliert spezifische IP3-Rezeptoren auf intrazellulären Speichern, die als Ca2+-Freiset- zungskanäle fungieren (Bultynck et al. 2003). Andererseits kann eine Freisetzung von intrazellulär gespeichertem Ca2+ auch über so genannte Ryanodinrezeptoren erfolgen, die für das Phänomen der Ca2+-induzierten Ca2+-Freisetzung verantwortlich sind (Franzini-Amstrong und Protasi 1997). Diese Fragestellung ist insofern von Bedeutung, als vor kurzem gezeigt wurde, dass bestimmte G-Protein/Phospholipase C-gekoppelte Rezeptoren, nämlich GPR41 or GPR43, deren Funktion bisher völlig unbekannt war, durch kurzkettige Fettsäuren stimuliert werden (Brown et al. 2003, Le Poul et al. 2003). 11 Insgesamt sollten folgende Fragen beantwortet werden: 1. Welche Konzentrationsabhängigkeit hat die Wirkung von Butyrat auf das Membranpotential myenterischer Neurone ? 2. Welche Eigenschaften haben die durch Butyrat stimulierten K+-Kanäle ? 3. Welche Rezeptoren auf den intrazellulären Ca2+-Speichern werden durch Butyrat stimuliert und welche Signalwege sind daran beteiligt ? 12 II. MATERIAL UND METHODEN 1. Versuchstiere Alle Versuchstiere stammten aus dem Institut für Veterinär-Physiologie der Justus- Liebig-Universität Gießen. Es handelte sich um neugeborene Wistar-Ratten beiderlei Geschlechts. Futter und Wasser stand den Muttertieren ad libitum zur Verfügung. Die Haltung erfolgte in klimatisierten Räumen in zwölf-Stunden-hell und zwölf-Stunden- dunkel Zyklen. 2. Die Präparation des Plexus myentericus der Ratte Für die Präparation des Plexus myentericus wurden junge Ratten im Alter von 4 bis 10 Tagen verwandt. Bei älteren Tieren ist die Isolierung des Plexus myentericus sehr schwierig. Die Tiere wurden durch cervikale Dislokation und anschließendes Entbluten getötet. Danach wurde der Körper mit der ventralen Seite nach oben auf einem Präpa- rationsbrett mit Nadeln, die durch die Pfoten geführt wurden, fixiert. Der Abdominal- raum wurde durch einen Bauchschnitt eröffnet und die Bauchdecke mit Präparierna- deln befestigt. Die dann folgende Präparation wurde unter einer Stereolupe (Olympus SZX9) bei mittlerer Vergrößerung durchgeführt. Zuerst wurde das Kolon vom Ende des Rektums abgetrennt und durch vorsichtiges Abpräparieren von Fett- und Bindegewebe sowie von Blutgefäßen soweit als möglich gesäubert. Ebenso wurde mit dem Ileum ver- fahren. Nachdem alle anhaftenden Gewebe entfernt wurden, konnte der gesamte Darm aus der Bauchhöhle entfernt werden. Das Kolon wurde zur Gewinnung des Plexus myentericus nicht verwandt. Der Dünndarm wurde nun vorsichtig mit einer feinen Uhrmacherpinzette (Dumont Nr. 5) fixiert und mit der anderen feinen Pinzette wurde versucht, die Serosa und die Lamina muscularis mit dem Auerbachschen Plexus (Plexus myentericus) von der Submukosa zu lösen. Einen schematischen Aufau der Darmwand zeigt Abb. 5. 13 Abb. 5: Aufbau der Darmwand im Längs- und Querschnitt (schematisch). 1 Plicae circulares, 2 Lamina epithelialis mucosae, 3 Lamina propria mucosae, 4 Lamina muscularis mucosae, 5 Plexus submucosus, 6 Tela submucosa, 7 Stratum circulare, 8 Plexus myentericus, 9 Stratum longitudinale (verändert nach: Ottenjann R, Hammersen F, Bräuer H: Exempla gastroenterologica, Medical Service, München 1990). Der so erhaltene Längsmuskelschlauch mit dem Plexus myentericus wurde in einem Nährmedium (DMEM = Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium, s. Lösungen) zwischengelagert. Die einzelnen Plexenteile wurden dann in Eppendorfgefäßen jeweils für ca. 2 h bei 37°C in einer Kollagenase-Lösung (s. Lösungen) inkubiert. Anschließend wurde der Inhalt der Eppendorfgefäße für ca. 30 s mit einem Vortex-Schüttler resuspendiert und in einer Petrischale unter der Stereolupe untersucht. Bei genügend langer Einwirkung der Kollagenase (2 - 4 maliges Wiederholen der Inkubation), lösten sich die Längsmuskelfasern vom Plexus myentericus ab, wodurch die Netzstruktur des Auerbach Plexus sichtbar wurde. Die so erhaltenen Neuronennetze wurden in einem 14 mit Medium (HEPES-gepuffertes DMEM) gefüllten Kunststoffschälchen auf Eis gesammelt. Danach wurden isolierte Stücke des Plexus myentericus (siehe Abb. 6) mit einer 200 µl Pipette aufgesammelt. Abb. 6: Lichtmikroskopisches Bild eines frisch isolierten Plexus myentericus nach der enzymatischen Behandlung mit Kollagenase, bei dem die einzelnen Nervenzellen noch im Verband der Ganglien liegen (Stückchenkultur). Alle Nervennetze kamen danach in ein steriles Eppendorfgefäß und wurden 10 min bei ca. 600 Umdrehungen min-1 zentrifugiert. Der Überstand aus dem Eppendorfgefäß wurde unter der Stereolupe auf eventuell enthaltene Neuronennetze untersucht. Je nach Anzahl der Netze wurden ein oder zwei Kulturplatten (Abb. 7) mit je vier Einsätzen vorbereitet. 15 Abb. 7: Foto einer Kulturplatte zum Aussäen von Neuronen des Plexus myentericus. 1: Eigentliche Kulturschale zur Aufnahme von mit Poly-Lysin beschichteten Glasplättchen. 2: Reservoir für steriles Aqua bidest. zum Schutz vor dem Austrocknen der Neurone. In je einen Einsatz wurde ein mit Polylysin beschichtetes Glasplättchen gelegt und der Raum zwischen den Einsätzen mit 3 ml sterilem Aqua bidest. beschickt. Für jeden Ein- satz wurden 100 µl Start V-Zellkulturmedium (neuronspezifisches Medium, s. Lösun- gen) zu den Neuronen gegeben. Nach dem Aussäen der Neurone wurde die Kultur- platte für ca. 45 - 60 min in den Wärmeschrank gestellt, um den Nervenzellen ein An- heften zu ermöglichen. Nach diesem Schritt wurden unter der Lamina jeweils weitere 400 µl Start V zu den Einsätzen mit den Zellen gegeben. Zur eindeutigen Identifizie- rung wurden die Deckel der Kulturplatten mit den Daten der Präparation (Datum, Alter der Ratte, Gewebeart) versehen. Nach drei Tagen im Inkubator wurden die Zellen zum ersten Mal mit frischem DMEM gefüttert. Weitere Fütterungen folgten im Abstand von jeweils zwei Tagen. Die Zellen konnten frühestens drei Tage nach Aussäen für die Patch-Clamp Ableitungen verwandt werden. Polylysin-Beschichtung Damit die Neurone sich auf Glas festheften konnten, mussten Glasplättchen (13 mm Durchmesser und 0,4 mm Dicke) mit Poly-L-Lysin beschichtet werden. Dazu wurden sie für mindestens 2 h in 70-%igen Alkohol gelegt. Danach wurden die Plättchen mit destilliertem Wasser viermal gespült. Polylysin (Biochrom KG, Berlin) wurde im Verhältnis 1 : 5 mit destilliertem Wasser verdünnt. In diese Lösung wurden die 16 Plättchen gelegt und für mindestens 2 h auf einem Schüttler in Bewegung gehalten. Zum Trocknen kamen die runden Glasplättchen in eine große Petrischale, dessen Boden mit sterilem Filterpapier bedeckt war. 3. Die Patch-Clamp-Technik Einzelkanalmessungen mit der so genannten “Membranfleckklemme” (Patch-Clamp) beschrieben Neher und Sakmann erstmals 1976. Ihre Methode wurde im Laufe der Zeit weiterentwickelt und die Auflösung wesentlich verbessert (Hamill et al. 1981). Die Methode basiert auf dem Prinzip der Spannungsklemme (Voltage-Clamp), die seit fast 50 Jahren bekannt ist (Marmont 1949, Cole 1949). Hodkin und Huxley (1952 a,b,c), teilweise in Zusammenarbeit mit Katz (Hodkin et al. 1949, 1952), führten damit elektrophysiologische Untersuchungen am Riesenaxon des Tintenfischs durch und konnten zum ersten Mal Natrium- und Kaliumströme getrennt voneinander darstellen. Um Einzelkanäle zu messen, muss das Hintergrundrauschen so gering wie möglich sein. Diese Low-noise Ableitung wird durch eine stabile Verbindung der Pipette mit der Plasmamembran ermöglicht (Tight seal). Voraussetzung dafür sind Zellen mit absolut sauberer Oberfläche sowie eine staubfreie und glatt polierte Pipettenspitze. Entschei- dend ist schließlich ein leichter Sog während der Ausbildung des Seals. Die Membran legt sich dabei Omega-förmig an die Glaspipette an und der Seal-Widerstand steigt sprunghaft auf mehrere Giga-Ohm an. Der Abstand zwischen Membran und Pipetten- wand verringert sich dabei auf etwa 1 Å (10-10 m). Durch dieses Gigaseal wird der Membranfleck elektrisch isoliert, so dass die Ströme durch die Membran in die Pipette und von dort zum Strommesskreis fließen. Da das Signalrauschen (Johnson Noise) umgekehrt proportional zum Widerstand ist, stellt der Seal-Widerstand die kritische Größe für das Hintergrundrauschen dar. In der Patch-Clamp Technik bieten sich vier verschiedene Konfigurationen an, mit denen elektrophysiologische Ableitungen möglich sind (Abb. 8). Sofort nach Bildung des Gigaohmseals durch Anlegen eines leichten Unterdruckes an die Pipette befindet man sich in der Cell-attached Konfiguration. Der elektrisch isolierte Membranfleck befindet sich weiterhin in der Zellmembran, intrazellulär bleiben second-messenger Systeme und die Ionenkonzentrationen unbeeinflusst. Außerdem bleibt über dem Großteil der Zytoplasmamembran das Ruhepotential unbeeinflusst, nur der elektrisch isolierte Bezirk wird von außen kontrolliert. Zieht man die Pipette aus der Cell-attached 17 Konfiguration langsam zurück, ist es aufgrund der mechanischen Stabilität des Giga- ohmseal möglich, den isolierten Membranabschnitt aus der Zellmembran herauszulö- sen. Man erhält also einen zellfreien Membranfleck, dessen zytoplasmatische Seite der Badlösung zugekehrt ist. Diese Konfiguration wird als Inside-out Patch bezeichnet. Es ist möglich, dass sich beim Herausreißen des Membranfleckes aus der Zellmembran zunächst ein Vesikel bildet, welchen man durch kurzes Herausheben der Pipettenspitze aus der Badlösung zum Platzen bringt, um einen so genannten Inside- out patch zu erhalten. Durchbricht man hingegen nach Etablierung der Cell-attached Konfiguration durch Erhöhung des Unterdruckes in der Pipette oder durch einen kurzen Stromimpuls die Zellmembran, gelangt man in die Whole-cell Konfiguration, die in dieser Arbeit von mir genutzt wurde. In diesem Messmodus kann das Membranpotential (V) und der Stromfluss (I) über der gesamten Membran der Zelle gemessen werden. Die elektrischen Eigenschaften der Zellmembran können durch Anlegen einer Spannungsklemme (Voltage-Clamp) oder durch Applikation von Strom (Current-Clamp) verändert werden. Diese Technik ist besonders für die basale Charakterisierung von elektrischen Membraneigenschaften geeignet. Da in der Whole- cell Konfiguration das Rauschen deutlich höher ist als in den Konfigurationen, die einen kleinen Membranfleck elektrisch isolieren, sind Einzelkanalregistrierung nahezu unmöglich. Die vierte Möglichkeit mit der Patch-Clamp-Technik Messungen von Strömen durch Ionenkanäle durchzuführen, besteht in der Outside-out Konfiguration. Einen Patch in dieser Anordnung erhält man, wenn die Pipette nach Bildung der Whole-cell Konfiguration vorsichtig von der Zelle zurückgezogen wird. Wie in der Inside-out Konfiguration erhält man auch hier einen zellfreien elektrisch isolierten Membranfleck, der die Registrierung von Einzelkanalaktivitäten ermöglicht. Allerdings ist die Außenseite der Zellmembran dem Bad und die Innenseite der Pipettenlösung zugewandt. 18 Abb. 8: Schema der verschiedenen Patch-Clamp Konfigurationen. Nach dem Aufsetzen der Patch-Pipette auf die Zellmembran kann man folgende Messanordnung erhalten: a) Cell-attached, b) Whole-Cell, c) Inside-out, d) Outside-out (aus: Numberger & Draguhn: Patch-Clamp- Technik; Spektrum, Akad. Verl., 1996, leicht verändert). Kleine Ströme werden als Spannungsabfall an einem Widerstand gemessen. Die Schwierigkeit dabei ist, das Pipettenpotential auf dem vorgegebenen Wert zu halten, da der Spannungsfehler mit Zunahme des Widerstands ansteigt. Die Lösung für dieses Problem bringt ein Operationsverstärker, der direkt das Pipettenpotential misst, mit dem eingestellten Sollwert vergleicht und die Spannungsdifferenz durch Stromzufuhr ausgleicht. Dadurch wird das Membranpotential konstant gehalten (Voltage-Clamp). Der zugeführte Strom lässt sich über einen Differentialverstärker messen und darstellen. Dieser Klemmstrom repräsentiert die Leitfähigkeitsänderung der Membran, die durch das Öffnen und Schließen von Ionenkanälen hervorgerufen werden. 19 4 Die Lösungen 4.1 Die Zellkultur und Präparationslösungen Die Darmisolation bei den neugeborenen Ratten erfolgte in N-(2-Hydroxyethyl)- piperazin-N-(2-ethanolsulfonsäure) (HEPES, 25 mmol· l-1) gepuffertem Dulbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM; Sigma, Deisenhofen, Deutschland) mit den Antibiotika Gentamycin (40 µg· ml-1) und Metronidazol (50 µg· ml-1). Die Lamina muscularis wurde in dem vorher beschriebenen Medium mit Zusatz von Kollagenase Typ II (1mg· ml-1, 255 units· mg-1) inkubiert. Die aufgetrennten Neurone wurden für ein bis vier Tage in Medium (Start-V; Biochrom, Berlin, Deutschland) mit und ohne fetalem Kälberserum (FKS, 10 Vol %) unter Zusatz von Antibiotika Pencillin/Streptomycin (Life Technologies, Eggenstein, Deutschland; Penicillin: 10000 units· ml-1, Streptomycin 10000 µg· ml-1 in autoklaviertem destillierten Wasser) inkubiert. 4.2 Perfusionslösungen bei den Patch-Clamp-Versuchen Als Standardbadlösung wurde bei den Patch-Clamp und den Fura-2-Messungen eine HEPES-gepufferte Tyrode-Lösung verwandt. Die Zusammensetzung der Standardtyrode ist (in mmol· l-1): NaCl 140, KCl 5,4; HEPES 10, Glucose 12,2, CaCl2 1,25, MgCl2 1. Perfusionslösungen mit Butyrat enthielten (in mmol· l-1):Na-Butyrat 50, NaCl 85, KCl 5,4, HEPES 10, Glucose 5, CaCl2 1,25, MgCl2 1. Für die Konzentrations-Wirkungskurven-Versuche wurde ein Teil des NaCl in der Tyrode-Lösung äquimolar durch Na-Butyrat ersetzt. Der pH-Wert aller Lösungen wurde mit NaOH/HCl auf 7,4 eingestellt. 4.3 Pipettenlösungen Bei Patch-Clamp-Ableitungen im Whole-cell-Modus wird durch die Wahl der Pipettenlö- sung die Zusammensetzung der intrazellulären Flüssigkeit vorgegeben, denn es erfolgt ein rascher Austausch zwischen Zellinnerem und Pipettenlösung. Die Standard Pipettenlösung für die Patch-Clamp-Messung enthielt in (mmol· l-1): Kaliumgluconat (KGluc) 100, KCl 30, NaCl 10, Ethylenglycol-bis(2-aminoethyl)-tetraessigsäure (EGTA) 0,1, Tris(hydroxymethyl)-aminomethan (TRIS) 10, Adenosintriphosphat (ATP) 1, MgCl2 2. Die Lösung wurde mit Tris/HCl auf einen pH-Wert von 7,2 eingestellt. 20 4.4 Lösungen für die Fura-2-Messungen Fura-2-acetoxymethylester (Molecular Probes, Leiden, Niederlande) wurde als 1 mmol· l-1 Stammlösung in Dimethylsulfoxid (DMSO) angesetzt und bei -20°C aufbewahrt. Pluronic® F-127 (BASF, Weyandotte, USA), ein Detergenz zur Unter- stützung der Löslichkeit des Fluoreszenzfarbstoffes, wurde als 20 % (Gew/Vol)-ige Lösung in DMSO (maximale Endkonzentration 2,5 ml· l-1) gelöst. Die Nervenzellen wurden mit 2,5 ·10 -6 mol· l-1 Fura-2 und 0,05 % (Gew/Vol) Pluronic® für eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend wurden die Neurone mit der Standard-Tyrode-Lösung gespült, um den überschüssigen, nicht in die Zellen aufgenommenen Farbstoff zu entfernen. Danach wurden die aufgeladenen Neurone bis zur Messung unter Lichtschutz aufbewahrt. Die Standard-Perfusionlösung war NaCl-Tyrode (siehe oben). In den Versuchen mit den Saponin-permeabilisierten Neuronen wurde eine intrazellulärartige Lösung als Superfusionsmedium verwendet. Diese Lösung enthielt (in mmol· l-1): KGluc 100, KCl 30, NaCl 10, EGTA 0,1, Tris 10, ATP 1, MgCl2 2. Weiterhin enthielt die Lösung Phosphocreatin (10 mmol· I-1) als ATP-Regenerations- system und Creatin-Phsphokinase (3000 U· I-1) sowie Saponin (10 mg· l-1). Der pH- Wert wurde mit Tris/HCl auf 7,2 eingestellt. 5. Der Patch-Clamp-Messstand 5.1 Mikroskop Bei dem verwendeten Mikroskop handelt es sich um ein inverses Mikroskop (IX-70 Olympus, Tokyo, Japan; Abb. 9). Ein ausreichender Abstand von Lichtquelle und Kon- densor zur Messkammer ermöglicht genügend Platz für Perfusion, Messpipette, Elek- troden und ähnliches. Bei einem Patch-Clamp-Experiment ist ein kontrolliertes Aufset- zen der Glaspipette auf die Zelloberfläche wichtig. Um eine dreidimensionale Darstel- lung der Neurone zu erhalten, wurde eine so genannte Normarski-Optik eingesetzt. Bei diesem kontrastverstärkenden Verfahren, einem differentiellen Interferenzkontrast (Übersicht bei Gerlach 1985), wird optisch eine dünner Schnitt durch das Untersu- chungsobjekt gelegt, so dass Strukturen über und unter der Betrachtungsebene weni- ger stören. Durch abwechselndes Fokusieren auf Pipettenspitze und Zelle kann man sich gut orientieren und erfolgreich die Pipette an die Zelloberfläche führen. 21 Abb. 9: Inverses Mikroskop vom Typ Olympus IX-70 mit seinen Komponenten. Die angekoppelte CCD-Kamera wird vom Fuß des Mikroskops verdeckt. 5.2 Die optischen Komponenten Um das Patch-Präparat auf Dauer beobachten zu können, wurde das Bild vom Mikro- skop gleichzeitig mit einer CCD-Videokamera (Soligor C-480, Soligor GmbH, Leinfelden, Deutschland) aufgenommen und auf einem Farbmonitor dargestellt. Im vor- liegenden Fall konnte das Objektiv entfallen, da die Kamera direkt am Mikroskopfuß befestigt wurde. Mit dieser zusätzlichen optischen Darstellung wurden Erschütterun- gen, die durch Bedienen des Mikroskops entstehen können, vermieden. Gleichzeitig konnte so die Lage der Pipette bzw. Zelle beobachtet und ein Wegdriften der Zelle bzw. der Pipette erkannt werden. 22 5.3 Messkammer und Perfusionssystem Eine spezielle Messkammer wurde auf einem modifizierten Objekttisch des Mikroskops eingesetzt, der in X- und Y-Richtung bewegt werden konnte. Die Messkammer, herge- stellt aus Plexiglas und ähnlich einem Objektträger aus Glas, zeigte in ihrer Mitte eine runde Vertiefung (Durchmesser 15 mm) für die Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläs- chen (Durchmesser 13 mm, Stärke 0,16 - 0,19 mm, Plannet, Wetzlar, Deutschland). Das Volumen der Vertiefung betrug 0,6 ml. Die Gefäße mit den Perfusionslösungen waren etwa 60 cm oberhalb der Versuchsanordnung angebracht und mit dieser über Infusionsbestecke (LDKS Oversan Industria Biomedica, Mailand, Italien) verbunden. Diese endeten in einem Verteiler, der in die Messkammer mündete. Der Zulauf in die Messkammer erfolgte kontinuierlich mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 ml· min- 1. Um ein konstantes Volumen von 0,6 ml in der Kammer zu erhalten, wurde auf der dem Zulauf gegenüber liegenden Seite der Messkammer ein Absaugstutzen einer unter dem Tisch stehenden Saugpumpe installiert. Alle Versuche wurden bei Raumtemperatur durchgeführt. 5.4 Mechanische Abschirmung: Der Messtisch Beim Patchen sind auch die geringsten Erschütterungen mit ein Grund für den Abbruch eines geplanten Experiments. Daher musste auf eine ausreichende mechanische Dämpfung geachtet werden. Hierfür eignen sich besonders gut schwere Stein- oder Metallplatten, die über Luft-gefüllte Gummischläuche auf einem Untertisch ruhen. 5.5 Elektrische Abschirmung: Der Faraday-Käfig Da beim Patchen sehr kleine Ströme gemessen werden sollen, stören elektrische und magnetische Einstreuungen aus dem Niederspannungsnetz (50 bzw. 162/3 Hz) stark. Hier konnte eine Abschirmung mit Eisenblechen Abhilfe bringen. Die elektrischen Ge- räte wie Computer, Monitor, Verstärker etc. wurden außerhalb des Faraday-Käfigs plat- ziert und an einen gemeinsamen Massepunkt angeschlossen, um unnötige Einstreuun- gen von Störspannungen zu vermeiden. Die Lichtversorgung des Mikroskops geschah mit Gleichspannung. Alle elektrischen Verbindungen zum Verstärker, Oszilloskop etc. bestanden aus abgeschirmten BNC-Kabeln; die Geräte selbst waren mit ihren Metallgehäusen am Faraday-Käfig angeschlossen. 23 5.6 Der Mikromanipulator Der hydrauliche Mikromanipolatur (MHV-103; Narishige International, London, England) erlaubte Bewegungen in alle Raumrichtungen, um die Patch-Pipette an die Zellen heranführen zu können. Die Patchpipetten wurden in einen Pipettenhalter einge- setzt (siehe Abb. 10), der direkt am Vorverstärker befestigt war. Durch eine Schlauch- verbindung des Pipettenhalters konnte ein Unter- oder Überdruck angelegt werden. Ein Überdruck wurde beim Eintauchen der Pipette in der Badlösung appliziert, um eine Verschmutzung der Pipettenöffnung zu vermeiden. Ein Unterdruck wurde erzeugt, um ein Seal herzustellen. Die elektrische Verbindung zwischen der Pipette und dem Vorverstärker erfolgte über einen Silber/ Silberchlorid-Draht (Abb. 10). Abb 10: Skizze der Pipettenhalterung im Querschnitt: Es bedeuten: 1 elektrischer Anschluss, 2 obere Dichtung, 3 Unterdruck-Anschluss, 4 Silberdraht, 5 Untere Dichtung,6 Arretierung der Patchpipette, 7 Patchpipette. Die Hydraulik des Mikromanipulators (Abb. 11) hatte den Vorteil, dass die Einstellung am Stellrad ohne Verzögerung in eine eindimensionale Bewegung umgesetzt wurde und der Einstellradius mit 10 mm größer war als bei Mikromanipulatoren mit elektrischem Antrieb. Der Manipulator war auf einem drehbaren Halter montiert, so dass eine gewechselte Patch-Pipette wieder umgehend in die gewünschte Ausgangsposition geschwenkt werden konnte, da die Position der Pipette auf den Drehtisch durch Stellschrauben fest vorgegeben war. 24 Abb. 11: Der gesamte Mikromanipulator besteht aus der Hydraulik- einheit mit den drei Raumachsen (x-y-z) und der Getriebe-Einheit. Wird am Stellrad die x-Komponente verändert, erfährt die Getriebeeinheit die gleiche Änderung der Raumachse. 5.7 Elektronische Komponenten Die Messung der Membranströme und des Membranpotentials erfolgte mit einem Patch-Clamp-Verstärker (RK 400; Biologic Science Instruments, Claix, Frankreich). Auf dem Mikromanipulator wurde ein Vorverstärker (HK409; Biologic Science Instruments, Claix, Frankreich) mit einem Pipettenhalter befestigt. Dieser Vorverstärker misst den Strom, der durch die Membran unter der Pipette fließt, wandelt ihn in eine Spannung um, verstärkt das Signal und schickt es in das Hauptgerät (siehe Abb.12). Das verstärkte Signal wurde in den Patch-Clamp-Verstärker übertragen, nochmals verstärkt und gefiltert (3 kHz Low-Pass Filter). Der Verstärker kann mit Hilfe von einem speziellen Programm (CED Patch und Voltage Clamp Software; Cambridge Electronics Design, Cambridge, England) gesteuert werden. Zur Verbindung zwischen dem Verstärker und dem Computer diente ein DA/AD-Wandler (CED 1401; Cambridge Electronics Design Cambridge, England). Dieser Wandler wandelt digitale Signale in analoge um und umgekehrt. Bei der Seal-Bildung und dem Aufbrechen der Zellmembran zum Erstellen des Whole- cell-Modus war ein Oszilloskop (HM-205-3; Hameg Instruments, Frankfurt, Deutschland) an den Verstärker angeschlossen. 25 Abb 12: Schaltbild eines Patch-Clamp-Verstärkers 5.8 Elektroden und Patchpipetten Die Elektroden sind die Badreferenz- und Messelektrode (Pipettenelektrode). Die Refe- renzelektrode wurde über eine Agarbrücke (3 mol· l-1 KCl in 3 % (Gew./Vol.) Agar) in die Badlösung eingetaucht. Die Pipettenelektrode verband den Vorverstärker mit der Pipettenlösung und befand sich in einer Glaspipette, die vorher mit einer Standard- Pipettenlösung gefüllt wurde. Sie wurde mit dem Vorverstärker über den Pipettenhalter verbunden. Die beiden Elektroden wurden aus einem Silber/Silberchlorid-Draht herge- stellt. Um eine Beschädigung der Silberchloridschicht der Messelektrode und des Dich- tungsgummis im Pipettenhalter beim Einsetzen der Pipette in den Pipettenhalter zu vermeiden, wurde das hintere Ende der Pipette mit einem Bunsenbrenner rundge- schmolzen. Die verwendeten Glaspipetten wurden aus Borosilikatglaskapillaren (Jencons Scientific, Bedfordshire, England) hergestellt. Die Glaspipetten wurden mit Hilfe eines Vertikalpullers (Typ PC 95, Hans Ochotzki Feinmechanik,Homburg/Saar, Deutschland) in zwei Arbeitsgängen zu gleichgeformten Glaspipetten ausgezogen. Das Ausziehen der Pipetten erfolgte durch Erhitzen innerhalb einer Heizspule, wobei die erste Erwärmung eine Streckung der Glaskapillare zur Folge hatte und die nachfolgende zweite Erhitzung den Bruch der Kapillare bewirkte. Das Ziel war eine Pipettenspitze mit einer Öffnung von ca. 1 µm Durchmesser und einem Pipettenwiderstand von 5 - 10 Mega Ohm. 26 6. Datenerfassung Am Hauptverstärker wurden verschiedene Geräte (DAT-Rekorder, Schreiber, Compu- ter) angeschlossen, um die gemessenen Daten zu erfassen. Der Papierschreiber (L250E; Phywe, Düsseldorf, Deutschland) zeichnete während des Versuchsablaufs entweder Membranstrom oder Membranspotential auf. Die durch den DA/AD-Wandler in Digitalform umgewandelten Daten wurden auf einer Festplatte des Computers sowie auf einem DAT-Rekorder (DTR 1204; Biologic Science Instruments, Claix, Frankreich) gespeichert. Die Datenauswertung erfolgte mit einer speziellen Patch Software (Cambridge Electronics Design, Cambridge, England). 7. Ablauf eines Patch-Clamp-Experimentes Am Anfang wurde mit Hilfe des Mikroskops eine geeignete Nervenzelle ausgesucht und unter dem Mikroskop in die Mitte des Gesichtsfeldes platziert. Dann wurde eine frisch gezogene Patchpipette mit der Pipettenlösung luftblasenfrei aufgefüllt und in den Pipettenhalter eingespannt. Ein leichter Überdruck wurde im Pipetteninneren angelegt, um das Verstopfen der Pipettenspitze beim Eintauchen in die Badlösung zu vermeiden und ein besseres Aufsetzen (durch Abspülen eventuell vorhandener Verunreinigungen auf der Zelloberfläche) auf der Neuronzelloberfläche zu erhalten. Mit Hilfe des Mikro- manipulators wurde die Pipettenöffnung in die Badlösung eingetaucht. Dadurch ent- steht in der Messkette Silberdraht–Pipettenlösung–Badlösung–Referenzelektrode ein Messartefakt, "Liquid Junction Potential" oder "Offsetpotential" genannt. Am Verstärker wurde das Offsetpotential auf Null korrigiert. Um den Pipettenwiderstand zu berechnen, applizierte man eine definierte Spannung (50 mV für 30 ms, alle 1 s wiederholt). Aus dem daraus resultierenden Strom lässt sich der Pipettenwiderstand nach dem Ohm- schen Gesetz (R = U / I) berechnen. Die Werte des Widerstandes der Pipetten lagen bei 5 - 9 Mega Ohm. Nun wurde die Pipette mit Hilfe des Mikromanipulators nahe an die Zelloberfläche herangeführt und die Pipettenöffnung vorsichtig auf die Zelle gesetzt. Sofort danach wurde der Überdruck an der Glaspipette abgelassen (siehe Abb. 13). 27 Abb. 13: Das lichtmikroskopische Bild von dissoziierten Plexus myentericus Neuronen in Kultur zeigt eine aufgesetzte Glaspipette auf einem Neuron in der Kultur. Durch das Aufsetzen entsteht eine Zell-Glaspipetten-Verbindung. Dabei kam es selten zu einer spontanen Sealbildung. Häufiger musste man einen leichten Unterdruck in der Pipette erzeugen, um ein hochohmiges Seal zu erhalten. Die Sealbildung konnte man am Oszilloskop verfolgen, da die Stromantwort auf den Kommandospannungspuls sehr klein wird (Abb. 14). Die dabei gemessenen Ströme zeigen zwei kapazitative Artefakte am Anfang und Ende des Kommandospannungspulses. Die kapazitativen Artefakte entstehen durch Umladeprozesse an Pipette und Zellmembran. Die Artefakte wurde am Hauptverstär- ker vor Beginn der Messung kompensiert. Durch den angelegten Unterdruck wurde ein Teil der Zellmembran in die Pipette gesaugt, so dass eine weitere Abdichtung erfolgte. Dadurch bilden sich nun kapazitative Antworten im Stromverlauf (Abb. 14c). Nach Einstellung der Zellmembran auf ein negatives Haltepotential wurde vorsichtig die Membran unter der Patchpipette durch ruckartiges Saugen am Pipettenschlauch durchbrochen. Dadurch wurde eine elektrischer Zugang zur Zelle (Whole-Cell-Modus) hergestellt (Abb. 14d). 28 Nach Aufbrechen der Membran änderte sich die Stromantwort am Oszilloskop. Die ka- pazitativen Ströme nahmen sehr stark durch die Vergrößerung der Messfläche zu (Abb. 14d). Gleichzeitig verringerte sich der Widerstand unterhalb der Pipette, so dass ein Stromfluss auf dem Oszilloskop sichtbar wurde. Nach der Kompensation der Kapazität kann man bei Stromklemmung (Current-Clamp-Modus) einen definierten Strompuls in die Zelle applizieren und das resultierende Membranpotential der Zelle ablesen. Wird kein Strom appliziert, kann man in diesem Modus das Ruhemembranpotential der Zelle erfassen. Abb. 14: Stromantworten in Abhängigkeit des Sealzustandes einer Ganzzellableitung. a) Stromantwort nach erfolgtem Kom- mandospannungspuls. b) Stromregistrierung nach Ausbildung der Cell-attached-Konfiguration. c) Stromregistrierung und ka- pazitative Antworten nach angesaugten Membranabschnitten. d) Stromregistrierung nach Durchbrechen der Membran. VCom: Kommandospannungspuls, IOsz: am Oszilloskop gemes- sene Stromantwort. 29 Vcom IOsz. a Vcom IOsz. b Vcom IOsz. c Vcom IOsz. d 8. Berechnungen Umkehrpotential und Nernst-Gleichung An der Zellmembran liegt ein elektrochemischer Gradient für jedes vorhandene Ion an. Der Strom des entsprechenden Ions kommt zum Stillstand, wenn sich elektrischer und chemischer Gradient im Gleichgewicht befinden. In diesem Gleichgewichtszustand ist der Nettostrom des jeweiligen Ions durch die Membran null. Das Nernstpotential oder Umkehrpotential hängt von den ionalen Bedingungen auf beiden Seiten der Membran ab. Wenn die Ionenkonzentrationen auf beiden Seiten der Membran bekannt sind, lässt sich das Gleichgewichtspotential für jedes Ion mit Hilfe der Nernst-Gleichung (Abb. 15 ) berechnen. Nernst Gleichung Abb. 15: Nernst-Gleichung zur Bestimmung des Gleichgewichtpo- tentials eines bestimmten Ions an der Zellmembran. Es bedeuten: E = Gleichgewichtspotential in Volt (V) R = Gaskonstante (8,3143 J • K -1 • mol-1) T = Absolute Temperatur (K) z = Ladung des Ions F = Faraday-Konstante (96478 C • mol-1) [Ion]a = Ionenkonzentrationen extrazellulär [Ion]i = Ionenkonzentrationen intrazellulär In = natürlicher Logarithmus 30 9. Messung der intrazellulären Ca2+-Konzentration mit Fura-2 9.1 Struktur von Fura-2: Fura-2 ist ein Ca2+-Chelator, der Ca2+ über vier Carboxylgruppen bindet (Abb. 16). Die Stilbengruppe ist das Chromophor des Moleküls. Diese Substanz ist sehr selektiv für Ca2+ und fast unempfindlich für pH-Schwankungen im physiologischen Bereich. Die Ca2+-Affinität ist sehr günstig für physiologische Messungen: Die Dissoziationskonstan- te beträgt etwa 0,25 µmol•l-1, liegt also genau in dem Bereich zellulärer Ca2+-Signale (0,01 - 1 µmol· l-1). Das veresterte Fura-2 ist ungeladen und damit membranpermea- bel. In der Zelle wird es durch Esterasen von den fünf Estergruppen gespalten. In die- sem Zustand ist Fura-2 geladen und kann die Zelle nicht mehr verlassen. Abb.16: Fura-2 als membrangängiger Acetoxymethylester. Die Ester- gruppen werden durch unspezifische Esterasen abgespalten (aus: www.sigma-aldrich.com). 9.2 Fluoreszenzemission von Fura-2 Im folgendem Schema (Abb. 17) wird die Fluoreszenzintensität von Fura-2 bei Anre- gung mit ultraviolettem Licht dargestellt. Die Fluoreszenz ändert sich sowohl mit der Ca2+-Konzentration als auch mit der Wellenlänge des Anregungslichts. Das Spektrum wird in Ca2+-freier Lösung mit einem Maximum bei einer Anregungswellenlänge von 365 nm gemessen. Erhöht sich die Ca2+-Konzentration, verschiebt sich das Maximum der Anregung auf 340 nm. Unabhängig vom Ca2+-Gehalt ist dagegen die Fluoreszenz 31 nur bei einer Anregung von 360 nm, dem isoemissiven Punkt. Bei Zugabe von Ca2+ zu einer Fura-2-Lösung ergeben sich also zwei gegenläufige Änderungen der emittierten Fluoreszenzintensität: Eine Zunahme bei einer Anregungswellenlänge von 340 nm und eine Abnahme bei einer Anregungswellenlänge 380 nm. Dieser Effekt wird bei der Messung der Ca2+-Konzentration ausgenutzt (siehe unten). Abb. 17: Fluoreszenzanregungsspektrum von Fura-2 in Lösungen mit unterschiedlichen freien Ca2+-Konzentrationen. Auffallend ist die gegenläufige Verschiebung der Anregungsmaxima. Der Schnittpunkt der beiden Linien ist der isoemissive Punkt (aus: www.probes.com/handbook/figures/2001.htm; leicht verändert). Die Intensität des Fluoreszenzlichtes bei 340 nm Anregung (F340) wird bestimmt durch die Konzentration des Farbstoffs (C), die Dicke der Zelle (d), eine Konstante (K), welche die optischen Eigenschaften der Messapparatur zusammenfasst, und sie ist natürlich auch eine Funktion der Ca2+-Konzentration ([Ca2+]): F340 = C * d * K * f([Ca2+]) 32 Da mehrere dieser Parameter unbekannt sind, kann über die Intensität F340 alleine nicht die Ca2+-Konzentration berechnet werden. Man nutzt nun die gegenläufige Spektrenverschiebung von Fura-2 bei Anstieg der Ca2+-Konzentration aus. Führt man zwei Fluoreszenzmessungen kurz hintereinander durch, und zwar zuerst mit einem Anregungslicht von 340 nm und dann bei 380 nm, kann man annehmen, dass sich weder C noch d oder K zwischen den beiden Messungen ändern. Wenn man dann die beiden gemessenen Fluoreszenzintensitäten F340 und F380 in Relation zueinander setzt, entfallen die drei unbekannten Größen c, d und K: F340 = C * d * K * f([Ca2+]) _______________________ F380 = C * d * K * f'([Ca2+]) Durch diese mathematische Operation erhält man eine experimentell bestimmbare Messgröße (den Quotienten F340/F380), die nur von der Ca2+-Konzentration abhängt. Der Quotient F340/F380 wird oft mit R (englisch: ratio) bezeichnet. Er ermöglicht die Messung absoluter Ca2+-Konzentrationen in lebenden Zellen, weil er unabhängig von der Farbstoffkonzentration und der Zellform ist. Um von einem gemessenen R-Wert auf die Ca2+-Konzentrationen schließen zu können, muss man die Ca2+-Abhängigkeit von R experimentell ermitteln. Man misst dazu R bei einer Reihe von bekannten Ca2+- Konzentrationen und erhält eine Eichkurve (Abb. 18). 33 Abb. 18: Eichkurve von Fura-2 zur Bestimmung von freien Ca2+-Konzentrationen aus den Ratio-Daten. Mit Hilfe dieser Kurve kann man für jeden in der Zelle ge- messenen R-Wert die entsprechende Ca2+-Konzentration ermitteln. 9.3 Der Imaging-Messstand 9.3.1 Fluoreszenzmikroskopie und elektronische Komponenten Es wurde auch für diese Messungen, wie bei den Patch-Clamp-Experimenten, ein inverses Lichtmikroskop (Olympus IX-50; Olympus optical, Japan) verwandt. Bei diesen wirkt das Objektiv zugleich auch als Kondensor. Das Kernstück der Auflichtmikroskopie ist eine Konstruktion im Strahlengang zwischen Objektiv und Okular, über die die anregende Strahlung zugeführt wird, und die aus Erregerfilter, Teilerspiegel und Sperr- filter besteht (Abb. 19). 34 Abb. 19: Strahlengang in einem Fluoreszenzmikroskop. 1. anregende Strahlung. 2. emittierte Strahlung (Fluoreszenz). Die angegebenen Nanometerwerte beziehen sich auf einen der möglichen Fälle. Durch Wahl anderer Filtersysteme kann auch Licht anderer Wellenlängen verwendet werden (nach einem Werkphoto von Carl Zeiss, Wetzlar, Deutschland). Das Mikroskop war mit einer CCD-Kamera und einem Controller verbunden, die beide zum Fura-2 Data Acquisition System (Till Photonics, Martinried, Deutschland) gehörten. Abb. 20 gibt eine Überblick über die Geräte. 35 Anregungsfilter Farbteiler FT 420 Fluoreszenz- Emission Objektiv =Kondensor Anregungs- strahlung Objektiv >420 nm >420 nm <420 nm 1 2 Präparat <420 nm Abb. 20: Bestandteile des optischen Systems zur Fluoreszenzmessung. 9.3 Messkammern und Perfusionssystem Es wurde als Messkammer eine Zellkulturschale mit einem Durchmesser von 35 mm (Greiner Labortechnik, Frickenhausen, Deutschland) verwendet. In diese Schale wurde in der Mitte des Bodens ein Loch von 10 mm Durchmesser gebohrt. Die Neurone des Plexus myentericus, die auf Poly-L-Lysin-beschichteten Deckgläschen auf einer Kultur- platte wuchsen, wurden aus dem Brutschrank gebracht und in der gleichen Zell- kulturplatte (siehe Abb. 7) für eine Stunde mit 2,5 • 10-6 mol· l-1 Fura-2-AM und Pluronic® (1 µl· ml-1 Tyrodelösung) bei Raumtemperatur lichtgeschützt inkubiert. An- schließend wurde der nicht resorbierte Farbstoff mit Tyrodelösung abgespült. Die Deckgläschen mit den Neuronen wurden mit Hilfe von Silikonpaste (Baysilone, Bayer AG, Leverkusen, Deutschland) unter die gebohrten Öffnungen der Zellkulturschalen geklebt. Diese Schalen wurden in einer Halterung auf dem Objekttisch des Mikroskops 36 eingesetzt und konnten dort kontinuierlich perfundiert werden (ähnlich wie beim Patch- Clamp-Messstand beschrieben). Der Perfusionsschlauch und die Absaugung waren mittels Magneten am Objekttisch des Mikroskops befestigt. Der Zulauf erfolgte mit einer Fließgeschwindigkeit von etwa 1 ml· min-1. Ein Absaugschlauch war gegenüber dem Perfusionsschlauch befestigt, um das Flüssigkeitsvolumens innerhalb der Mess- kammern (ungefähr bei 3 ml) konstant zu halten. 9.4 Versuchsdurchführung Es wurden mehrere Neurone im Sichtfeld des Mikroskops justiert. Mit Hilfe der Imaging-Software (Till Photonics, Martinsried, Deutschland) konnten die Zellen auf dem Monitor des Computers dargestellt werden. An dem zu untersuchenden Präparat wurden mehrere Neurone als Messregion markiert (regions of interest = ROI; Abb. 21). Im Verlauf des Experiments wurden die Ca2+-Konzentrationsänderungen im Bereich der Messregionen aufgezeichnet. Am Anfang eines jeden Experimentes wurde das Präparat mit einer 140 mmol· l-1 NaCl Tyrode-Lösung superfundiert, so dass eine Messung der Grundlinie (basale Ca2+-Konzentration unter Kontrollbedingungen) bis zu ihrer Stabilisierung über mehrere Minuten stattfand. Danach wurde ein Lösungswechsel bzw. eine Substanzapplikation vorgenommen. 37 Abb 21: Falschfarbendarstellung von mit Fura-2 aufgeladenen Neuronen. Im Bildaus- schnitt sind fünf Messbereiche (regions of interest, ROI) definiert. 9.5 Datenerfassung Gemessen wurde die Fluoreszenz von Fura-2 bei zwei Anregungswellenlängen (340 nm und 380 nm). Die Lichtpulse hatten eine Dauer von 20 ms, die festgelegte Sammelrate lag bei 0,2 Hz, d.h. es wurde alle 5 s ein Bildpaar registriert. Eine Emission über 470 nm wurde über einen Filter, der Wellenlängen unter 540 nm passieren ließ, zu einer CCD-Kamera geleitet und in digitale Bilder umgesetzt. Mit Hilfe der Image- Analyse-Software (Tillvision; Till Photonics, Martinsried, Deutschland) wurden die erfassten Emissionen in Zahlenwerte (Ratio-Werte) umgesetzt und auf dem Monitor in Form einer Grafik dargestellt. Gleichzeitig wurden diese Daten für die Auswertung des Versuchs auf der Festplatte gespeichert. 38 10. Chemikalen Heparin (Calbiochem, Darmstadt, Deutschland) und Ruthenium Rot (Alfa Aesar, Karlsruhe, Deutschland) wurden in wässrigen Stammlösungen angesetzt. U-73122 (Calbiochem, Darmstadt, Deutschland) wurde in DMSO gelöst (DMSO-Endkonzentrati- on 0,2 ml· l-1), ebenso Fura und Fura-2-AM (Molecular Probes, Leiden, Niederlande). Charybdotoxin wurde in Aqua dest. mit Rinderserumalbumin (BSA, 1 g· l-1) gelöst. Ryanodin stammte von Calbiochem (Bad Soden, Deutschland). Andere Chemikalien für die Tyrode Lösungen und die Patch-Pipettenlösungen wurden überwiegend von Sigma (Deisenhofen, Deutschland) bezogen. Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) mit N-(2-Hydroxyethyl)-piperazin-N-(2-ethanolsulfonsäure) (HEPES), Poly-L- Lysin (Molekulargewicht 70 000 – 150 000 D), Kollagenase Typ II (255 units· ml-1), Pencillin (10000 IU· ml-1), Streptomycin (10000 µg· ml-1), Fetales Kälberserum (FKS) und Start-V® -Medium stammten von Biochrom (Berlin, Deutschland). Metronidazol (Flagyl® , 100 µg· ml-1) war von Bayer, Leverkusen, Deutschland. 11. Auswertung Alle Messwerte wurden als Mittelwert ± Standardfehler des Mittelwertes (SEM = standard error of the mean) angegeben. Vergleiche zwischen mehreren Gruppen wurden mittels Varianzanalyse gefolgt von einem Tukey’s Test statistisch ausgewertet, der Vergleich von zwei Gruppen wurde mit einem gepaarten bzw. einem ungepaartem Student’s T-Test durchgeführt. Ein P-Wert < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. Für die Durchführung der Berechnungen wurden die Software-Programme Staroffice und Origin® (Microcal, Northampton, USA) benutzt. 39 III. ERGEBNISSE 1. Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von Butyrat auf das Membranpotential Butyrat ist ein bekannter sensorischer Stimulus des enteralen Nervensystems (Haschke et al. 2002). Diese kurzkettige Fettsäure führt zu einer Hyperpolarisation der Membran enterischer Neurone. In der hier beschriebenen Arbeit wurde der Einfluss des Butyrats auf das Membranpotential von isolierten Neuronen des Plexus myentericus gemessen und versucht näher zu charakterisieren. Als Substrat wurde Natrium-Butyrat (Abb. 22) verwendet. CH3-CH2-CH2-COO- Na+ Abb. 22: Strukturformel von Natriumbutyrat. Bislang unbekannt ist die Konzentrationsabhängigkeit der Wirkung von Butyrat auf das Membranpotential. Daher wurden myenterische Neurone mit Na-Butyrat in unterschied- lichen Konzentrationen (10 – 100 mmol · l -1) superfundiert. Um die Osmolarität des Su- perfusionmediums konstant zu halten, wurde NaCl in der Tyrode-Lösung isoosmolar ge- gen Na-Butyrat ausgetauscht, der pH-Wert wurde konstant bei 7,4 gehalten. Das basale Membranpotential der Neurone in Abwesenheit von Na-Butyrat betrug -35,8 ± 3,8 mV (n = 5). Butyrat verursachte eine Hyperpolarisation der Membran aller unter- suchten Neurone (Abb. 23). Die Amplitude der Hyperpolarisation erwies sich als abhän- gig von der eingesetzten Konzentration. 40 Abb. 23: Durch die Gabe ansteigender Butyratkonzentrationen wird die Zellmembran hyperpolarisiert. Die Originalaufzeichnung ist typisch für n = 5 Versuche mit ähnlichem Ergebnis. Statistik siehe Abb. 24. Die Wirkung des Butyrats war reversibel nach Auswaschen. Rückkehr zur Tyrode- Lösung ließ die Membran wieder depolarisieren. Aus diesen Versuchen ließ sich die Konzentrationsabhängigkeit berechnen (Abb. 24). 41 0 -10 -20 -30 -40 -50 1 min M em br an po te nt ia l ( m V) Tyrode 10 mM 20 mM 100 mM Tyrode50 mM Butyratkonzentration Abb. 24: Konzentrationsabhängige Hyperpolarisation der Membran myenterischer Neurone durch Butyrat. Die Werte sind Mittelwerte ± SEM, n = 5. Bei 50 mmol · l -1 Butyrat erhält man fast maximale Hyperpolarisation. Die Kurve zeigt den Fit auf eine Michaelis-Menten-Kinetik mit Vmax (maximale Hyperpolarisation) = 25,9 ± 2,4 mV und Km (halbmaximale Konzentration) = 29,7 ± 7,2 mmol ·l -1. Die Konzentrationswirkungsbeziehung ließ sich mit einer Michaelis-Menten-Kinetik beschreiben mit folgenden Parametern und der Variabeln [S] für die Substratkonzentration: Vmax * [S] V = _________ Km + [S] Dadurch erhielt man für die maximale Hyperpolarisation (Vmax) einen Wert von 25,9 ± 2,4 mV bzw. für die halbmaximale Konzentration (Km) einen Wert von 29,7 ± 7,2 mmol · l -1 (n = 5). Bei 50 mmol ·l -1 Butyrat wurde eine fast maximale Hyperpolarisation beobachtet. Aufgrund dieser Ergebnisse wurden alle weiteren Experimente mit einer Butyratkonzentration von 50 mmol · l -1 durchgeführt. 42 0 20 40 60 80 100 0 5 10 15 20 25 H yp er po la ris at io n (m V ) Butyrat-Konzentration (mM) Wenn diese Konzentration alleine, d.h. ohne vorherige Applikation von niedrigeren Butyratkonzentrationen angeboten wurde, hyperpolarisierte die Zellmembran nach circa 30 Sekunden um 11,6 ± 1,0 mV (n = 7; Abb. 25). Auch dieser Effekt war vollkommen reversibel nach Auswaschen der kurzkettigen Fettsäure und war an allen getesteten Neuronen zu beobachten. Abb. 25: Wirkung von Natrium-Butyrat (90 mmol · l -1 NaCl/50 mmol · l -1 Na-Butyrat) auf das Membranpotential eines myenterischen Neurons. Butyrat induziert eine Hyperpolarisation der Zellmembran. Dieser Effekt kann durch Auswaschen mit Tyrode-Lösung (140 mmol · l -1 NaCl) rückgängig gemacht werden. Typisches Ergebnis von n = 7 Versuchen; Statistik siehe Text. 43 0 -10 -20 -30 -40 -50 -60 -70 M em br an po te nz ia l ( m V) 1 min Tyrode TyrodeButyrat 2. Charakterisierung der durch Butyrat stimulierten Kaliumleitfähigkeit Aus einer Vorgängerarbeit ist bekannt, dass Butyrat die Kaliumleitfähigkeit der enteri- schen Neurone stimuliert (Haschke et al. 2002). Um die daran beteiligten Kaliumkanäle zu charakterisieren, wurde Charybdotoxin eingesetzt. Dieses Gift des Skorpions Leiurus quinquestriatus var. hebraeus ist ein spezifischer Blocker von Ca2+-aktivierbaren K+- Kanälen (Sugg et al, 1990, Hanner et al. 1998, Doughty et al. 1999, Cui et al. 2001, Garcia et al. 2001). Primärstruktur und Tertiärstruktur dieses inhibitorischen Peptids sind in Abb. 26 und 27 dargestellt. CHARYBDOTOXIN Abb. 26: Aminosäurensequenz von Charybdotoxin. Eingezeichnet sind die Disulfidbrücken zwischen den Aminosäuren Cystein (Quelle: Sigma, Deisenhofen, Deutschland). 44 1 2 7 13 17 18 (pGlu-Phe-Thr-Asn-Val-Ser-Cys-Thr-Thr-Cer-Lys-Glu-Cys-Trp-Ser-Val-Cys-Gln- -Arg-Leu-His-Asn-Thr-Ser-Arg-Gly-Lys-Cys-Met-Asn-Lys-Lys-Cys-Arg-Cys-Tyr-Ser) 19 28 33 35 Disulfidbrücke Abb. 27: Dreidimensionale Darstellung der Struktur von Charybdotoxin. Die für die räumliche Anordnung verantwortlichen sechs Cysteine sind in ihrer Reihenfolge mit 1 bis 6 gekennzeichnet (obere Zahlenreihe). Die untere Zahlenreihe zeigt die Position der Cysteine im Peptid. Helikale Strukturen sind hellgrau gekennzeichnet, planare schwarz (nach Kellenberger et al. 1999; leicht verändert). Die Aminosäurendarstellung erfolgt nach internationaler Ein-Buchstabencodierung; Z steht für Pyroglutamin. Charybdotoxin wurde durch Perfusion von außen appliziert. Um eine Adsorption des Peptids an das Perfusionssystem zu verhindern, enthielt die Superfusionslösung bovines Serumalbumin (BSA; Konzentration 1 mg·ml -1). Die Wirkung von Butyrat auf das Membranpotential wurde an insgesamt 11 Zellen in Gegenwart von Charybdotoxin getestet. Bei allen war der Zeitverlauf des Butyrateffekts massiv verändert (Abb. 28). In allen getesteten Zellen induzierte Butyrat nur noch eine transiente Hyperpolarisation von 11,9 ± 2,3 mV. Diese ging bei 9 von 11 getesteten Zel- len nach kurzer Zeit (3,0 ± 0,6 min; n = 9) in eine deutliche Depolarisation über. Die Membran depolarisierte dabei signifikant (p < 0,05) um 19,8 ± 1,4 mV auf -24,3 ± 4,3 mV gegenüber dem Ausgangswert von -43,3 ± 3,9 mV (n = 9) vor der Applikation von 45 Butyrat. Bei 2 von 11 Zellen war diese sekundäre Depolarisation nur schwach ausge- prägt und das Membranpotential stellte sich auf das Ausgangspotential vor der Butyrat- zugabe ein. Auch in Gegenwart von Charybdotoxin erwies sich die Butyratantwort als reversibel, wenn die kurzkettige Fettsäure wieder ausgewaschen wurde. Abb. 28: Wirkung von Butyrat (90 mmol · l -1 NaCl/50 mmol· l -1 Na-Butyrat) auf das Membranpotential in Gegenwart von Charybdotoxin (10-7 mol · l -1). Die Originalaufzeichnung ist typisch für 9 von 11 Experimenten, in denen Butyrat nach transienter Hyperpolarisation eine massive Depolarisation auslöste. In 2 von 11 Zellen war diese zweite Phase nur schwach ausgeprägt, so dass das Membranpotential auf den Grundwert vor Butyratapplikation zurückging. Statistik siehe Text. 46 0 -10 -20 -30 -40 M em br an po te nt ia l ( m V) -50 -60 -70 1 min Tyrode Na-Butyrat Tyrode 100 nM Charybdotoxin 3. Intrazelluläre Vermittlung der Wirkung von Butyrat Die Hemmung der Butyrat-induzierten Hyperpolarisation durch Charybdotoxin weist da- rauf hin, dass es in Gegenwart der kurzkettigen Fettsäure zu einer Stimulation von Ca2+-aktivierbaren K+-Kanälen kommt. Zu dieser Vermutung passt auch die Beobach- tung, dass Exposition gegenüber Butyrat zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Kon- zentration führt, wie sich in entsprechenden Versuchen an mit Fura-2 aufgeladenen my- enterischen Neuronen zeigte (Haschke et al. 2002). Der Ca2+-Anstieg geht dabei auf eine Freisetzung von Ca2+ aus intrazellulären Thapsigargin-sensitiven Speichern zurück. Daher sollte im Folgenden der Mechanismus, über den Butyrat zu einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration führt, untersucht werden. Eine Möglichkeit, intrazellu- läre Ca2+-Speicher zu entleeren, besteht in der Stimulation der Bildung des second messengers Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) (Berridge und Irvine 1984, 1989). Der Rezeptor für IP3 kann durch Heparin blockiert werden, wodurch der Botenstoff seine Wirksamkeit verliert (Broad et al. 2001). Bei Heparin handelt es sich um eine hochmolekulare Substanz (Abb. 29), die nicht nach Superfusion in die Zellen aufgenommen wird. Daher musste der Inhibitor bei den Whole-Cell Patch-Clamp-Ableitungen über die Pipettenlösung, die das Zytosol bei dieser Art von Messung ersetzt, appliziert werden. Abb. 29: Teil der Polysacharidkette, aus der Heparin besteht. 47 In Gegenwart von Heparin (6 ·10 -6 mol · l -1) in der Patch-Pipette betrug das basale Membranpotential -40,0 ± 6,1 mV (n = 6). Unter diesen Bedingungen induzierte Butyrat (90 mmol · l -1 NaCl/50 mmol · l -1 Na-Butyrat) immer noch eine Hyperpolarisation, die mit 12,0 ± 1,4 mV (n = 6) nicht signifikant von der Butyratantwort unter Kontrollbedingungen verschieden war (Abb. 30). Abb. 30: Butyratantwort in Gegenwart von Heparin (6 ·10 -6 mol · l -1). Heparin wurde mit Patch-Pipette appliziert. Die Originalaufzeichnung ist typisch für 6 Versuche mit ähnlichem Ergebnis; Statistik siehe Abb. 35. Ebenso erwies sich die Butyrat-Antwort als resistent gegenüber der Blockade der Phospholipase C. Dieses Enzym, das die Bildung von IP3 katalysiert, lässt sich durch U- 73122 (Abb. 31) spezifisch hemmen (Leis et al. 2000, Broad et al. 2001, Wang et al. 2001, Kettunen et al. 2002, Vogt et al. 2003). 48 1 min Tyrode Na-Butyrat Tyrode 6 µM Heparin-Na0 -10 -20 -30 -40 M em br an po te nt ia l ( m V) -50 Abb. 31: Molekulare Struktur des Phospholipase C-Blockers U-73122. In Gegenwart von U-73122 (10-5 mol · l -1; mit der Patch-Pipette appliziert), betrug das basale Membranpotential -30,8 ± 5,2 mV (n = 6). In Gegenwart des Inhibitors induzierte Butyrat immer noch eine Hyperpolarisation von 13,7 ± 2,4 mV (n = 6, Abb. 32). Abb. 32: Hemmung der Phospholipase C mit U-73122 (10-5 mol · l -1 in der Patch- Pipette) hat keinen Einfuss auf die durch Butyrat (90 mmol · l -1 NaCl/50 mmol · l -1 Na-Butyrat) induzierte Hyperpolarisation. Die Originalaufzeichnung ist typisch für 6 Versuche mit ähnlichem Ergebnis, Statistik siehe Abb. 35. 49 0 -10 -20 -30 -40 M em br an po te nt ial (m V) -50 1 min 10 µM U-73122 Tyrode Na-Butyrat Tyrode Die Beteiligung des Phospholipase–IP3-Signalweges am Zustandekommen des Butyrat- effektes erscheint damit als unwahrscheinlich. Eine andere Möglichkeit, Ca2+ aus intrazellulären Speichern freizusetzen, ist die Stimulation von Ryanodinrezeptoren. Diese lassen sich durch Ruthenium Rot (Abb. 33) hemmen (Sorrentino 1995, Franzini- Amstrong und Protasi 1997, Taylor et al. 1998, Kocks et al. 2002). Um die Beteiligung von Ryanodinrezeptoren an der Butyratantwort zu untersuchen, wurde gemessen, ob Butyrat nach Blockade von Ryanodinrezeptoren mit Ruthenium Rot noch in der Lage ist, eine Hyperpolarsation der Membran zu induzieren. Ruthenium Rot [(NH3)5Ru-O-Ru(NH3)4-O-Ru(NH3)5]6 Abb. 33: Formel von Ruthenium Rot (Pottosin 1999) In Gegenwart von Ruthenium Rot (3· 10-5 mol.l-1, mit der Patch-Pipette appliziert) betrug das basale Membranpotential -47,9 ± 5,2 mV (n = 10). In Gegenwart des Inhibitors war die Hyperpolarisation, die Butyrat (90 mmol.l-1 NaCl/50 mmol.l-1 Na-Butyrat) auslöste, deutlich abgeschwächt (Abb. 34). Sie betrug lediglich 4,7 ± 0,4 mV (n = 10). Dieser Wert entspricht 40 % der unter Kontrollbedingungen durch Butyrat induzierten Hyperpo- larisation (11,6 ± 1,0 mV; n = 7, p < 0,05 versus Butyratantwort unter Kontrollbedingun- gen). 50 Abb. 34: Ruthenium Rot (3 ·10 -5 mol.l-1 in der Patch-Pipette, siehe schematische Zeichung) vermindert deutlich die durch Butyrat (90 mmol · l -1 NaCl/50 mmol· l -1 Na-Butyrat) ausgelöst wird. Die Originalaufzeichnung ist typisch für 10 Versuche mit ähnlichem Ergebnis; Statistik siehe Abb. 35. 51 0 -10 -20 -30 -40 M em br an po te nt ia l ( m V) -50 Tyrode Na-Butyrat Tyrode 1 min 30 µM Ruthenium Rot 4. Zusammenfasssung der Inhibitor-Experimente In Abbildung 35 sind zusammenfassend die bisherigen Resultate dargestellt. Die Zell- membran hyperpolarisiert nach Zugabe von Butyrat. Inhibitoren des Phospholipase C/IP3-Signalwegs wie Heparin oder U-73122 beeinflussen diese Antwort nicht. Hem- mung von Ryanodinrezeptoren mit Ruthenium Rot hingegen vermindert die Butyrat- induzierte Hyperpolarisation um ca. 60 % (n = 6 - 10, p < 0,05 versus Butyratantwort unter Kontrollbedingungen). Abb. 35: Darstellung der durch Butyrat (90 mmol · l -1 NaCl/50 mmol · l -1 Na- Butyrat) ausgelösten Hyperpolarisation in Abwesenheit von Inhibitoren (Kontrolle, weiße Säule) und in Anwesenheit von U-73122 (dunkelgraue Säule, 10-5 mol ·l -1, mit der Patch-Pipette appliziert), Heparin (hellgraue Säule, 6 ·1 0-6 mol · l -1, mit der Patch-Pipette appliziert) oder Ruthenium Rot (schwarze Säule, 3 ·10 -5 mol ·l -1, mit der Patch-Pipette appliziert). Werte sind Mittelwerte ± SEM, n = 6 - 10. * p < 0,05 versus Butyrateffekt in Abwesenheit jeglicher Inhibitoren. 52 0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 Hy pe rp ol ar is at io n (m V) Kontrolle U-73122 Heparin Ruthenium Rot * 5. Fura-2-Messungen 5.1 Ryanodinrezeptoren Die Inhibitorexperimente legen die Vermutung nahe, dass Butyrat eine Freisetzung von intrazellulärem Ca2+ aus Speicherorganellen über Ryanodinrezeptoren auslöst. Um diese Hypothese zu überprüfen, wurden Neurone mit Fura-2 aufgeladen. Das Verhältnis der Emission dieses Fluoreszenzfarbstoffes bei Anregung mit Licht von 340 nm dividiert durch die Emission bei einer Anregung bei 380 nm steigt bei zunehmender Beladung mit Ca2+, d.h. bei einem Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration, an (Grynkiewicz et al. 1985). Superfusion der Neurone mit Butyrat unter Kontrollbedingungen erhöhte das Fluores- zenzverhältnis von Fura-2 um 0,13 ± 0,02 (Abb. 36a), was eine Zunahme der intrazellu- lären Ca2+-Konzentration anzeigt. Mit Hilfe der Grynkiewicz-Gleichung (Grynkiewicz et al. 1985) ist es möglich, auf die intrazelluläre Ca2+-Konzentration zurückzurechnen, der einem bestimmten Wert für die Ratio zu Grunde liegt. Die Grynkiewicz-Gleichung lautet: [Ca]i = KD • ß • ( R - Rmin ) / ( Rmax - R ) Es bedeuten: [Ca]i = intrazelluläre Calciumkonzentration KD = Dissoziationskonstante = 224 nmol· l-1 Fluoreszenzsignal bei 340 nm bei 0 mmol · l-1 Calcium ß = _________________________________________________________ Fluoreszenzsignal bei 380 nm bei 10 mmol · l-1 Calcium R = Ratio Rmin = Ratio bei 0 mmol · l-1 Calcium Rmax = Ratio bei 10 mmol · l-1 Calcium Nach der Grynkiewicz-Gleichung lag die intrazelluläre Ca2+-Konzentration vor Zugabe von Butyrat bei 12,0 ± 3,3 nmol · l-1. Nach Butyrat Applikation stieg die zytosolische Ca2+-Konzentration auf 23,2 ± 4,0 nmol · l-1 (n = 11). Dieser Anstieg ist unabhängig von der Anwesenheit von extrazellulärem Ca2+, muss also auf eine Freisetzung aus intrazel- lulären Speichern zurückgehen (Haschke et al. 2002). Um die vermutete Beteiligung 53 von Ryanodinrezeptoren an dieser Antwort zu untersuchen, wurden die Neurone mit Ruthenium Rot (3 ·10 -5 mol · l -1) vorbehandelt. Unter diesen Bedingungen löste Butyrat nur noch einen geringen und stark verzögerten Anstieg des Fura-2- Fluoreszenzverhältnisses aus (Abb. 36b). Die Ausgangsratio änderte sich von 0,48 ± 0,02 bei Zugabe von Butyrat auf 0,52 ± 0,02 (gemessen 10 min nach Butyratgabe) bei 11 untersuchten Zellen. Die Amplitude des Butyrat-induzierten Anstiegs betrug in Gegenwart von Ruthenium-Rot nur noch 0,04 ± 0,01 (n = 11) gegenüber 0,13 ± 0,01 (n = 5) unter Kontrollbedingungen (Abb. 37). Einfaktorielle Varianzanalyse und ungepaarter t-Test zeigten einen signifikanten Unterschied der beiden Datenreihen an (p < 0,05). Abb. 36a: Die Gabe von Natrium-Butyrat (90 mmol· l -1 NaCl/50 mmol · l -1 Na- Butyrat) führt zu einem Anstieg der Emission von Fura-2 bei Anregung mit Licht von 380 nm im Vergleich zu einer Anregung bei 340 nm, was gleichbedeutend mit einer Erhöhung der intrazellulären Ca2+-Konzentration ist. b: In Anwesenheit von Ruthenium Rot (3 ·10 -5 mol · l -1) ist dieser Anstieg gehemmt. Die Originalaufzeich- nung ist typisch für 11 Versuche mit ähnlichem Ergebnis, Statistik siehe Abb. 37. 54 0,2 0,4 0,6 0,8 Ra tio 3 40 n m / 38 0 nm 1 min Tyrode 50 mM Na-Butyrat 30 µM Ruthenium Rot a b Ra tio 34 0 nm / 38 0 nm Na-Butyrat 1 min Abb. 37: Ruthenium Rot (3 ·10 -5 mol · l -1) hemmt den Anstieg der Fura- 2-Ratio, den Butyrat (90 mmol · l -1 NaCl/50 mmol· l -1 Na-Butyrat) induziert. Werte sind Mittelwerte ± SEM, n = 5 - 11, * p < 0,05 versus Butyratantwort unter Kontrollbedingungen. 5.2 Einfluss hoher Ryanodinkonzentrationen Aus der Literatur ist bekannt, dass Ryanodinrezeptoren durch Ryanodin in hohen Konzentrationen gehemmt werden können, damit wird dann ein Ca2+-induzierter Ca2+Ausstrom vermindert (Franzini-Amstrong und Protasi 1997, Ozawa 2001). Um zu überprüfen, ob dies auch an den myenterischen Neuronen der Fall ist, wurde zuerst im Rahmen der Fura-Messung mit normaler Tyrode-Lösung perfundiert. Dann wurde diese Lösung durch eine Tyrode mit 10-4 mol ·l -1 Ryanodin ersetzt. Dies führte zu einem (nicht signifikanten) Abfall der Fura-2-Ratio von 0,56 ± 0.07 auf 0,48 ± 0.04 (n = 8). In Gegenwart von dieser hohen Ryanodinkonzentration induzierte Butyrat überhaupt keinen Anstieg der Fura-2-Ratio mehr, sondern im Gegenteil sank das Fura-2-Signal weiter (nicht signifikant) auf einen Wert von 0,45 ± 0,03 (n = 8). Die Abbildung 38 zeigt beispielhaft einen solchen Kurvenverlauf, Abbildung 39 die dazugehörige Statistik. 55 Butyrat + Ruthenium Rot Butyrat 0 0,05 0,10 0,15 0,20 R at io -A ns tie g * Abb. 38: Unter dem Einfluss von Ryanodin (10-4 mol ·l -1) findet kein signifikanter Anstieg der Fura-2 Ratio durch Butyratzugabe mehr statt. Hier eine Originalauf- zeichnung von insgesamt 8 ähnlichen Verläufen, Statistik siehe Abb. 39. Abb. 39: Fura-2-Ratio in Gegenwart von Ryanodin (10-4 mol · l -1; weiße Säule) und in Gegenwart von Ryanodin gemeinsam mit Butyrat (90 mmol · l -1 NaCl/50 mmol· l -1 Na-Butyrat; schwarze Säule). Werte sind Mittelwerte ± SEM, n = 8. 56 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 R a tio ( 3 8 0 n m / 3 8 0 n m ) Ryanodin (100 µM) 5 min 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 Tyrode Ryanodin (100 µM) Na-Butyrat (50 mM) R at io 3 80 n m / 38 0 nm 5.3 Beeinflussung der Ca2+-Freisetzung durch Permeabilisation In einer letzten Versuchsserie sollte herausgefunden werden, ob Butyrat über Vermittlung von membranständigen Rezeptoren (Brown et al. 2003, Le Poul et al. 2003) zu einer Ca2+-Freisetzung via Ryanodinrezeptoren führt, oder ob die kurzkettige Fettsäure direkt die Ryanodinrezeptoren zu stimulieren vermag. Hierzu wurden die Neurone mit Saponin (Abb. 40) permeabilisiert. Abb. 40: Strukturformel von Saponin (aus: www.omikron- online.de/ naturhaus/angebote/kraeuter/monograf/2336-mon.htm ). Diese Substanz, die in einer Konzentration von 10 mg· l -1 eingesetzt wurde, bildet Po- ren in der Zellmembran (Schulz 1990). Diese Poren sind für Moleküle bis zu 200 kD permeabel. Da auch Fura-2 (Molekulargewicht der freien Säure: 641 D) diese Poren zu passieren vermag, musste das Fura-2 (5 · 10-6 mol ·l -1) mit dem Superfusionsmedium appliziert werden. Außerdem erwies es sich in Vorversuchen als günstig, die Butyrat- konzentration zu reduzieren, da Butyrat unter diesen Bedingungen seinen vermuteten Zielort, die intrazellulären Speicherorganellen, direkt, d.h. ohne vorherige Diffusion durch die Zellmembran, erreichen kann. Unter diesen Bedingungen, bei denen durch die massive Permeabilisation der Zellmem- bran eine intrazelluläre Vermittlung von der Zellmembran über diffusible second messenger zu den Speicherorganellen ausgeschlossen werden kann, war Butyrat 57 immer noch in der Lage, einen Anstieg der intrazellulären Ca2+-Konzentration der myenterischen Neurone auszulösen (Abb. 41). Der Ausgangswert der Ratio von 0,38 ± 0,02 erhöhte sich signifikant (p < 0,05) nach der Zugabe von Butyrat auf 0,51 ± 0,02 (n = 5), dies entspricht einer Zunahme um 34 % (Abb. 42). Abb. 41: In mit Saponin (10 mg· l -1) permeabilisierten Zellen verursacht Butyrat (100 mmol ·l -1 KGluc / 30 mmol · l -1 KCl / 5 mmo· l-1 NaCl / 5 mmol ·l -1 Na Butyrat) einen Anstieg des Fura-2-Fluoreszenzverhältnisses. Die Originalaufzeichnung ist typisch für 5 Versuche mit ähnlichem Ergebnis, Statistik siehe Abb. 42. 58 Ra tio (3 40 n m / 38 0 nm ) 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 5 min 5 mM Na-Butyrat 10 mg / l Saponin freies Fura-2 Die Ergebnisse sind in Abb. 42 zusammenfassend dargestellt. Abb. 42: Anstieg der Fura-2-Ratio vor (  ) und nach (  ) Butyrat (135 mmol ·l -1 NaCl / 5 mmol ·l -1 Na Butyrat) in mit Saponin permeabilisierten myenterischen Neuronen. Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM, n = 5, * p < 0.05 versus Fura-2-Ratio in Abwesenheit von Butyrat. Um zu überprüfen, ob dieser Anstieg des Fura-2-Signals in permeabilisierten Neuronen auf eine Stimulation von Ryanodinrezeptoren zurückgeht, wurde Ruthenium Rot (3 ·10 -5 mol · l -1) als Blocker eingesetzt. In Gegenwart von Ruthenium Rot verursachte Butyrat nur einen geringen Anstieg des Fura-Signals. Vor der Zugabe betrug die Ratio 0,59 ± 0,02, nach Butyratzugabe zeigte sich eine Ratio von 0,65 ± 0,02, die Zunahme betrug im Mittel lediglich 0,06 ± 0,01 (n = 9; Mittelwert ± SEM). Das entspricht einer Hemmung von ca. 50 % (p < 0,05) im Vergleich zur Butyratantwort in Abwesenheit von Ruthenium Rot. Die Abbildung 43 zeigt einen von 9 ähnlichen Kurvenverläufen. 59 0,00 0,10 0,20 0,30 0,40 0,50 R at io (3 40 n m /3 80 n m ) 0,60 10 mg / l Saponin * Abb. 43: In mit Saponin (10 mg· l -1) permeabilisierten Zellen verursacht Butyrat (100 mmol ·l -1 KGluc / 30 mmol · l -1 KCl / 5 mmol· l-1 NaCl / 5 mmol ·l -1 Na Butyrat) in Gegenwart von Ruthenium Rot (3 ·10 -5 mol · l -1) nur einen geringen Anstieg des Fura- 2-Fluoreszenzverhältnisses. Die Originalaufzeichnung ist typisch für 9 Versuche mit ähnlichem Ergebnis, Statistik siehe Abb. 44. 60 5 min. 10 µM Saponin 5 µM freies Fura-2 30 µM Ruthenium Rot 5 mM Butyrat 0,0 0,2 0,4 0,6 0,8 1,0 Ra tio (3 40 nm / 3 80 nm ) Abb. 44: Anstieg der Ratio vor (  ) und nach (  ) Butyrat (135 mmol · l -1 NaCl / 5 mmol · l -1 Na Butyrat) in mit Saponin permeabi- lisierten myenterischen Neuronen unter der Einwirkung von Ruthenium-Rot (3 ·10 -5 mol · l -1). Die Ergebnisse sind Mittelwerte ± SEM, n = 9, * p < 0.05 versus Fura-2-Ratio in Abwesenheit von Butyrat. Beim Vergleich der Saponin-Messreihen (Abb. 41 und 43) fällt auf, dass die Zunahme des Anstieg der Ratio nach Butyratgabe unter dem Einfluss von Ruthenium-Rot sich extrem erniedrigt. Der Anstieg der Ratio nach Butyratapplikation betrug 0,12 ± 0,01 (n = 5) in Saponin-behandelten Neuronen, und halbierte sich bei den permeabilisierten und mit Ruthenium Rot behandelten Neuronen (0,06 ± 0,01; n = 9). Der Vergleich der beiden Ratio-Zunahmen ist in der nächsten Abbildung grafisch dargestellt. 61 0,0 0,1 0,2 0,3 0,4 0,5 0,6 0,7 0,8 R at io ( 34 0 nm / 38 0 nm ) Saponin (10 mg / l) Ruthenium Rot (30 µM) * Abb. 45: Vergleich der Butyrat-induzierten Zunahme der Fura-2-Ratio in Saponin-permeabilisierten Neuronen in Abwesenheit (  ) bzw. Anwesenheit von Ruthenium Rot (3 ·10 -5 mol · l -1;  ). Es zeigt sich eine signifikante Reduktion (* p < 0,05) der Zunahme unter dem Einfluss des Inhibitors Werte sind Mittelwerte ± SEM, n = 5-9. 62 0,00 0,05 0,10 0,15 0,20 Ra tio -Z un ah m e * Saponin (10 mg / l) Butyrat Butyrat + Ruthenium Rot IV. DISKUSSION Das enterale Nervensystem wurde in den letzten drei Dekaden intensiv in elektrophysiologischer und immunhistologischer Hinsicht untersucht (Wood 1994). Um die Zusammenhänge zwischen dem enterischen Nervensystem und Störungen in Funktionen des Gastrointestinaltrakts besser zu verstehen, kann eine Primärkultur von Neuronen des Plexus myentericus herangezogen werden (Schäfer et al. 1997, Haschke et al. 2002). Diese Neurone können mit der Patch-Clamp Technik leicht untersucht werden. Sie weisen einen typischen Na+-getragenen schnellen Einwärtsstrom bei Depolarisation der Membran auf, der unter Normalbedingungen zur Entwicklung eines Aktionspotentials führt. Eine frühere elektrophysiologische Charakterisierung deckte auf, dass diese Neurone unterschiedliche Arten von spannungsabhängigen Na+-Kanälen funktionell exprimieren, die bei verschiedenen Schwellenpotentialen aktiviert werden (Haschke et al. 2002). Die myenterischen Neurone ändern ihr Membranpotential in Gegenwart von kurzkettigen Fettsäuren wie Butyrat, die durch bakterielle Fermentationsvorgänge in hohen Konzentrationen vor allem im Dickdarmlumen vorliegen (Bugaut 1987). Ziel meiner Arbeit war eine nähere Untersuchung des Mechanismus, der der Hyperpolarisa- tion der Membran durch Butyrat zugrunde liegt. Butyrat wurde den Neuronen extrazellulär appliziert, wobei sich eine Hyperpolarisation des Membranpotentials um bis zu 15 mV (Abb. 25) einstellte. Bislang war unbekannt, ob die Konzentration von Butyrat einen Einfluss auf die Höhe der Hyperpolarisation hat. Daher wurde Na-Butyrat in unterschiedlichen Konzentrationen (10 - 100 mmol l-1) auf myenterische Neurone eingesetzt (Abb. 23). Durch eine ansteigende Butyratkonzentrati- onsreihe wurde das Membranpotential konzentrationsabhängig hyperpolarisiert. Anhand der Michaelis-Menten-Kinetik (Vmax = 25,9 ± 2,4 mV und Km = 29,7 ± 7,2 mmol l-1 ) lag die in den folgenden Versuchen eingesetzte Konzentration von 50 mmol l-1 Butyrat weit über der halbmaximalen Konzentration von rund 30 mmol l-1 , also im fast gesättigten Bereich (Abb. 24). Aus diesem Grund wurde in den vorliegenden Untersuchungen eine Butyratkonzentration von 50 mmol▪ l-1 gewählt. 63 Eine Möglichkeit, eine Hyperpolarisation der Membran auszulösen, ist eine Stimulation der K+-Leitfähigkeit. Dass eine solche auch dem Butyrateffekt zugrunde liegt, lässt sich daraus vermuten, dass Blockade von K+-Kanälen durch intrazellulär appliziertes Cs+, welches unselektiv eine Vielzahl von K+-Kanälen hemmt, die Butyratantwort unterdrückt (Haschke et al. 2002). Allerdings war es bisher nicht möglich, die betroffenen K+-Kanäle näher zu charakterisieren, da sich alle bisher getesteten selektiveren K+-Kanalblocker wie Ba2+, Tetraethylammonium (TEA) oder 4-Aminopyridin (4-AP) als unwirksam er- wiesen hatten. Aus Vorversuchen von Haschke et al. (2002) ist aber bekannt, dass bei der Butyrat-induzierten Hyperpolarisation Ca2+-Ionen beteiligt sind. Dies legt die Mög- lichkeit nahe, dass Ca2+-abhängige K+-Kanäle die Butyratwirkung vermitteln. Aus diesem Grunde wurde Charybdotoxin (CHTX), ein Gift des Scorpions Leiurus quinquestriatus hebraeus (Sugg et al. 1990), als spezifischer Blocker von Ca2+- aktivierbaren K+-Kanälen (Cui et al. 2001, Fu et al. 2002) eingesetzt. In einem ersten Ansatz wurde CHTX über die Patch-Pipette intrazellulär appliziert. In dieser Anordnung wirkte Charybdotoxin nicht (Daten nicht gezeigt). Wurde Charybdotoxin dagegen mit der extrazellulären Perfusionslösung gegeben, konnte Butyrat keine dauerhafte Hyperpolari- sation mehr bewirken (Abb. 28). Charybdotoxin bindet mit seiner helikalen Struktur (Abb. 27) an der extrazellulären Öffnung des K+-Kanals und blockiert damit den Ionentransport (Anderson et al. 1988, MacKinnon et al. 1989, 1990, Sugg et al. 1990). Charybdotoxin blockiert den Ionenfluss nicht nur an spannungsabhängigen und an Ca2+-aktivierbaren K+-Kanälen, sondern auch an einwärts-gleichrichtenden K+-Kanälen (Cui et al. 2001; Abb. 46). 64 Abb. 46: Modell eines Kaliumkanals, der in die Plasmamembran einer Zelle eingebettet ist. Der Kanal besteht aus vier Untereinheiten; die beiden vorderen sind nicht gezeich- net, um Einblick in die Kanalpore zu gewähren. K+-Ionen dringen von der Zellinnenseite in den Kanal ein und treffen auf eine enge Stelle, die Kanalpore, die nur K+-Ionen, nicht aber Na+-, Ca2+- oder Cl-- Ionen passieren lässt. Auf der Zellaußenseite hat der Kanal einen weiten Vorhof, in dem Charybdotoxin binden und damit den Kanal blockieren kann. Der Durchmesser eines Charybdotoxinmoleküls beträgt ungefähr 1,5 nm. Aus Biologie in unserer Zeit 32: 148-158; 2002 Die Bindung von Scorpiongiften aus der Charybdotoxin-Familie an K+-Kanäle ist mittler- weile auch auf molekularer Ebene relativ gut untersucht. Vier Strukturen in dem Molekül binden mit hoher Wahrscheinlichkeit elektrostatisch an bestimmte Domänen des K+-Ka- nals (Cui et al. 2001, 2002). Mit Hilfe dieser Strukturen konnte ein dreidimensionales Modell des Toxin-K+-Kanal-Komplexes durch Dreigruppenkontaktanalyse, elektrostati- sche Abhängigkeiten und durch Brownsche Dynamik-Simulationen (Abb. 47) hergeleitet werden. 65 Abb. 47: Verteilung von Charybdotoxin (Kugeln) um die extrazellulare Öffnung des K+-Kanals (Stabmodell). Um die Pore des Kanals ist die Aufenthaltswahrscheinlichkeit am höchsten. Ladungssymbole geben die Oberflächenla- dungen von K+-Kanal und Charybdotoxin weder (aus Cui et al. 2001, verändert). Wie erwartet trägt die extrazelluläre Öffnung des K+-Kanals ein großes negatives elek- trostatisches Potential, während die Oberfläche von Charybdotoxin ein positives elektro- statisches Potential aufweist. Zusätzlich ist das elektrostatische Potential des K+-Kanals an der Zellinnenseite negativ, während es innerhalb des Kanals positiv ist. Diese Ladungsverteilung zieht das Kaliumion zur Kanalöffnung. In den von mir durchgeführten Versuchen ließ sich beobachten, dass Charybdotoxin den Zeitverlauf der Wirkung von Butyrat (50 mmol l-1) auf das Membranpotential massiv verändert. In Anwesenheit des Charybdotoxins wurde die Zellmembran der Neurone nur noch für kurze Zeit durch Na+-Butyrat hyperpolarisiert. Im Unterschied zu den Kontroll- versuchen war die Hyperpolarisation nur noch transient und ging nach kurzer Zeit in 66 ++ - - - - + + - - + + + + + ++ + eine massive Depolarisation über (Abb. 28). Der Zeitverlauf dieser Hemmung der Buty- ratwirkung durch Charybdotoxin ist relativ gut mit den bekannten Bindungseigenschaf- ten von Charybdotoxin an K+-Kanäle erklärbar. Offenkundig stimuliert Butyrat auch in Gegenwart dieses Toxins initial noch das Öffnen der Kanäle. Dadurch steigt, wie am Skelettmuskel gezeigt wurde, die Affinität der K+-Kanäle für Charybdotoxin deutlich an (Anderson et al. 1988). Folge ist ein Schließen der Kanäle, was dann die Hyperpolari- sation beendet. Danach kehrte sich der Butyrateffekt bei der Mehrzahl der untersuchten Zellen in eine paradoxe, sekundäre Depolarisation um (Abb. 28). Der Grund für die Sekundärdepolari- sierung, die durch Butyrat in Anwesenheit von Charybdotoxin entsteht, ist nicht sicher bekannt. Sie könnte durch eine Stimulation von Ca2+-abhängigen Cl--Kanälen verur- sacht werden. Ca2+-abhängige Cl--Kanäle sind an myenterischen Neuronen der Maus nachgewiesen wurden (Kang et al 2003). Ihr Öffnen führt dazu, dass sich das Mem- branpotential näher zum Cl--Gleichgewichtpotential verschiebt (-32,8 mV unter den von mir gewählten Bedingungen mit 44 mmol l-1 Cl- in der Pipettenlösung und 149,9 mmol l-1 Cl- im Superfusionsmedium). Diese Phänomen wurde jedoch wegen der inkonsistenten Natur der Sekundärdepolarisation (und der hohen Kosten bei einer Superfusion mit Charybdotoxin) nicht weiter untersucht. In fast allen Zellen spielen intrazelluläre Ca2+-Speicher eine essenzielle Rolle bei der Kontrolle des zytosolischen Ca2+-Spiegels. Zellorganellen, wie z.B. Mitochondrien und das endoplasmatische Retikulum (ER), dienen als Ca2+-Speicher. Ein Ausstrom von Ca2+ aus diesen Speichern kann z.B. durch eine positive Rückkopplung über die Ca2+- induzierte Ca2+-Freisetzung ausgelöst werden, aber auch durch Botenstoffe wie z.B. Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3). Das endoplasmatische Retikulum bzw. im Muskel das sarkoplasmatische Retikulum steht im Mittelpunkt des Ca2+-Signalwegs. Unter physiolo- gischen Bedingungen spielen die Mitochondrien keine besondere Rolle während einer Signalübertragung, da sie erst durch hohe Ca2+-Konzentrationen stimuliert werden (Lee 1999); sie wirken im Gegenteil eher als Puffer, die stärkere Schwankungen der zytosoli- schen Ca2+-Konzentration durch Ca2+-Aufnahme dämpfen. Die Änderung im Membranpotential, die durch Butyrat induziert wird, wird durch eine Zunahme der intrazellulären Ca2+ Konzentration über eine Freisetzung von Ca2+ aus 67 Thapsigargin-sensitiven intrazellulären Speichern hervorgerufen (Haschke et al. 2002). Thapsigargin ist ein Gift, das die Ca2+-ATPase blockiert, welche Ca2+ wieder zurück in die Speicher pumpen kann. Es gibt zwei bekannte direkte Wege, die zu einer Ca2+-Freisetzung aus intrazellulären Speichern führen können. Eine Freisetzung über IP3-Rezeptoren (Bultynck et al. 2003) oder eine Freisetzung über Ryanodin-Rezeptoren (Franzini-Amstrong und Protasi 1997). Der erste Weg ist abhängig von der Stimulation der Phospholipase C, die Phos- phatidylinositol-4,5-bisphosphat in Inositol-1,4,5-trisphosphat (IP3) umwandelt, welches als intrazellulärer Botenstoff dient. Dadurch wird das endoplasmatische Retikulum zur Abgabe von Ca2+ Ionen in das Zytosol der Zelle stimuliert. Gleichzeitig entsteht Diacyl- glycerol, welches in der Zellmembran zurückbleibt und dort die Proteinkinase C aktiviert, welche über Phosphorylierung die Zellfunktionen beeinflussen kann. In meinen Experi- menten wurde Heparin, ein IP3-Rezeptor Antagonist (Bultynck et al. 2003), über die Patch-Pipette in die Zellen appliziert. Heparin hatte keinen Effekt auf die Butyratantwort (Abb. 30). Im folgenden Experiment wurde U-73122, ein Blocker der Phospholipase C (Taylor und Broad 1998), in die Zellen injiziert. Wie in Abb. 32 gezeigt, hatte auch dieser Hemmstoff keinen Einfluss auf die durch Butyrat induzierte Hyperpolarisation. Diese Beobachtungen sprechen gegen die Beteiligung der G-Protein/Phospholipase C- verbundenen Rezeptoren GPR41 oder GPR43 an der Butyratantwort der myenterischen Neurone. Wie vor kurzem gezeigt wurde, sind kurzkettige Fettsäuren in der Lage diese Rezeptoren zu stimulieren (Brown et al. 2003, Le Poul et al. 2003). GPR41 zum Beispiel wird stark im Fettgewebe exprimiert, während GPR43 überwiegend in den Monozyten oder neutrophilen Leukozyten (Brown et al. 2003) vorhanden ist. Es ist spekuliert worden, dass diese Rezeptoren eine Rolle bei der Aktivierung von Leukozyten spielen (Le Poul et al. 2003). Die oben genannten Befunde lassen aber eine Beteiligung dieser Rezeptorsignalwege mit nachgeschalteter Phospholipase C/IP3-Produktion an den kultivierten enterischen Neuronen als eher unwahrscheinlich erscheinen. Um die Beteiligung von Ryanodinrezeptoren an der Butyratantwort zu untersuchen, wur- de Ruthenium Rot, ein Blocker von Ryanodinrezeptoren (Sorrentino 1995, Franzini- Amstrong und Protasi 1997), über die Patch-Pipette in die Zelle appliziert. Ruthenium Rot verrin