Genotyp-Phänotyp-Korrelation bei Patienten mit frühkindlicher Netzhautdegeneration und Sequenzvariationen im CEP290-Gen Inauguraldissertation zur Erlangung des Grades eines Doktors der Medizin des Fachbereichs Medizin der Justus-Liebig-Universität Gießen vorgelegt von Ute Schneider aus Gierstädt/OT Kleinfahner Gießen (2017) Aus dem Labor für Molekulare Ophthalmologie an der Klinik und Poliklinik für Augenheilkunde der Justus-Liebig-Universität Gießen Direktorin der Klinik: Prof. Dr. med. Birgit Lorenz Gutachter: PD Dr. Preising Gutachter: Prof. Dr. Müller Tag der Disputation: 01.08.2017 Inhaltsverzeichnis 1. Einleitung 1.1. Die Retina 1.2. Die Photorezeptoren 1.3. Die Zilien 1.4. Ziliopathien 1.4.1. Frühkindliche Netzhautdystrophien 1.4.1.1. Leber`sche Kongenitale Amaurose (LCA) 1.4.1.2. Retinitis pigmentosa (RP) 1.4.2. Ziliopathien 1.4.2.1. Senior-Løken-Syndrom (SLS) 1.4.2.2. Joubert-Syndrom (JBTS) 1.4.2.3. Meckel-Gruber-Syndrom (MKS) 1.4.2.4. Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) 1.4.2.5. Usher-Syndrom 1.5. CEP290 1.6. Aufgabenstellung 2. Material und Methoden 2.1. Das Patientenkollektiv 2.2. Materialnachweis 2.3. Instrumenten- und Gerätenachweis 2.4. Methoden 2.4.1. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) 2.4.2. Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren und deren Nachweis 2.4.2.1. Die Agarose-Gelelektrophorese 2.4.2.2. DNA-Färbung im Agarosegel mit Ethidiumbromid 2.4.2.3. Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) 2.4.2.4. Silberfärbung von Polyacrylamidgelen 2.4.2.5. Sequenzierung 2.4.2.6. High Resolution Melting (HRM) 3. Ergebnisse 3.1. Das Patientenkollektiv 3.2. Identifizierte Sequenzvariationen im CEP290-Gen 3.2.1. Ablauf der Screeninguntersuchung 3.2.2. Sequenzvariationen im CEP290-Gen – Ergebnisse des Mutationsscreenings 3.3. Mutationsformen 3.3.1. Splice-Site Mutationen 3.3.2. Nonsense-Sequenzvariation 3.3.3. Missense-Mutation 3.3.4. Leserasterverschiebungen 3.3.5. Isokodierende Polymorphismen im CEP290-Gen 3.4. Augenärztliche Daten der Patienten mit Sequenzvariationen im CEP290-Gen 4. Diskussion 4.1. Technische Bewertung 4.1.1. Bewertung der Single Strand Conformation Polymorphismus (SSCP)-Analyse 4.1.2. Bewertung der High Resolution Melting (HRM)-Analyse 4.2. Pathogenes Potential der Sequenzvariationen im CEP290-Gen 4.3. Vergleich des Phänotyps der CEP290-Patienten 4.4. Molekulargenetische Bewertung 4.5. Bewertung der Genotyp-Phänotyp-Korrelation 4.6. Schlussgedanke 5. Zusammenfassung Summary 6. Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 7. Abkürzungsverzeichnis 8. Literaturverzeichnis / Quellenangaben 9. Ehrenwörtliche Erklärung 10. Danksagung 1. Einleitung 1. Einleitung 1.1. Die Retina Die Netzhaut ist entwicklungsgeschichtlich und funktionell ein vorgeschobener Anteil des Gehirns (Vorderhirn). Die Photorezeptoren stellen einen Teil des Gehirns dar [15; 19; 33; 60]. Die Netzhaut besitzt drei hintereinander geschaltete Neurone: die Photorezeptoren, die Bipolar- und die Ganglienzellen [19; 30; 33; 60]. Das einfallende Licht durchläuft alle Netzhautschichten, bis es an der äußersten Schicht, der Rezeptorenschicht, ankommt. Die Ganglienzellschicht setzt sich aus den Ganglienzellen (3. Neuron) zusammen. Die Axone der Ganglienzellen (Nervenfaserschicht) und die Membrana limitans interna grenzen die Retina vom Glaskörper ab. An der Papille finden alle Ganglienzell- Axone zusammen und bilden von dort an den Sehnerv. Sie sind in der Retina nicht myelinisiert [19; 30; 32; 33; 60]. Die innere Körnerschicht wird durch die Zellkerne der Bipolarzellen (2. Neuron), Horizontalzellen und amakrinen Zellen gebildet. Die innere plexiforme Schicht durch deren Axone. Sie erfüllen die Funktion der horizontalen Verschaltung und Informationsverarbeitung [19; 30; 33; 60]. In der Rezeptorenschicht, die den Bereich zwischen der äußeren plexiformen Schicht und der Schicht der Photorezeptoraußensegmente umfasst, trifft der einfallende Lichtstrahl auf die Photorezeptoren. Die äußere Körnerschicht wird durch die Zellkerne der Photorezeptoren (1. Neuron) gebildet [19; 30; 33; 60]. Die Retina enthält ca. 127 Mio. Photorezeptoren. Im Zentrum der Netzhaut befindet sich die Macula lutea (Gelber Fleck). Sie enthält eingelagertes gelbliches Pigment (Lutein und Zeaxanthin). In der Macula lutea sind vorwiegend Zapfen vorzufinden, die für das Tag- und Farbsehen verantwortlich sind. In ihrem Zentrum liegt die gefäßfreie Netzhautgrube (Fovea centralis retinae), die Stelle des schärfsten Sehens. Sie befindet sich drei bis vier Millimeter temporal und etwas unterhalb der Papille. In der Foveola (Zentrum der Fovea) sind nur Zapfen vorhanden, die einzeln innerviert sind. In der Peripherie der Netzhaut befinden sich vorwiegend Stäbchen, die für das Dämmerungs- und Nachtsehen zuständig sind [15; 19; 30; 33; 60; 62]. Die Photorezeptoren liegen über dem retinalen Pigmentepithel (RPE). Ohne Anbindung an das Pigmentepithel können die Photorezeptoren ihre Funktion nicht wahrnehmen [15; 19; 30; 33; 60; 62]. Das RPE stellt die Verbindung der Netzhaut mit der Aderhaut (Chorioidea) dar. Das RPE reduziert die Reflektion, der von den Photorezeptoren nicht absorbierten Lichtquanten, durch die Choroidea und Sklera. Eine Verringerung des räumlichen Auflösungsvermögens wird dadurch vermieden [60]. Das Pigmentepithel ist von Bedeutung bei der Versorgung der Photorezeptoren sowie bei der Erneuerung der Photorezeptoren und der Entsorgung von Stoffwechselendprodukten (z.B. abgestoßene Außensegmente der Photorezeptoren, gebleichter Chromophor) [15; 30; 32; 33; 60]. Von der Aderhaut (Chorioidea) wird das Pigmentepithel durch die Bruch-Membran abgegrenzt. Die Chorioidea dient den äußeren Netzhautschichten zur Ernährung und Temperaturregulation. Müller- 1 1. Einleitung Stützzellen, spezielle Gliazellen, befinden sich in allen Netzhautschichten und verankern die Retina [19; 30; 32; 33; 60]. Abb. 1: Schnitt durch die humane Netzhaut (Mit freundlicher Genehmigung von PD Dr. M. Preising) 2 1. Einleitung 1.2. Die Photorezeptoren Die Retina enthält zwei verschiedene Sinneszellen (Photorezeptoren), die Stäbchen und die Zapfen. Die Stäbchen sind verantwortlich für die Hell-Dunkel-Empfindlichkeit (Dämmerungs-, Nachtsehen). Die Zapfen sind zuständig für die Farbempfindlichkeit (Tag-, Farbensehen). Das Sehpigment Rhodopsin ist in den Stäbchen, und die lang-, mittel- und kurzwelligen Sehpigmente sind in den Zapfen zu finden [15; 19; 30; 33; 60; 62]. Die Zapfen werden in drei verschiedene Typen eingeteilt, die für das trichromatische Farbensehen verantwortlich sind: Rot- (langwellig), Grün- (mittelwellig) und Blauzapfen (kurzwellig) [19; 33; 60]. Stäbchen und Zapfen sind auf der Netzhaut unterschiedlich verteilt. In der Fovea centralis sind nur Zapfen vorhanden, deren Dichte zur Peripherie hin schnell abnimmt. Die höchste Stäbchendichte ist ca. 30 Grad rings um die Fovea centralis zu finden. An der Papilla nervi optici sind keine Photorezeptoren vorhanden. Diese Stelle wird aufgrund dessen als blinder Fleck bezeichnet [15; 19; 30; 33; 60; 62]. Im direkten Kontakt mit dem Pigmentepithel befindet sich das äußere Segment der Stäbchen und Zapfen. Es ist in eine Vertiefung der Pigmentepithelzellen eingelagert. Das Außensegment ist lichtsensitiv. Bei den Stäbchen stellt das äußere Segment einen Membranzylinder dar, in dem sich mehrere tausend gleichgroße scheibenförmige Membransäckchen befinden. Die Membransäckchen sind vom Plasmalemma umhüllt. Das äußere Segment der Zapfen nimmt eine eher konische Form ein, bei der die proximalen Einstülpungen der Zellmembran größer sind als die distalen [26; 30; 32; 62]. Dem äußeren Segment folgt das innere Segment. Verbunden sind beide Segmente durch ein Übergangsstück. Dieses hat eine dünne exentrische Form und enthält das verbindende Zilium [26; 30; 56]. In dem inneren Segment befinden sich die Zellorganellen (Endoplasmatisches Retikulum, Golgi- Apparat und Mitochondrien). Es wird unterteilt in einen distalen azidophilen Bereich (Ellipsoid) und einen proximalen basophilen Bereich (Myoid). Der Zellkörper geht in einen Fortsatz über, in dem sich wie bei einem Axon Filamente und Mikrotubuli befinden. Entweder ist der Zellkern am Übergang vom inneren Segment zum Axon zu finden oder im Bereich des Axons. Das innere Segment bildet am apikalen Ende eine Synapse und stellt damit den Kontakt mit der nachgeschalteten Bipolarzelle her [26; 30; 32; 62]. Das äußere Segment wird permanent regeneriert. Alte Membranscheiben werden an der Spitze abgestoßen und vom Pigmentepithel phagozytiert (die der Stäbchen morgens, die der Zapfen abends). Neue Membranscheiben werden von dem inneren Segment nachgeschoben. Photorezeptoren sind terminal differenzierte Zellen, die nicht erneuert werden [26; 30; 60; 62]. 3 1. Einleitung 1.3. Die Zilien Die Zilien (Flimmerhärchen) sind schlanke - röhrenförmige, haarähnliche, 5 - 10 µm lange und 250 nm dicke Zellorganellen, die wie kleine Antennen aus der Zelloberfläche herausragen [1; 21; 26; 35; 40; 56; 59]. Die primären Zilien sind auf den meisten Zelltypen im Körper zu finden. Diese sind, bedingt durch ihre innere Struktur, von den motilen (beweglichen) Zilien zu unterscheiden. Die beweglichen Zilien sind nur in bestimmten Organen anwesend und besitzen eine bedeutende Rolle bei intra-, und extrazellulären Transportvorgängen. Dazu gehört die Zellbewegung, zum Beispiel der Spermien oder der Transport der Einzelle im Eileiter (sexuelle Reproduktion). Weiterhin spielen sie eine Rolle bei der Transportbewegung von Flüssigkeiten im Körper, beispielsweise in der Niere oder bei dem Transport des Schleims und der Schmutzstoffe entlang der Trachea aus der Lunge heraus [1; 3; 21; 26; 35; 40; 53; 56]. Im Gegensatz dazu dienen die primären Zilien als Bindeglieder und erfüllen eine Vielzahl von Funktionen als Mechano-, Chemo- und Osmosensoren sowie bei der Durchführung und Kontrolle von zahlreichen Signalwegen zwischen Zellen. Dadurch spielen sie eine wichtige Rolle bei der Koordination von Zellwachstum, Polarität und Differenzierung der Zelle [1; 3; 21; 26; 35; 40; 53; 56; 59]. Die Zilien sind von der Zellmembran umhüllt, die auch den Rest der Zelle umgibt. Das Axonem stellt das Grundgerüst der Zilie dar. Dieses Faserbündel besteht aus Mikrotubuli. Die primären Zilien weisen eine 9x2+0-Anordnung auf (ohne die zentralen Mikrotubuli). Die motilen Zilien besitzen, durch zwei zusätzliche zentrale Mikrotubuli, eine 9x2+2-Struktur der Mikrotubuli [1; 3; 21; 26; 35; 40; 53; 56; 59]. Hierbei werden zwei einzelne, voneinander getrennte, zentrale Mikrotubuli von neun Mikrotubuli- Dubletten (Doppelröhren) kranzförmig umgeben. Eine zentrale Hülle umgibt die zwei zentralen Mikrotubuli. Die peripheren Mikrotubuli-Dubletten beinhalten einen komplett aufgebauten A- und einen halbmondförmig angelagerten B-Tubulus. Durch Dyneinarme (innere und äußere) sind die peripheren Mikrotubuli-Dubletten verbunden. Hierbei reichen die Dyneinarme vom A-Tubulus einer Dublette zum B-Tubulus der nächsten Mikrotubuli-Dublette. Auf den primären Zilien sind keine Dyneinarme vorhanden. Die im Kreis angeordneten peripheren Mikrotubuli-Dubletten sind über Nexine (Brücken zwischen den Dubletten) ringförmig verbunden. Zu den zwei einzelnen zentralen Mikrotubuli besteht eine Verbindung über radiär angeordneten Speichen. Das Axonem durchzieht die ganze Zilie und ist im Cytoplasma über einen Basalkörper verankert. Der Basalkörper ist eine spezialisierte Zentriole mit einem Strukturmuster von 9x3 Mikrotubuli [1; 21; 53; 59]. Verantwortlich für die aktive Bewegung der motilen Zilien sind die Dyneine, die mit dem A-Tubulus fest verankert und mit dem B-Tubulus, der benachbarten peripheren Mikrotubuli-Dublette, reversibel verbunden sind. Der Bewegungsmechanismus ist energieabhängig und stellt ein Aneinandergleiten der peripheren Mikrotubuli-Dubletten bei gleichzeitiger Krümmung der Zilie dar. Hierbei dienen die Nexine zur Fixierung und Verankerungen der Mikrotubuli-Dubletten an der 4 1. Einleitung Zilienbasis. Jede Zilie bewegt sich gegenüber ihrer Nachbarzilie zeitlich gering versetzt. Dadurch kommt es zu einer wellenförmigen Bewegung (metachrone Bewegung) [53; 59]. In der Abbildung 2 ist ein Photorezeptor mit verbindendem Zilium dargestellt. Der Photorezeptor ist unterteilt in das Außensegment, das verbindende Zilium und das Innensegment. Das Außensegment enthält einen Stapel aus flach liegenden Vesikeln, den Disks. In deren Diskmembran erfolgt der photochemische Prozess der Sehkaskade. Die notwendige Energie erhält das Außensegment aus dem Innensegment, in dem die Synthese der essentiellen Substanzen zur Phototransduktion erfolgt. Das Außen- und Innensegment ist über eine Zilie verbunden [1; 3; 21; 26; 35; 40; 53; 56; 59]. Das Photorezeptoraußensegment mit dem verbindenden Zilium ist eine in Struktur und Funktion spezialisierte primäre Zilie. Funktionell stellt sie eine Verbindungszilie dar. Die innere Struktur der Photorezeptor-Zilie entspricht einer primären Zilie [1; 3; 26; 40; 56]. Abb. 2: Aufbau des Photorezeptors mit verbindendem Zilium Das verbindende Zilium ist eine primäre Zilie. (Mit freundlicher Genehmigung von PD Dr. M. Preising) Funktionell dient die Photorezeptor-Zilie dem interflagellaren Transport (IFT) von Proteinen und essentiellen Substanzen (beispielsweise der retinalen Guanylatzyklase (RetGC), Rhodopsin, Transduzin oder Arrestin) und Lipiden (zur Erneuerung der Membranscheibchen). Diese werden bei der Phototransduktion, der Instandhaltung und Funktion des äußeren Segmentes benötigt (anterograder IFT, in Richtung der Zilie). Der anterograde IFT erfolgt von dem inneren zum 5 1. Einleitung äußeren Segment, dem Axonem entlang. Ursächlich dafür ist die Synthese aller essentiellen Substanzen im inneren Segment. Der retrograde IFT, zur Basis (Richtung Zellkörper) ist für den Rücktransport des Materials zur Wiederaufbereitung zuständig [1; 3; 26; 40; 56]. Die Transportbewegungen werden durch molekulare Motoren ermöglicht. Der anterograde Transportweg erfolgt durch Kinesine (KIF3A, KIF3B) und der Retrograde durch Dynein1B. Der IFT- Transport stellt die ständige Erneuerung der Membranscheibchen des äußeren Segmentes sicher. Die neuen Membranscheibchen werden an der Basis des äußeren Segmentes nachgeschoben. Die Entsorgung findet am apikalen Ende statt. Findet der Abtransport nicht statt, stirbt die Zelle [1; 3; 21; 26; 40; 56]. Eine Sequenzvariation in Genen, die für Proteine kodieren, die zum Aufbau der Zilien und/oder den Proteintransport benötigt werden, führen zur Photorezeptordegeneration. Aufgrund des vielfältigen Vorkommens von primären Zilien auf vielen unterschiedlichen Zelltypen kann die Photorezeptordegeneration mit anderen klinischen Manifestationen verbunden sein, die unter dem Begriff Ziliopathien zusammengefasst werden [1; 3; 26; 40; 56]. 1.4. Ziliopathien Unter dem Begriff Ziliopathien wird eine große Vielfalt von Erkrankungen zusammengefasst, deren Ursache in einer Störung der Struktur und/oder Funktion von Zilien liegt. Die genetische Veränderung kann zum einen ein einzelnes Organ (oder Gewebe) betreffen (isolierte Ziliopathie). Zum anderen kann die Ziliopathie sich in einem Syndromspektrum manifestieren, wobei verschiedene Organe betroffen sein können. Dabei ist eine große phänotypische Variabilität zu verzeichnen. Die Pleiotropie der Zilienproteine basiert auf deren Organspezifität und der Protein- Protein-Wechselbeziehung [3; 21; 26; 27; 35; 40; 56]. Einen weiteren Einfluss auf die Manifestation hat die allelische Heterogenität. Diese führt aufgrund der funktionellen Eigenarten einer jeden Sequenzvariation zu vielfältigen phänotypischen Ausprägungen und zum Teil auch zu Syndromen, wie im Fall des CEP290. Hier werden isolierte Ziliopathien wie Retinitis pigmentosa, Leber`sche Kongenitale Amaurose und Nephronophthisis, wie auch ziliopathieassoziierte Syndrome wie zum Beispiel Joubert-Syndrom, Senior-Løken- Syndrom und Meckel-Gruber-Syndrom beschrieben. Aus der Vielzahl der betroffenen Organe kann die große Vielfalt der phänotypischen Manifestationen abgeleitet werden, in denen die Zilienfunktion für eine adäquate Entwicklung und Aufrechterhaltung der Gewebe eine bedeutende Rolle spielt. Zu diesen Organen zählen hauptsächlich das Auge und dort die Netzhaut (Netzhautdegeneration), die Niere (Nephronophthisis), das zentrale Nervensystem (Encephalocele), mentale Retardierung, das Herz (Anomalien (Vitien: Pulmonalklappenstenose; Herzrhythmusstörungen), die Leber (Leberfibrose), die Bauchspeicheldrüse (Zysten), die Lunge (Bonchiektasien), die Nase (Anosmie) und das Ohr (Schwerhörigkeit). Weiterhin spielt die Zilienfunktion in der Embryologie eine bedeutende Rolle bei der Entwicklung der 6 1. Einleitung Achsendeterminierung (Situs inversus), der Links-rechts-Symmetrie, der Gliedmaßen (Polydaktylie) und orofazialer Strukturen (offener Gaumen). Zur sexuellen Reproduktion sind Zilien unerlässlich. Sie sind auf den Epithelien der Eileiter vorhanden. Die Motilität der Spermien, beispielsweise durch den Eileiter, erfolgt durch Flagellen. Die Flagellen der Spermien sind modifizierte bewegliche Zilien. Ist die sexuelle Reproduktion betroffen, kann eine Infertilität hervorgerufen werden [3; 14; 21; 27; 40; 56]. Die zentrale Steuerung der Nahrungsaufnahme wird von der Zilienfunktion mit beeinflusst. Dies wird als Ursache der Entstehung der Adipositas bei Ziliopathie-Patienten diskutiert [40]. Weiterhin spielen Zilien bei der Entwicklung von Gehirnstrukturen eine entscheidende Rolle, beispielsweise beim Hypocampus und Hypothalamus, da z.B. die Leptinrezeptoren der Neuronen des Hypothalamus auf der ziliären Membran lokalisiert sind [3; 14; 21; 27; 40; 56]. Häufig ist die primäre Zilie (Verbindungszilie) des Photorezeptors betroffen. Sie verbindet das äußere mit dem inneren Segment, und ermöglicht den Transport von molekularbiologischen Substanzen und Abbauprodukten. Dies ist entscheidend für das Aufrechterhalten und Funktionieren der Photorezeptoren. Die Zilie des Photorezeptors teilt wichtige regulierende Schlüsselmechanismen mit Zilien anderer Zelltypen. Sequenzvariationen der Photorezeptor-Zilie und/oder dessen Transportproteine kann zur Photorezeptordegeneration führen. Zusätzlich können weitere klinische Manifestationen in verschiedenen Organen, durch die Fehlfunktion der primären Zilie und/oder der Transportproteine, verursacht werden [26; 40; 56]. 1.4.1. Frühkindliche Netzhautdystrophien 1.4.1.1. Leber`sche Kongenitale Amaurose (LCA) Theodor Carl Gustav von Leber beschrieb im Jahre 1869, erstmals die Leber`sche Kongenitale Amaurose, die als schwere Sehbeeinträchtigung von Geburt an beobachtet wird. Diese Beobachtung bezeichnete er als eine tapeto-retinale Degeneration mit Amaurosis [11; 19; 55]. Die LCA ist eine Erbkrankheit, die meist autosomal-rezessiv vererbt wird. Es kommen jedoch auch Fälle mit einem autosomal-dominanten Erbgang vor [11; 46; 54; 55]. Die LCA stellt eine heterogene Gruppe von Netzhaut-Aderhaut-Dystrophien dar. Es liegt eine ausgeprägte klinische Heterogenität vor, die sich als Zapfen-Dystrophie, Zapfen-Stäbchen-Dystrophie und Stäbchen- Zapfen-Dystrophie darstellen kann [54]. Klinisch manifestiert sich die Leber`sche Kongenitale Amaurose mit einer ausgeprägten Sehbeeinträchtigung (mit Gesichtsfeldeinschränkung) oder Blindheit bei der Geburt oder kurz nach der Geburt (innerhalb des ersten Lebensjahres). Die Ausprägung ist individuell. Zum Teil ist noch eine Lichtwahrnehmung vorhanden, und in einigen Fällen wird eine geringe Sehschärfe erreicht. Diese Sehreste können für die Patienten in der Jugend noch einige Jahre von Nutzen sein [11; 19; 46; 54; 55]. In der Literatur werden weitere Erkrankungssymptome aufgelistet, die in Erscheinung treten 7 1. Einleitung können: Nystagmus, Strabismus, herabgesetzte Blendungsempfindlichkeit, fehlende Reaktion auf Lichtreize, Störungen des Nacht- und Farbsehens, herabgesetzte oder fehlende Pupillen- Lichtreaktion, Hyperopie, Linsentrübung (Katarakt), Keratokonus und eine Photophobie sind möglich. Manche Patienten sind photophil. Sie wenden sich starken Lichtquellen zu [11; 46; 55]. Die Patienten können durch das okulodigitale Phänomen (Augenbohren) in Erscheinung treten, bei dem durch Druck mit den Fingern auf den Bulbus versucht wird, Lichtphänomene auszulösen [19; 46]. Im Frühstadium kann sich der Augenhintergrund sowohl unauffällig bis schwer atrophisch darstellen. Im Verlauf können sehr verschieden ausgeprägte Befunde festgestellt werden, die Pigmentepitheldefekte, knochenkörperförmige Ablagerungen, Blutgefäßverengungen, Aderhautatrophie und Optikusatrophie umfassen [11; 46; 54; 55]. Die genetischen Veränderungen betreffen bereits frühzeitig die Funktion der Stäbchen und Zapfen- Reizantworten. Aufgrunddessen sind im Ganzfeld-Elektroretinogramm (ERG) skotopische (Stäbchen) und photopische (Zapfen) Reizantworten nicht oder nur sehr gering ableitbar [11; 46; 54; 55]. Zu den ursächlich veränderten Genen gehören: GUCY2D (LCA1), RPE65 (LCA2), SPATA7 (LCA3), AIPL1 (LCA4), LCA5, RPGRIP1 (LCA6), CRX (LCA7), CRB1 (LCA8), CEP290 (LCA10), IMPDH1 (LCA11), RD3 (LCA12), RDH12 (LCA13), ALMS1, CABP4, CNGA3, IQCB1, KCNJ13, LRAT, MYO7a, PDE6C, TULP1. Sequenzvariationen in diesen Genen liegen bei 70 - 80% der LCA-Patienten der Erkrankung zugrunde. Für die anderen Patienten mit LCA konnten aktuell die ursächlichen Gene noch nicht identifiziert werden [11; 46; 54; 55]. Sequenzvariationen in den fünf Genen, AIPL1, CEP290, GUCY2D, RDH12 und RPGRIP stellen aktuell die häufigste Ursache der LCA dar. Phänotypisch können hier meist schwerwiegende Retina-Veränderungen verzeichnet werden [54; 55]. CEP290 ruft circa 15 - 22% der Fälle (je Literaturangabe schwankend) und GUCY2D circa 12% der Fälle hervor [37; 70]. Eher sporadisch treten Sequenzvariationen in den Genen RD3, LCA5, CABP4, IMPDH1, IQCB1, KCNJ13, PDE6C, SPATA7, TULP1, ALMS1, CNGA3 und MYO7a bei LCA auf [54; 55]. Vier dieser LCA verursachenden Gene kodieren für ziliäre Proteine und können zu Ziliopathien führen. Diese sind CEP290, TULP1, RPGRIP und LCA5 [11]. Abhängig von der Sequenzvariation eines Proteins und dessen Restfunktion prägen die Patienten eine schwere Sehbeeinträchtigung bereits im ersten Lebensjahr aus, und werden in diesem Zusammenhang als LCA-Patienten klassifiziert. Im Gegensatz dazu berichtete von Leber in einer Publikation von 1916 über eine mildere Verlaufsform, der von ihm beschriebenen Erkrankung, die erst im sechsten bis siebten Lebensjahr begann und erst in der vierten Dekade zur Erblindung führte. Dieses Patientenkollektiv erfüllt nicht die Charakteristika der „klassischen“ LCA. Für diese Patienten prägten Lorenz und Mitarbeiter den Begriff frühkindliche Netzhautdegeneration (Early- onset severe retinal dystrophien, EOSRD). Der Begriff wird allerdings nicht einheitlich in der Literatur angewendet [68; 73]. 8 1. Einleitung Die EOSRD ist eine heterogene Erbkrankheit. Weleber und Kollegen beschreiben zum einen einen hauptsächlichen autosomal-rezessiven Erbgang. In wenigen Fällen kann ein autosomal- dominanter Erbgang bei frühkindlichen Formen auftreten. Die autosomal-rezessive Form ist bei den Genen AIPL1, CEP290, CRB1, GUCY2D, IQCB1, LCA5, LRAT, MERTK, RD3, RDH12, RPGRIP1, RPE65, SPATA7 und TULP1 beobachtet worden, die autosomal-dominante Form bei den Genen CRX und IMPDH1. Die Liste der beteiligten Gene expandiert derzeit schnell, wobei in letzter Zeit vor allem Gene identifiziert wurden, die nur wenige Familien betreffen [55; 68; 73; 75; 77; 79; 80; 82]. 1.4.1.2. Retinitis pigmentosa (RP) Im Jahre 1855 prägte der Niederländer Franz Donders den Begriff Retintis pigmentosa. Er beschrieb vor allem die knochenkörperähnlichen Pigmentablagerungen und die Gefäßveränderungen. Als Synonym wurde der Begriff Retinopathia pigmentosa eingeführt, da es sich nicht primär um eine Entzündung handelt (Retinitis = Entzündung der Netzhaut). Bei der klassischen RP sind am Augenhintergrund Pigmentverklumpungen und -ablagerungen zu finden. Aufgrund dessen wurde der Begriffsteil pigmentosa gewählt [7; 33; 48]. Die Retinitis pigmentosa stellt eine heterogene Gruppe von Netzhaut-Dystrophien dar. Es erfolgt eine chronisch progrediente Zerstörung der Photorezeptoren (meist bevorzugt zuerst die Stäbchen und später die Zapfen) und des Pigmentepithels der Retina [7; 19; 22; 26; 33; 48]. Sekundär kann die Degeneration anderer Netzhautschichten beobachtet werden, wie auch eine Optikusatrophie, Nachtblindheit, Gesichtsfeldeinschränkung, Visusreduktion bis Erblindung, Blendungsempfindlichkeit sowie Abnahme des Dämmerungs-, Kontrast- und Farbsehens [7; 19; 26; 33; 48]. Das Vorhandensein der klinischen Merkmale, ihr zeitliches Auftreten und deren Ausprägung ist individuell. Der Verlauf ist schleichend und kann sich über Jahrzehnte erstrecken. Die RP stellt derzeit die häufigste Ursache des Sehverlustes im mittleren Erwachsenenalter dar [19; 26; 33]. Die ophthalmologischen Befunde der klassischen Retinitis pigmentosa (Stäbchen-Zapfen- Dystrophie) sind knochenkörperähnliche Pigmentverklumpungen und -ablagerungen der äußeren und mittleren Netzhautperipherie. Die Netzhautarterien erscheinen sehr eng. Die Papille ist wachsgelb gefärbt und atrophisch [19; 26; 33]. Das ERG ist schon im Frühstadium des Krankheitsverlaufes stark reduziert bzw. unterhalb der Nachweisgrenze, wodurch sich teilweise Überlappungen zu den frühkindlichen Netzhautdegenerationen ergeben [19; 26]. Aufgrund der vielfältigen klinischen Überlappung werden mit dem Begriff Retinitis pigmentosa verschiedene Formen erblicher Netzhauterkrankungen verknüpft. An dieser Stelle werden daher einige Formen aufgelistet, die in der Literatur beschrieben werden: 1. klassische / primäre RP = Stäbchen-Zapfen-Dystrophie 9 1. Einleitung 2. inverse RP = Zapfen-Stäbchen-Dystrophie (zuerst sind hauptsächlich Zapfen betroffen) 3. Pseudo-Retinitis pigmentosa (Phänokopien) (Ähnliche Veränderungen des Augenhintergrundes werden z. B. durch Entzündungen, Autoimmunerkrankungen oder Vergiftungen hervorgerufen) 4. Syndromale Retinitis pigmentosa (Hierbei tritt die RP und andere schwerwiegende Augenveränderungen, verbunden mit weiteren Organerkrankungen auf. Hierzu zählen u. a. die Ziliopathien die im Verlauf näher erläutert werden) [19; 33]. Die RP ist eine Erbkrankheit. In der Literatur werden aktuell drei Vererbungswege beschrieben: autosomal-rezessiv, autosomal-dominant und geschlechtsgebundene Vererbung (X-chromosomal) [7; 19; 26; 33; 48]. Patienten mit autosomal-dominanter Vererbung weisen, im Gegensatz zu den autosomal- rezessiven und X-chromosomalen Formen, oft erst im späteren Lebensalter eine erhebliche Sehverschlechterung auf [19]. Je nach Literaturangabe schwanken die Angaben. Hosch und Kollegen berichten, dass die autosomal-dominante Form ca. 30 - 40% der RP-Fälle ausmacht, die autosomal-rezessive Vererbung 50 - 60% und die X-chromosomale Form 5 - 15%. Retinitis pigmentosa kann als isolierte Erkrankung wie auch als Syndrom mit extraokulären Symptomen assoziiert auftreten [26]. Für die X-chromosomale Retinitis pigmentosa wurden sechs Genorte beschrieben. Für zwei davon RP2 und RP3 (RPGR) sind die ursächlichen Gene bereits beschrieben und gehören in die Gruppe der ziliopathieassoziierten Gene [22; 82]. Ca. 80% der Patienten mit X-chromosomaler RP zeigen Sequenzvariationen im RPGR-Gen. RPGR interagiert mit CEP290 [26]. Für RP6, RP23, RP24 und RP34 müssen die ursächlichen Gene noch identifiziert werden [22; 82]. Für den autosomal-dominanten Erbgang sind derzeit 23 und für den autosomal-rezessiven 39 identifizierte Loci beschrieben worden [82]. 1.4.2. Ziliopathien 1.4.2.1. Senior-Løken-Syndrom (SLS) Bei dem Senior-Løken-Syndrom (SLS) ist eine Kombination von Nephronophthisis (NPHP) und Netzhautdegeneration vorzufinden. Das SLS wird, wie die isolierte NPHP, autosomal-rezessiv vererbt [12; 27; 40]. Das Endstadium der Nierenerkrankung ist verbunden mit Niereninsuffizienz, Nierenversagen und Dialysepflichtigkeit. Ihr Verlauf ist chronisch und progressiv, und sie wird in drei Formen (die infantile, die juvenile und die adolescente Form) unterteilt [12; 27; 40]. Bei ca. 15 % der Patienten mit Nephronophthisis wurde eine Netzhautdegeneration festgestellt. Die Kombination NPHP und Netzhautdegeneration trat am häufigsten bei der juvenilen Form der Nephronophthisis auf [12; 27; 40]. 10 1. Einleitung In der Literatur wird die Netzhautdegeneration hauptsächlich in zwei Formen unterschieden: die Leber`sche Kongenitale Amaurose und die tapeto-retinale Degeneration. Die LCA stellt die schwerwiegendere Verlaufsform dar, die schon im Säuglingsalter auftreten kann (siehe 1.4.1.1. Leber`sche Kongenitale Amaurose (LCA)). Die tapeto-retinale Degeneration stellt die mildere Verlaufsform dar [12; 27; 40]. Mockel und Kollegen verweisen aktuell auf 11 NPHP-Gene (NPHP 1-11), die eine Nephronophthisis verursachen. Sie berichten, dass SLS-Fälle durch die NPHP-Gene (außer NPHP7) hervorgerufen wurden. Sequenzvariationen in NPHP5 und NPHP6 waren häufiger mit Netzhautdegenerationen verbunden, die in jüngerem Lebensalter begannen und einen schwereren Verlauf aufzeigten [40]. 1.4.2.2. Joubert-Syndrom (JBTS) Das Joubert-Syndrom wurde auch als Joubert-Bolthauser-Syndrom, Vermis-Agenesie und Cerebello-Parenchymale Störung IV bezeichnet [14]. Es gehört ebenfalls in den Komplex der ziliopathieassoziierten Syndrome und wird autosomal-rezessiv vererbt [12; 14; 17; 27; 40; 44; 47]. In der Literatur wird das JBTS durch Mittel- und Hinterhirnveränderungen (Vermis-cerebelli- Aplasie), Okzipitale Meningoenzephalozele, Hydrozephalus, degenerative Veränderungen der Retina (Netzhautdegeneration, Retina-Dystrophy, LCA), der Aderhaut und des Nervus opticus, Strabismus, Nystagmus (oft von Geburt an), Amblyopie, Ptosis, Kolobom der Aderhaut und der Retina, Drusenpapille, Hypotonie, Hyperpnoe, Tachypnoe, Apnoe (vor allem bei Säuglingen, Apnoe kann auch bei älteren Kindern vorkommen), Nierenveränderungen (Nephronophthisis, Zystennieren), Leberfibrose, Polydaktylie (der oberen und/oder unteren Extremitäten), Ataxie, Tremor, Protrusion der Zunge und endokrine Veränderungen charakterisiert. Des weiteren kann eine Entwicklungsverzögerung und geistige Retardierung beobachtet werden [12; 14; 27; 40; 44; 47; 64]. Es besteht eine große Variabilität in dem klinischen Erscheinungsbild. Bei den Patienten werden verschiedene dargelegte phänotypische Merkmale, in unterschiedlicher Ausprägung, beschrieben. Die Ausprägung der klinischen Manifestationen muss nicht von Geburt an vorhanden sein, sondern kann sich im Laufe der Zeit entwickeln und verstärken [12; 14; 27; 40; 44; 47; 64]. Die Diagnose Joubert-Syndrom wird aufgrund der vorhandenen phänotypischen Manifestation gestellt. Dazu gehört das Molar-Tooth-Sign in der Magnetresonanztomografie-Aufnahme, als Folge der Vermisaplasie [12; 14; 40; 47]. Mockel und Mitarbeiter listen zehn Gene auf, die als ursächlich für das Joubert-Syndrom beschrieben wurden. Diese sind INPP5P/JBTS1, AHI1/JBTS3, NPHP1, CEP290/NPHP6, TMEM67/MKS3/NPHP11, RPGRIP1L/NPHP8, ARL13B/JBTS8, CC2D2A/JBTS9, TMEM216/JBTS2 und OFD1 [40]. 11 1. Einleitung 1.4.2.3. Meckel-Gruber-Syndrom (MKS) Das Meckel-Gruber-Syndrom ist eine schwere autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung. Diese Entwicklungsstörung findet in der frühen embryonalen Phase statt [12; 27; 40]. Die meisten Kinder versterben intrauterin oder perinatal. Selten überschreitet die Lebenserwartung der neugeborenen Kinder mehr als zwei Wochen. Dies ist abhängig von der Art und der Ausprägung der Entwicklungsstörung. Die Prognose ist grundsätzlich infaust [12; 27; 40]. Das MKS manifestiert sich klinisch in einer Multiorganbeteiligung. In der Literatur zählen zu den klassischen phänotypischen Manifestationen: zystisch-dysplastische Nierenveränderungen, kongenitale Leberfibrose, okzipitale Meningoenzephalozele und weitere Fehlbildungen des zentralen Nervensystems wie Dysgenesie der Fossa rhomboidea und Anenzephalus. Dazu sind postaxiale Polydaktylien (der oberen und/oder unteren Extremitäten) bekannt. Weiterhin können degenerative Veränderungen der Retina wie Retinitis pigmentosa und Fehlbildungen in der Retina (Sehnervhypoplasie, Mikrophthalmie), im Herzkreislaufsystem und im Urogenitaltrakt auftreten sowie ein offener Gaumen und ein Situs inversus [12; 27; 40]. Mockel und Kollegen berichten derzeit über sieben ursächliche Gene für das Meckel-Gruber- Syndrom. Diese sind: MKS1, MKS2 und MKS3, CEP290, NPHP 3, RPGRIP1L und CC2D2A [40]. 1.4.2.4. Bardet-Biedl-Syndrom (BBS) Das Bardet-Biedl-Syndrom gehört zu den ziliopathieassoziierten Syndromen und wird autosomal- rezessiv vererbt [12; 19; 40; 45]. Die phänotypische Manifestation zeigt sich in einer Multiorganbeteiligung. Die klinischen Manifestationen können von Patient zu Patient eine unterschiedliche Ausprägung zeigen [12; 19; 40; 45]. In der Literatur erfolgt daher eine Klassifizierung in primäre und sekundäre Merkmale. Zu den primären Merkmalen werden eine Netzhautdystrophie im Sinne einer Retinitis pigmentosa, Nierenerkrankungen (Niereninsuffizienz, Zysten, Dialysepflicht, vesikourethraler Reflux), Polydaktylie der oberen und/oder unteren Extremitäten, juvenile Adipositas mit lebenslangem Fortbestand, Hypogonadismus bei Männern und mentale Retardierung gezählt [12; 40; 45]. Als sekundäre Merkmale werden beispielsweise Strabismus, Katarakt, Anosmie, Brachydaktylie, Diabetes mellitus, Leberfibrose, Herzkreislaufveränderungen (Vitium: bikuspidale Aortenklappe, Pulmonalklappenstenose), Diabetes insipidus (Polyurie, Polydipsie), Ataxie, Koordinations- und Gleichgewichtsstörungen sowie verzögerte Sprachentwicklung, Verhaltensprobleme, leichte Spastik (vor allem der unteren Extremität), Zahnschiefstand, hochgewölbter Gaumen und urogenitale Fehlbildungen (beispielsweise Harnröhren-, Vorhautverengung, Hypospadie, Vaginalatresien) aufgeführt [12; 40; 45]. Die Augenveränderungen treten frühzeitig auf und führen zu einer schwerwiegenden visuellen Behinderung. Bei Patienten mit BBS und visueller Beeinträchtigung ist diese meist in den ersten 15 12 1. Einleitung - 20 Lebensjahren progredient. Hauptsächlich anzutreffen sind Zapfen- und/oder Stäbchendystrophie, Aderhautdystrophie, Nacht- und Farbenblindheit, Astigmatismus, Strabismus und Katarakt. Die Stärke und das Fortschreiten der Veränderungen sind von Patient zu Patient sehr verschieden [40; 45]. Die Diagnose wird hauptsächlich durch das Vorhandensein der primären Merkmale gefestigt. Es müssen mindestens vier davon vorliegen. Sollten nur drei primäre Merkmale das klinische Bild ausmachen, reichen zwei sekundäre Merkmale, um die Diagnose Bardet-Biedl-Syndrom zu sichern [40]. Derzeit sind 18 Gene (BBS1 - BBS18) für das BBS identifiziert worden, die ca. 80% der Patienten beschreiben. Dabei können in einem Patienten mehrere verursachende Gene Sequenzvariationen auftreten [40]. Mehrere BBS-Gene sind für andere Ziliopathien mit ursächlich, beispielsweise: -BBS13 ist mit MKS1 auch eine genetische Ursache für das Meckel-Gruber-Syndrom -BBS14 ist mit CEP290 ein zentrales Gen bei verschiedenen Ziliopathien [40; 45]. 1.4.2.5. Usher-Syndrom Das Usher-Syndrom ist eine autosomal-rezessiv vererbte Erkrankung [19; 40]. Sie ist charakterisiert durch die Kombination von Hör- und Sehbehinderung. Die Schädigung der Stereozilien in der Schnecke des Innenohres stellt die Ursache für die Innenohrschwerhörigkeit dar. Die Sehbehinderung beruht auf einer Retinopathia pigmentosa [19]. Weitere Merkmale des Usher-Syndroms wie grauer Star und Gleichgewichtsstörungen sind möglich [81]. In der Literatur erfolgt eine Klassifizierung in drei Typen: Typ 1: stellt die schwerste Form dieser Erkrankung dar, und ist charakterisiert durch eine Taubheit von Geburt an, schwere Gleichgewichtsstörungen und eine früh beginnende Sehbehinderung (Retinopathia pigmentosa schon im frühen Kindesalter: mit Nachtblindheit und Gesichtsfeldstörung); Typ 2: die Hörbehinderung ist schwächer ausgeprägt im Gegensatz zum Typ 1 und die Retinopathia pigmentosa manifestiert sich im frühen Erwachsenenalter (Verringerung des Dämmerungs- und Nachtsehens); Typ 3: die Hörbehinderung prägt sich erst im Laufe des Lebens aus und die Sehbehinderung im frühen Erwachsenenalter (seltener Typ) [19; 40; 81]. 13 1. Einleitung 1.5. CEP290 Das CEP290-Gen befindet sich auf dem Chromosom 12q21.32 [4]. Das Gen hat 54 Exone und eine Länge von 2479 Aminosäuren (umfasst 93,2 kb) [4]. Das Genprodukt CEP290 besitzt ein Molekulargewicht von 290 kDa. Das CEP290 ist aus 13 coiled- coil-, drei Tropomyosinhomologie-, einer hook-, sechs RepA/RepB- und Proteinkinase enthaltene Domäne, einer myosinschwanzhomologen Region und eine BPNLS-Domäne (zweigeteiltes Lokalisierungssignal), ein nukleäres Lokalisierungssignal sowie einem ATP/GTP Bindungsmotiv (P-loop) aufgebaut (siehe Abb. 3: Domänen und bindende Regionen im CEP290-Gen) [4; 8; 11; 12; 23; 24; 39; 47; 58]. Die Möglichkeit, dass die Coiled-coil Domänen an der gesamten Konformation von CEP290 beteiligt sind, wurde diskutiert. Sequenzvariationen in den Coiled-coil Domänen können die Zugänglichkeit für interagierende Proteine beeinflussen [11; 12]. Eine Bedeutung finden die RepA/RepB und Proteinkinase enthaltenden Domänen in der Beeinflussung der Regulation des Zellzyklus [58]. Jedoch ist die genaue Bedeutung und Funktion derzeit noch nicht geklärt [11; 12; 39]. Weiterhin lässt sich im mittleren Bereich des Proteins eine strukturelle Homologie zu sogenannten SMC-Proteinen (Structural Maintenance of Chromosoms) nachweisen. Bei den Proteinen SMC-1 und SMC-3 ist eine Interaktion mit dem Retinitis pigmentosa-GTPase Regulator (RPGR) bekannt. RPGR ist ein Protein, dass in primären Zilien und Zentrosomen exprimiert ist und dessen Sequenzvariationen zur Retinitis pigmentosa führen können. RPGR interagiert direkt oder indirekt mit ziliären Proteinen wie CEP290, und diese bilden ein oder mehrere Proteinkomplexe. Diese Proteinkomplexe können die Genese, Instandhaltung und Funktion von Zilien regulieren und sind hierbei an regulatorischen Signalwegen beteiligt. Die Aufgaben dieser Domänen und ihre Bedeutung sind aktuell nicht geklärt [8; 24; 38; 39; 49; 58]. CEP290 wird als ein Protein beschrieben, dass an den Zentrosomen und an der Basis von primären Zilien und von Verbindungszilien lokalisiert ist (ziliäres und centrosomales Protein). Weiterhin ist es in den Basalkörpern, Zellkernen, pericentriolären Satteliten und Dendriten der Geruchsneuronen vorzufinden [5; 8; 13; 24; 31; 39; 47]. In der Niere ist CEP290 in den Zentrosomen und Basalkörpern der zilientragenden Zellen lokalisiert sowie in den Photorezeptoren der Netzhaut in der Verbindungszilie zwischen dem inneren und äußerem Segment der Photorezeptoren [4; 8; 13; 31; 39; 43]. CEP290 ist evolutionär bis zu Chlamydomonas reinhardtii konserviert, wo es zwischen den äußeren Mikrotubulus-Dubletten und der Übergangszonenmembran gefunden wurde. Die Übergangszone befindet sich zwischen dem Basalkörper und dem Axoneme. Verbunden sind die Mikrotubulus-Dubletten mit der Membran der Übergangszone durch Faserproteine, die sich zum einen im Längsschnitt keilförmig und im Querschnitt Y-förmig verankern [5; 13; 43]. Sequenzvariationen im CEP290-Gen können zu Defekten in den Y- und keilförmigen Verankerungen führen. Hierbei können viele der quer gerichteten Y-förmigen Verankerungen der Faserproteine fehlen. Die keilförmigen längs gerichteten Strukturen können nicht vorhanden oder 14 1. Einleitung in Richtung Mikrotubulus-Dublette zusammengebrochen sein. Das wird dahin gedeutet, dass CEP290-Sequenzvariationen in der Übergangszone dazu führen, dass die Zilienmembran mit der Mikrotubulus-Dublette nicht mehr komplett verbunden ist [5; 13]. Das verbindende Zilium ist für den Austausch und Transport von Proteinen zwischen dem inneren und dem äußeren Segment notwendig (siehe 1.3. Die Zilien) [1; 3; 26; 40; 56]. Sequenzvariationen im CEP290-Gen führen zur Anhäufung von Proteinen der Photorezeptoraußensegmente. Der fehlerhafte Abtransport der Proteine der Photorezeptoraußensegmente kann zur Apoptose der Photorezeptoren führen [4; 5; 8; 13; 31; 43]. Bei LCA-Patienten wurde beobachtet, dass Sequenzvariationen im CEP290-Gen eine schnelle Verringerung der Außensegmente der Photorezeptoren hervorrufen. Weiterhin wurde eine Reduzierung der äußeren Körnerschichtdicke festgestellt. Ein wesentlicher Anteil der zentralen Zapfen der Photorezeptoren blieb jedoch erhalten [37]. Craige und Mitarbeiter stellten in ihren Untersuchungen fest, dass einige CEP290- Sequenzvariationen eine Abnahme des retrograden IFT-Transports in dessen Geschwindigkeit und Frequenz aufzeigten. Gesteuert wird der IFT-Transport durch einen heterotrimeren KIF3A-KIF3B- KAP-Komplex und einen homodimeren KIF17-Motor. Für das Ungleichgewicht beim Transport von molekularbiologischen Substanzen, bei Sequenzvariationen in CEP290, ist nicht nur der IFT- Transport ursächlich. Das Fehlen oder die Veränderungen innerhalb der Struktur der Mikrotubulusmembranverankerungen (keil- und Y-förmige Verankerungen) führen ebenfalls zu einem Ungleichgewicht innerhalb des IFT-Transportes [5; 13; 43]. Craige schildert des weiteren den Transport von an der Phototransduktion beteiligten Proteinen wie Opsin, Rhodopsin und Arrestin. Sequenzvariationen im CEP290-Gen können hier zu einem Ungleichgewicht der Proteine führen [13]. Der mikrotubulus-assoziierte Proteintransport erfolgt im Photorezeptor, vom inneren zum äußeren Segment und umgekehrt, über die Verbindungszilie. Weiterhin übernimmt das Zentrosom eine Vielzahl von Funktionen im Zellzyklus [4; 5; 8; 13; 39; 43]. Sequenzvariationen in CEP290 können zum einen isolierte Erkrankungen wie Erblindung bei Netzhautdystrophien (LCA, RP, EOSRD), zum anderen ziliopathieassoziierte Syndrome (SLS, JBTS, MKS, BBS, Usher-Syndrom) hervorrufen, weil primäre Zilien auf den meisten Zelltypen des menschlichen Organismus zu finden sind und sich an den verschiedensten Zellprozessen beteiligen. Dadurch können Sequenzvariationen in centrosomalen/ziliären Proteinen wie CEP290 Erkrankungen mit einer großen Vielfalt von phänotypischen Manifestationen verursachen [4; 5; 8; 10; 11; 12; 13; 14; 23; 31; 39; 43; 47]. Veränderungen in CEP290 sind mit bis zu 22% der Patienten die häufigste Ursache für die isolierte LCA [4; 10; 11; 12; 13; 23; 37; 47]. Die Assoziation von CEP290 mit weiteren krankheitsverursachenden Proteinen kann ursächlich für Variationen des Phänotyps sein [10; 11; 12; 13; 14; 18; 39]. In der Literatur werden Interaktionen von CEP290 mit RPGR, CC2D2A, ATF4 beschrieben. 15 1. Einleitung CEP290 aktiviert hierbei ATF4-vermittelte Transkription. ATF4 ist an Prozessen wie der Linsen- (Linsenfaserzelldifferenzierung) und Skelettentwicklung beteiligt [8; 10; 11; 12; 13; 14; 15; 39]. CC2D2A kodiert für eine coiled-coil- sowie für eine C2-Protein-Domäne. Es besteht eine strukturelle Ähnlichkeit mit RPGRIP1 und RPGRIP1L. CC2D2A Sequenzvariationen stehen in Verbindung mit autosomal-rezessiv vererbter geistiger Retardierung, Retinitis pigmentosa, Nierenzysten und Ziliendysfunktion. In Zilien ist CC2D2A in Basalkörpern colokalisiert mit CEP290 zu finden. CC2D2A interagiert mit CEP290. Phänotypisch sind in der Literatur ziliopathieassoziierte Syndrome beschrieben wie das Joubert-Syndrom [14; 18]. Die Interaktion zwischen CEP290 und PCM-1 (pericentriolar material 1, Hauptkomponente zentriolärer Satelliten) weist auf eine Beteiligung des CEP290 bei der Rekrutierung von zentrosomalen Proteinen und bei dem Aufbau der cytoplasmatischen Mikrotubulusstruktur hin. Weiterhin sind CEP290 sowie auch PCM-1 notwendig für die ziliäre Lokalisierung von Rab8. Rab8 spielt eine wichtige Rolle bei der Biogenese der ziliären Membran, und reguliert BBS- Proteinkomplexe [11; 12; 14; 31; 39]. Weitere Assoziationen existieren mit RPGRIP1, TMEM67, AHI1, NPHP1, NPHP4, CP110, Dynactin Untereinheiten p150Glurd und p50-Dynamitin, Kinesin Untereinheit KIF3A, Kinesin assoziiertes Protein (KAP3) und Retinitis pigmentosa GTPase Regulator (RPGRORF15) [8; 11; 12; 14; 39]. Alle Mutationsformen wie frühzeitige Stopcodons, Missense-, Nonsense-Mutationen, Splice-Site- und Frameshift-Mutationen wurden beschrieben. Diese treten über das gesamte CEP290-Gen verteilt auf. Die meisten Frameshift-Mutationen werden durch Deletionen und Insertionen hervorgerufen [4; 12; 23; 24]. Die genaue Bedeutung von CEP290 in der menschlichen Retina wie auch in primären Zilien ist noch nicht genau aufgeklärt. Die klinische Manifestation zeigt eine ausgeprägte Variabilität. In der Literatur sind unterschiedliche Organbeteiligungen mit verschiedenen Ausprägungen wie auch Überlappungen der Organbeteiligungen beschrieben [4; 5; 10; 12; 13; 39; 43]. Bisher konnte hierbei keine klare Korrelation zwischen dem Genotyp und dem Phänotyp festgestellt werden [4; 12; 39]. Die häufigste menschliche CEP290-Sequenzvariation ist eine intronische Sequenzvariation (Intron 26, c.2991 + 1655 A > G). Die Veränderung führt durch kryptisches Splicing zu einem Frameshift. Hierbei werden durch einen starken Splice-Donor 128 bp zwischen Exon 26 und Exon 27 eingefügt. Hieraus resultiert ein Stopcodon an der Aminosäure Cystein 998 [4; 12; 23; 24; 31; 39]. 16 1. Einleitung 1.6. Aufgabenstellung Ziel dieser Arbeit war die Genotypisierung von Patienten mit frühkindlichen Netzhautdegenerationen zur Korrelation des phänotypischen Spektrums mit Sequenzvariationen des CEP290-Gens. Hierzu lagen DNA-Proben von 176 Patienten vor, die an frühkindlicher Netzhautdegeneration erkrankt waren. 21 Exone des CEP290-Gens und das Intron 26 wurden in diesen DNAs über eine Screeninguntersuchung bewertet. Patienten mit Sequenzvariationsnachweis in einem dieser Exone wurden auf Sequenzvariationen in den restlichen der insgesamt 54 Exone gescreent. Weiterhin erfolgte bei identifizierten Sequenzvariationen eine Segregationskontrolle über Blutsverwandte. Für die identifizierten Sequenzvariationen wurde anhand der vorliegenden klinischen Daten eine Genotyp-Phänotyp-Korrelation durchgeführt. 17 2. Material und Methoden 2. Material und Methoden 2.1. Das Patientenkollektiv Als Grundlage dieser Arbeit dienten 176 DNA-Proben von Patienten mit frühkindlichen Netzhautdegenerationen. Die Erkrankungen der Patienten waren als Retinitis pigmentosa (RP, simplex oder autosomal rezessiv), Leber`sche Kongenitale Amaurose (LCA), Joubert-Syndrom (JS) und frühkindliche schwere Netzhautdegeneration (EOSRD) diagnostiziert worden. Die EOSRD schloß frühe Formen generalisierter degenerativer Netzhauterkrankungen wie die erbliche retinale Degeneration (IRD), Zapfen-Stäbchen-Degenerationen (CRD), Stäbchen-Zapfen-Degenerationen (RCD) und Makuladegenerationen (MD) ein. Die Unterscheidung von LCA und EOSRD war fließend. Unter gesicherter LCA wurden alle Patienten erfasst, die vor dem ersten Lebensjahr einen Visus von 0,1 und schlechter und Antworten im Elektroretinogramm (ERG) unter der Nachweisgrenze zeigten. Für Patienten mit EOSRD konnten Visus und ERG im ersten Lebensjahr entweder nur anamnestisch ermittelt werden oder der Visus lag über 0,1 und im ERG konnten Restantworten gemessen werden. 2.2. Materialnachweis Die verwendeten Chemikalien wurden soweit möglich in p.A. Qualität eingesetzt. Tabelle 1: Chemikalien Chemikalie Summenformel Artikelnummer Hersteller LE Agarose C12H18O9 870093 Biozym (Hess. Oldendorf) Ammoniumperoxidisulfat H8N2O8S2 001201-0500 Merck (Darmstadt) Ammoniumchlorid NH4Cl K298.1 Carl Roth GmbH & Co-KG (Karlsruhe) EDTA 2Na 2*H2O (Ethylendiamintetraessigsäure Dinatriumsalz Dihydrat) C10H16N2O8 8043.2 Carl Roth GmbH & Co-KG (Karlsruhe) Essigsäure abs. CH3COOH 3738.2 Carl Roth GmbH & Co-KG (Karlsruhe) Ethanol 99,8% vergällt mit 1% MEK H5C2OH K928.4 Roth (Karlsruhe) Ethidiumbromid 1% Lösung C21H20BrN3 11608.0030 Merck (Darmstadt) Glycerin > 98% Ph. Eur. wasserfrei C3H8O3 7530.1 Carl Roth GmbH & Co-KG (Karlsruhe) LC-Green I BCHM-ASY-005 BIOKE (Leiden NL) Natriumhydrogencarbonat NaHCO3 1.06329-0500 Merck (Darmstadt) Nukleotide 18 2. Material und Methoden dATP (100 µmol) dCTP (100 µmol) dTTP (100 µmol) dGTP (100 µmol) C10H16N5O12P3 C9H16N3O13P3 C10H17N2O14P3 C10H16N5O13P3 RO 142 RO 152 RO 172 RO 162 MBI Fermentas (St. Leon-Rot) Paraformaldehyd CH2O UN2213 Merck (Darmstadt) Rotiphorese Gel 40 (19:1) 3030.1 Carl Roth GmbH & Co-KG (Karlsruhe) Salpetersäure 65% HNO3 1.00456.2500 Merck (Darmstadt) Silbernitrat AgNO3 7908.1 Carl Roth GmbH & Co-KG (Karlsruhe) TEMED 89% (N,N,N´,N´- Tetramethylethylendiamin) C6H16N2 2367.01 Carl Roth GmbH & Co-KG (Karlsruhe) TRIS (Trishydroxymethyl- aminoethan) C4H11NO3 4855.3 Carl Roth GmbH & Co-KG (Karlsruhe) Tabelle 2: Biochemikalien Marker Artikelnummer Hersteller Gene Ruler 100 bp DNA Ladder SM0321 MBI Fermentas (St. Leon-Rot) GoTaq DNA Polymerase 5u/µl 6082744330, M500B Promega GmbH (Mannheim) Tabelle 3: Papier Artikelnummer Hersteller Chromatography Paper 3 MM Chr 46x57 cm 3030917 Biometra Whatman (Göttingen) Tabelle 4: Stammlösungen Stammlösung Zusammensetzung 10x TBE-Puffer: (Tris-Borat-EDTA-Puffer) 1 M Tris: 121,1 g/l 0,83 M Borsäure: 51,36 g/l 10 mM EDTA 2Na 2*H2O: 3,72 g/l pH 8 ad 1 l ddH2O 1x TE-Puffer: (Tris-EDTA-Puffer) 10 mM Tris 5 mM EDTA 2Na 2*H2O pH 8 ad 100 ml ddH2O 40% Rotiphorese-Acrylamidmischung 100 ml Gellösung 10% Polyacrylamidgel 10 ml 10xTBE 56,7 ml dH2O 19 2. Material und Methoden 33,3 ml Rotiphorese 30% 10% Polyacrylamidgel mit Glycerin 10 ml 10xTBE 51,7 ml dH2O 33,3 ml Rotiphorese 30% 5 ml Glycerin 6% Polyacrylamidgel 10 ml 10xTBE 70 ml dH2O 20 ml Rotiphorese 30% 6% Polyacrylamidgel mit Glycerin 10 ml 10xTBE 65 ml dH2O 20 ml Rotiphorese 30% 5 ml Glycerin 8% Polyacrylamidgel 10 ml 10xTBE 63,3 ml dH2O 26,7 ml Rotiphorese 30% 8% Polyacrylamidgel mit Glycerin 10 ml 10xTBE 58,3 ml dH2O 26,7 ml Rotiphorese 30% 5 ml Glycerin dNTP-Mischung je 12,5 µl 100 mM dATP, dCTP, dGTP, dTTP In 950 µl 1x TE-Puffer Tabelle 5: Kits Kit Artikelnummer Firmensitz Nucleospin Extract II 740609.250 Macherey-Nagel (Düren) 20 2. Material und Methoden Tabelle 6: Primer der ersten Screeningserie Primername Sequenz Produkt (bp) Fragment CEP2-3a GTAAGGTGCTAGAAAACCAATAATACTGTG 557 Exon 2 bis 3 CEP2-3b GGTGATGTAGATATTACCAGGTATTTTCAC CEP4-5a GTGCTTACATTCCAGTATAAAGGCATATTG 510 Exon 4 bis 5 CEP4-5b TGACAATTACATCCTAGGGAATACAAAA CEP10a GGCTGCGTTTAATTTTAATTTGGT 372 Exon 10 CEP10b GACAGACAAAAATTCACATCCTAGAAAA CEP16-17c TGCAGCTTATTTGAATGTTTTTAAGT 370 Exon 16 bis 17 CEP16-17d CCAGACAACTCACTTATCAATAATTCTTTT CEP21c ACTATGATTTTACTGTTTTTCTCCACATTT 334 Exon 21 CEP21d GAATTAATTCAAGGGGCATTTTCT CEP22a CATATCTGTCAATTTGTCTTTCTTTGGG 282 Exon 22 CEP22b CTACCAATGATTTTTGTTATTCACATGTAA NP6-i26a AGAGATGGGGTTTCACCTTGTTAGC 245 Intron 26 NP6-i26b TGTGGCAGTAAGGAGGATGTAAGAC CEP28a ACAGCATGAGATTGACTTAAATATTATTGC 334 Exon 28 CEP28b GAGATCCAGACAAACCACTTAACAATAA CEP31a TTCACTGGAAAAATTTGAAACTTACTACA 603 Exon 29 CEP31b GGAGTTCCAGCTATGTTTGCACC CEP32a CAACTGGCATATGAAAATAGAAGAACTTCG 250 Exon 30 CEP32b AGTCTGGGCGACAGAGTGAGACT CEP35a GATGAAGCATTTTAAAGGGAAA 423 Exon 31 CEP35b CAAGAAAAGAAATACCACTTTAGGG CEP36a GGAATTTTAGAAGATTGAAGAGAAAA 290 Exon 32 CEP36b TTCCAAAAAAGAAGAGAGCTGA CEP37a GCATTGAATTATACATGCCTATTGC 325 Exon 37 CEP37b GGCATAGCAAACACTTATGTTTATCTTC CEP40-41a TTCTGTTTTATGTTCCTTTTATCATTG 816 Exon 40 bis 41 CEP40-41b TGTCACTACCTTAAGCATATAAGTCAGT CEP42-43a AAATAACACTGGTAATTTTCCTACCTCC 724 Exon 42 - 43 CEP42-43b CCAGTTTTTCATTACAATGGGTG CEP46a TGTTTGCCTTTTCTTTTCAATGGC 196 Exon 46 CEP46b CTGCTGAAACCAAAACAAATGTATGGTA CEP54a TTACAATTAAATCTCCTTGTTCAAAC 389 Exon 54 CEP54b GGAGAACTGCTTATTTCCAAGTATA 21 2. Material und Methoden Tabelle 7: Primer der zweiten Screeningserie Primername Sequenz Produkt (bp) Fragment Cp6a GTTGTTGACTCATTTGAACCTCAAA 260 Exon 6 Cp6b GCCAGGTAACTTGAACAGTGAAGAT Cp7a TCGCACCACTGTACTCCAGCCTA 274 Exon 7 Cp7b CAGTTACTTAGAAGACTCCAGTCCTGG Cp8-9a CCTTTCTCATTTCTAATTACCGTTTTCC 439 Exon 8 bis 9 Cp8-9b CAGGGAATTTACATGTAGGGCTAAATA Cp11a GTTACATCAGTTTGCAACAACTCTTG 173 Exon 11 Cp11b AAAAAGAAAAAGTTATTATGTCAATTGAAA Cp12a TGATAATGAAGAATGTTTTATTAACTTTCC 222 Exon 12 Cp12b CTGGTTGATAAACAAAATTCTGTTAAGA Cp13a CAAAATGGTAAAAGGCATACTTGTACC 361 Exon 13 Cp13b GAGAAAACTCAATATTGACTTGACATTTT Cp14a ACCATGTTGGGATCACTGATTTGA 269 Exon 14 Cp14b GGAATGTTTTTTAAATGGTATGCAG Cp15a GGCATATGTACATTTTCCTTTAGACTTA 384 Exon 15 Cp15b GCATTTGAAAAAAGCATTAAACTACTTAAT Cp18a GTGTTGGAATAGTAGGAGGGTTATTTT 255 Exon 18 Cp18b AGACAGAGCGAGACTCCGTCTC Cp19-20a TGAAAATTATAGACTTGTGATATTTTGTTG 883 Exon 19 bis 20 Cp19-20b GAAAATCTCTCTAAAGTGATAGGGGAA Cp23a GTGTTGCTTACAGATTTGGTGACTT 346 Exon 23 Cp23b GAAGAAGAAGGGAAGAACAAAACAT Cp24-25a CTATGATACCTCTTGTGTTGAGAAAACT 607 Exon 24 bis 25 Cp24-25b ACCATCCTATCTTCTGCATATTTGA Cp26a TGGCTAGTGCTTGACCAGAAAA 285 Exon 26 Cp26b TGAAGAAAAATGGCTAATTTCACAA Cp27a AATGTCATTTTGTGGTATTGGTCTG 283 Exon 27 Cp27b GTCAAAATACTTCCTTTTAATCTAGCATAA Cp30a GAATTTTGGCATTTACTTAGAAAGTGT 244 Exon 30 Cp30b CTCCCAACATCTAATGTAAATTTAGGGA Cp33-34a GCCTGTTATGTGCCTGATGTCT 616 Exon 33 bis 34 Cp33-34b TCATTCTATGCATTGCCCTCAT Cp38a CGAGATTGCGCTGCTGCACT 385 Exon 38 Cp38b AATCTTCTCTAAAAGCAATCTACCACA Cp39a ATTCATATAAAATGTCAGTTTTCCTTTAAA 335 Exon 39 Cp39b GTGTGTGTCTATGTCTAGCCACCA Cp44a GTACAACAGAAAAAAGATGAAATGTGA 238 Exon 44 Cp44b CTTTCATGCATTTTAACATGGAAA Cp45a TCCAGTATGTCTTTTATGGCTTTTATT 256 Exon 45 Cp45b CTAAGGAAGGAGTTTTAGGCATTAGA Cp47a CCTGTTGTATTGTTGGTACTTCGTATT 282 Exon 47 Cp47b CGTAAAATATTCCCCTAAAAATGATCA Cp48a ATAAGATTATCTTTTATTTCCTTGTTTTGA 256 Exon 48 Cp48b CAGTTTTTCCAAGAGGTATTAAGTAAAAT Cp49a AGCCCCAGGTTATTTTTGTTTTCCAAT 372 Exon 49 Cp49b CAGGTTATCCAGAATAGTGTTGTCTTT Cp50a AAATCAGTGACATAAATTATTTGCCA 257 Exon 50 Cp50b GGAACATCTTGCGATATTATGCATT Cp51a GCCTATGCGTGCTTTTGAAA 285 Exon 51 22 2. Material und Methoden Cp51b GTCTCTAGTTGTAGCAATTCGGAGTAT Cp52a TTCTAGATTAGCTAATCATCAGCTGGA 230 Exon 52 Cp52b CCAAAGCTTATCAGGAATTCGATTT Cp53a CCATTACCTTGAACTCATTCGTAGTG 190 Exon 53 Cp53b ACAGCTGTTTTCACAAAACGATACT Cp29a CCTCACCAAAAATTGATGTATCTGA 288 Exon 29 Cp29b GAATTGTATACCTGTAATTGGGTTTCTT Tabelle 8: Plastikwaren Pipettenspitzen Artikelnummer Firmensitz Pipettenspitzen 10 µl, farblos 720031 Biozym (Hess. Oldendorf) Pipettenspitzen 1000 µl, blau 721020 Biozym (Hess. Oldendorf) Pipettenspitzen 2500 µl, farblos 722501 Biozym (Hess. Oldendorf) Kapillarspitzen 200 µl, farblos 929011 Biozym (Hess. Oldendorf) Pipettenspitzen 200 µl 4844 Corning (Schiphol-Rijk, NL) Pipettenspitzen 5 ml, einzeln G-224-2 Brandt (Wertheim) Pipettenspitze, konduktiv, 50µl 750215 Biozym (Hess. Oldendorf) Pipettenspitze, konduktiv, 200µl 750225 Biozym (Hess. Oldendorf) Reagiergefäß 0,2 ml, einzeln 711080 Biozym (Hess. Oldendorf) PCR Softstrips 0,2 ml, farblos 711070 Biozym (Hess. Oldendorf) Reagiergefäß 0,5 ml, einzeln 72699 Sarstedt (Nümbrecht) Reagiergefäß 1,5 ml, einzeln 72690001 Sarstedt (Nümbrecht) Reagiergefäß 2 ml, einzeln 72695500 Sarstedt (Nümbrecht) 2.3. Instrumenten- und Gerätenachweis Tabelle 9: Instrumente und Geräte Pipetten Artikelnummer Hersteller Variable Pipette Reference 1 - 10 µl Eppendorf (Hamburg) Variable Pipette Reference 2 - 20 µl Eppendorf (Hamburg) Variable Pipette Reference 10 - 100 µl Eppendorf (Hamburg) Variable Pipette Reference 100 - 1000 µl Eppendorf (Hamburg) Transferpette S-8; 0,5 - 10 µl Brandt (Wertheim) Transferpette S-8; 5 - 50 µl Brandt (Wertheim) Transferpette S-12; 0,5 - 10 µl Brandt (Wertheim) Transferpette S-12; 5 - 50 µl Brandt (Wertheim) Transferpette S; 0,5 - 5 ml Brandt (Wertheim) Multipipette stream Eppendorf (Hamburg) Gelausstecher 611001 Biozym Scientific GmbH (Oldendorf) Pipettierroboter Freedom Evo 75, 2-Kanal 14082320 Tecan (Crailsheim) 23 2. Material und Methoden Feinwaage PA2102 OHAUS, Pine Brook, (USA) Zentrifugen Sigma Zentrifuge 1-15PK Rotor: 24x2 ml 15300 Sigma GmbH (Osterode) Sigma Zentrifuge 4K15 Rotor: Festwinkel Ausschwingrotor Becher Mikrotiterplatteneinsatz 12169 11150 13350 13220 Sigma GmbH (Osterode) Mini Centrifuge MCF-2360 LMS CO., LTO, (Tokyo) Schüttler Heizschüttler RCT classic 01.632173 IKA Werke (Staufen) WT 17 Biometra Whatman (Göttingen) LAB Dancer S 40 01.627374 VWR (Darmstadt) Thermocycler T Professional Basic Gradient Biometra Whatman (Göttingen) T Personal Biometra Whatman (Göttingen) Realplex und Mastercycler ep gradient S Eppendorf (Hamburg) Agarose Gelkammern Compact XS/S 070610001 Biometra Whatman (Göttingen) Compact M 070610001 Biometra Whatman (Göttingen) Compact L/XL 070610001 Biometra Whatman (Göttingen) Spannungsgeräte für Elektrophorese Power Pack P 25 Biometra Whatman (Göttingen) PS 305 T Biometra Whatman (Göttingen) PS 9009 Biometra Whatman (Göttingen) 24 2. Material und Methoden Geldokumentation Transilluminator Bio Doc Analyse Biometra Whatman (Göttingen) Polyacrylamidgelelektrophoresekammern Multigel long Biometra Whatman (Göttingen) Maxigel Biometra Whatman (Göttingen) Kühlthermostat EH + F 12 Julabo (Selbach) TB2 Thermoblock Biometra Whatman (Göttingen) Bioline TM HTI Hölle und Hüttner AG (Tübingen) Dryer Mididry Typ D62 Biometra Whatman (Göttingen) Bio Photometer 8,5 mm Eppendorf (Hamburg) Präzisions-Küvette 10 mm x 8,5 mm 105.210-QS Hellma Analytics (Müllheim) 25 2. Material und Methoden 2.4. Methoden 2.4.1. Die Polymerasekettenreaktion (PCR) Die PCR stellte die Basis der Labortätigkeiten dieser Arbeit dar. Sie ist ein Verfahren, mit dem ein bestimmter DNA-Abschnitt millionenfach amplifiziert werden konnte. Die Abläufe der Amplifikation ähneln den Reaktionsabläufen der natürlichen Replikation. Ein vorteilhafter Aspekt hierbei war die Möglichkeit, die PCR mit sehr geringer Menge an Patienten-DNA durchzuführen [25; 29; 42; 48; 59; 63]. Wie bei der Replikation synthetisierte eine DNA-Polymerase einen neuen DNA-Strang an einer einzelsträngigen Nukleinsäurenmatrize (Template-DNA). Dies erfolgte ausgehend von Startermolekülen. Als Startermoleküle wurden synthetische DNA-Oligonukleotide verwendet (einzelsträngige DNA-Primer mit 20 - 30 Nukleotiden Länge (Tabelle 6 und 7), die an die einzelsträngig vorliegende Template-DNA hybridisiert wurden. Die Primer waren komplementär zu den beiden Enden der zu amplifizierenden einzelsträngigen DNA-Sequenz. Von dem 3`-Ende der Primer aus synthetisierte eine hitzestabile DNA- Polymerase den neuen DNA-Doppelstrang [25; 29; 42; 48; 59; 63]. Eine PCR erfolgte in einem sich 35 mal wiederholenden Zyklus. Jeder Zyklus bestand aus einem Denaturierungs-, einem Annealing- und einem Elongationsschritt. Begonnen wurde mit einer thermischen Denaturierung des zu amplifizierenden DNA-Doppelstranges. Hierbei wurde dieser bei 94°C aufgeschmolzen und es entstand einzelsträngige Template-DNA. An die einzelsträngige Template-DNA wurden anschließend die Primer hybridisiert (Annealing). Bei welcher Temperatur das Annealing durchgeführt wurde, war abhängig vom Temperaturoptimum des jeweiligen Primer- Paares. Dieses wurde über eine Gradienten-PCR für jedes Primerpaar ermittelt. Im Anschluss wurde die Temperatur auf 72°C, dem Temperaturoptimum der hitzestabilen Polymerase, erhöht. Es erfolgte die Amplifikation des gewünschten Sequenzabschnittes (Elongation). Durch die Verwendung der hitzestabilen Polymerase wurde eine kontinuierliche Durchführung der PCR, ohne zusätzliche neue Enzymzugabe pro Zyklus, ermöglicht. Durch die Wiederholung der Zyklen fand eine exponentielle Vermehrung der gewünschten Sequenz statt [25; 29; 42; 48; 59; 63]. Im Anschluss an die PCR erfolgte zur Überprüfung der Amplifikate eine elektrophoretische Auftrennung auf einem Agarosegel. 26 2. Material und Methoden Protokoll PCR-Ansatz: Ein PCR-Ansatz wurde wie folgt pipettiert: DNA-Probe (20 ng/µl) 5 µl Reaktionsmix: Reaktionspuffer 5 µl MgCl2 (25 mM) 2 µl dNTP-Mischung (1,25 mM) 4 µl Primer a (10 pmol/µl) 1 µl Primer b (10 pmol/µl) 1 µl dd H2O 7 µl Taq-Polymerase 0,1 µl 25,1 µl Die angegebenen Bestandteile wurden in 0,2 ml Reaktionsgefäßen pipettiert. Anschließend erfolgte eine Durchmischung des Ansatzes auf einem Schüttler. Nach einer kurzen Zentrifugation wurden die Reaktionsgefäße im Thermocycler platziert und das primerspezifische Programm gestartet. 2.4.2. Elektrophoretische Auftrennung von Nukleinsäuren und deren Nachweis Zur Auftrennung von Nukleinsäuren wurden Gelelektrophoresen durchgeführt. Nukleinsäuren enthalten geladene Gruppen. Diese Ladung ermöglicht die Bewegung im elektrischen Feld (von der Kathode zur Anode) [29; 42; 61; 63]. Gelelektrophoresen stellen trägergebundene Systeme dar. Als Trägermatrix wurden Agarose oder Polyacrylamid gewählt. Die Trägermatrix stabilisierte die wässrige Trennphase und bildete, aufgrund seiner physikalischen Eigenschaften (dreidimensionale Netzstruktur, Porengröße), mikroskopische Poren in der Größenordnung der zu trennenden Teilchen aus. Dies erzeugte einen Siebeffekt des Gels. Dadurch konnten sich die Nukleinsäuren aufgrund ihrer Größe, bei gleicher Ladung, im elektrischen Feld unterschiedlich schnell bewegen und wurden je nach ihrer Größe aufgetrennt [29; 42; 59; 61; 63]. Die elektrophoretische Beweglichkeit von geladenen Teilchen ist abhängig von der Ladung der Nukleinsäuren; der Größe und Gestalt der Nukleinsäuren; der Porengröße der Trägermatrix; dem pH-Wert, Temperatur und Ionenstärke des verwendeten Puffers und der benutzten elektrischen Feldstärke [29; 42; 59; 61; 63]. Agarose- wie auch Polyacrylamidgele können zur Analyse und zur präparativen Isolierung von Nukleinsäuren dienen [29; 42; 61; 63]. 27 2. Material und Methoden 2.4.2.1. Die Agarose-Gelelektrophorese Agarose (ein lineares Polysaccharid) wird aus Seetang (roten Meeresalgen) gewonnen [61]. Die Agarose-Gelelektrophorese stellt eine Standardmethode zur Trennung, Identifizierung und Reinigung von DNA-Fragmenten (0,5 - 25 kb Länge) dar. In dieser Arbeit wurde sie verwendet, um die PCR-Produkte auf Größe und Reinheit zu überprüfen und um die Templates für die Sequenzierung (Abschnitt 2.4.2.5. Sequenzierung) vorzubereiten [29; 42; 59; 61; 63]. In der durchgeführten Agarose-Gelelektrophorese wurden 2 %ige Agarose-Gele verwendet. Hier zeigte sich eine gute Trennung der DNA-Fragmente mit einer Fragmentlänge von 0,1 bis 2 kb [29; 42; 63]. Protokoll Agarosegel-Ansatz: Ein Agarosegel-Ansatz setzte sich zusammen aus: 50 ml Gel (verwendete Kämme: max. 20 Slots): 1 g Agarose 50 ml 1x TBE-Puffer 10 µl 1% Ethidiumbromid Laufbedingungen: 45 min bei 100 Volt 100 ml Gel (verwendete Kämme: max. 50 Slots): 2 g Agarose 100 ml 1xTBE-Puffer 15 µl 1% Ethidiumbromid Laufbedingungen: 60 min bei 100 Volt 250 ml Gel (verwendete Kämme: max. 208 Slots): 5 g Agarose 250 ml 1xTBE-Puffer 20 µl 1% Ethidiumbromid Laufbedingungen: 90 min bei 120 Volt Die Agarose wurde in einen Erlemeyerkolben abgewogen und mit 1xTBE-Puffer versetzt. Der Erlemeyerkolben wurde mit Aluminiumfolie abgedeckt und das Gemisch in der Mikrowelle aufgekocht (700 W 1 min), um die Agarose zu lösen. Das hierbei verdampfte Wasser wurde danach wieder hinzu gegeben und auf dem Schüttler vermengt. Nachdem die gelöste Agarose auf 37 - 40 °C abgekühlt war, wurde sie mit Ethidiumbromid versetzt und luftblasenfrei in den jeweiligen Gelträger gegossen. In das flüssige Gel wurden die Kämme eingesetzt. Nach Aushärten des Gels wurde der Gelträger in die Elektrophoresekammer eingesetzt und mit 1xTBE-Puffer 28 2. Material und Methoden überschichtet. Die Kämme wurden senkrecht nach oben entfernt. In den ersten Slot jeder Reihe wurde ein DNA-Marker (Gene Ruler 100 bp DNA Ladder) zur Bestimmung der Fragmentgröße pipettiert. In die weiteren Slots wurden die PCR-Produkte (10 µl) eingebracht. Die Gelelektrophorese erfolgte bei Raumtemperatur und den jeweiligen oben genannten Laufbedingungen. Nach beendeter Gelelektrophorese wurde das Agarosegel aus der Kammer entnommen und in den Transilluminator Bio Doc Analyser platziert. Mit Hilfe von UV-Licht konnten die aufgetrennten DNA-Banden dargestellt und fotodokumentiert werden. 2.4.2.2. DNA-Färbung im Agarosegel mit Ethidiumbromid Eine Möglichkeit, DNA im Agarosegel sichtbar zu machen, war die Färbung des Gels mit Ethidiumbromid, einem roten Phenanthridin-Farbstoff. Ethidiumbromidmoleküle interkalieren zwischen die Basen der DNA. Dadurch veränderte sich das Anregungsspektrum des Ethidiumbromid. Seine Fluoreszenz gegenüber freiem Ethidiumbromid in Lösung wurde erhöht. Ultraviolettes Licht (254 - 260 nm) wurde von den Nukleinsäureketten absorbiert und an Ethidiumbromid weitergeleitet. Dadurch leuchteten im Agarosegel die Stellen hell auf, an denen sich Nukleinsäuren befanden. Die Lichtintensität war proportional zur vorliegenden DNA- Konzentration im Agarosegel und zur Länge der Nukleinsäuren (je kleiner die Moleküle desto geringer die Fluoreszenzverstärkung und Abbildung) [29; 42; 59; 61; 63; 76; 78]. 2.4.2.3. Single-Strand Conformation Polymorphism (SSCP) Die SSCP (deutsch: Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus) basierte auf der Polymerase- Kettenreaktion. Durch die Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse konnten die DNA- Fragmente (nach PCR-Amplifikation) auf mögliche Sequenzvariationen gescreent werden [42; 48; 63; 74]. Die SSCP beruht darauf, dass DNA-Einzelstränge aufgrund ihrer Basensequenz eine bestimmte Konformation einnehmen. Schon die Änderung einer einzelnen Base kann zu einer Konformationsänderung führen. Die Sequenzunterschiede führen zu einem veränderten Laufverhalten in der Elektrophorese und können durch das veränderte Bandenmuster im SSCP- Gel dargestellt werden [42; 48; 63; 74]. Die Wanderungsgeschwindigkeit der DNA-Einzelstränge ist abhängig von der Konformation der DNA, Art der Gelmatrix, dem verwendeten Puffer und der Temperatur [29; 48; 61; 63; 74]. Die Durchführung der Einzelstrang-Konformations-Polymorphismus-Analyse gliederte sich in folgende Schritte: Herstellung der PCR-Amplifikate und versetzen mit Probenauftragspuffer denaturieren der doppelsträngigen DNA in Einzelstrang-DNA durch Erhitzen anschließend abkühlen 29 2. Material und Methoden auftrennen der Einzelstrang-DNA durch Polyacrylamidgel-Elektrophorese Visualisierung der DNA-Banden durch Silberfärbung [29; 42; 63; 74]. Ein Vorteil der SSCP ist, dass sie ein sehr sensitives Verfahren beim Screening auf Sequenzvariationen darstellt. Nachteilig zeigt sich, dass bei PCR-Amplifikaten, die länger als 300 bp waren, die Sensitivität nachließ [42; 48; 63]. PCR-Produkte mit einer großen Anzahl Basenpaare haben eine langsamere Laufgeschwindigkeit. Sie benötigten eine längere Laufzeit für eine bessere Aufspaltung. DNA-Amplifikate mit einer kleineren Basenpaaranzahl haben eine schnellere Laufzeit und benötigen eine stärkere Geltmatrix [29; 42; 63]. In dieser Arbeit wurden 10%ige Gele mit 6%igem Sammelgel und 8 %ige SSCP-Gele hergestellt und verwendet. Welches Gel eingesetzt wurde, war abhängig von der Anzahl der Basenpaare des untersuchten PCR-Produktes. Um die Konformationsänderungen im SSCP-Gel optimal darzustellen, wurden die Gelgrößen, der Laufpuffer (0,5 oder 1 x TBE), die Spannung [V], der Stromfluß [mA] und die Laufzeit variiert. Jedes PCR-Produkt wurde in einem SSCP-Gel ohne Glycerinzusatz und in einem SSCP-Gel mit Glycerinzusatz untersucht. PCR-Produkte über 330 bp wurden auf 8%igen Gelen und PCR-Produkte unter 330 bp auf 10%igen Gelen aufgetrennt. Tabelle 10: verwendete SSCP-Gele Primerpaar Anzahl der Basenpaare SSCP-Gel 10 ab 372 bp 8% und 10% + 6% 16/17 cd 370 bp 8% und 10% + 6% 21 cd 334 bp 8% und 10% + 6% 22 ab 282 bp 10% + 6% 28 ab 334 bp 8% und 10% + 6% 32 ab 250 bp 10% + 6% 35 ab 423 bp 8% 36 ab 290 bp 10% + 6% 37 ab 325 bp 10% + 6% 46 ab 196 bp 10% + 6% 54 ab 389 bp 8% und 10% + 6% I26 ab 245 bp 10% + 6% 30 2. Material und Methoden Protokoll SSCP-Gel-Ansatz: SSCP-Puffer: 1 ml Formamid (deionisiert) 100 ml 1% Bromphenolblau 100 ml 1% Xylene-cyanol 20 ml 0,5 M Na* EDTA pH 8 Ein SSCP-Gel-Ansatz setzte sich zusammen aus: Sammelgel 10% und 6% 20 ml Ansatz 10% (verwendete Kämme: max. 24 Slots): 15 ml PAA10% in TBE ohne bzw. mit Glycerin 15 µl TEMED 150 µl APS 10% und 20 ml Ansatz 6% Gel (verwendete Kämme: max. 24 Slots): 5 ml PAA 6% in TBE ohne bzw. mit Glycerin 5 µl TEMED 50 µl APS 10% 45 ml Ansatz 10% Gel (verwendete Kämme: max. 36 Slots): 35 ml PAA 10% in TBE ohne bzw. mit Glycerin 35 µl TEMED 350 µl APS 10% und 45 ml Ansatz 6% Gel (verwendete Kämme: max. 36 Slots): 10 ml PAA 6% in TBE ohne bzw. mit Glycerin 10 µl TEMED 100 µl APS 10% 20 ml Ansatz 8% Gel (verwendete Kämme: max. 24 Slots): 20 ml PAA 8% in TBE ohne bzw. mit Glycerin 20 µl TEMED 200 µl APS 10% 40 ml Ansatz 8% Gel (verwendete Kämme: max. 36 Slots): 40 ml PAA 8% in TBE ohne bzw. mit Glycerin 40 µl TEMED 400 µl APS 10% 31 2. Material und Methoden Die Laufbedingungen variierten: -im Stromfluß -der Laufzeit -der Spannung -dem TBE-Laufpuffer Tabelle 11 (SSCP-Gele: Laufbedingungen, Laufzeit in Abhängigkeit Exon/Intron) fasst die verwendeten Laufbedingungen der SSCP-Elektrophorese zusammen. Tabelle 11: SSCP-Gele: Laufbedingungen, Laufzeit in Abhängigkeit Exon/Intron Gel Laufbedingungen Laufzeit (Stunden/Minuten) Exon/Intron 10% + 6%, Maxigel 1xTBE, 1200V, 30mA, 40W 14 h/840 min Exon 22, Exon 32, Exon 46 10% + 6%, Maxigel 1xTBE, 1200V, 40mA, 40W 15 h/900 min Exon 22 10% + 6%, Maxigel 1xTBE, 1200V, 35mA, 40W 16 h/960 min Exon 16/17, Exon 21, Exon 22, Exon 54, Intron 26 10% + 6%, Maxigel 1xTBE, 1200V, 45mA, 40W 18,16 h/1090 min Exon 10, Exon 54 10% + 6%, Maxigel 1xTBE, 1200V, 35mA, 40W 20 h/1200 min Exon 10, Exon 28 10% + 6%, Multigel- long 0,5xTBE, 150V 12 h/720 min Exon 32 10% + 6%, Multigel- long 1xTBE, 160V 12 h/720 min Intron 26 10% + 6%, Multigel- long 1xTBE, 200V 14 h/840 min Exon 22 10% + 6%, Multigel- long 1xTBE, 150V 14,3 h/ 860 min Exon 36, Exon 37 10% + 6%, Multigel- long 1xTBE, 150V 16 h/960 min Exon 22, Exon 54 8%, Maxigel 1xTBE, 1200V, 45mA, 40W 11 h/660 min Exon 54 8%, Maxigel 0,5xTBE, 1200V, 45mA, 40W 12 h/720 min Exon 54 8%, Maxigel 0,5xTBE, 1200V, 45mA, 40W 14 h/840 min Exon 54 8%, Maxigel 1xTBE, 1200V, 30mA, 40W 14 h/840 min Exon 10, Exon 28 8%, Multigel-long 0,5xTBE, 200V 14 h/840 min Exon 10, Exon 16/17, Exon 21, Exon 35 8%, Multigel-long 1xTBE, 200V 14 h/840 min Exon 35 Für ein SSCP-Gel wurden zwei Glasplatten benötigt, welche vor dem Zusammensetzen mit Ethanol gründlich gereinigt werden mussten. Die Glasplatten wurden nach Herstellerbeschreibung zu einer Gelkassette zusammengesetzt. Die Inhaltsstoffe des Polyacrylamidgeles (wie oben aufgelistet) wurden in einen Erlemeyerkolben 32 2. Material und Methoden gemischt. Danach wurde das flüssige Gel in die Gelkassette luftblasenfrei gegossen und mit einem Kamm (mit gewünschter Taschenanzahl) versehen. Bei der Verwendung von 10% + 6% Gel erfolgte zuerst das Giessen des 10% Trenngeles. Das 6% Sammelgel wurde auf das Trenngel gegossen, nachdem dieses ausgehärtet war. Nach Aushärten des Geles wurde überschüssige Gelmasse, der Kamm und die Silikondichtung entfernt und die Gelkassette in die Elektrophoreseapparatur eingebaut. Das Polyacrylamidgel wurde mit Laufpuffer versetzt und die Geltaschen gereinigt. 1 µl PCR-Produkt wurde mit 6 µl Laufpuffer in einem 0,2 ml Reaktionsgefäß gemischt und bei 94 °C für 10 min in einem Heizblock denaturiert. Danach wurde der Probenansatz sofort in eine Zentrifuge gegeben und für 5 min bei 4 °C abgekühlt und zentrifugiert. Nach dem Abkühlen wurde die Probe in die vorgesehene Tasche des Gels pipettiert und die Elektrophorese nach oben genannten Bedingungen gestartet. 2.4.2.4. Silberfärbung von Polyacrylamidgelen Die Visualisierung der entstandenen DNA-Bandenmuster in den Polyacrylamidgelen erfolgte mit der Silberfärbung. Hierbei entstand ein Komplex zwischen den Silberionen und den Seitenketten der DNA. Die DNA- Banden stellten sich braun bis schwarz dar. Gestoppt wurde die Reaktion durch Essigsäure bei ausreichender Kontrastierung. Die Silberfärbung ist ein sensitiver Nachweis für Proteine und Nukleinsäuren [29; 42; 61; 63]. Protokoll Silberfärbung: 10% Ethanol: 90 ml dH2O absolut 10 ml Ethanol abs. 1% Salpetersäure: 15,4 ml konz. Salpetersäure (65%) 984,6 ml dH2O Ablauf der Silberfärbung: Fixierer: 10% Ethanol (absolut vergällt) Oxidierer: 1% Salpetersäure (HNO3) Silberlösung: 0,012 M Silbernitrat (AgNO3) Waschlösung: A. bidest. Entwickler: 0,5% w/v Paraformaldehyd 0,28 M Natriumcarbonat (100 ml) Stopplösung: 5% Essigsäure 33 2. Material und Methoden Nach beendeter SSCP-Gelelektrophorese wurde das Gel aus der Gelkassette entnommen und in einer Plastikwanne auf einem Taumelschüttler gefärbt. Alle weiteren Schritte fanden bei Raumtemperatur statt. Dabei schwamm das Gel frei in der Färbelösung. Beim Wechsel der Lösungen wurde die Vorhergehende vollständig aus der Wanne entfernt bevor die Nächste zugeführt wurde. Zunächst wurde das Gel in 10% Ethanol für 10 min fixiert und anschließend für 3 min in 1% Salpetersäure oxidiert. Nach Inkubation des Gels für 20 min im 0.012 M Silbernitrat wurde das überschüssige Silbernitrat für 1 min in destilliertem Wasser ausgewaschen. Das gewaschene Gel wurde zunächst mit Entwickler gewaschen, um überschüssiges Silbernitrat abzufangen, bis sich der Entwickler schwarz verfärbte. Anschließend wurde die Kontrastierung mit frischem Entwickler fortgeführt, bis sich die DNA-Banden ausreichend darstellten. Bei guter Kontrastierung des Bandenmusters wurde der Vorgang durch Inkubation in 5% Essigsäure für 10 min gestoppt. Nach Beendigung der Färbung wurden überschüssige Bereiche des Gels abgeschnitten. Anschließend wurde das Gel auf Fließpapier und unter einer Cellopohanschicht auf dem Geltrockner für 2 Stunden bei 100 °C im Vakuum getrocknet. Bei einer größeren Anzahl von SSCP-Gelen wurde die Färbung auf dem BiolaneTM HTI durchgeführt. 2.4.2.5. Sequenzierung Die DNA-Sequenzierung wurde nach dem von Sanger et al. (enzymatische Sequenzierung) 1977 entwickelten Verfahren durchgeführt. Die Methode wird auch als Kettenabbruch- oder Didesoxynucleotid-Verfahren bezeichnet. Sie beruht auf einer polymerase-gestützten Elongation und wird in der aktuell angewandten Form als zyklische Sequenzierung mit einer thermostabilen Polymerase durchgeführt. Der Unterschied zur oben aufgeführten PCR-Reaktion besteht darin, dass nur ein Primer (Sequenzierungsprimer) verwendet wird und zu den 2`- Desoxynucleotidtriphosphaten (dNTPs) zusätzlich 2`,3`-Didesoxynucleotidtriphosphat (ddNTPs) hinzugegeben wird. Bei der Polymerisation werden dNTPs wie auch ddNTPs als Substrat zur Kettenverlängerung von der Polymerase eingebaut. Der Einbau der ddNTPs führt aber zum Abbruch der Polymerisation. Die Ursache dafür liegt in der fehlenden 3`-Hydroxygruppe der ddNTPs, die keine Verlängerung der Molekülkette erlauben. Es entsteht eine Mischung von DNA- Fragmenten unterschiedlichster Kettenlängen, die durch eine Kapillargelelektrophorese aufgetrennt werden und mittels Fluoreszenzfarbstoffmarkierung (für jedes der vier ddNTPs eine andere Farbe) detektiert werden. Über das Elektropherogramm kann die Sequenz nach dem Primer ausgelesen und mit einer Referenzsequenz verglichen werden [29; 42; 48; 63]. Die eigentliche Sequenzierung erfolgte bei einem kommerziellen Anbieter (Seqlab, Göttingen). In dieser Arbeit wurden DNA-Proben, welche auffällige DNA-Bandenmuster in der SSCP- Gelelektrophorese zeigten, als 50 µl PCR-Ansatz hergestellt und auf einem Agarosegel, wie oben 34 2. Material und Methoden beschrieben aufgetrennt (siehe 2.4.2.1. Die Agarose-Gelelektrophorese und 2.4.2.2. DNA-Färbung im Agarosegel mit Ethidiumbromid). Nach abgelaufener Elektrophorese wurden die PCR-Produkte mit einer Stanze unter UV-Licht als Gelblöckchen aus dem Agarosegel ausgestanzt und in beschriftete Tubes gegeben. Die DNA wurde aus den Gelblöckchen mit dem NucleoSpin Extract II nach Angaben des Herstellers isoliert. Anschließend wurde der DNA-Gehalt gemessen und die Sequenzierreaktion mit 60 ng Template DNA und 10 pMol Primer im 14 µl Reaktionsansatz zur Sequenzierung durch den kommerziellen Anbieter eingeschickt. Die Sequenzierungsdaten wurden elektronisch übermittelt und mit Hilfe der Analysesoftware Gentle mit einer Referenzsequenz verglichen [75; 77; 79; 80; 82]. 2.4.2.6. High Resolution Melting (HRM) Die High Resolution Melting Analyse (Schmelzkurvenanalyse) stellte ein weiteres Verfahren zum Screening von PCR-Produkten dar. Es hat eine hohe Sensitivität, Sequenzvariationen in PCR- Amplifikaten zu detektieren. Im Gegensatz zur Single-Strand Conformation Polymorphismus Analyse war diese Methode ein schnelleres Untersuchungsverfahren [16; 34; 57; 69; 72]. In dieser Arbeit wurde die Methode mit Hilfe der Realplex (Eppendorf, Hamburg) durchgeführt. Untersucht wurden die Exone mit einer großen Basenpaaranzahl (Exon 2-3 (557 bp), Exon 4-5 (510 bp), Exon 31 (603 bp), Exon 40-41 (816 bp), Exon 42-43 (724 bp)), welche durch die SSCP nicht mehr aussagekräftig überprüft werden konnten. Weiterhin erfolgte die Untersuchung der Exone der zweiten Serie, bei Patienten mit Sequenzvariationen in der ersten Serie. Die High Resolution Melting Analyse erforderte keine Trennungsschritte während des Ablaufes wie bei der oben aufgeführten Single-Strand Conformation Polymorphismus Analyse. Amplifikation (quantitative PCR) und High Resolution Melting Analyse eines PCR-Ansatzes erfolgten im selben Reaktionsgefäß nacheinander. Die PCR-Produkte waren dadurch der Umgebung weniger ausgesetzt. Das Risiko einer Verschmutzung, wie bei PCR und SSCP beschrieben (mögliche Verschmutzungsreaktionen durch Wechsel der Instrumente während des Ablaufes), der PCR- Amplifikate konnte verringert werden [16; 20; 34; 57; 69; 72]. Es wurde der Fluoreszenzfarbstoff LC-Green I, von BIOKE (Leiden NL), verwendet. Dieser wurde dem PCR-Ansatz hinzugegeben. LC-Green I interkalierte während der Amplifikation in die doppelsträngige DNA. Vorteil dieses Farbstoffes war, dass er folgende PCR-Schritte nicht hemmt. Nach erfolgter Amplifikation war ein hohes Fluoreszenzniveau vorhanden, aufgrund vieler doppelsträngiger DNA-Amplifikate, an die LC-Green I vergleichbar Ethidiumbromid unter Verstärkung der emittierten Fluoreszenz bindet [34; 57; 69; 72 ]. Danach wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Hierzu wurde die doppelsträngige DNA erhitzt bis zu dem Punkt, an dem sich die Doppelhelix in ihre Einzelstränge trennte. Die Schmelztemperatur war dabei spezifisch für das jeweilige PCR-Amplifikat. Das Fluoreszenzniveau fiel hierbei ab, da LC-Green I beim Schmelzvorgang von der einzelsträngigen DNA freigesetzt wird. 35 2. Material und Methoden Die Verringerung des Fluoreszenzniveaus wurde mit Hilfe der Realplex-Software aufgezeichnet, verarbeitet und als Schmelzkurve visuell dargestellt [16; 34; 57; 69; 72 ]. Die hier verwendete Auswertesoftware „Device independent Melting Analysis (DiMA)“ wurde von Herrn Dr. Matthäus Pilch entwickelt. Bei einer Sequenzvariation der doppelsträngigen DNA veränderte sich die Schmelztemperatur und damit die Form der Schmelzkurve. Dieser Unterschied wurde durch die Software graphisch, über die Entstehung abweichender Schmelzkurvenprofile, dargestellt [16; 20; 57; 69; 72]. Proben, die in der HRM-Analyse auffällig waren, wurden wie oben beschrieben zum Sequenzieren verschickt und ausgewertet (siehe 2.4.2.5. Sequenzierung). 36 3. Ergebnisse 3. Ergebnisse 3.1. Das Patientenkollektiv Dieser Arbeit lagen zur Screeninguntersuchung DNA-Proben von 176 Patienten zugrunde. 92 Patienten (52,3 %) waren weiblich und 69 Patienten (39,2%) waren männlich. Alle Patienten im Kollektiv waren an einer Netzhautdegeneration mit frühem Beginn erkrankt. Die Diagnosen bei der Erstvorstellung umfassten LCA, EOSRD (einschließlich Zapfen-Stäbchen-, Stäbchen-Zapfen-Degenration und generalisierte Formen), RP (simplex oder autosomal rezessiv) und JBTS. 3.2. Identifizierte Sequenzvariationen im CEP290-Gen 3.2.1. Ablauf der Screeninguntersuchung Das Screening wurde in mehreren Schritten durchgeführt. Zunächst erfolgte die Untersuchung der Patienten auf das Vorliegen der häufigsten Sequenzvariation des CEP290-Gens (c.2991+1655A>G). Danach wurden diejenigen Exone einer Screeninguntersuchung unterzogen, in denen, bei Beginn der Arbeit, in der Literatur bereits Sequenzvariationen berichtet wurden. Dies waren insgesamt 21 der 54 kodierenden Exone (2-3, 4-5, 10,16-17, 21, 22, 28, 31, 32, 35, 36, 37, 40-41, 42-43, 46 und 54). Bei auffälligen Bandenmusterveränderungen in der SSCP erfolgte eine Sanger-Sequenzierung des auffälligen PCR-Produktes. Wies ein Patient eine Sequenzvariation in einem der untersuchten Exone oder Introne auf, wurden die restlichen Exone anschließend über ein High-Resolution Melting (HRM) Screening untersucht. Auffällige PCR-Produkte wurden mittels Sanger-Sequenzierung auf Sequenzvariationen untersucht. 3.2.2. Sequenzvariationen im CEP290-Gen – Ergebnisse des Mutationsscreenings Aus dem Patientenkollektiv wiesen von den insgesamt 176 untersuchten Patienten 38 (21,6%) Sequenzvariationen im CEP290-Gen auf (Tabellen 12, 15 und 16). Es konnten 24 verschiedene Sequenzvariationen festgestellt werden. Diese wurden in 16 Exonen, über das gesamte CEP290- Gen verteilt, (Exon 10, 14, 17, 20, 21, 22, 23, 31, 35, 36, 37, 39, 40, 46, 48 und 54) und drei Intronen (begrenzt auf den Bereich Intron 22, 26 und 28) nachgewiesen. Bei 24 der 38 (63%) Patienten konnten homozygote und compound heterozygote Sequenzvariationen identifiziert werden (Tabelle 15). Bei 21 der 38 (55%) Patienten wurde die unabhängige Herkunft der Sequenzvariation von der Mutter und dem Vater durch eine Segregationsprüfung bestätigt. 37 3. Ergebnisse Tabelle 12: Übersicht über die Häufigkeit in der ursächlichen Sequenzvariationen korrelierten Patienten im Vergleich zur Patientenkohorte Hier einige Änderungen nach den Tabellen mit Mutationen Patienten Allele Gesamtanteil Patienten [%] / Allele [%]* Anteil Mutationen Patienten [%] / Allele [%]* Patienten 176 352 Ohne Sequenzvariationen 139 278 81,5 Mit Sequenzvariationen 38 62 21,5 / 17,61 Homozygote Sequenzvariationen 9 18 5,1 37,5 Compound heterozygote Sequenzveränderungen 15 30 8,5 62,5 Einfach heterozygoge Sequenzveränderungen 14 14 7,9 / 3,9 37,8 / 22,9 Häufige Sequenzvariationen c.2991+1655A>G 20 27 11,4 / 7,7 52,6 / 43,5 c.4723A>T 8 10 4,5 / 2,8 21,1 / 16,1 c.2119_2123dupCAGCT 5 5 2,8 / 1,4 13,2 / 8,1 *für einfach Heterozygote Einundzwanzig (87,5%) der 24 in dieser Arbeit im CEP290-Gen identifizierten Sequenzvariationen sind in den Mutations-Datenbanken (www.biobase-international.com; www.exac.broadinstitute.org; www.medgen.ugent.be/cep290base; www.retina-international.org) bereits erfasst. Ihre Annotation wurde mit Mutalyzer 2 (www.mutalyzer.nl/check) gegen die aktuelle Referenzsequenz (RefSeq NG_008417.1) geprüft. Die drei häufigsten bisher in der Literatur beschriebenen Sequenzvariationen im CEP290-Gen waren: c.2991+1655A>G (p.C998*, Intron 26; intronische Splice-Site-Mutation), c.4723A>T (p.K1575*, Exon 36) und c.5587-1G>C (Exon 41) [11; 12; 17; 23]. Für die Sequenzvariationen im Intron 26 (c.2991+1655A>G (p.C998*)) und Exon 36 (c.4723A>T (p.K1575*)) konnte dies im untersuchten Patientenkollektiv bestätigt werden. Die Sequenzvariation c.5587-1G>C (Exon 41) konnte bei den hier untersuchten Patienten nicht identifiziert werden. Stattdessen fand sich die Sequenzvariation c.2119_2123dupCAGCT fünf Mal in den hier untersuchten Patienten. Tabelle 13 fasst die verschiedenen identifizierten Sequenzvariationen zusammen und Abbildung 3 stellt diese graphisch dar. Die in dieser Arbeit identifizierten Sequenzvariationen liegen in verschiedenen Domänen und beeinflussen unterschiedliche Protein-Protein-Interaktionen. Hierbei wird die Verteilung der Sequenzvariationen über das gesamte CEP290-Gen deutlich. 38 http://www.mutalyzer.nl/check http://www.exac.broadinstitute.org/ http://www.biobase-international.com/ 3. Ergebnisse Tabelle 13: Zusammenfassung der in dieser Arbeit identifizierten pathogenen Sequenzvariationen und deren Lokalisation in den Domänen des CEP290-Proteins Domäne Bindungs- partner Exon / Intron Nukleotid erwarteter Effekt Referenz 1 Coiled-coil, Transmembrando- mänenhomologie Homo- und Heterodimeri- sierung Exon 10 c.837_838insACGA p.H280Tfs*19 [12; 39; 58] 2 Coiled-coil Homo- und Heterodimeri- sierung Exon 14 c.1298A>G p.D433G [12; 39; 58] 3 Coiled-coil Exon 17 c.1665_1666delAA p.K555Nfs*20 [12; 39; 58] 4 Coiled-coil Homo- und Heterodimeri- sierung Exon 20 c.1984C>T p.Q662* [12; 39; 58] 5 6 7 Coiled-coil NPHP5, CC2D2A Exon 21 Intron 22 c.2119_2123dupCAGCT c.2279_2280delTT c.2367+1G>A p.T709Sfs*11 p.F760* [12; 14; 18; 39; 58 ] 8 Coiled-coil , SMC Homologie NPHP5, CC2D2A Exon 24 c.2578G>T p.G860* [12; 14; 18; 39; 58] 9 10 Coiled-coil , Hook, Homologie, SMC Homologie CC2D2A Intron 26 Intron 28 c.2991+1655>AG c.3310-1G>C p.C998* [12; 14; 18; 39; 58] 11 12 Coiled-coil , Hook Homologie Rab8a Exon 31 c.3640dupG c.3758G>A p.E1214Gfs*7 p.R1253H [11; 12; 39; 58] 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 Coiled-coil, Myosin Homologie Homo- und Heterodimeri- sierung Exon 35 Exon 36 Exon 37 Exon 39 Exon 40 Exon 46 c.4452_4455delAGAA c.4723A>T c.4805C>T c.4963delA c.4962_4963delAA c.4966_4967delGA c.4966delG c.5254C>T c.5428A>C c.6277delG p.K1484fs p.K1575* p.T1602M p.R1655Efs *6 p.E1656Nfs*3 p.E1656Nfs*3 p.E1656Kfs *5 p.R1752W p.N1810H p.V2093Sfs*4 [12; 39; 58] 23 Coiled-coil, Myosin Homologie, KID Homology Exon 48 c.6604delA p.I2202Lfs*24 [12; 39; 58] 24 C-Terminus Exon 54 c.7394_7395delAG p.E2465Vfs*2 [12; 39; 58] 39 3. Ergebnisse Aminosäuren 0 250 500 750 1000 1250 1500 1750 2000 2250 2500 1 2 3 4 65 7 8 9 10 11 12 13 14 Missense Frameshift Nonsense Splice 15 16-19 Exons2 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 Domänen Hook Homologie TM Homologie Myosin Homologie P-Loop KID coiled coil SMC Homologie BP-NLS Mutationen 2021 22 23 24 Gen Abb. 3: Domänen und bindende Regionen im CEP290-Gen Die Dreiecke zeigen die Position der identifizierten Sequenzvariationen an. Die Zahlen über den Dreiecken entsprechen der fortlaufenden Nummerierung in Tabelle 13. Der Zahlenstrahl gibt die relative Positionierung der Exone an. Die Balken entsprechen der Positionierung der beschriebenen Domänen [11; 12; 14; 18; 39; 58]. Sofern die Funktion der einzelnen Domänen bekannt ist, ist dieses in Tabelle 13 zusammengefasst. Dies umfasst auch die bekannten Protein-Protein-Interaktionen des CEP290- Proteins. [11; 12; 39; 58]. 3.3. Mutationsformen Es konnten alle Mutationsformen, wie Missense-, Nonsense-, Splice-Site- und Frameshift- Mutationen, im CEP290-Gen identifiziert werden. Dabei wurden die Frameshift-Mutationen sowohl durch Deletionen als auch durch Insertionen hervorgerufen [4; 12; 23; 24]. 40 3. Ergebnisse Tabelle 14: Häufigkeiten der identifizierten Mutationen Mutationsform Anzahl Exon / Intron Missense-Mutationen 5 14, 31, 36, 39, 40 Nonsense-Mutationen 3 20, 23, 36 Splice-Site-Mutationen 3 IVS22, IVS26, IVS28 Deletionen 10 17, 22, 35, 37, 46, 48, 54 Insertionen 1 10 Duplikationen 2 21, 31 Bei allen Patienten, bei denen die Sequenzvariationen im CEP290-Gen ursächlich waren, lagen zwei Sequenzvariationen vor. Lediglich Patient 2065.01 wies drei unterschiedliche Sequenzvariationen in drei verschiedenen Exonen (Exon 23, Exon 31 und Exon 39) auf. Alle in dieser Arbeit identifizierten Sequenzvariationen sind in den Tabellen 15 und 16 den jeweiligen Patienten zugeordnet worden. Die verschiedenen Mutationsformen verteilen sich dabei über das gesamte Gen (Abb. 3). Lediglich die Splice-site-Mutationen fanden sich zwischen Exon 20 und Exon 30. 3.3.1. Splice-Site Mutationen Im Intron 26 wurden bei 20 Patienten (11,4%) des Patientenkollektivs die Sequenzvariation c.2991+1655A>G nachgewiesen. Diese sehr häufige Sequenzvariation führt zu einem aberranten Spleißvorgang verbunden mit einer Insertion eines 128 bp großen Sequenzabschnitts zwischen Exon 26 und 27. Hieraus resultiert eine Veränderung der Aminosäuresequenz nach Exon 26 und ein Einschleusen eines vorzeitigen Stopcodons an Aminosäure 998. Dies führt zu einem funktionslosen Genprodukt [11; 12; 23; 63; 75; 79; 80; 82]. Im Intron 22 wurde bei Patient 2157.01 ein Austausch von Guanin durch Adenin an der ersten Basenposition des Introns identifiziert (c.2367+1G>A). Diese Veränderung wirkt sich direkt auf das Spleißverhalten des Introns aus, weil dadurch der Splice-Donor inaktiviert wird. In der Folge wird das folgende Intron nicht ausgespleißt und im Leseraster in das Genprodukt mit eintranslatiert. Das nächste Stop-Codon im neuen Leseraster führt dann zu einem vorzeitigen Ende der Translation [63; 80]. Patient 1911.02 wies im Intron 28 einen Basenaustausch von Guanin durch Cytosin an der letzten Basenposition des Introns 28 auf (c.3310-1G>C). Hierbei kommt es zu einem Verlust einer Splice- Acceptor-Site und dies führt mindestens zum Verlust des nachfolgenden Exons. Durch die so entstehende Leserasterverschiebung kommt es zu einem vorzeitigen Abbruch der Translation [63; 75; 79; 80]. Damit wurden alle Formen einer Splice-site-Mutation (tief intronisch, Splice Donor und Splice Acceptor) gefunden. 41 3. Ergebnisse 3.3.2. Nonsense-Sequenzvariation Insgesamt wurden drei verschiedene Nonsense-Mutationen bei 11 Patienten nachgewiesen. Die häufigste (acht Patienten) war ein Austausch von Adenin durch Thymin an Position 4723 in Exon 36 (c.4723A>T). Das hieraus resultierende Stopcodon an der Aminosäueposition 1575 führt, wie auch die anderen Nonsense-Mutationen, zu einem vorzeitigen Translationsstop [11; 12; 23; 63; 75; 79; 80; 82]. Alle Nonsense-Mutationen lagen in der Mitte des Genproduktes wodurch große Teile des Genproduktes verloren gehen. Aufgrund des Nonsense Mediated Decay (NMD) ist anzunehmen, dass bereits das Transkript des CEP290-Gens aufgrund dieser Sequenzvariationen in der Qualitätskontrolle aussortiert wird und diese Sequenzvariationen daher als Null-Mutationen zu werten sind [7; 9; 28; 71]. 3.3.3. Missense-Mutation Insgesamt wurden fünf Missense-Mutationen bei fünf Patienten nachgewiesen. Die Missense- Mutationen lagen im zentralen Bereich des Gens über Exon 14 bis Exon 40 verteilt vor. Missense Mutationen haben ein sehr breites Funktionsspektrum von leichten (hypomorphen) Funktionseinschränkungen bis hin zur Null-Mutation. Die Funktionen der hier vorliegenden Missense-Mutationen werden in der Diskussion im Zusammenhang mit den phänotypischen Daten bewertet [63; 79; 80]. 3.3.4. Leserasterverschiebungen 13 der Patienten mit Sequenzvariationen hatten Mutationen, die das Leseraster verändern. Diese Leserasterveränderungen wurden durch Deletionen, Insertionen und Duplikationen hervorgerufen. Die Leserasterveränderungen führten zu vorzeitigen Translationsabbrüchen, die über das gesamte Gen verteilt waren. Es ist zu erwarten, dass die Genprodukte dieser Leserasterverschiebungen alle ebenso, wie die Nonsense-Mutationen, dem NMD unterliegen und damit Null-Mutationen darstellen [7; 9; 28; 60; 63; 70; 71; 74; 75; 79; 80]. 42 3. Ergebnisse Tabelle 15: Identifizierte pathogene Sequenzvariationen im CEP290-Gen bei Patienten im homozygoten und compound heterozygoten Zustand Patient Maternale Sequenzvariation Paternale Sequenzvariation Referenz Exon / Intron Nukleotid erwarteter Effekt Exon / Intron Nukleotid erwarteter Effekt homozygot 0622.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* [23] 0668.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* [23] 1278.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* [23] 1601.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* [23] 1630.03 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* [23] 1945.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* [23] 2381.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* [23] 1423.01 Exon 36 c.4723A>T p.K1575* Exon 36 c.4723A>T p.K1575* [51; 66] 2428.01 Exon 36 c.4723A>T p.K1575* Exon 36 c.4723A>T p.K1575* [51; 66] compound heterozygot 1264.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Exon 21 c.2119_2123dupCAGCT p.T709Sfs*11 [23] 2107.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Exon 21 c.2119_2123dupCAGCT p.T709Sfs*11 [23] 2276.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Exon 21 c.2119_2123dupCAGCT p.T709Sfs*11 [23] 2157.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Intron 22 c.2367+1G>A [23; 44; 46] 1911.02 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Intron 28 c.3310–1G>C [23; 65] 2664.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Exon 35 c.4452_4455delAGAA p.K1448Nfs*4 [23] 1506.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Exon 36 c.4723A>T p.K1575* [23; 51; 66] 2803.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Exon 36 c.4723A>T p.K1575* [23; 51; 66] 1016.02 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Exon 37 c.4963delA p.R1655Efs*6 [23; 44; 46] 0772.02 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Exon 40 c.5428A>C p.N1810H [23; 44; 46] 1802.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* Exon 46 c.6277delG p.V2093Sfs4* [6; 23] 2065.01 Exon 31 Exon 39 c.3758G>A, c.5254C>T p.R1253H p.R1752W Exon 23 c.2578G>T p.G860* rs763801479 [44; 46] rs748471942 2365.01 Exon 31 c.3640dupG p.E1214Gfs*7 Exon 48 c.6604delA p.I2202Lfs*24 [44; 46; 51] 2359.01 Exon 36 c.4723A>T p.K1575* Exon 37 c.4962_4963delAA p.E1656Nfs*3 [51; 66] 2677.01 Exon 36 c.4723A>T p.K1575* Exon 20 c.1984C>T p.Q662* [2; 51; 66] 43 3. Ergebnisse Tabelle 16: Identifizierte pathogene Sequenzvariationen im CEP290-Gen bei Patienten im einfach heterozygoten Zustand Patient Sequenzvariation Referenz Exon / Intron Nukleotid erwarteter Effekt 0926.01 Exon 10 c.837_838insACGA p.H280Tfs*19 [44; 46] 2084.01 Exon 14 c.1298A>G p.D433G [44; 46] 0291.01 Exon 17 c.1665_1666delAA p.K555Nfs*20 [6] 0325.01 Exon 21 c.2119_2123dupCAGCT p.T709Sfs*11 [23] 0738.01 Exon 21 c.2119_2123dupCAGCT p.T709Sfs*11 [23] 1004.01 Exon 37 c.4966_4967delGA p.E1656Nfs*3 [44; 46] 1061.01 Exon 22 c.2279_2280delTT p.F760* [44; 46] 0334.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* [23] 1384.01 Intron 26 c.2991+1655A>G p.C998* [23] 1135.01 Exon 36 c.4723A>T p.K1575* [51; 66] 2561.01 Exon 36 c.4723A>T p.K1575* [51; 66] 2619.01 Exon 36 c.4805C>T p.T1602M [44; 46] 1223.01 Exon 37 c.4966G>T E1656* [23] 1221.01 Exon 54 c.7394_7395delAG p.E2465Vfs*2 [44; 46] 3.3.5. Isokodierende Polymorphismen im CEP290-Gen Ein Teil der identifizierten Sequenzvariationen rufen keine krankheitsverursachende Sequenzvariation hervor. Dabei handelt es sich um isokodierende Sequenzvariationen und intronische Sequenzvariationen. Sequenzvariationen außerhalb der kodierenden Sequenzen führen nur bedingt zu Veränderungen des Gendprodukts. Befinden sie sich innerhalb der kodierenden Sequenzen oder an ungenutzten Spleißstellen im Intron, kann eine genetische Erkrankung durch eine Veränderungen des Spleißverhaltens hervorgerufen werden [7; 29; 42; 63]. Die in dem vorliegenden Patientenkollektiv identifizierten Polymorphismen lagen alle außerhalb der kodierenden Sequenzen und waren in den Mutationsträgern einfach heterozygot, so dass sie nicht als ursächlich in Betracht kamen [7; 29; 42; 63]. Tabelle 17 fasst diese Sequenzvariationen zusammen. Tabelle 17: Isokodierende Polymorphismen im CEP290-Gen Exon Nukleotidänderung Aminosäure Patienten / Allele dbSNP rs-Nummer Referenz Intron 3 c.180+56T>A 1 / 1 NEU Intron 4 c.250+163C>T 1 / 1 [44; 46] Exon 21 c.2055T>C p.A685 24 / 27 rs45465996 [23] Intron 21 c.2217+33A>T 1 / 1 [44; 46] c.2217+16A>C 1 / 2 [44; 46] Exon 22 c.2268G>A p.S755 16 / 16 rs2468255 [6] c.5568G>A p.S765 5 / 5 NEU c.2340G>A p.Q780 21 / 21 [44; 46] Exon 28 c.3273G>A p.E1091 1 / 1 [44; 46] Exon 31 c.3939T>G p.N1313 2 / 2 [44; 46] Exon 32 c.4185A>G p.Q1395 1 / 1 rs371530941 [44; 46] c.4119A>G p.K1373 2 / 2 rs117122459 [44; 46] 44 3. Ergebnisse Intron 35 c.4704+46delT 1 / 1 rs11356711 [6] Exon 36 c.4705-45T>A 3 / 3 [44; 46] Den hier aufgeführten Daten ist zu entnehmen, dass das in dieser Arbeit einbezogene Patientenkollektiv die größte Anzahl der identifizierten Polymorphismen in den Exonen 21 und 22 aufwies (Tabelle 17). 3.4. Augenärztliche Daten der Patienten mit Sequenzvariationen im CEP290-Gen Die augenärztlichen Daten wurden in dieser Studie retrospektiv erhoben. Insgesamt konnte