S A B R I N A C O L L I C A T H E O B R O M I N -M E T A B O L I S I E R U N G B E I M B E A G L E H U N D VVB SABRINA COLLICA Der Polymorphismus 1117C>T im Cytochrom P450 CYP1A2 beeinträchtigt die Metabolisierung von Theobromin beim Beagle Hund VVB LAUFERSWEILER VERLAG édition scientifique INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen 9 7 8 3 8 3 5 9 5 9 1 6 3 VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15 D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: -5599890 redaktion@doktorverlag.de www.doktorverlag.de VVB LAUFERSWEILER VERLAG édition scientifique ISBN: 978-3-8359-5916-3 Cover Photos: © tanala - Fotolia.com + Floortje - istockphoto.com Das Werk ist in allen seinen Teilen urheberrechtlich geschützt. Jede Verwertung ist ohne schriftliche Zustimmung des Autors oder des Verlages unzulässig. Das gilt insbesondere für Vervielfältigungen, Übersetzungen, Mikroverfilmungen und die Einspeicherung in und Verarbeitung durch elektronische Systeme. 1. Auflage 2012 All rights reserved. No part of this publication may be reproduced, stored in a retrieval system, or transmitted, in any form or by any means, electronic, mechanical, photocopying, recording, or otherwise, without the prior written permission of the Author or the Publishers. st1 Edition 2012 © 2012 by VVB LAUFERSWEILER VERLAG, Giessen Printed in Germany VVB LAUFERSWEILER VERLAG STAUFENBERGRING 15, D-35396 GIESSEN Tel: 0641-5599888 Fax: 0641-5599890 email: redaktion@doktorverlag.de www.doktorverlag.de édition scientifique Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. Joachim Geyer Der Polymorphismus 1117C>T im Cytochrom P450 CYP1A2 beeinträchtigt die Metabolisierung von Theobromin beim Beagle Hund INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen eingereicht von Sabrina Collica Tierärztin aus Solingen Gießen 2012 Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. M. Kramer Gutachter: Prof. Dr. J. Geyer Prof. Dr. N. Mencke Tag der Disputation: 28. Juni 2012 Zwischen Reden und Tun liegt das Meer – Tra il dire e il fare c'è di mezzo il mare Für meinen Opa und meine Oma Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________ I Gliederung INHALTSVERZEICHNIS VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN VERZEICHNIS DER TABELLEN ABKÜRZUNGEN INHALTSVERZEICHNIS 1 EINLEITUNG ........................................................................................... 1 1.1 Biotransformation........................................................................................ 1 1.2 Cytochrom P450 und Arzneistoffmetabolisierung ................................... 3 1.3 Polymorphismen in Cytochrom P450 Enzymen ....................................... 4 1.4 Der CYP1A2 1117C>T Polymorphismus beim Hund ............................. 5 1.5 Methylxanthine ............................................................................................ 7 1.5.1 Theobromin....................................................................................................... 8 1.5.1.1 Klinische Wirkung ................................................................................................... 8 1.5.2 Metabolismus von Theobromin ...................................................................... 10 1.5.3 Theobrominvergiftung beim Hund ................................................................. 12 1.6 Zielsetzung der Arbeit ............................................................................... 17 Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________ II 2 MATERIAL UND METHODEN .......................................................... 18 2.1 Genotypisierung ......................................................................................... 18 2.1.1 Material ........................................................................................................... 18 2.1.2 Methode .......................................................................................................... 19 2.2 Kinetikstudie .............................................................................................. 23 2.2.1 Material ........................................................................................................... 23 2.2.1.1 Tiere ....................................................................................................................... 23 2.2.1.2 Verwendete Prüfgegenstände ................................................................................. 26 2.2.2 Methode .......................................................................................................... 28 2.2.2.1 Versuchsaufbau ...................................................................................................... 28 2.2.2.2 Applikation ............................................................................................................. 31 2.2.2.3 Probenentnahme ..................................................................................................... 32 2.3 Kreatinin ..................................................................................................... 34 2.3.1 Kreatininbestimmung ..................................................................................... 35 2.4 Bestimmung der Methylxanthinkonzentrationen .................................. 35 2.4.1 Material ........................................................................................................... 35 2.4.2 Methode 1 ....................................................................................................... 37 2.4.3 Methode 2 ....................................................................................................... 38 2.5 Berechnungen ............................................................................................. 39 2.5.1 Methylxanthinkonzentrationen ....................................................................... 39 2.5.2 Pharmakokinetischer Parameter ..................................................................... 40 2.5.3 Statistische Methoden ..................................................................................... 41 3 ERGEBNISSE ......................................................................................... 43 3.1 Klinische Allgemeinuntersuchung ........................................................... 43 3.2 Genotypisierung ......................................................................................... 43 3.3 Methylxanthinkonzentrationen nach intravenöser Applikation .......... 44 3.4 Methylxanthinkonzentrationen nach per oraler Applikation ............... 46 3.5 Direkter Vergleich zwischen den Genotypen nach intravenöser Applikation .......................................................................................................... 47 3.6 Direkter Vergleich zwischen den Genotypen nach per oraler Applikation .......................................................................................................... 55 3.7 Pharmakokinetische Parameter ............................................................... 62 Inhaltsverzeichnis ___________________________________________________________________ III 4 DISKUSSION .......................................................................................... 64 5 ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................ 75 6 SUMMARY ............................................................................................. 77 7 LITERATURVERZEICHNIS ............................................................... 78 8 DANKSAGUNG ...................................................................................... 85 9 ERKLÄRUNG ......................................................................................... 86 Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen ___________________________________________________________________ IV VERZEICHNIS DER ABBILDUNGEN Abb. 1.1: Schema der Biotransformation Abb. 1.2: Cytochrom P450 1A2 1117C>T Polymorphismus Abb. 1.3: Methylxanthine Abb. 1.4: Schematische Darstellung des Theobrominmetabolismus beim Hund Abb. 2.1: Absolute Quantifizierung 1117T/T Abb. 2.2: Absolute Quantifizierung 1117C/C Abb. 2.3: Absolute Quantifizierung 1117C/T Abb. 3.1: Ergebnis der CYP1A2 Genotypisierung von 270 Beagle Hunden Abb. 3.2: Methylxanthinkonzentrationen im Plasma nach intravenöser Applikation Abb. 3.3: Methylxanthinkonzentrationen im Urin nach intravenöser Applikation Abb. 3.4: Methylxanthinkonzentrationen im Plasma nach per oraler Applikation Abb. 3.5: Methylxanthinkonzentrationen im Urin nach per oraler Applikation Abb. 3.6: Theobrominkonzentrationen im Plasma nach intravenöser Applikation Abb. 3.7: 3-Methylxanthinkonzentrationen im Plasma nach intravenöser Applikation Abb. 3.8: Theobrominkonzentrationen im Urin nach intravenöser Applikation Abb. 3.9: 3-Methylxanthinkonzentrationen im Urin nach intravenöser Applikation Abb. 3.10: 7-Methylxanthinkonzentrationen im Urin nach intravenöser Applikation Abb. 3.11: 3,7-Dimethylharnsäurekonzentrationen im Urin nach intravenöser Applikation Abb. 3.12: Theobrominkonzentrationen im Plasma nach per oraler Applikation Abb. 3.13: 3-Methylxanthinkonzentrationen im Plasma nach per oraler Applikation Abb. 3.14: Theobrominkonzentrationen im Urin nach per oraler Applikation Abb. 3.15: 3-Methylxanthinkonzentrationen im Urin nach per oraler Applikation Abb. 3.16: 7-Methylxanthinkonzentrationen im Urin nach per oraler Applikation Abb. 3.17: 3,7-Dimethylharnsäurekonzentrationen im Urin nach per oraler Applikation Abb. 4.1: Theobrominmetabolismus VERZEICHNIS DER TABELLEN Tab. 2.1: Kennzeichnung der eingesetzten Hunde Tab. 2.2: Prüfgegenstand 1 Tab. 2.3: Prüfgegenstand 2 Tab. 2.4: Prüfgruppen Tab. 2.5: Cross-over Studiendesign Tab. 2.6: Randomisierung Tab. 2.7: Blut- und Urinprobenentnahmezeitpunkte Tab. 3.1: Pharmakokinetische Parameter im Plasma nach per oraler Applikation Tab. 3.2: Pharmakokinetische Parameter im Plasma nach intravenöser Applikation Tab. 3.3: Pharmakokinetische Parameter im Urin nach per oraler Applikation Tab. 3.4: Pharmakokinetische Parameter im Urin nach intravenöser Applikation Verzeichnis der Abbildungen und Tabellen ___________________________________________________________________ V Tab. 4.1: Unterschiede in der Allelfrequenz des caninen CYP1A2 1117C>T SNP Tab. 4.2: Speziesunterschiede in der Metabolisierung von Theobromin Tab. 4.3: Pharmakokinetische Parameter nach intravenöser Applikation Tab. 4.4: Pharmakokinetische Parameter nach per oraler Applikation von Schokolade bzw. Kapseln ABKÜRZUNGEN ___________________________________________________________________ VI ABKÜRZUNGEN Abb. Abbildung AC Animal Center AUCinf Area under the curve from zero to infinity BAH Bayer Animal Health Bp Basenpaar BV Bioverfügbarkeit °C Grad Cesius Clobs Körperclearance der Substanz Cmax maximale Konzentration CP Konzentration in der Probe CYP Cytochrom D Dosis Fläche Peakfläche der Probe im Chromatogramm g Gramm h Stunde i.v. intravenös kg Kilogramm KG Körpergewicht KI Konfidenzintervall l Liter 1 % in einer bestimmten Population. Der häufigste genetische Polymorphismus ist der Single Nukleotid Polymorphismus (SNP). Er bezeichnet den Austausch eines einzelnen Nukleotides (Stojiljkovic et al. 2011). Über Sequenzanalysen wurden bisher fünf der neun caninen Cytochrome als polymorph beschrieben: CYP1A2, CYP2C41, CYP2D15, CYP2E1 und CYP3A12. Allerdings ist über die Auswirkung dieser Polymorphismen auf die Arzneistoffmetabolisierung bisher nur wenig bekannt. Häufig werden Unterschiede in den Plasmakonzentrationen pharmakologisch wirksamer Substanzen und derer Metaboliten in pharmakokinetischen Studien oder Toxizitätsstudien bei Hunden beobachtet. Nur wenige Studien richteten hierbei ihr Augenmerk auf die Assoziation mit Polymorphismen (Kamimura 2006). Polymorphismen können in präklinischen Studien, in denen Hunde als Versuchstiere eingesetzt werden, eine entscheidende Rolle spielen. So können sie nicht nur die Pharmakokinetik des Arzneistoffs beeinträchtigen, sondern auch zu einer unterschiedlichen Arzneistoffantwort führen. Dies kann wiederum über die Wirksamkeit und die Sicherheit eines Arzneistoffes mitentscheiden (Tenmizu et al. 2006; Fleischer et al. 2008). Hunde repräsentieren nicht nur Patienten in der tierärztlichen Praxis oder Klinik, sondern werden auch im Rahmen von präklinischen Studien, insbesondere zur Pharmakokinetik neuer Wirkstoffe eingesetzt. Kamimura empfiehlt bereits im Jahre 2006 nur Gruppen von genetisch homogenen Beagle Hunden für diese Studien einzusetzen, um das Potential interindividueller Unterschiede zu minimieren (Kamimura 2006). Einleitung 5 1.4 Der CYP1A2 1117C>T Polymorphismus beim Hund Im CYP1A2 des Hundes wurde vor einigen Jahren ein Polymorphismus (CYP1A2 1117C>T) identifiziert, welcher in homozygoter Ausprägung zu einem Totalausfall dieses Enzymsystems führt (Tenmizu et al. 2004; Mise et al. 2004a). Dieser Polymorphismus ist in Exon 4 des CYP1A2-Gens des Hundes lokalisiert. Dort befindet sich beim Wildtyp die Base Cytosin, während polymorphe Hunde an dieser Stelle die Base Thymin aufweisen. Dadurch wird das für Arginin codierende Basen-Triplett CGA zu TGA, welches als Stopcodon fungiert und somit zu einem frühzeitigen Abbruch der Translation führt. Das entstehende trunkierte Protein ist nicht funktionsfähig und kann somit keine Metabolisierungsreaktionen katalysieren (Tenmizu et al. 2004, Abb. 1.2). Dieser CYP1A2-Polymorphismus und der damit verbundene Enzymausfall führt bei normalerweise über CYP1A2 metabolisierten Substraten zu einer signifikanten Beeinträchtigung der Pharmakokinetik. Das kinetische Verhalten einer oral verabreichten Substanz ist bestimmt von der Absorption (Aufnahme), Distribution (Verteilung) und der Eliminierung (Ausscheidung). Während die Aufnahme- und Umverteilungsphase nur wenig von Cytochrom-Polymorphismen beeinflusst werden, können diese in der Eliminierungsphase eine entscheidende Rolle spielen. Einige Substanzen werden hauptsächlich über Oxidationsreaktionen durch Cytochrome metabolisiert. Bereits im Jahre 2004 wurde beschrieben, dass der CYP1A2 1117C>T Polymorphismus zu einem signifikant unterschiedlichen pharmakokinetischen Verhalten zweier neuer Wirksubstanzen (YM64227 und AC3933) führt (Tenmizu et al. 2004; Mise et al. 2004a). Weiterhin gibt es Hinweise, dass dieser Polymorphismus für die großen interindividuellen Unterschiede im kinetischen Verhalten einer dritten Substanz (Celecoxib) mitverantwortlich ist (Kamimura 2006). Am Beispiel der Substanz AC3933 konnten Hunde als „poor metabolizer“ (PM) und „extensive metabolizer“ (EM) phänotypisiert werden (Mise et al. 2004a). Durch Immunoblotverfahren konnten dieselben Autoren später zeigen, dass PM-Hunde kein CYP1A2 in der Leber exprimieren (Mise et al. 2004b). Obwohl bisher wenig über die möglichen toxischen Folgen von Cytochrom-Polymorphismen beim Hund berichtet wurde ist es möglich, dass Substanzen, welche hauptsächlich über Cytochrome metabolisiert werden, bei einem Enzymausfall toxisch wirken können (Kamimura 2006). Fleischer et al. weisen in einer Übersichtsarbeit darauf hin, dass es in Zukunft Einleitung 6 möglicherweise Microarray-gestützte Testsysteme geben wird, mit welchen Hunde auf mögliche Polymorphismen getestet werden können. Entsprechende Testverfahren existieren in größerem Stil bereits für einige CYP-Polymorphismen beim Menschen (Fleischer et al. 2008). Abb. 1.2 Cytochrom P4501A2 1117C>T Polymorphismus beim Hund, modifiziert nach Aretz und Geyer 2010. Der Basenaustausch 1117C>T führt zu einem frühzeitigen Stopcodon und damit zu einem Abbrechen der Proteintranslation bei der CYP1A2- Proteinbiosynthese. Entsprechende sonst von CYP1A2 katalysierte Biotransformationsreaktionen können dann nicht mehr stattfinden. Einleitung 7 1.5 Methylxanthine Methylxanthine sind Xanthinderivate, die als natürliche Inhaltsstoffe in unterschiedlichen Konzentrationen in verschiedenen Pflanzen vorkommen. Coffein (1,3,7-Trimethylxanthin), Theophyllin (1,3-Dimethylxanthin) und Theobromin (3,7-Dimethylxanthin) sind verwandte Methylxanthine, die eine ähnliche pharmakologische Wirkung aufweisen (Abb. 1.3). Methylxanthine liegen in Reinform als weiße Kristalle vor, die in Wasser schwer löslich sind, keinen Geruch, aber einen bitteren Geschmack aufweisen. Wegen ihrer nachweislichen pharmakologischen Wirkung waren sie seit jeher in der Medizin von Bedeutung (Matissek 1997). Coffein ist als anregender Inhaltsstoff das Hauptalkaloid in Kaffee, Theophyllin findet sich neben Coffein in Tee, Theobromin findet sich als Hauptalkaloid in Kakaopflanzen. Methylxanthine verteilen sich nach Aufnahme in allen Körperflüssigkeiten und akkumulieren aufgrund ihrer schnellen Verstoffwechslung nicht in Organen und Geweben. Hauptsächlich werden sie über Cytochrome in der Leber metabolisiert (Arnaud 2011). Abhängig von der Tierart werden sie in unterschiedlichen prozentualen Anteilen über den Urin und die Faeces ausgeschieden. Miller et al. konnten in einer Studie 89 % des verabreichten radioaktiv markierten Theobromins im Urin und 4,5 % in den Faeces von Hunden nachweisen. 36,8 % des an Hunden verabreichten Theobromins wurde unverändert mit dem Urin ausgeschieden, 19,9 % als 3-Methylxanthin (3-MX), 3,4 % als 7-Methylxanthin (7-MX) und 0,4 % als 3,7-Dimethylharnsäure (3,7-DMH). Beim Hund konnte somit eine dominierende Aktivität der Demethylierung von Theobromin an der Bindungsstelle 7 aufgezeigt werden (Miller et al. 1984; Arnaud 2011). NH N N NO O CH3 CH3 N N N NO O CH3 H CH3 N N N NO O CH3 CH3 CH3 1,3-Dimethylxanthin (Theophyllin) 3,7-Dimethylxanthin (Theobromin) 1,3,7-Trimethylxanthin (Coffein) Abb. 1.3 Chemische Struktur und Klassifizierung der Methylxanthine. Einleitung 8 1.5.1 Theobromin Theobromin (griechisch „die Speise der Götter“) ist das Hauptalkaloid in Kakao (Theobroma cacao). Der Gehalt an Theobromin in Kakao und Schokolade wird durch viele Faktoren beeinflusst. Die Hauptfaktoren stellen hierbei die Bearbeitung, das Herstellungsverfahren, der Genotyp der Kakaopflanze, die geographische Abstammung und das Gewicht der Kakaobohne dar. Da Schokoladenprodukte in der Regel eine Mischung aus verschiedenen Kakaobohnen enthalten, lässt sich ein genauer Theobromingehalt in einem Fertigprodukt nicht mehr errechnen. Handelsübliche Milchschokolade enthält circa 0,184 %, Kakaobutter circa 0,006 % und weiße Schokolade circa 0,002 % Theobromin (Matissek 1997). Shively et al. zeigten, dass die orale Bioverfügbarkeit von Theobromin in Schokolade (circa 80 %) geringer als die Bioverfügbarkeit einer oral applizierten Theobromin-Salz-Lösung ist (Shively et al. 1985). Mumford et al. verglichen jedoch in einer Studie die Absorption und Bioverfügbarkeit von Schokolade und oral verabreichten Theobromin in Kapseln. Hierbei war die orale Bioverfügbarkeit des Theobromins in der Schokolade höher als die der Kapseln. Auch wurden nach kürzerer Zeit höhere Konzentrationsmaxima nach der Verabreichung von Schokolade im Plasma nachgewiesen (Mumford et al. 1996). Die Autoren vermuteten, dass die applizierte Theobromin-Salz-Lösung, die Shively et al. 1985 verwendeten, die Theobrominabsorption verringern könnte. 1.5.1.1 Klinische Wirkung Heutzutage gibt es in Deutschland kein zugelassenes Arzneimittel in der Tiermedizin, welches Theobromin als Monopräparat enthält. Seine leistungsfördernde Wirkung findet jedoch noch heute einen Missbrauch im Doping von Windhunden und Rennpferden (Loeffler 2000; Schaarschmidt 2008). Diuretische Wirkung von Theobromin Bereits um die Jahrhundertwende 1900 wurde eine verstärkte Urinausscheidung nach Aufnahme von Theobromin beobachtet. Die diuretische Wirkung wurde arzneilich genutzt (Diuretin®, Theobromin-Natriumsalicylat), jedoch ging die Bedeutung durch die Einführung wirksamere Einleitung 9 Diuretika im Jahre 1930 zurück (Rau 2001). Dorfman und Jarvik bestätigten 1970 die höhere Wirksamkeit von Coffein im Vergleich zu Theobromin, wogegen Czok im Jahre 1974 Theobromin die stärkere diuretische Wirkung zusprach (Dorfman und Jarvik 1970; Czok 1974). Der renale Blutkreislauf wird durch Adenosin α1- und α2-Rezeptoren reguliert (Vallon et al. 2006). Theobromin besitzt im Vergleich zu anderen Methylxanthinen zwar eine geringere Adenosin-Rezeptor-Affinität, zeichnet sich aber dennoch als nicht-selektiver Adenosin- Antagonist aus, wodurch die diuretische Wirkung zu erklären ist (Fredholm und Lindström 1999; Smit 2011). Wirkungen von Theobromin auf den Respirationstrakt Die Kontraktilität der glatten Muskulatur der Bronchien wird über adrenerge β2-Rezeptoren und Adenosin-Rezeptoren reguliert (Smit 2011). Aufgrund der relaxierenden Wirkung auf die glatte Bronchialmuskulatur wurde Theobromin auch in der Asthma-Therapie eingesetzt, jedoch durch das stärker wirkende Theophyllin ersetzt (Locher 1989). Theobromin unterdrückte in einer Vergleichsstudie mit Codein den Hustenreiz effektiver, wobei Theobromin deutlich weniger Nebenwirkungen aufwies (Usmani et al. 2005). Sowohl die bronchodilatative als auch die antitussive Wirkung schreibt Smit gegenwärtig Theobromin als Adenosin-Rezeptor-Antagonist zu, jedoch sei die genaue Wirkweise ungeklärt (Smit 2011). Kardiovaskuläre Wirkungen von Theobromin Ein weiteres Anwendungsgebiet von Theobromin stellte die Therapie der Herzinsuffizienz dar (Batterman et al. 1959). Hierbei erwies sich Theobromin durch die Kombination aus diuretischer, vasodilatierender und positiv inotroper Wirkung als vorteilhaft (Heathcote 1920; Chapman und Miller 1974; Timson 1975). In der Literatur finden sich jedoch auch Angaben, nach welchen Theobromin außer Magen- Darm-Reizungen keine pharmakologischen Wirkungen beim Menschen zuzusprechen sind (Dorfman und Jarvik 1970) und die therapeutische Nutzbarkeit daher bestritten wird (Tarka 1982). Einleitung 10 1.5.2 Metabolismus von Theobromin Die Stoffwechselwege von Theobromin wurden intensiv beim Menschen erforscht und beschrieben. Im Gegensatz zu Coffein und Theophyllin wird Theobromin nicht in andere Dimethylxanthine verstoffwechselt. Dagegen entsteht aus der Demethylierung von Coffein das Theobromin und aus Theophyllin entsteht das Paraxanthin (Smit 2011). Eine vergleichende Studie zwischen fünf verschiedenen Säugetieren (Ratte, Maus, Hamster, Kaninchen und Hund) zeigte, dass alle untersuchten Spezies oral appliziertes Theobromin über Demethylierung, Ringoxidation und Ringteilung zu überwiegend gleichen Metaboliten verstoffwechseln. Jedoch ließen sich große Unterschiede im quantitativen Verhältnis der einzelnen Metaboliten erkennen, welche vor allem die Präferenz der Demethylierungsposition betreffen. Bei Hund und Ratte zeigte sich eine Präferenz für die Demethylierung an Position C7, wodurch der pharmakologisch wirksame Metabolit 3-Methylxanthin entsteht. Beim Menschen und vielen anderen untersuchten Spezies dominiert dagegen der Anteil des Metaboliten 7-Methylxanthin über 3-Methylxanthin, da hier die N-Demethylierung bevorzugt an Position C3 abläuft. Als quantitativ größter Anteil wurde von den meisten Spezies jedoch unverändertes Theobromin ausgeschieden (Miller et al. 1984; Arnaud 2011, Abb. 1.4). Im Übrigen stellt Coffein eine Testsubstanz für die Messung der CYP1A2-Aktivität beim Menschen dar und wird daher zur Phenotypisierung bestimmter CYP1A2-Polymorphismen eingesetzt (Zanger et al. 2008). Gates und Miners zeigten im Jahre 1999, dass neben CYP1A2 auch CYP2E1 am Metabolismus von Theobromin beim Menschen beteiligt ist. Dabei ist CYP1A2 an der Bildung von 7-Methylxanthin und CYP2E1 an der Bildung von 7-Methylxanthin, 3-Methylxanthin und 3,7-Dimethylharnsäure beteiligt. Als Testsubstanz für Aktivitätsmessungen von CYP1A2 und CYP2E1 wäre Theobromin jedoch nicht geeignet, da hier mehrere Enzyme in den einzelnen Metabolisierungsschritten beteiligt sind (Gates und Miners 1999). Dorne et al. beschreiben zudem die Beteiligung von CYP2A6 im Metabolismus von Theobromin beim Menschen (Dorne et al. 2001). Des Weiteren muss angemerkt werden, dass trotz hoher Sequenzhomologie zwischen einzelnen CYPs von Mensch und Hund, das Substratspektrum durchaus unterschiedlich ausfallen Einleitung 11 kann (Fink-Gremmels 2008). So zeigten z.B. Mise et al. (2008), dass CYP1A2, anders als beim Menschen, im Metabolismus von Coffein beim Hund nicht beteiligt ist. NH N N NO O CH3 CH3 NH N N H NO O CH3 NH N H N NO O CH3 NH N N NO O CH3 CH3 O NH N N NO O CH3 CH3 3-Methylxanthin (19,9%) 7-Methylxanthin (3,4%) 3,7-Dimethylharnsäure (0,4%) 3,7-Dimethylxanthin (Theobromin) 3,7-Dimethylxanthin (36,8%) Abb. 1.4 Schematische Darstellung des Theobrominmetabolismus beim Hund. Die Prozentangaben beziehen sich auf den jeweiligen Anteil der Metabolite im Urin nach oraler Verabreichung von Theobromin. Angaben nach Miller et al. 1984. Einleitung 12 1.5.3 Theobrominvergiftung beim Hund Als therapeutische Dosis für den Hund werden in der Literatur für Theobromin 20 mg/kg Körpergewicht angegeben (Glauberg und Blumenthal 1983; Hornfeldt 1987). Erste klinische Anzeichnen sind ab dieser therapeutischen Dosis von 20 mg/kg KG zu erwarten, schwere Anzeichen bereits ab 40-50 mg/kg KG und Anfälle ab 60 mg/kg KG (Gwaltney-Brant 2001). So traten Vergiftungserscheinungen beim Hund in der Vergangenheit bereits bei einer aufgenommenen Menge Theobromin von unter 100 mg/kg Körpergewicht auf (Jansson et al. 2001). Strachan und Bennett beschreiben 1994 eine Dosis von 100 mg/kg KG als letale Dosis für den Hund (Strachan und Bennett 1994). Die Berichterstattung über Theobrominvergiftungen bei Tieren begann nach dem 2. Weltkrieg. Zu dieser Zeit waren Vergiftungen weit verbreitet, da Kakaobohnenschalen als Futterzusatz für Vitamin D bei Nutztieren verwendet wurden (Sutton 1981). In der Literatur erschienen Fallberichte von Vergiftungen bei Pferden (Hooser 1985), Schweinen, Geflügel (Blakemore und Shearer 1943), Kälbern (Curtis und Griffiths 1972), Hunden, Katzen, Ratten, Mäusen, Kaninchen, Meerschweinchen (Tarka 1982; Eteng et al. 1997), aber auch bei Hausfliegen (Srinivasau und Kesava 1979). Menschen hingegen verzehren seit jeher Schokolade wobei nie über gravierende Vergiftungserscheinungen berichtet wurde. Fallberichte von Theobrominintoxikationen Bei Haustieren, insbesondere dem Hund, wird immer wieder von Theobrominvergiftungen aufgrund von Schokoladenverzehr berichtet (Decker 1972; Sutton 1981; Tarka 1982; Glauberg und Blumenthal 1983; Hooser 1985; Hornfeldt 1987; Strachan und Bennett 1994; Sturgeon und Sutton 2008; Stosic et al. 2011), aber auch nach dem Verzehr von Kakaobohnenschalenmulch wurden Vergiftungssymptome beschrieben (Drolet et al. 1984; Hovda und Kingston 1994). Im Jahre 1942 starben sechs Hunde infolge der Verfütterung eines Futtermittels mit einem Theobromingehalt von 2 g/kg (Clough 1942). Durch achtlos weggeworfenen Müll verstarben zwei Wildtiere (Rotfuchs und Dachs) in Schweden vermutlich an einer Theobrominvergiftung (Jansson et al. 2001). Glauberg und Blumenthal berichteten im Jahre 1983 von einem 20,6 kg schweren Springer Spaniel, der einen Tag nach der Aufnahme von Milchschokolade mit einem Einleitung 13 geschätzten Theobromingehalt von 1920 mg nach vorangehender Nervosität, Harninkontinenz, Tremor und generalisierten Krämpfen verstarb. Der Serumspiegel des verstorbenen Hundes betrug 133 mg Theobromin/l (Glauberg und Blumenthal 1983). Stidworthy et al. untersuchten einen Fall in dem ein Hundebesitzer eine geringe Menge dunkler Schokolade an vier englische Bulldoggen verfütterte. Zwei dieser Hunde kollabierten und starben, zwei der Hunde zeigten keine Symptome. Aufgrund des gleichzeitigen Todes zweier zuvor gesunder Hunde schlossen die Autoren auf eine Theobrominvergiftung und unterstützten hiermit die Beobachtung von Gans et al., die bereits 1980 über die individuelle Variabilität in der Pharmakokinetik von Theobromin bei Hunden berichteten (Gans et al. 1980; Stidworthy et al. 1997). Hovda und Kingston beschreiben im Jahre 1994 drei Fälle von Theobrominvergiftungen bei Hunden infolge des Verzehrs von Kakaobohnenschalenmulch (Theobromingehalt: 0,2 - 3,0 %), der in Gartenzentern zum Verkauf angeboten wird. Alle drei Hunde zeigten Vomitus, Nervosität und Tremor und wurden symptomatisch behandelt. Ein Hund zeigte nach 96 h keine deutliche Besserung der Symptome, die anderen beiden Hunde erholten sich nach 72 h vollständig (Hovda und Kingston 1994). Auch Drolet et al. berichten bereits im Jahre 1984 von einem ähnlichen Fall. Nach dem Verzehr großer Mengen Kakaobohnenschalen verstarb ein Labrador Retriever infolge von Konvulsionen (Drolet et al. 1984). Strachan und Bennett verwiesen 1994 auf die Gefährlichkeit von Schokoladenprodukten indem sie über einen Fall von Kakaopulveraufnahme durch zwei Hunde berichteten, die am Folgetag verstarben. Eine anschließende Obduktion ergab einen Serumspiegel von 140 mg Theobromin / l (Strachan und Bennett 1994). Sutton berichtete 1981 von einer Theobrominaufnahme durch einen Springer Spaniel in Form von einer Tasse Kakaogetränk. Auch dieser Hund verstarb am Folgetag gemäß Obduktion an akutem Herz-Kreislaufversagen (Sutton 1981). Decker beschrieb den Fall eines Airedale Terriers, welcher Blockschokolade aufgenommen hatte und nach Vomitus, Tremor, Spasmen und zyanotischen Schleimhäuten einen komatösen Zustand aufwies. Der Hund verstarb unmittelbar nach der Ankunft in einer Tierklinik (Decker 1972). Stosic et al. berichteten von einem Kavalier King Charles Spaniel, welcher etwa 25 Stunden vor Vorstellung in der tierärztlichen Klinik circa 200 g Vollmilchschokolade aufgenommen hatte. Dies entspricht einer errechneten, aufgenommenen Theobrominmenge von 200-400 mg bzw. Einleitung 14 33-66 mg/kg KG. Die Besitzer des Hundes berichteten von Diarrhoe und Vomitus bei gestörtem Allgemeinbefinden. In der Klinik zeigte der Hund zudem Exzitationen, Tachykardie, Tachypnoe und Polyurie. Eine Bestimmung der Methylxanthinkonzentrationen mittels HPLC ergab 45 h nach Schokoladenaufnahme einen Serumspiegel von 108 mg Theobromin / l. Der Hund wurde nach fünftägiger umfangreicher Therapie mittels Infusionen, Aktivkohle, Esmolol und Atenolol mit gutem Allgemeinbefinden entlassen (Stosic et al. 2011). Symptome einer Theobrominvergiftung werden in den oben genannten Berichten wie folgt zusammengefasst: Nervosität, Hyperaktivität, Tremor, Zyanose der Schleimhäute, Spasmen, Hyperthermie, Ataxie, Vomitus, Diarrhoe, Polyurie, Dehydratation, Harninkontinenz, Tachypnoe, beginnende Bradykardie bis Tachykardie, Arrhythmien, Koma, plötzliches Herz-Kreislauf- Versagen. Offizielle Meldungen von Theobrominintoxikationen Eine Analyse von Sturgeon und Sutton aus 3014 Fällen von Theobrominvergiftungen bei Hunden, die im Zeitraum von April 1992 bis Oktober 1997 im Veterinary Poisons Information Service in London gemeldet wurden, ergab eine hohe Morbidität, jedoch eine geringe Mortalität nach Theobrominaufnahme (Sturgeon und Sutton 2008). Hooser berichtete über 77 Fälle von Theobrominvergiftungen bei Tieren, die im Jahr 1984 an das National Animal Poison Control Center der Universität Illinois gemeldet wurden und kam zu dem Ergebnis, dass in 97,4 % aller Anrufe die Aufnahme von Schokolade für Vergiftungssymptome verantwortlich war. Insgesamt starben zwei Hunde und zwei Pferde (Hooser 1985). Toxikologische Studien mit Theobromin Gans et al. führten 1980 eine Studie durch, in der Mischlingshunden unterschiedliche Mengen Theobromin in Kapseln verabreicht wurden. Nach einmaliger Applikation verstarb einer von vier Hunden bei einer Dosierung von 300 mg/kg Körpergewicht, sowie einer von acht Hunden bei 500 mg/kg Körpergewicht und einer von zwei Hunden bei 1000 mg/kg Körpergewicht. Symptome traten nicht dosisabhängig auf und äußerten sich in Hecheln, Nervosität und Tremor. Während der Langzeitapplikation von Theobromin in unterschiedlichen Dosierungen starben Einleitung 15 sieben von zehn Hunden. Die verbliebenen drei Hunde wurden am Ende der Studie euthanasiert. In der Obduktion dieser zehn Hunden zeigten sich bei sechs Tieren fibrotische Myopathien des rechten Vorhofes, die ebenfalls nicht dosisabhängig auftraten (Gans et al. 1980). Hodenatrophie (Friedmann et al. 1975; Tarka et al. 1981), sinkende Wachstumsgeschwindigkeit, Gewichtsverlust und Thymusatrophie (Tarka et al. 1979), wie sie in Rattenversuchen nach Applikation von Theobromin zu beobachten waren, traten bei Hunden nicht auf. Bei einer Verabreichung von Theobromin in einer Dosierung von unter 300 mg/kg traten unter den Studienbedingungen bei keinem Hund Symptome einer Vergiftung auf (Gans et al. 1980). Therapie der Theobrominvergiftung beim Hund Da kein spezifisches Antidot existiert, wurden in den berichteten Fällen von Theobrominvergiftungen symptomatische Therapien eingeleitet. Empfohlen werden induziertes Erbrechen, Magenspülungen und Verabreichung von Aktivkohle um die Resorption von Theobromin über den Magen-Darm-Trakt zu verhindern, wiederholte Diazepam-Injektionen gegen Krampfanfälle, bei langanhaltenden Krämpfen Anästhesien durch kurzwirkende Barbiturate oder Phenobarbital, Überwachung der Herzfunktionen und gegebenen Falles die Verabreichung von Propanolol beziehungsweise Lidocain (Glauberg und Blumenthal 1983; Hornfeldt 1987; Hovda und Kingston 1994; Strachan und Bennett 1994). Einige Hunde wurden vom Besitzer tot aufgefunden, andere starben trotz eingeleiteter Therapie an Herz- Kreislaufversagen. In einigen Fällen wurden die Hunde obduziert. Die ermittelten Diagnosen entsprachen dem klinischen Bild. Es zeigten sich Magenüberladungen mit schokoladeähnlichem Inhalt, geschwollene und gerötete Schleimhäute im Magen-Darm-Trakt, Zyanose, Leber-, Nieren-, Milzstauungen und diffuse Lungenstauung (Decker 1972; Sutton 1981; Drolet et al. 1984; Strachan und Bennett 1994). Theobromin in Zusammenhang mit Doping Aufgrund des stimulierenden und leistungsfördernden Effekts zählt Theobromin im Rennsport von Hunden und Pferden zu den doping-relevanten Substanzen (Loeffler 2000; Schaarschmid 2008). Für den Pferdesport gibt die Deutsche Reiterliche Vereinigung (Bundesverband für Pferdesport und Pferdezucht) im Anhang I eine Liste der Dopingsubstanzen und verbotenen Methoden im Einleitung 16 Wettkampf an. Hier liegt der Grenzwert für Theobromin im Urin bei 2 µg/ml. Im Schlittenhundesport gilt die Liste verbotener Substanzen und verbotener Methoden von 2011, herausgegeben von der International Federation of Sleddog Sports. Hier zählt Theobromin zu den Stimulantien und ist verboten. Auch die FCI (Federation Canina International)-Sportordnung, die im Windhundesport (Rennen und Coursing) gilt, legt einen Grenzwert von 2 µg/ml Urin fest. Einleitung 17 1.6 Zielsetzung der Arbeit Polymorphismen in den Cytochrom P450-Enzymen (CYPs) des Menschen wurden in den letzten Jahrzehnten intensiv erforscht. Viele von diesen, z.B. CYP2D6, CYP2C9 oder CYP2C19 haben einen erheblichen Einfluss auf die Metabolisierungsrate und damit auf das Auftreten unerwünschter Arzneimittelwirkungen. Polymorphismen in den CYPs des Hundes sind weniger gut erforscht. Diese sind jedoch aus zweierlei Hinsicht von Interesse: So ist der Hund nicht zur Zielspezies der Arzneitherapie in der Veterinärmedizin, sondern im Falle des Beagle Hundes auch Modelltier für pharmakokinetische Untersuchungen im Rahmen der Arzneistoffentwicklung und -zulassung. Ein besseres Verständnis der genetischen Variabilität in den CYPs des Hundes würde dabei nicht nur die therapeutische Sicherheit vieler Arzneistoffe verbessern, sondern auch pharmakokinetische Daten aus Studien am Beagle Hund besser interpretierbar machen. Derzeit wurden neun Cytochrom P450-Enzyme des Hundes identifiziert: CYP1A1, CYP1A2, CYP2B11, CYP2C21, CYP2C41, CYP2D15, CYP2E1, CYP3A12, und CYP3A26. Für einige der genannten CYPs wurden bereits polymorphe Sequenzen beschrieben. Darunter ein CYP1A2 1117C>T Polymorphismus, welcher in homozygoter Ausprägung zu einem Totalausfall des CYP1A2 führt. Dies äußert sich nicht nur in erheblichen Unterschieden in der Metabolisierung von Entwicklungssubstanzen (AC-3933, YM-64227) im Rahmen der Arzneistoffentwicklung, sondern könnte auch an der hohen Empfindlichkeit von Hunden gegenüber Methylxanthinen wie Theobromin beteiligt sein. Im Rahmen dieser Dissertation sollte Theobromin als mögliches CYP1A2-Substrat des Hundes identifiziert und die Metabolisierung sowie die renale Elimination von Theobromin nach oraler und intravenöser Einmalgabe in Abhängigkeit von der genetischen Disposition der eingesetzten Hunde untersucht werden. Das Ziel dieser Studie war eine CYP1A2 Genotyp-basierte pharmakokinetische Metabolismusstudie mit der wirksamen Substanz Theobromin. Da eine höhere Empfindlichkeit für toxische Reaktionen in der Gruppe der polymorphen CYP1A2 1117T/T Hunde erwartet wurde, wurde eine subtoxische Dosierung von 10 mg/kg Körpergewicht gewählt. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 18 2 MATERIAL UND METHODEN 2.1 Genotypisierung 2.1.1 Material DNA-Gewinnung und -Isolierung MasterAmpTM Buccal Swab Brush Epicentre, Biotechnologies, Madison, USA QIAmp DNA Mini Kit Qiagen, Hilden, Deutschland Ethanol, 100% Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland Phosphatgepufferte Salzlösung Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland Heraeus Multifuge 3 L-R Kendro Laboratory Products GmbH, Kernen, Deutschland Vortex Heidolph Instruments, Schwabach, Deutschland Eppendorf Reaktionsgefäß Eppendorf, Hamburg, Deutschland Genotypisierung TaqMan Genotyping Master Mix AmpliTaq Gold DNA-Polymerase dNTP-Mix Reaktionspuffer TaqMan AD Assay Applied Biosystems 7300 Thermocycler 7300 Real-Time PCR-System Sequence Detection Software (SDS) v1.4 Applied Biosystems, Darmstadt, Deutschland Material und Methoden ___________________________________________________________________ 19 2.1.2 Methode DNA-Gewinnung Es wurden von der Maulschleimhaut Abstriche von 270 Beagle Hunden mit Hilfe von MasterAmpTM Buccal Swab Brushs (Epicentre, Biotechnologies, Madison, USA) entnommen und genomische DNA mittels QIAmp DNA Mini Kit (Qiagen, Hilden, Deutschland) isoliert. Um Verunreinigungen zu vermeiden wurden die Proben an nüchternen Tieren gewonnen. Nach Entnahme des Buccal Swab Brushs aus der sterilen Umverpackung wurde der Fang des Tieres geöffnet und das Stäbchen 10 x gründlich über die Schleimhaut gerieben. Dabei wurde das Stäbchen zusätzlich gedreht um möglichst viel Zellmaterial auf das Stäbchen zu übertragen. Anschließend wurde das Stäbchen in ein gekennzeichnetes steriles Probengefäß verbracht. Die Proben wurden mindestens 2 Stunden getrocknet und bis zur DNA-Isolierung bei 4-8°C aufbewahrt. DNA-Isolierung Die DNA wurde mit Hilfe des QIAmp DNA Mini Kit, nach Vorgaben des Herstellers (Qiagen, Hilden, Deutschland, QIAmp DNA Mini and Blood Mini Handbuch) isoliert. Hierzu wurden die Buccal Swab Brushs (Epicentre, Biotechnologies, Madison, USA) in ein 2-ml-Reaktionsgefäß überführt und 500 µl phosphatgepufferte Salzlösung zugefügt. Nach Zugabe von 20 µl Protease (im Kit enthalten) und 500 µl Buffer AL (im Kit enthalten) wurde die Probe sofort mit Hilfe eines Schüttelgeräts (Vortex) 15 Sekunden vermischt. Danach wurde die Probe für 10 min in ein auf 56°C erwärmtes Wasserbad gestellt und im Anschluss 10 min bei Raumtemperatur (15-25°C) mit 3220 x g zentrifugiert (Heraeus Multifuge 3 L-R, Kendro Laboratory Products GmbH, Kernen, Deutschland). Anschließend wurden 500 µl Ethanol hinzugefügt und die Probe erneut mit einem Schüttelgerät gemischt. Danach wurden 700 µl des Reaktionsgemisches in eine QIAamp-Spinsäule (im Kit enthalten) überführt, 1 min mit 6.000 x g zentrifugiert und die QIAamp-Spinsäule in ein sauberes 2-ml-Reaktionsgefäß gesetzt. Mit den restlichen 700 µl des Reaktionsgemisches wurde ebenso verfahren. Im Anschluss wurde dem Reaktionsgemisch 500 µl Buffer AW1 (im Kit enthalten) zugefügt und 1 min mit 6.000 x g zentrifugiert. Die QIAamp- Material und Methoden ___________________________________________________________________ 20 Spinsäule wurde erneut in ein 2-ml-Reaktionsgefäß gesetzt und daraufhin 500 µl Buffer AW2 (im Kit enthalten) zugefügt. Dieses Gemisch wurde 3 min mit 20.000 x g zentrifugiert und in ein neues 1,5-ml-Reaktionsgefäß gesetzt. Der Säule wurden danach 150 µl Buffer AE (im Kit enthalten) zugefügt, bei Raumtemperatur 1 min inkubiert und mit 6.000 x g zentrifugiert. Die DNA-Lösung wurde bis zur PCR Analyse bei -20°C aufbewahrt. Genotypisierung Die isolierte DNA wurde ohne vorherige Quantifizierung mit einem Volumen von 7,5 µl in die nachfolgende PCR-Reaktion zur CYP1A2-Genotypisierung eingesetzt. Dabei wurde eine Methode angewendet, die von Aretz und Geyer (2010) beschrieben wurde und die auf einer allel- spezifischen Bindung von Fluoreszenzfarbstoff-gekoppelten Oligonukleotidsonden an die DNA beruht. Das Pipettieren der PCR-Ansätze (7,5 µl DNA-Lösung, 12,5 µl TaqMan Master Mix, 0,625 µl des Gemischs aus Primern und allel-spezifischen Sonden, 4,375 µl DNase-freies Wasser, Gesamtvolumen 25 µl) als auch die Durchführung der Reaktionen wurden nach Anweisung des Herstellers (Applied Biosystems) durchgeführt. Die verwendeten Oligonukleotid-Primer (vorwärts: 5'-CCT TAA TGG AGG CCT TCA TCC T-3'; rückwärts: 5'-CAG AAG AAG CAG GCC TTA CCT-3', Applied Biosystems) waren spezifisch gegen das CYP1A2-Gen gerichtet und lieferten ein 89 bp großes, den 1117C>T SNP enthaltendes Amplifikationsprodukt. Die beiden mit unterschiedlichen Fluoreszenzfarbstoffen (VIC und FAM) gekoppelten Sonden (Applied Biosystems) unterscheiden sich in ihrer Sequenz nur an einer Position (siehe Unterstreichung) entsprechend dem zu untersuchenden SNP im CYP1A2-Gen (1117C-Allel: VIC-5‘-ATC TTC CGA CAC ACC T-3‘ und 1117T-Allel: FAM-5'-ATC TTC TGA CAC ACC T-3'). Am 3‘ der Sonden wurde ein Quencher gekoppelt, welcher die Eigenfluoreszenz der Sonden unterdrückt. Solange die Fluoreszenzfarbstoffe mit dem Quencher in räumlich naher Verbindung stehen, geht die Anregungsenergie auf den Quencher über, so dass keine Fluoreszenz detektiert werden kann. Trifft aber die Polymerase bei der Elongation ausgehend von dem Vorwärtsprimer auf die Sonde, so baut sie über ihre 5‘ Exonuklease-Aktivität die Sondennukleotide ab. Dabei wird der Fluoreszenzmarker frei und kann bei Anregung Licht emittieren. Diese Fluoreszenz wird im Rahmen einer real-time PCR-Reaktion aufgezeichnet. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 21 Die in einer 96-well Platte befindlichen PCR-Ansätze wurden mit einem Applied Biosystems 7300 Thermocycler (Applied Biosystems) amplifiziert. Dabei wurde eine initiale Denaturierung bei 95°C für 10 Minuten, gefolgt von 40 Zyklen aus Denaturierung bei 92°C für 15 Sekunden und Bindung bzw. DNA-Synthese bei 60°C für eine Minute durchgeführt. Nach Beendigung der PCR wurde in einem post-run Fluoreszenzread die Fluoreszenz beider Sondenfarbstoffe bestimmt und über die Sequence Detection Software (SDS) v1.4 automatisch der entsprechende Genotyp zugewiesen (Allelische Diskriminierung). Der im Rahmen der absoluten Quantifizierung während der real-time PCR gemessene Fluoreszenzzuwachs pro Zyklus diente zur Qualitätskontrolle des PCR-Laufs. Die Zuweisung der Genotypen erfolgte auf folgender Grundlage: Wird nur der mit der CYP1A2 1117C-Sonde gekoppelte Farbstoff FAM freigesetzt, liegt das C-Allel homozygot vor (Abb. 2.1). Wenn jedoch nur der an die CYP1A2 1117T-Sonde gekoppelte Farbstoff VIC freigesetzt wird, stammt die DNA-Probe von einem Hund der homozygot das T-Allel trägt (Abb. 2.2). Werden beide Farbstoffe freigesetzt, liegt ein heterozygoter Genotyp CYP1A2 C/T vor (Abb. 2.3). Bei automatischer software-gestützter allelischer Diskriminierung stellt sich folgendes Bild dar: Die nach dem PCR-Lauf gemessenen Fluoreszenzen von VIC und FAM werden gegeneinander aufgetragen. No template control (NTC) Proben, welche keine genomische DNA enthalten, zeigen nur Hintergrundfluoreszenz für VIC und FAM. Proben homozygot für das T-Allel werden nur im FAM-Kanal registriert, Proben homozygot für das C-Allel nur im VIC-Kanal. Heterozygote Proben liegen auf einer gedachten Winkelhalbierenden; hier wird Fluoreszenz in beiden Kanälen für FAM und VIC detektiert. Die Zuordnung der Genotypen C/C, C/T und T/T erfolgte automatisch durch die Software. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 22 Abb. 2.1 Repräsentative Darstellung eines real-time PCR Laufes für einen homozygoten CYP1A2 1117T/T Hund. Es wurde nur ein Fluoreszenzzuwachs für den Farbstoff FAM detektiert. Abb. 2.2 Repräsentative Darstellung eines real-time PCR Laufes für einen homozygoten CYP1A2 1117C/C Hund. Es wurde nur ein Fluoreszenzzuwachs für den Farbstoff VIC detektiert. FAM VIC Material und Methoden ___________________________________________________________________ 23 Abb. 2.3 Repräsentative Darstellung eines real-time PCR Laufes für einen heterozygoten CYP1A2 1117C/T Hund. Es wurde ein Fluoreszenzzuwachs für beide Farbstoffe, FAM und VIC, detektiert. 2.2 Kinetikstudie 2.2.1 Material 2.2.1.1 Tiere Charakterisierung der Prüftiere In der Prüfung wurden 10 Hunde der Rasse Beagle aus dem Bestand der Bayer Animal Health GmbH (Monheim am Rhein, Deutschland), gezüchtet bei Harlan Winkelmann (Eystrup, Deutschland) eingesetzt. Vor Studienbeginn wurden 270 Hunde auf einen Polymorphismus im Cytochrom P4501A2-Gen getestet und entsprechend ihres Genotyps unterschieden. Fünf ausgewählte Hunde wiesen den VIC FAM Material und Methoden ___________________________________________________________________ 24 genannten Polymorphismus auf, während fünf Hunde keinen Polymorphismus zeigten. Diese zehn Hunde wurden vor Studienbeginn zur Sicherheit ein zweites Mal typisiert. Die Hunde wurden entsprechend den gesetzlichen Vorschriften durch eine permanente Tätowierung im Ohr unveränderlich und individuell, sowie durch eine laufende Nummer gekennzeichnet. Die Charakteristika der eingesetzten Hunde sind in Tabelle 2.1 aufgelistet. Tab. 2.1 Kennzeichnung der eingesetzten Hunde Genotyp laufende Nummer Geschlecht Genotyp laufende Nummer Geschlecht C/C 1 ♀ T/T 6 ♂ T/T 2 ♂ T/T 7 ♂ T/T 3 ♂ T/T 8 ♀ C/C 4 ♀ C/C 9 ♂ C/C 5 ♀ C/C 10 ♀ Eingewöhnungsphase vor Prüfungsbeginn Die für die Prüfung vorgesehenen Tiere waren zu Beginn der Prüfung bereits an die Prüfeinrichtung gewöhnt. Einschlusskriterien In die Prüfung wurden nur Hunde eingeschlossen, die in der Einschlussuntersuchung am Prüftag (PT) -4 klinisch unauffällig waren. Die Tiere durften mindestens zwei Monate vor der Applikation von Theobromin nicht mit Methylxanthinen behandelt worden sein. Die Einschlussuntersuchung wurde von mir vorgenommen und in den Rohdaten dokumentiert. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 25 Ausschlusskriterien vor Einschluss in die Prüfung Tiere mit gestörtem Allgemeinbefinden oder Symptomen einer schwerwiegenden Erkrankung zum Zeitpunkt der Einschlussuntersuchung wurden nicht in die Prüfung eingeschlossen. Verbleib der Tiere nach Prüfungsende Nach Beendigung der Prüfung gingen die Hunde wieder in den Bestand des Bayer Animal Centers, Monheim am Rhein, Deutschland über. Haltungsbedingungen Die Hunde waren in der Prüfeinrichtung des Bayer Animal Centers untergebracht. Die Hunde wurden einzeln in Zwingern gehalten. Die Käfige waren mit einem Fliesenboden, Futternäpfen und Nippel-Selbsttränken ausgestattet. Die Größe eines Zwingers betrug mindestens 6m². Es wurde eine Luftfeuchtigkeit von 40-85 % und eine Lufttemperatur von 18-23°C angestrebt. Die Tierhaltungsräume wurden täglich für 12 Stunden von circa 6.00-18.00 Uhr künstlich beleuchtet. Fütterung und Tränke Die Tiere wurden einmal täglich bedarfsgerecht mit einem handelsüblichen Alleinfutter für Hunde (Firma Ssniff, extrudiert, Alleinfutter für Hunde, Ssniff-Spezialdiäten GmbH, 59494 Soest, Deutschland) gefüttert. Die Fütterungszeitpunkte wurden in den Rohdaten dokumentiert. An den Tagen vor der Applikation wurde die Futteraufnahme zeitlich begrenzt. Der Zeitpunkt des Futterentzugs wurde dokumentiert. An den Applikationstagen erfolgte die Fütterung 4 h nach der Applikation. Trinkwasser stand den Tieren ad libitum zur Verfügung. Die Wasseraufnahme wurde nicht dokumentiert und Wasserproben wurden nicht genommen. Hygienemaßnahmen Die Reinigung der Zwinger erfolgte mindestens einmal täglich. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 26 2.2.1.2 Verwendete Prüfgegenstände Material Analysenwaage Mettler AM 100 Mettler Toledo GmbH, Gießen, Deutschland Waage Mettler PM 4800 DeltaRange Mettler Toledo GmbH, Gießen, Deutschland Vortex Heidolph Instruments, Schwabach, Deutschland Ultraschallbad Transsonic 460 Elma, Singen, Deutschland Filter Millipore Sterivex TM GP 0,22 µm Millipore GmbH, Eschborn, Deutschland FluroTec Stopfen (03) West Pharmaceutical Services, Eschweiler, Deutschland Polyethylenglykol 200 Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland Hartgelatine-Leerkapseln Küpper-Primax GmbH, Troisdorf, Deutschland Natronhydroxid Plätzchen KMF Laborchemie Handels GmbH, Leipzig, Deutschland Methansulfonsäure Merck, Darmstadt, Deutschland Methode Herstellung der Kapseln Um eine exakte per orale Applikation der intendierten Theobromindosis zu gewährleisten, wurde die individuell erforderliche Menge des Theobromins mit Hilfe des dokumentierten Körpergewichtes berechnet, am Tag der Applikation für jedes oral zu behandelnde Tier individuell in Hartgelatine-Leerkapseln gefüllt und in separaten mit der Tier ID beschrifteten Behältern aufbewahrt. Als Hilfsstoff wurde PEG 200 im Verhältnis 1:1 verwendet. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 27 Tab. 2.2 Prüfgegenstand 1 Bezeichnung Theobromin-Hart-Gelatine-Kapseln, Größe 4, farblos, klar, transparent Wirkstoff Theobromin-Polyethylenglykol 200 im Verhältnis 1:1 individuell eingewogen Hilfsstoffe Polyethylenglykol 200 Chargenbezeichnung BII-442-0-1 Behälter 50 ml Injektionsflasche mit Bördelkappe Herkunft Bayer Animal Health, Formulation Technology, Monheim am Rhein, Deutschland Lagerung Raumtemperatur und Lichtschutz Herstellung der Injektionslösung Am Tag der Applikation wurde eine 5 molare NaOH Lösung mit Hilfe eines NaOH Plätzchens und Bidestwasser angesetzt. Es wurden 40 g Bidestwasser vorgelegt, 2 g Theobromin zugefügt und mit Hilfe eines Schüttelgeräts (Heidolph MR 3001 K) vermischt. Da man auf diese Weise keine klare Lösung erhielt, wurden 3 g NaOH Lösung zugetropft bis die Lösung klar vorlag und einen pH-Wert von 12,5 aufwies. Im Anschluss wurde der pH-Wert durch 0,2 g Methansulfonsäure auf 11,5 eingestellt. In einem Messkolben wurde die Lösung auf 50 ml aufgefüllt und durch einen Spritzenvorsatzfilter (Millipore Sterivex TM GP 0,22 µm) in eine 50 ml Klarglasflasche (Glasart I) steril filtriert. Die Glasflasche wurde mit einem Silikonstopfen und einer Bördelkappe verschlossen. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 28 Tab. 2.3 Prüfgegenstand 2 Bezeichnung Theobromin-Injektionslösung Wirkstoff Theobromin Wirkstoffgehalt 4 g in 100 ml (4%) Hilfsstoffe Bidestwasser, NaOH 5N, Methansulfonsäure Chargenbezeichnung BII-441-0-6 Herkunft Bayer Animal Health, Formulation Technology, Monheim am Rhein, Deutschland Behälter 50 ml Klarglasinjektionsflasche Glasart I mit Teflonstopfen und Bördelkappe Lagerung Raumtemperatur und Lichtschutz 2.2.2 Methode 2.2.2.1 Versuchsaufbau Die Studie wurde als kinetische Studie im 2x2 cross-over Design unter Berücksichtigung des Standards von “Good Scientific Practice Studies”, der Richtlinie für die Durchführung von pharmakokinetische Studien (EMEA/CVMP/133/99-Final, vom 08. September 2000) und den europäischen Tierschutzrichtlinien durchgeführt. Im Rahmen dieser Studie sollte Theobromin als mögliches CYP1A2-Substrat identifiziert und die Metabolisierung sowie die renale Elimination von Theobromin nach per oraler und intravenöser Einmalgabe in Abhängigkeit von dem CYP1A2 1117 Genotyp der eingesetzten Hunde untersucht werden. Dazu wurden zehn adulte Hunde der Rasse Beagle vor Studienbeginn auf den CYP1A2 1117C>T Polymorphismus untersucht und entsprechend ihres Genotyps unterschieden. Fünf Hunde davon Material und Methoden ___________________________________________________________________ 29 wiesen den genannten Polymorphismus 1117T/T homozygot auf, fünf Hunde waren CYP1A2 intakt mit dem Genotyp 1117C/C. Allen Tieren wurde Theobromin per oral in Kapselform (Prüfgegenstand 1) und intravenös als Injektionslösung (Prüfgegenstand 2) mit einer dazwischen liegenden Auswaschphase verabreicht. Nach Behandlung mit dem jeweiligen Prüfgegenstand wurden zur Bestimmung des plasmapharmakokinetischen Profils, der oralen Bioverfügbarkeit und der Clearance zu festgelegten Zeitpunkten Blutproben entnommen. Für die Feststellung des renalen Ausscheidungsverhaltens der Prüfgegenstände wurde in regelmäßigen Intervallen vor und nach Applikation Urin gesammelt. Alle Proben wurden mittels Flüssigkeitschromatographie mit tandem-massenspektrometrischer Detektion (LC-MS/MS) bzw. Tubulent Flow Chromatographie mit tandem- massenspektrometrischer Detektion (TFC-MS/MS) auf ihren Gehalt an Theobromin sowie seiner Metaboliten 3-MX, 7-MX und 3,7-DMH untersucht. Tab. 2.4 Prüfgruppen Prüfgruppe Tier lfd. Nr. Applikation Dosis Prüfgegenstand 1 1 – 10 per oral 10 mg/kg KG Theobromin-Kapsel 2 1 – 10 intravenös 10 mg/kg KG Theobromin-Injektionslösung Gruppenaufteilung (cross-over Schema) Da die Prüfung im cross-over Design durchgeführt wurde, waren alle 10 Hunde in den beiden Prüfgruppen 1 und 2 enthalten. Im Folgenden sind die aus dem cross-over Schema entstehenden Behandlungs-Sequenzen aufgelistet. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 30 Tab. 2.5 Cross-over Studiendesign Periode 1 Periode 2 Sequenz 1 (Hunde mit Nummer 1 bis 5) Prüfgegenstand 1 10 mg/kg per oral (2 1117T/T Tiere / 3 1117C/C Tiere) Prüfgegenstand 2 10 mg/kg intravenös (2 1117T/T Tiere / 3 1117C/C Tiere) Sequenz 2 (Hunde mit Nummer 6 bis 10) Prüfgegenstand 2 10 mg/kg intravenös (3 1117T/T Tiere / 2 1117C/C Tiere) Prüfgegenstand 1 10 mg/kg per oral (3 1117T/T Tiere / 2 1117C/C Tiere) Randomisierung Nach Durchführung der Einschlussuntersuchung am PT-4 wurden die Prüftiere den Prüfgruppen mittels Würfeln randomisiert zugeordnet. In den Prüfgruppen sollte das Verhältnis von Tieren mit und ohne Polymorphismus 1:1 betragen, so dass bei der Randomisierung nach Genotyp geblockt wurde. Die Hunde wurden nach Ohrtattoonummern (Tier ID) aufsteigend sortiert. Danach wurden die Tiere aufgrund der gewürfelten Augenzahl den zwei Sequenzen zugeordnet, beginnend bei der niedrigsten Tattoonummer. War die gewürfelte laufende Nummer oder der Genotyp in der Sequenz bereits vergeben, wurde das nächste Tier auf der Liste mit passendem Genotyp in die nächste Sequenz unter der entsprechenden laufenden Nummer einsortiert. Es wurde solange erneut gewürfelt, bis eine noch „freie“ Augenzahl erschien. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 31 Tab. 2.6 Randomisierung Zuordnung der Augenzahl zu den laufenden Nummern und Sequenzen Sequenz 1 Sequenz 2 Laufende Nummer Augenzahl Laufende Nummer Augenzahl 1 1 6 1 2 2 7 2 3 3 8 3 4 4 9 4 5 5 10 5 Die Tiere blieben während der gesamten Prüfung den laufenden Nummern zugeordnet. Vorbereitung der Tiere Am Versuchstag wurde den Hündinnen vor Applikation der Formulierung mit Hilfe eines geschlitzten Spekulums und den Rüden durch Vorlagerung der Glans penis ein Harnkatheter (Wiruthan, Rüsch-Ballonkatheter aus Polyurethan, Größe 8, Teleflex Medical, Kernen, Deutschland) eingeführt. Das Ende des Katheters wurde mit Hilfe eines Stopfens verschlossen und durch Einzelhefte an der Haut fixiert. Die Hunde trugen einen Plastikhalskragen um das Herausziehen und eine Beschädigung der Katheter durch die Hunde zu verhindern. Im Falle der intravenösen Applikation wurde eine Venenverweilkanüle (Größe 22G, 0,9 x 25 mm der Firma B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland) in die rechte oder linke Vena cephalica antebrachii gelegt. 2.2.2.2 Applikation Prüfgegenstand 1 wurde in Form von Hartgelatinekapseln verabreicht. Dazu wurde der Prüfgegenstand auf den Zungengrund der Hunde gegeben und der Fang solange geschlossen gehalten, bis das Abschlucken erfolgt war. Im Anschluss wurde den Tieren eine ausreichende Menge Wasser eingegeben. Die verabreichte Substanz wurde von allen Tieren vollständig aufgenommen. Erbrechen oder Regurgitieren wurde nicht beobachtet. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 32 Prüfgegenstand 2 wurde intravenös verabreicht. Zur Applikation wurden geeignete Einmalspritzen (1 ml Spritze mit exentrischem Luer Konus, B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland, oder 3 ml Spritze mit exentrischem Luer Konus, Becton Dickinson EDC, Temse, Belgien) verwendet, mit denen das berechnete Volumen der Prüfgegenstände möglichst genau aufgezogen werden konnte. Die intravenöse Applikation erfolgte durch Punktion der rechten oder linken Vena cephalica antebrachii mit Hilfe eines Venenverweilkatheters. 2.2.2.3 Probenentnahme Material Heraeus Multifuge 3 L-R Kendro Laboratory Products GmbH, Kernen, Deutschland Reaktionsgefäß 2 ml Eppendorf, Hamburg, Deutschland S-Monovette® 4,9 ml Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland Neolus Einmal Kanülen Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien 1 ml Spritze B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland 3 ml Spritze Becton Dickinson EDC, Temse, Belgien Venenverweilkatheter B. Braun Melsungen AG, Melsungen, Deutschland Rüsch-Ballonkatheter, Wiruthan Teleflex Medical, Kernen, Deutschland Die Blut- und Urinprobenentnahmezeitpunkte wurden so gewählt, dass sie den gesamten Konzentrations-Zeitverlauf von Absorption, Distribution und Eliminierung der aktiven Substanz Theobromin und seiner Hauptmetaboliten 3-Methylxanthin, 7-Methylxanthin und 3,7-Dimethylharnsäure im Plasma der Hunde abbildeten. Zusätzlich wurde eine Blutprobe und eine Urinprobe vor jeder Applikation entnommen (Nullwert) um die Abwesenheit der aktiven Substanzen im Plasma und Urin zu überprüfen. Alle eingesetzten Probengefäße zur Blut- und Uringewinnung waren etikettiert. Auf jedem Etikett wurden Prüfnummer, Tieridentifikationsnummer, Datum, Prüftag, Entnahmezeitpunkt und Art des Probenmaterials vermerkt. Die gewählten Probenentnahmezeitpunkte sind in der folgenden Tabelle dargestellt. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 33 Tab. 2.7 Blut- und Urinprobenentnahmezeitpunkte Prüftage je Prüfperiode Entnahmezeiten Blut Entnahmezeiten Urin 1 2 per oral intravenös per oral intravenös -1 27 0 h1) 0 h1) 0 28 30, 60, 90 min 2; 3; 4; 6; 8; 10 h 5; 10; 15; 30; 45; 60, 90 min 2; 3; 4; 6; 8; 10 h 0h1) ,30, 60 min 2; 3; 4; 6; 8; 10 h 0h1) ,30, 60 min 2; 3; 4; 6; 8; 10 h 1 29 24; 34 h 24; 34 h 30 h 30 h 2 30 48 h 48 h 54 h 54 h 3 31 72 h 72 h 78 h 78 h 4 32 96 h 96 h 96 h 96 h 1)0 h ist die Blutentnahme bzw. Urinentnahme vor Applikation = Nullwert Blutprobenentnahme Die Blutentnahmen erfolgten durch Punktion der linken oder rechten Vena jugularis mit Hilfe eines geeigneten Plasma-Blutentnahmesystems (S-Monovette® 4,9 ml Firma Sarstedt AG, Nümbrecht, Deutschland) und Einwegkanülen (Neolus Einmal Kanülen, Größe: 0,8 x 25 mm, Firma Terumo Europe N.V., Leuven, Belgien). Zu den in Tab. 2.7 aufgeführten Zeitpunkten wurden Blutproben mit einem Volumen von circa 4,0 ml entnommen. Die Blutproben wurden zur Plasmagewinnung 10 min bei 4°C mit 3220 x g zentrifugiert (Heraeus Multifuge 3 L-R, Kendro Laboratory Products GmbH, Kernen, Deutschland) und der Überstand in Probengefäße (Reaktionsgefäße: 2 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) abpipettiert. Hierbei wurden die Proben für die Einlagerung einer zusätzlichen Rückstellprobe geteilt. Das überschüssige Plasma des Nullwertes wurde gepoolt und zum Zweck der Validierung der analytischen Methode dieser Prüfung verwendet. Auf jedem Etikett wurden Prüfnummer, Tieridentifikationsnummer, Datum, Prüftag, Entnahmezeitpunkt und Art des Probenmaterials vermerkt. Material und Methoden ___________________________________________________________________ 34 Die Gesamtanzahl der Proben pro Hund betrug nach per oraler Verabreichung 16 und nach intravenöser Verabreichung 19 Proben. Urinprobenentnahme Für die Urinsammlungen wurden den Hunden vor der Applikation Ballonharnkatheter (Wiruthan, Rüsch Gold, Größe 8) in die Harnröhre gelegt, fixiert und verschlossen. Bei jeder Urinentnahme wurde der in der Harnblase befindliche Urin soweit möglich abgelassen. Zu den in Tab. 2.7 aufgeführten Zeitpunkten wurde 4 ml Urin gewonnen. Davon wurden zwei Aliquots in geeignete Probengefäße (Reaktionsgefäß 2 ml, Eppendorf, Hamburg, Deutschland) abgefüllt. Der Probenrest wurde verworfen. Ein Aliquot wurde zur Analyse weitergegeben. Das andere Aliquot wurde tiefgefroren, verblieb als Rückstellprobe im Labor und wurde nach Fertigstellung der Analyse verworfen. Die Gesamtanzahl der Urinproben pro Hund betrug nach per oraler Verabreichung 12 und nach intravenöser Verabreichung 13 Proben. 2.3 Kreatinin Kreatinin stammt als Abbauprodukt von Kreatin bzw. Kreatininphosphat aus den Stoffwechselprozessen der Muskelzellen, wird nicht tubulär rückresorbiert und mit dem Urin ausgeschieden. Somit stellt Kreatinin eine Meßgröße bei der Beurteilung der Urinkonzentration dar. Zur Ermittlung einer diureseunabhängigen renalen Stoffausscheidung wurde als Normierungsverfahren der Kreatininquotient gewählt. Der Bezug auf den Kreatiningehalt der Urinprobe gilt als übliches Normierungsverfahren um den störenden Einfluss unterschiedlich konzentrierten Urins bei der Beurteilung von Stoffgehalten im Urin auszugleichen (Carrieri et al. 2001; Braun et al. 2003; Arndt 2007). Material und Methoden ___________________________________________________________________ 35 2.3.1 Kreatininbestimmung Kreatinin wurde auf dem Vettest® Chemie-Analysegerät 8008, Version 8.25A (IDEXX Laboratories, Ludwigsburg, Deutschland) nach den Vorgaben des Herstellers bestimmt. Hierzu wurden die Urinproben 10 min bei 4°C mit 4000 x g zentrifugiert. 10 µl der Urinprobe wurden mit 200 µl Wasser in einem Probengefäß vermischt und nach Angaben des Herstellers in das Gerät überführt. 2.4 Bestimmung der Methylxanthinkonzentrationen Die Entwicklung der analytischen Methode und die Bestimmung der Methylxanthinkonzentrationen wurde mit freundlicher Unterstützung von Herrn Dr. Ralph Krebber, Mitarbeiter der Bayer CropScience AG, Monheim am Rhein, Deutschland durchgeführt. 2.4.1 Material Reagenzien Formuliertechnik: Theobromin, 99 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland Natronhydroxid Plätzchen KMF Laborchemie Handels GmbH, Leipzig, Deutschland Methansulfonsäure Merck, Darmstadt, Deutschland Millipore Sterivex TM-GP Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland Analytik: Theobromin, 99 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland 3-Methylxanthin, 98 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland 7-Methylxanthin, 98 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland 3,7-Dimethylharnsäure, 95 % Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland Natronhydroxid Plätzchen KMF Laborchemie Handels GmbH, Leipzig, Deutschland Material und Methoden ___________________________________________________________________ 36 Reinstwasser Milli-Q plus Millipore GmbH, Eschborn, Deutschland Acetonitril Optigrade Promochem, Wesel, Deutschland Ameisensäure Merck, Darmstadt, Deutschland Ammoniumacetat Merck, Darmstadt, Deutschland Tetrahydrofuran Merck, Darmstadt, Deutschland Triethylamin purum Riedel- de Haen, Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland Lösungen Stammlösungen Analyten (1.000 µg/l) Theobromin 3-Methylxanthin 7-Methylxanthin 3,7-Dimethylharnsäure Lösemittel Triethylamin 1 % / Tetrahydrofuran 98,75:1,25 (v/v) Geräte Formuliertechnik: Waage Mettler PM 4800 DeltaRange Mettler Toledo GmbH, Gießen, Deutschland Vortex Heidolph Instruments, Schwabach, Deutschland Analysenwaage Mettler AM 100 Mettler Toledo GmbH, Gießen, Deutschland Ultraschallbad Transsonic 460 Elma, Singen, Deutschland Kaliumhydrogensulfat Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Deutschland Material und Methoden ___________________________________________________________________ 37 Analytik: Zentrifuge Biofuge Fresco 13.000 rpm Kendro Laboratory Products GmbH, Kernen, Deutschland Vibrationsmixer Vibrofix IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen, Deutschland Hochdruckflüssigkeitschromatographie Serie 1100, Agilent Technologies, Böblingen, Deutschland Autoinjektor CTC HTS PAL, CTC Analytics AG, Sprockhövel, Deutschland Turbolent Flow Chromatographiesystem 2300 HTLCTM Cohesive Technologies Inc. Tandem-Massenspektrometer EP10+, IONICS (aufgerüstetes AB Sciex 365) 2.4.2 Methode 1 Für das erste Verfahren wurden alle Plasmaproben vorab deproteinisiert. Hierzu wurden den Plasmaproben Ammoniumacetat, Ameisensäure und Acetonitril hinzugefügt und anschließend zentrifugiert. Die Proben wurden mittels Flüssigkeitschromatographie mit tandem- massenspektrometrischer Detektion (LC-MS/MS) untersucht. Die Bestimmungsgrenze lag bei 75 µl. Detektion Theobromin: Übergang vom Molekülion m/z = 181 ([M + H]+) zum Produktion m/z = 108 3- und 7-Methylxanthin: Übergang vom Molekülion m/z = 167 ([M + H]+) zum Produktion m/z = 124 3,7-Dimethylharnsäure: Übergang vom Molekülion m/z = 197 ([M + H]+) zum Produktion m/z = 126 Analytische Säulen: Zorbax Bonus RP, 4,6 x 150 mm, 5 µm, Agilent Technologies Injektionsvolumen: 50 µl Material und Methoden ___________________________________________________________________ 38 Isokratische Pumpe: Mobile Phase A: Wasser + Acetonitril (1+1, v/v) + 0,1 ml Ameisensäure Flow rate: 1 ml/min Binäre Pumpe: Mobile Phase A: Wasser + 0,1 ml Ameisensäure Mobile Phase B: Acetonitril + 0,1 ml Ameisensäure Retentionszeiten: 4,6 min (Theobromin) 4,4 min (3-Methylxanthin) 4,3 min (7-Methylxanthin) 4,5 min (3,7-Dimethylharnsäure) Bestimmungsgrenze: 75 µl 2.4.3 Methode 2 Da die zuerst gewählte Methode eine zu geringe Empfindlichkeit für die Urinanalyse aufwies, wurden die Proben mittels Tubulent Flow Chromatographie mit Tandem- massenspektrometrischer Detektion (TFC-MS/MS) analysiert. Hierbei ist eine effizientere Trennung niedermolekularer Analyten von der hochmolekularen bzw. salzhaltigen Matrix (Urin) möglich. Es wurde eine Online-Probenvorbereitung (Trennung nach chemischen Wechselwirkungen und Molekülgröße) durchgeführt. Vorab wurden alle Proben zentrifugiert und direkt in das Gerät injiziert. Die Bestimmungsgrenze in diesem Verfahren lag bei 25 µl. Detektion Theobromin: Übergang vom Molekülion m/z = 181 ([M + H]+) Produktion m/z = 108 Material und Methoden ___________________________________________________________________ 39 3- und 7-Methylxanthin: Übergang vom Molekülion m/z = 167 ([M + H]+) zum Produktion m/z = 124 3,7-Dimethylharnsäure: Übergang vom Molekülion m/z = 197 ([M + H]+) zum Produktion m/z = 126 Extraktionssäulen: Oasis HLB 2,1 x 20 mm, 25 µm (Waters GmbH, Eschborn) Analytische Säulen: Zorbax Bonus RP, 4,6 x 150 mm, 5 µm, Agilent Technologies Injektionsvolumen: 20 µl Beladungspumpe: Mobile Phase A: Wasser + 0,1 ml / l Ameisensäure Mobile Phase B: Wasser + Acetonitril (1+1, v / v) + Ameisensäure / l Elutionspumpe: Mobile Phase C: Wasser + 0,1 ml / l Ameisensäure Mobile Phase D: Acetonitril + 0,1 ml / l Ameisensäure Retentionszeiten: 3,7 min (Theobromin) 3,3 min (3-Methylxanthin) 3,1 min (7-Methylxanthin) 3,4 min (3,7-Dimethylharnsäure) Bestimmungsgrenze: 25 µl 2.5 Berechnungen 2.5.1 Methylxanthinkonzentrationen Bei einer linearen Regression der entsprechend y = ax + b mit a = Steigung und b = Achsenabschnitt erfolgt die Berechnung nach folgender Formel: Material und Methoden ___________________________________________________________________ 40 P End P V V Steigung hnittAchsenabscProbe Fläche C ⋅−= CP = Konzentration in der Probe Fläche = Peakfläche der Probe im Chromatogramm VEnd = Endvolumen der Probe VP = eingestztes Probenvolumen 2.5.2 Pharmakokinetische Parameter Alle pharmakokinetischen Parameter wurden unter Verwendung der Standardsoftware WinNonlin®, Version 5.3 (Pharsight Corp., Mountain View, CA, USA) berechnet. Hierzu zählen: Konzentrationsmaximum (Cmax), Zeit bis zum Erreichen des Konzentrationsmaximums (Tmax), Halbwertzeit (T1/2), die Fläche unter der Konzentrations-Zeitkurve (AUC) und die Eliminationshalbwertzeit (λz). Nach intravenöser Applikation wurden zusätzlich die Gesamtkörper-Clearance (Cl) und die orale Bioverfügbarkeit (BV) von Theobromin berechnet. BV = AUCinf p.o. x 100 AUCinf i.v. Cl = D AUCinf λz = 1 Tmax AUC = AUC(0-tlast) + Clast, calc. λz T1/2 = ln2 λz Material und Methoden ___________________________________________________________________ 41 2.5.3 Statistische Methoden Die statistischen Auswertungen erfolgten in Zusammenarbeit mit Frau Dipl.-Stat. Marion Ocak, MD Research, Pullach im Isartal. Verwendet wurde hierzu das Statistikprogramm TESTIMATE Version 6.5.0 (idv, Datenanalyse und Versuchsplanung). Die graphischen Abbildungen wurden mit Hilfe des Programms GraphPad Prism®, Version 5 (GraphPad, San Diego, CA, USA) und Science GraphX Version 4.9.30 erstellt. Zur Deskription der Daten wurden Mittelwerte (MW) mit Standardabweichung (SD), Standardfehler des Mittelwertes (SEM), Variationskoeffizienten (SD/MW) und Probenumfang (n) der vorab berechneten pharmakokinetischen Parameter bestimmt. Aufgrund der kleinen Stichprobenumfänge und des nicht-gesicherten Vorliegens einer Normalverteilung wurden signifikante Unterschiede in den pharmakokinetischen Parametern der beiden Gruppen mit dem Wilcoxon-Mann-Whitney-U Test (nicht-parametrischer Test) geprüft. Die medizinische Relevanz der Gruppenunterschiede wird mit Hilfe des dazugehörigen Relevanzmaßes, des Mann-Whitney-Überlegenheitsmaß (MWÜ) und seinem zweiseitigen 95,0%-igen Konfidenzintervall (KI) untersucht. Das MWÜ-Maß (0.0 bis 1.0) gibt die Wahrscheinlichkeit an, dass ein zufällig ausgewähltes Tier aus der Gruppe der CYP 1117T/T Hunde einen jeweils besseren Wert hat als ein zufällig ausgewähltes Tier der CYP 1117C/C Hunde. Die allgemein anerkannten Grenzwerte sind (Colditz et al. 1988): 0.36 mittlere Unterlegenheit 0.44 kleine Unterlegenheit 0.50 Gleichheit 0.56 kleine Überlegenheit 0.64 mittlere (relevante) Überlegenheit 0.71 große Überlegenheit Zur Beurteilung eines Gruppenunterschiedes wurden alle getesteten Parameter herangezogen (Cmax, Tmax, T1/2, AUCinf sowie Cl, soweit vorhanden), da die Interpretation der Testergebnisse Material und Methoden ___________________________________________________________________ 42 deskriptiv vorgenommen werden kann und ein Zusammenspiel aller Parameter erst einen sinnvollen Überblick zulässt. Als Signifikanzniveau wurde ein α = 0,05 (zwei-seitig) definiert, so dass Ergebnisse mit p < 0,05 als signifikant angesehen wurden. Wenn kein exakter p-Wert angegeben ist um die statistische Signifikanz zwischen den Gruppen zu belegen, wurden Zahlenwerte oder Diagrammbalken mit Sternchen gekennzeichnet, um auf die folgenden p-Werte hinzuweisen: * p < 0,05, ** p < 0,01. Ergebnisse 43 3 ERGEBNISSE 3.1 Klinische Allgemeinuntersuchung Im Rahmen der Einschlussuntersuchung sowie zu Beginn der zweiten Prüfperiode und am Ende der jeweiligen Prüfperioden wurden die folgenden klinischen Parameter erfasst und in den Rohdaten dokumentiert: Allgemeinbefinden, Ernährungszustand, Haut und Haarkleid, Schleimhäute, Atmungsapparat, Kotbeschaffenheit, Bewegungsapparat, Rektaltemperatur. Alle Tiere waren am Tag der Einschlussuntersuchung vor Studienbeginn klinisch unauffällig und wurden in die Studie eingeschlossen. Nach Einschluss der Tiere in die Studie wurden keine Hunde aus gesundheitlichen oder tierschutzrechtlichen Gründen vorzeitig ausgeschlossen. 3.2 Genotypisierung Zwecks Genotypisierung wurden Abstriche von der Maulschleimhaut von 270 Beagle Hunden entnommen und genomische DNA isoliert. Diese Beagle stammten aus zwei verschiedenen Zuchtlinien und wurden zufällig ausgewählt: 192 Hunde stammen aus der Zucht Harlan Winkelmann (Eystrup, Deutschland), 78 Tiere stammten aus der Zucht Marshall BioResources (North Rose, NY, USA). Ein direktes Verwandtschaftsverhältnis kann nicht ausgeschlossen werden. Die Genotypisierung erfolgte über allelspezifische Sonden mit gekoppelten Fluoreszenzfarbstoffen in einer real-time PCR. Im Folgenden werden Hunde mit homozygotem CYP1A2 1117C/C Genotyp als C/C-Hunde und Hunde mit homozygotem CYP1A2 1117T/T Genotyp als T/T-Hunde bezeichnet. Bei der Genotypisierung wurde für 187 (69 %) Hunde der homozygote Wildtyp (C/C) ermittelt, 77 (29 %) Hunde wiesen das T-Allel heterozygot (C/T) auf, und 6 (2 %) Hunde wiesen homozygot das T-Allel (T/T) auf (Abb. 3.1). Aufgrund dieser Ergebnisse ließ sich bei den untersuchten Beagle Hunden eine Allelfrequenz für das T-Allel von 17 % berechnen. Ergebnisse 44 1117 C/C 1117 C/T 1117 T/T 0 50 100 150 200 69% 29% 2% Genotyp A nz ah l d er H un de Abb. 3.1 Ergebnis der CYP1A2 Genotypisierung von 270 Beagle Hunden. Insgesamt wiesen 6 Hunde den homozygoten CYP1A2 1117T/T Genotyp auf und waren daher für die vorliegende Studie geeignet. Entsprechende 1117C/C Hunde konnten für die Studie aus insgesamt 187 typisierten Beagles ausgewählt werden. 3.3 Methylxanthinkonzentrationen nach intravenöser Applikation Nach intravenöser Applikation von 10 mg/kg Körpergewicht Theobromin konnten im Plasma über 96 Stunden Theobromin (∅ 92,3 %) und 3-Methylxanthin (∅ 7,7 %) bei einer Nachweisgrenze von 75 µg/l mittels Flüssigkeitschromatographie mit tandem- massenspektrometrischer Detektion (LC-MS/MS) nachgewiesen werden. Im Urin konnten Theobromin (∅ 62,8 %), 3-Methylxanthin (∅ 34,8 %), 7-Methylxanthin (∅ 2,2 %) und 3,7- Dimethylharnsäure (∅ 0,2 %) bei einer Nachweisgrenze von 25 µg/l mittels Tubulent Flow Chromatographie mit Tandem-massenspektrometrischer Detektion (TFC-MS/MS) nachgewiesen werden. Die Ergebnisse sind für die Plasmakonzentrationen in Abb. 3.2 und für die Urinkonzentrationen in Abb. 3.3 getrennt nach CYP1A2 Genotyp zusammengefasst. An dieser Stelle wurden noch keine Vergleiche zwischen den Genotypengruppen vorgenommen, dieser erfolgt ab Kapitel 3.5. Insgesamt wurde Theobromin an jeweils fünf Hunde jeden Genotyps appliziert. In der ersten Prüfphase verlief die geplante intravenöse Applikation bei jeweils zwei Hunden aus beiden Gruppen jedoch nicht vollständig intravenös. Das Konzentrationsmaximum einer intravenös applizierten Substanz ist unmittelbar nach Applikation zu erwarten. So konnte bei sechs Tieren zum Zeitpunkt der ersten Blutprobenentnahme ein Konzentrationsmaximum für Ergebnisse 45 Theobromin berechnet werden. Bei vier Tieren wurde jedoch eine Zeit bis zum Erreichen des Konzentrationsmaximums von 1,5 h ermittelt. Aus diesem Grund wurden diese Tiere nicht in den Berechnungen und graphischen Darstellungen berücksichtigt, so dass die Daten auf einer Gruppengröße von n=3 basieren. 1117 C/C 0 2 4 6 8 10 12 0 5 10 15 20 24 36 48 60 72 84 96 Theobromin 3-Methylxanthin Zeit (h) M et hy lx an th in ko nz en tr at io ne n im P la sm a na ch i. v. A pp lik at io n (m g/ l) 1117 T/T 0 2 4 6 8 10 12 0 5 10 15 20 24 36 48 60 72 84 96 Theobromin 3-Methylxanthin Zeit (h) M et hy lx an th in ko nz en tr at io ne n im P la sm a na ch i. v. A pp lik at io n (m g/ l) Abb. 3.2 Plasmakonzentration-Zeit-Diagramm für Theobromin und 3-Methylxanthin nach intravenöser Applikation (n=3) von 10 mg/kg KG Theobromin. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM. 1117 C/C 0 2 4 6 8 10 12 0 50 100 150 200 250 24 36 48 60 72 84 96 Theobromin 3-Methylxanthin 7-Methylxanthin 3,7-Dimethylharnsäure Zeit (h) M et hy lx an th in ko nz en tr at io ne n im U rin na ch i. v. A pp lik at io n (m g/ l) 1117 T/T 0 2 4 6 8 10 12 0 50 100 150 200 250 24 36 48 60 72 84 96 Theobromin 3-Methylxanthin 7-Methylxanthin 3,7-Dimethylharnsäure Zeit (h) M et hy lx an th in ko nz en tr at io ne n im U rin na ch i. v. A pp lik at io n (m g/ l) Abb. 3.3 Urinkonzentration-Zeit-Diagramm für Theobromin sowie 3-Methylxanthin, 7-Methylxanthin und 3,7-Dimethylharnsäure nach intravenöser Applikation (n=3) von 10 mg/kg KG Theobromin. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM. Ergebnisse 46 3.4 Methylxanthinkonzentrationen nach per oraler Applikation Auch nach per oraler Applikation von 10 mg/kg Körpergewicht Theobromin konnten im Plasma Theobromin (∅ 92,8 %) und der Metabolit 3-Methylxanthin (∅ 7,2 %) nachgewiesen werden (Abb. 3.4), im Urin ebenfalls Theobromin (∅ 65,7 %) und 3-Methylxanthin (∅ 31,9 %) sowie zusätzlich 7-Methylxanthin (∅ 2,1 %) und 3,7-Dimethylharnsäure (∅ 0,3 %) (Abb. 3.5). Die per orale Applikation war nach den Studienvorgaben für alle Hunde erfolgreich, sodass für jeden Genotyp Daten von jeweils fünf Hunden in die Auswertung eingeflossen sind. 1117 C/C 0 2 4 6 8 10 12 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 24 36 48 60 72 84 96 Theobromin 3-Methylxanthin Zeit (h) M et hy lx an th in ko nz en tr at io ne ne n im P la sm a na ch p .o . A pp lik at io n (m g/ l) 1117 T/T 0 2 4 6 8 10 12 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 24 36 48 60 72 84 96 Theobromin 3-Methylxanthin Zeit (h) M et hy lx an th in ko nz en tr at io ne n im P la sm a na ch p .o . A pp lik at io n (m g/ l) Abb. 3.4 Plasmakonzentration-Zeit-Diagramm für Theobromin und 3-Methylxanthin nach per oraler Applikation (n=5) von 10 mg/kg KG Theobromin. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM. Ergebnisse 47 1117 C/C 0 2 4 6 8 10 12 0 50 100 150 200 250 24 36 48 60 72 84 96 Theobromin 3-Methylxanthin 7-Methylxanthin 3,7-Dimethylharnsäure Zeit (h) M et hy lx an th in ko nz en tr at io ne n im U rin na ch p .o . A pp lik at io n (m g/ l) 1117 T/T 0 2 4 6 8 10 12 0 50 100 150 200 250 24 36 48 60 72 84 96 Theobromin 3-Methylxanthin 7-Methylxanthin 3,7-Dimethylharnsäure Zeit (h) M et hy lx an th in ko nz en tr at io ne n im U rin na ch p .o . A pp lik at io n (m g/ l) Abb. 3.5 Urinkonzentration-Zeit-Diagramm für Theobromin, 3-Methylxanthin, 7-Methylxanthin und 3,7-Dimethylharnsäure nach per oraler Applikation (n=5) von 10 mg/kg KG Theobromin. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM. 3.5 Direkter Vergleich zwischen den Genotypen nach intravenöser Applikation Nach intravenöser Applikation von 10 mg/kg Theobromin konnten im Plasma Theobromin und 3-Methylxanthin sowie im Urin Theobromin, 3-Methylxanthin, 7-Methylxanthin und 3,7-Dimethylharnsäure nachgewiesen werden. Sowohl im Plasma als auch im Urin zeigten sich dabei signifikante Unterschiede zwischen den beiden CYP1A2-Genotypen, welche im Folgenden dargestellt werden sollen. Die folgenden Darstellungen beschreiben den Konzentrationsverlauf jeweils nur eines Analyten für beide Genotypen; hierbei sind Diagramme für die jeweilige Area- under-curve (AUC) eingebettet (a). Zusätzlich zum Konzentrations-Zeit-Diagramm wurde die statistische Auswertung der pharmakokinetischen Parameter mittels Wilcoxon-Mann-Whitney-U Test graphisch dargestellt (b). Diese Graphiken beinhalten das Konfidenzintervall (KI), das Mann-Whitney Überlegenheitsmaß und den exakten p-Wert für das Konzentrationsmaximum (Cmax), die Zeit bis zum Erreichen des Konzentrationsmaximums (Tmax), die AUC und die Halbwertzeit (T1/2) jedes Analyten, sowie die Körperclearance (Cl) für Theobromin im Plasma. Für den Theobrominkonzentrationsverlauf im Plasma lag die AUC in der C/C-Gruppe (211,22 mg*h/l) signifikant unter der AUC in der T/T-Gruppe (283,08 mg*h/l, Abb. 3.6). Darüber hinaus war die Halbwertzeit für Theobromin in der T/T-Gruppe (16,18 h) gegenüber der Ergebnisse 48 C/C-Gruppe (9,14 h) signifikant verlängert (Abb. 3.6). Dies spiegelt sich auch in der signifikant unterschiedlichen Gesamtkörperclearance für Theobromin wieder, welche in der T/T-Gruppe mit 0,50 ml/min/kg und in der C/C-Gruppe mit 0,83 ml/min/kg berechnet wurde (p = 0,0339). Auch im Urin zeigten sich signifikante Unterschiede in der Halbwertzeit für Theobromin (p = 0,0495). Der vorliegende Gruppenunterschied im Konzentrationsverlauf für 3-Methylxanthin im Plasma konnte statistisch bewiesen werden. So lag die Halbwertzeit bei den CYP1A2 defizienten Hunden bei durchschnittlich 17 h und bei den Wildtyp Hunden bei 9 h (p = 0,0495). Aufgrund der kleinen Probenanzahl und der großen Streuung konnten weitere Unterschiede in den pharmakokinetischen Parametern statistisch nicht bewiesen werden. Trotzdem lässt sich über das Mann-Whitney-Überlegenheitsmaß verdeutlichen, dass das Konzentrationsmaximum für 3-Methylxanthin in der T/T-Gruppe eine Unterlegenheit (MWÜ: 0,111) gegenüber der C/C- Gruppe aufweist (Abb. 3.7). Im Urin konnten Unterschiede im Konzentrationsverlauf von 3-Methylxanthin ebenfalls statistisch bewiesen werden. So liegt das Konzentrationsmaximum in der Gruppe der C/C Hunde signifikant über dem Konzentrationsmaximum der T/T-Gruppe (p = 0,0495). Zudem zeigt das Mann-Whitney-Überlegenheitsmaß, dass die Länge der Halbwertzeit für 3-Methylxanthin im Urin in der Gruppe der T/T-Hunde eine große Überlegenheit (MWÜ: 0,8889) gegenüber der C/C-Hunde aufweist, die aufgrund des kleinen Probenumfangs statistisch nicht bewiesen werden konnte, aber eine klinische Relevanz zeigt (Abb. 3.9). Das Konzentrationsmaximum für 7-Methylxanthin war in der C/C-Gruppe signifikant höher als in der T/T-Gruppe (12,32 mg/l vs. 4,76 mg/l, p = 0,0495). Dies spiegelt sich auch in der statistisch signifikant höheren AUC für die CYP1A2 Wildtyp-Hunde wieder (215,96 vs. 101,87 mg*h/l, p = 0,0495) sowie der signifikant verlängerten Halbwertzeit (14,92 h vs 10,52 h) in der CYP1A2 defizienten Gruppe (Abb. 3.10). Für den Metaboliten 3,7-Dimethylharnsäure konnten keine Gruppenunterschiede statistisch bewiesen werden, jedoch lässt sich mit Hilfe des Mann-Whitney-Überlegenheitsmaß (MWÜ: 0,8889) ein deutlicher Unterschied in der Halbwertzeit erkennen (Abb. 3.11). Die Halbwertzeit betrug in der T/T-Gruppe im Mittelwert 31 h, während in der Gruppe der C/C- Hunde ein Wert von durchschnittlich 18 h erreicht wurde. Somit zeigte sich sowohl im Plasma als auch im Urin, dass die T/T-Hunde deutlich weniger Theobromin-Metabolite gebildet haben als die C/C-Hunde. Dies spiegelt sich auch in der oben Ergebnisse 49 bereits erwähnten höheren AUC und geringeren Clearance für Theobromin bei den T/T-Hunden wieder. Insbesondere zeigten sich signifikante Unterschiede im Vergleich der Konzentrationsverläufe für 7-Methylxanthin, die trotz eines kleines Stichprobenumfangs (n=3) statistisch bewiesen werden konnten. Theobromin / Plasma / i.v. a b THEOBROMIN IM PLASMA NACH INTRAVENÖSER APPLIKATION 1117 T/T (Test) vs. 1117 C/C (Reference) Wilcoxon-Mann-Whitney-U Test, zwei-seitig, 95.0% KI M an n- W hi tn ey Ü be rle ge nh ei ts m aß Cmax MWÜ=0.3333 P=0.7000 Tmax MWÜ=0.5556 P=1.0000 AUCinf MWÜ=1.0000 P=0.0495 T 1/2 MWÜ=1.0000 P=0.0495 CL MWÜ=0.0000 P=0.0339 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Größere Werte: 1117 T/T Größere Werte: 1117 C/C Abb. 3.6 a Plasmakonzentration-Zeit-Diagramm für TB und AUCinf nach intravenöser Applikation (n=3) von 10 mg/kg KG Theobromin. * Statistisch signifikanter Unterschied mit p < 0,05. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM. b Graphische Darstellung des Wilcoxon-Mann-Whitney-U Tests für die pharmakokinetische Parameter. Dargestellt sind das 95%ige Konfidenzintervall (KI), das Mann-Whitney Überlegenheitsmaß (MWÜ) und exakte p-Werte. Ergebnisse 50 3-Methylxanthin / Plasma / i.v. a 0 2 4 6 8 10 12 0.00 0.25 0.50 0.75 1.00 1.25 24 36 48 60 72 84 96 1117 C/C 1117 T/T Zeit (h) 3- M X -K on ze nt ra tio ne n im P la sm a na ch i. v. A pp lik at io n (m g/ l) 1117 C/C 1117 T/T 0 10 20 30 3- M X A U C in f im P la sm a na ch i. v. A pp lik at io n (m g* h/ l) b 3-METHYLXANTHIN IM PLASMA NACH INTRAVENÖSER APPLIKA TION 1117 T/T (Test) vs. 1117 C/C (Reference) Wilcoxon-Mann-Whitney-U Test, zwei-seitig, 95.0% KI M an n- W hi tn ey Ü be rle ge nh ei ts m aß Cmax MWÜ=0.1111 P=0.1266 Tmax MWÜ=0.4444 P=1.0000 AUCinf MWÜ=0.3333 P=0.7000 T 1/2 MWÜ=1.0000 P=0.0495 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Größere Werte: 1117 T/T Größere Werte: 1117 C/C Abb. 3.7 a Plasmakonzentration-Zeit-Diagramm für 3-MX und AUCinf nach intravenöser Applikation (n=3) von 10 mg/kg KG Theobromin. Dargestellt sind Mittelwerte ± SEM. b Graphische Darstellung des Wilcoxon-Mann-Whitney-U Tests für die pharmakokinetische Parameter. Dargestellt sind das 95%ige Konfidenzintervall (KI), das Mann-Whitney Überlegenheitsmaß (MWÜ) und exakte p-Werte. Ergebnisse 51 Theobromin / Urin / i.v. a 0 2 4 6 8 10 12 0 80 160 240 320 400 24 36 48 60 72 84 96 1117 C/C 1117 T/T Zeit (h) TB -K on ze nt ra tio ne n im U rin na ch i. v. A pp lik at io n (m g/ l) 1117 C/C 1117 T/T 0 2500 5000 7500 TB A U C in f im U rin na ch i. v. A pp lik at io n (m g* h/ l) b THEOBROMIN IM URIN NACH INTRAVENÖSER APPLIKATION 1117 T/T (Test) vs. 1117 C/C (Reference) Wilcoxon-Mann-Whitney-U Test, zwei-seitig, 95.0% KI M an n- W hi tn ey Ü be rle ge nh ei ts m aß Cmax MWÜ=0.6667 P=0.7000 Tmax MWÜ=0.8333 P=0.3000 AUCinf MWÜ=0.6667 P=0.7000 T 1/2 MWÜ=1.0000 P=0.0495 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Größere Werte: 111 T/T Größere Werte: 1117 C/C Abb. 3.8 a Urinkonzentration-Zeit-Diagramm für TB und AUCinf nach intravenöser Applikation (n=3) von 10 mg/kg KG Theobromin. Dargestellt sind Mittelwerte +/- SEM. b Graphische Darstellung des Wilcoxon-Mann-Whitney-U Tests für die pharmakokinetische Parameter. Dargestellt sind das 95%ige Konfidenzintervall (KI), das Mann-Whitney Überlegenheitsmaß (MWÜ) und exakte p-Werte. Ergebnisse 52 3-Methylxanthin / Urin / i.v. a 0 2 4 6 8 10 12 0 30 60 90 120 150 24 36 48 60 72 84 96 1117 C/C 1117 T/T Zeit (h) 3- M X -K on ze nt ra tio ne n im U rin na ch i. v. A pp lik at io n (m g/ l) 1117 C/C 1117 T/T 0 1200 2400 3600 3- M X A U C in f im U rin na ch i. v. A pp lik at io n (m g* h/ l) b 3-METHYLXANTHIN IM URIN NACH INTRAVENÖSER APPLIKATI ON 1117 T/T (Test) vs. 1117 C/C (Reference) Wilcoxon-Mann-Whitney-U Test, zwei-seitig, 95.0% KI M an n- W hi tn ey Ü be rle ge nh ei ts m aß Cmax MWÜ=0.0000 P=0.0495 Tmax MWÜ=0.5000 P=1.0000 AUCinf MWÜ=0.3333 P=0.7000 T 1/2 MWÜ=0.8889 P=0.1266 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Größere Werte: 1117 T/T Größere Werte: 1117 C/C Abb. 3.9 a Urinkonzentration-Zeit-Diagramm für 3-MX und AUCinf nach intravenöser Applikation (n=3) von 10 mg/kg KG Theobromin. Dargestellt sind Mittelwerte +/- SEM. b Graphische Darstellung des Wilcoxon-Mann-Whitney-U Tests für die pharmakokinetische Parameter. Dargestellt sind das 95%ige Konfidenzintervall (KI), das Mann-Whitney Überlegenheitsmaß (MWÜ) und exakte p-Werte. Ergebnisse 53 7-Methylxanthin / Urin / i.v. a 0 2 4 6 8 10 12 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 12.5 24 36 48 60 72 84 96 1117 C/C 1117 T/T Zeit (h) 7- M X -K on ze nt ra tio ne n im U rin na ch i. v. A pp lik at io n (m g/ l) 1117 C/C 1117 T/T 0 90 180 270 * 7- M X A U C in f im U rin na ch i. v. A pp lik at io n (m g* h/ l) b 7-METHYLXANTHIN IM URIN NACH INTERAVENÖSER APPLIKAT ION 1117 T/T (Test) vs. 1117 C/C (Reference) Wilcoxon-Mann-Whitney-U Test, zwei-seitig, 95.0% KI M an n- W hi tn ey Ü be rle ge nh ei ts m aß Cmax MWÜ=0.0000 P=0.0495 Tmax MWÜ=0.2778 P=0.7000 AUCinf MWÜ=0.0000 P=0.0495 T 1/2 MWÜ=1.0000 P=0.0495 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0.7 0.8 0.9 1.0 0.0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 Größere Werte: 1117 T/T Größere Werte: 1117 C/C Abb. 3.10 a Urinkonzentration-Zeit-Diagramm für 7-MX und AUCinf nach intravenöser Applikation (n=3) von 10 mg/kg KG Theobromin. * Statistisch signifikanter Unterschied mit p < 0,05. Dargestellt sind Mittelwerte +/- SEM. b Graphische Darstellung des Wilcoxon-Mann-Whitney-U Tests für die pharmakokinetische Parameter. Dargestellt sind das 95%ige Konfidenzintervall (KI), das Mann-Whitney Überlegenheitsmaß (MWÜ) und exakte p-Werte. Ergebnisse 54 3,7-Dimethylharnsäure / Urin / i.v. a 0 2 4 6 8 10 12 0.0 0.3 0.6 0.9 1.2 1.5 24 36 48 60 72 84 96 1117 C/C 1117 T/T Zeit (h) 3, 7- D M H -K on ze nt ra tio ne n im U rin na ch i. v. A pp lik at io n (m g/ l) 1117 C/C 1117 T/T 0 5 10 15 3, 7- D M H A U C in f im U rin na ch i. v. A pp lik at io n (m g* h/ l) b 3,7-DIMETHYLHARNSTOFF IM URIN NACH INTRAVENÖSER APP LIKATION 1117 T/T (Test) vs. 1117 C/C (Reference) Wilcoxon-Mann-Whitney-U Test, zwei-seitig, 95.0% KI M an n- W hi tn ey Ü be rle ge nh ei ts m aß Cmax MWÜ=0.2222 P=0.4000 Tmax MWÜ=0.5000 P=1.0000 AUCinf MWÜ=0.3333 P=0.7000 T 1/2 MWÜ=0.888