Aus dem Institut für Lebensmittelchemie und 

Lebensmittelbiotechnologie der Justus Liebig Universität Gießen 

 

 

Sekretomanalyse von Pleurotus sapidus 
zum effizienten Aufschluss von 

Lignocellulosen 
  

 

 

 

Dissertation 

zur Erlangung des 

naturwissenschaftlichen Doktorgrades 

- Dr. rer. nat. - 
 

im Fachbereich Biologie und Chemie 

der Justus-Liebig-Universität Gießen 

 
vorgelegt von 

 

Dipl.-Ing. (FH) Ina Schüttmann 
 

 

Gießen, 2011 
  



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

1. Gutachter:  Prof. Dr. H. Zorn 

2. Gutachter:  Prof. Dr. S. Schnell 

Prüfer:   Prof. Dr. A. M. Pingoud 

Prüfer:  Prof. Dr. S. Schindler 

 



 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

Ich erkläre hiermit: Ich habe die vorgelegte Dissertation selbständig und ohne 

unerlaubte fremde Hilfe und nur mit den Hilfen angefertigt, die ich in der 

Dissertation angegeben habe. Alle Textstellen, die wörtlich oder sinngemäß aus 

veröffentlichten Schriften entnommen sind, und alle Angaben, die auf mündlichen 

Auskünften beruhen, sind als solche kenntlich gemacht. Bei den von mir 

durchgeführten und in der Dissertation erwähnten Untersuchungen habe ich die 

Grundsätze guter wissenschaftlicher Praxis, wie sie in der „Satzung der Justus-

Liebig-Universität Gießen zur Sicherung guter wissenschaftlicher Praxis“ 

niedergelegt sind, eingehalten. 

 

 

Ina Schüttmann 



Danksagung 
 

Die vorliegende Arbeit wurde in der Zeit von Oktober 2007 bis November 2008 

bei der AG Technische Biochemie der Universität Dortmund und in der Zeit von 

November 2008 bis August 2011 am Institut für Lebensmittelchemie und 

Lebensmittelbiotechnologie der Justus Liebig Universität Gießen unter der 

Leitung von Prof. Dr. Holger Zorn angefertigt. 

Meinem Doktorvater Prof. Dr. Holger Zorn danke ich recht herzlich für die 

Möglichkeit der Promotion und die wissenschaftliche Betreuung dieser Arbeit. Die 

stete Diskussionsbereitschaft, der gewährte Freiraum zur Bearbeitung des 

Themas und die hervorragenden Arbeitsbedingungen am Institut haben mir bei 

der Bewältigung der Arbeit sehr geholfen. 

 

An alle Mitarbeiterinnen und Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Technische 

Biochemie der Universität Dortmund und des Instituts für Lebensmittelchemie 

und Lebensmittelbiotechnologie der Universität Giessen: 

Ich danke Euch für die gute Zusammenarbeit, das freundschaftliche Verhältnis 

und die Unterstützung für die Bewältigung der verschiedensten Aufgaben. 

 

Ebenso bedanke ich mich bei unseren Projektpartnern Artes® Biotechnology 

GmbH, Langenfeld für die Produktion der Hansenula polymorpha Stämme und 

Protagen® AG, Dortmund für die 2D-Analysen und die Proteinidentifizierungen. 

Dem Analytischen Service des biochemischen Instituts der Justus-Liebig 

Universität danke ich für die Erstellung der Edmann-Sequenz und der 

Bundesstiftung Umwelt (DBU) für die finanzielle Förderung (AZ 13199 und 

13211). 

 

Bei meiner Familie möchte ich mich ganz herzlich für ihre Liebe und die mir 

immer gewährte Unterstützung bedanken. 

 



Zusammenfassung 
Mit einer polyvalenten Peroxidase wurde ein Schlüsselenzym des 

Lignocelluloseabbaus aus Kulturen des Basidiomyceten Pleurotus sapidus 

chromatographisch gereinigt. Nach einer dreistufigen Reinigung wurde das Enzym 

mit einem Reinigungsfaktor von 130 aus dem Überstand einer Submerskultur isoliert. 

Die Aktivitätsoptima wurden für die Substrate β,β-Carotin, ABTS, Syringol und 

Veratrylalkohol ebenso bestimmt wie die Wechselzahlen und katalytischen 

Konstanten. 

In Zusammenarbeit mit der Firma Artes Biotechnology GmbH wurde ein Hansenula 

polymorpha Stamm generiert, welcher die für die polyvalente Peroxidase aus 

Pleurotus sapidus kodierende cDNA enthielt. Das Enzym wurde heterolog exprimiert 

und die Aktivitätsoptima des rekombinanten Enzyms ermittelt. 

Anschließend wurde der Abbau der Substrate Rapsstroh und „Rückstand einer 

Biogasanlage“ durch den Basidiomyceten Pleurotus sapidus  untersucht. Dazu wurde 

die Gesamtheit der sekretierten Enzyme (das Sekretom) von Pleurotus sapidus in 

Submers- und Emerskulturen analysiert. Photometrisch bestimmt wurden die 

Aktivitätsverläufe von Laccasen, Esterasen, Lipasen, Cellulasen, Xylanasen und 

Peroxidasen, insbesondere von Manganperoxidasen und polyvalenten Peroxidasen. 

Das Sekretom von Pleurotus sapidus wurde anschließend mittels zweidimensionaler 

Elektrophorese getrennt, massenspektrometrisch identifiziert und bioinformatisch 

ausgewertet. 

Verschiedene Substrate wurden mit gereinigten Enzympräparationen und 

Kulturüberständen von  Pleurotus sapidus umgesetzt. Hierbei wurde die Umsetzung 

von Ligninmodellsubstanzen wie zum Beispiel Coniferyl- und Veratrylalkohol, aber 

auch von Lignin organosolv und feingemahlenem Rapsstroh durch die gereinigte 

polyvalente Peroxidase aus Pleurotus sapidus gezeigt. Ebenso wurde ein Umsatz 

von feingemahlenem Rapsstroh mit Pleurotus sapidus Submerskulturen 

nachgewiesen. Die Versuche wurden analytisch durch photometrische 

Bestimmungen (Glucose- und Phenolgehalt), Messung der 

Partikelgrößenverteilungen und HPLC-/HPSEC-Messungen ausgewertet. 

Schlagworte: Pleurotus sapidus, Lignocelluloseabbau, Sekretomanalytik, polyvalente 

Peroxidase, zellfreie Umsetzungen 



Abstract  
With a versatile peroxidase, a key enzyme of the degradation of lignocelluloses 

was purified by chromatographic methods from submers cultures of the 

basidiomycete Pleurotus sapidus. After three steps, the enzyme was isolated with 

a purification factor of 130. Optimal reaction conditions were determined together 

with turnover numbers and product formation rates for the substrates: β,β-

carotene, ABTS, syringol, and veratryl alcohol. 

In cooperation with Artes® Biotochnology, a Hansenula polymorpha strain was 

generated containing the cDNA encoding the versatile peroxidase of Pleurotus 

sapidus. The enzyme was expressed heterologously, and pH and temperature 

optima were determined for the recombinant enzyme. 

The degradation of the lignocelluloses rape straw and residues from a biogas 

plant by Pleurotus sapidus were studied. Therefore, the entirety of enzymes (“the 

secretome“) secreted by Pleurotus sapidus in submerged and surface cultures 

were analysed. The activities of laccases, esterases, lipases, cellulases, 

xylanases, and peroxidases, in particular manganese peroxidases and versatile 

peroxidases were calculated by photometric assays. The secretome of Pleurotus 

sapidus was separated by two-dimensional electrophoresis and identified by 

mass spectrometry. A bioinformatic analysis of the data was performed. 

In-vitro digestions of various substrates were carried out with the isolated 

versatile peroxidase and culture supernatants of Pleurotus sapidus. The 

conversion of various low molecular weight lignin model substances like coniferyl 

alcohol or veratryl alcohol, finely ground rape straw and lignin organosolv were 

investigated. The conversion of finely ground rape straw was  demonstrated with 

submerged cultures of Pleurotus sapidus. The product analysis was performed 

by photometric assays, determination of particle size distribution, and HPLC-

/HPSEC analysis. 

Keywords: Pleurotus sapidus, degradation of lignocellulose, secretome analysis, 

versatile peroxidase, in-vitro digestion 



Abkürzungsverzeichnis 
% (v/v) Volumenprozent  
% (w/v) Gewichtsprozent  
2D zweidimensional 
ABTS 2,2´-Azino-di-(3-ethylbenzthiazolin)-6-sulfonsäure 
AEBSF 4-(2-Aminoethyl)-benzensulfonylfluorid 
APS Ammoniumpersulfat 
ATP Adenosintriphosphat 
BLAST Basic Local Alignment Search Tool 
BSA Rinderserumalbumin 
BTX Stoffgemisch: Benzol, Toluol, Xylol 
bzw Beziehungsweise 
CBB – G250 CoomassieBrilliant Blau G250 
cDNA komplementäre DNA 
CHAPS 3-[(3-Cholamidopropyl)dimethylamino]-1-propansulfonathydrat 
d Durchmesser 
DAD Diode Array Detection 
DEAE Diethylaminoethyl 
DNS Desoxyribonukleinsäure 
DSMZ Deutsche Sammlung für Mikroorganismen und Zellkulturen 
DTT 1,4-Dithiothreitol 
DyP Dyedecoulorising Peroxidase 
ΔE Extinktionsdifferenz 
εx nm Extinktionskoeffizient bei der Wellenlänge x nm 
E64 trans-Epoxysucciny-L-leucyl-amido(4-guanidino)-butan 
EC Enzymkomission 
EDTA Ethylendiamintetraessigsäure 
eV Elektronenvolt 
F Verdünnungsfaktor 
FAD Flavin-Adenin-Dinukleotid 
FE Flächeneinheit 
FPLC Fast Protein Liquid Chromatography 
g Erdbeschleunigung 
GC Gaschromatographie  
GFC Gelfiltrationschromatographie 
h Stunde 
H6 sechs Histidinreste 
ha Hektar [Flächeneinhait] 
HIC hydrophobe Interaktionschromatographie 
HMF Hydroxymethylfurfural 
HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie  
HPSEC High-performance sizeexclusionchromatography 

ID Innendurchmesser 
IEF Isoelektrische Fokussierung 
IEX Ionenaustauschchromatographie 
IPG Immobilisierter pH-Gradient 
kDa Kilodalton 
kPa Kilopascal 
kVh Kilovoltstunden 
λ Wellenlänge [nm] 
L Liter 
LC Liquid Chromatography 
LIFT® Beschleunigungsmodul in der TOF-Detektion 

http://guiltinanlab.cas.psu.edu/Publications/SBE/Yao-FACE2005.pdf


LRET Long rangeelectrontransfer 
M Molar 
mA Milliampere 
MALDI Matrix-unterstützte Laser-Desorption/Ionisation  
min Minute 
Mio. Million 
Mox oxidiertes Methionin 
mRNA Messenger Ribonukleinsäure 
MS/MS Massenspektrometrie-Kopplung 
MW Molekulargewicht 
NADP Nicotinamid-adenin-dinukleotid-phosphat 
NCBI National Center for Biotechnology Information 
NEB New England Biolabs 
NIST National Institute of Standards and Technology 
nor. Spotvolumen normalisiertes Spotvolumen 
o- ortho- 
Ω Wiederstand 
p- para- 
p.a. pro analysi [für analytische Zwecke] 
PEG2000 Polyethylenglycol 2000 
PFAM Protein Families Datenbank 
PFF Peptid-Fragmentierungs-Fingerabdruckspektrum 
pI isoelektrischer Punkt 
PMF Peptid-Massen-Fingerabdruckspektrum 
PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid 
pNPP para-Nitrophenolpalmitat 
PVDF Polyvinylidenfluorid 
ρ Dichte 
RNA Ribonukleinsäure 
RP reversephase [Umkehrphase] 
rpm Umdrehungen pro Minute 
RT-PCR Real-time Polymerasekettenreaktion 
S Leitfähigkeit [Siemens] 
SDS-PAGE Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese 
SNL Standardnährlösung 
sp. Spezies 
TCA Trichloressigsäure 
TEMED Tetramethylethylendiamin 
TOF Time-of-flight Detektion 
TRIS Tris(hydroxymethyl)-aminomethan 
U Unit 
UF Ultrafiltration 
UV Ultraviolett 
V Volt 
VIS Visible : sichtbares Licht 
VP polyvalente Peroxidase 
VProbe/Kulturüberstand Volumen der Probe bzw. Kulturüberstand 
W Watt 
wt Wildtyp 
YNB Yeast Nitrogen Based 
YP Yeast Peptone 
  
  
   



Die Aminosäuren wurden nach dem internationalen Ein- beziehungsweise Drei-

Buchstabencode abgekürzt. Die Zahl an der Bezeichnung kennzeichnet die 

Position der Aminosäure im Protein. 

 

Die Bezeichnungen der Mikroorganismen wurden nach dem Species 2000 & ITIS 

Catalogue of Life: 2011 Annual Checklist benannt (Bisby et al. 2011). 

www.catalogueoflife.org/annual-checklist/2011/. Zugriff: 30. Juni 2011 

  



 

 



 
 S e i t e  | 1 
 
1 Einleitung .................................................................................... 5 

1.1 Hintergrund .............................................................................................. 5 

1.2 Zielsetzung ............................................................................................ 11 

2 Ergebnisse ................................................................................ 12 

2.1 Polyvalente Peroxidase ......................................................................... 12 

2.1.1 Wildtypenzym aus Pleurotus sapidus .............................................. 12 

2.1.1.1 Induktion der polyvalenten Peroxidase ..................................... 12 

2.1.1.2 Reinigung einer polyvalenten Peroxidase ................................. 13 

2.1.1.3 Biochemische Charakterisierung .............................................. 20 

2.1.1.4 Zellfreie Umsetzungen von Substraten ..................................... 25 

2.1.2 Rekombinantes Enzym aus Hansenula polymorpha ....................... 30 

2.1.2.1 Expression der polyvalenten Peroxidase .................................. 31 

2.1.2.2 Biochemische Charakterisierung .............................................. 31 

2.2 Sekretomanalyse von Pleurotus sapidus ............................................... 35 

2.2.1 Erfassung von Enzymaktivitäten als Summenparameter ................ 35 

2.2.1.1 Anwendbarkeit der kombinierten Laccase/Peroxidasemessung 
mittels ABTS ............................................................................. 35 

2.2.1.2 Oberflächenkulturen auf dem Rückstand einer Biogasanlage .. 40 

2.2.1.3 Oberflächenkulturen auf Rapsstroh .......................................... 46 

2.2.1.4 Submerskulturen mit dem Rückstand einer Biogasanlage ....... 52 

2.2.1.5 Submerskulturen mit Rapsstroh ................................................ 58 

2.2.1.6 Zellfreie Umsetzung von Rapsstroh .......................................... 63 

2.2.2 Zweidimensionale elektrophoretische Analyse des Sekretoms ....... 67 

2.2.2.1 Optimierung der Probenvorbereitung und Visualisierung von 
Proteinmustern ......................................................................... 67 

2.2.2.2 Übersichtsanalyse von Oberflächenkulturen auf Rapsstroh ..... 71 

2.2.2.3 Übersichtsanalyse von Submerskulturen mit Rapsstroh ........... 72 

2.2.2.4 Kinetische Analyse von Submerskulturen mit Rapsstroh .......... 78 

3 Diskussion ................................................................................ 98 

3.1 Polyvalente Peroxidase ....................................................................... 101 

3.1.1 Wildtypenzym aus Pleurotus sapidus ............................................ 102 

3.1.2 Charakterisierung der Enzympräparation ...................................... 102 

3.1.3 Zellfreie Umsetzungen von Substraten mit dem Wildtypenzym .... 108 



 
 S e i t e  | 2 
 

3.1.4 Heterologe polyvalente Peroxidase  aus Hansenula polymorpha .. 109 

3.2 Sekretomanalyse von Pleurotus sapidus ............................................. 111 

3.2.1 Erfassung von Enzymaktivitäten als Summenparameter............... 111 

3.2.1 Zellfreie Umsetzungen von Substraten .......................................... 125 

3.2.2 Zweidimensionale elektrophoretische Analyse des Sekretoms ..... 126 

3.2.3 Kinetische Analyse von Submerskulturen mit Rapsstroh............... 128 

3.3 Fazit und Ausblick ................................................................................ 133 

4 Experimenteller Teil ............................................................... 135 

4.1 Verwendete Mikroorganismen .............................................................. 135 

4.2 Verwendete Geräte .............................................................................. 135 

4.3 Verwendete Chemikalien ..................................................................... 136 

4.4 Verwendete Ultrafiltrationseinheiten ..................................................... 139 

4.5 Verwendete Gase für die Gaschromatographie ................................... 139 

4.6 Mikrobiologie ........................................................................................ 139 

4.6.1 Kultivierung von Basidiomyceten ................................................... 139 

4.6.1.1 Standardnährlösung-(SNL)-Medium ....................................... 139 

4.6.1.2 Hauptkulturmedium ................................................................. 140 

4.6.1.3 Spurenelementlösung ............................................................. 140 

4.6.1.4 Extraktionspuffer ..................................................................... 140 

4.6.1.5 Peptidaseinhibitor.................................................................... 140 

4.6.1.6 Stammhaltung ......................................................................... 140 

4.6.1.7 Vorkultur .................................................................................. 141 

4.6.1.8 Submerskultur (Hauptkultur) ................................................... 141 

4.6.1.9 Submerskultur (Volumenvergrößerung) .................................. 141 

4.6.1.10 Ernte der Submerskulturen..................................................... 141 

4.6.1.11 Emerskultur (Hauptkultur)....................................................... 141 

4.6.1.12 Ernte der Emerskulturen ........................................................ 142 

4.6.2 Kultivierung von Hansenula polymorpha ....................................... 142 

4.6.2.1 Wachstumsmedium (YNB-Medium) ........................................ 142 

4.6.2.2 Stammhaltung ......................................................................... 142 

4.6.2.3 Vorkultur .................................................................................. 142 

4.6.2.4 Hauptkultur .............................................................................. 143 

4.6.2.5 Ernte der Submerskulturen ..................................................... 143 



 
 S e i t e  | 3 
 

4.7 Proteinanalytik ..................................................................................... 143 

4.7.1 Enzymaktivitäten ........................................................................... 143 

4.7.1.1 ABTS -Assay – Bestimmung von Laccase- und 
Peroxidaseaktivität .................................................................. 144 

4.7.1.2 Manganperoxidase-Aktivität.................................................... 145 

4.7.1.3 β,β-Carotin-Assay ................................................................... 146 

4.7.1.4 Esterase-Aktivität .................................................................... 147 

4.7.1.5 Peptidase-Aktivität .................................................................. 148 

4.7.1.6 Cellulase-Aktivität ................................................................... 149 

4.7.1.7 Xylanase-Aktivität ................................................................... 149 

4.7.1.8 Lipase-Aktivität ....................................................................... 150 

4.7.1.9 Phenolgehalt ........................................................................... 151 

4.7.1.10 Wasserstoffperoxidgehalt ....................................................... 151 

4.7.1.11 Proteingehalt .......................................................................... 152 

4.7.1.12 Glucosegehalt ........................................................................ 152 

4.7.2 SDS-Polyacrylamid-Gelelktrophorese (SDS-PAGE) ..................... 153 

4.7.3 Western Blot .................................................................................. 156 

4.7.4 Isoelektrische Fokussierung (IEF) ................................................. 156 

4.7.5 Zweidimensionale Elektrophorese................................................. 157 

4.7.5.1 Fällung mit Trichloressigsäure ................................................ 157 

4.7.5.2 Probenaufarbeitung für die zweidimensionale Elektrophorese 157 

4.7.5.3 verwendete Stammlösungen .................................................. 158 

4.7.5.4 Erste Dimension: Isoelektrische Fokussierung mit 
immobilisierten pH-Gradienten ............................................... 160 

4.7.5.5 Zweite Dimension: SDS-Gelelektrophorese............................ 161 

4.7.6 Färbungen für elektrophoretische Methoden ................................. 162 

4.7.6.1 Färbung mit colloidalem Coomassie Brilliant Blau (CBB) ....... 162 

4.7.6.2 Silberfärbung .......................................................................... 163 

4.7.7 Biochemische Charakterisierung der gereinigten/ heterolog 
exprimierten polyvalenten Peroxidase ........................................... 164 

4.7.7.1 Bestimmung des Molekulargewichts ....................................... 164 

4.7.7.2 Bestimmung der optimalen Reaktionsbedingungen ................ 164 

4.7.7.3 Bestimmung der kinetischen Konstanten Km und kcat ............. 164 

 



 
 S e i t e  | 4 
 

4.8 Chromatographie ................................................................................. 165 

4.8.1 Fast Protein Liquid Chromatographie (FPLC) ................................ 165 

4.8.1.1 Hydrophobe Interaktionschromatographie (HIC) ..................... 165 

4.8.1.2 Ionenaustauschchromatographie (IEX) ................................... 166 

4.8.1.3 Gelfiltrationschromatographie (GFC) ...................................... 167 

4.8.2 Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) ....................... 168 

4.8.2.1 HPLC Analytik mit einer Umkehrphasen-Säule ....................... 168 

4.8.2.2 HPLC Analytik zur Molekulargewichtsverteilung mit einer 
linearen Säule (HPSEC) ......................................................... 168 

4.8.3 Gaschromatographie (GC) ............................................................ 168 

4.8.3.1 Gaschromatographie mit Flammenionisationsdetektor (GC-FID) . 
  ................................................................................................ 168 

4.8.3.2 Gaschromatographie mit massenspektrometrischem Detektor 
(GC-MS) .................................................................................. 169 

4.9 Zellfreie (in-vitro) Umsetzungen ........................................................... 169 

4.9.1 In-vitro Umsetzungen mit der gereinigten Enzympräparation aus 
Pleurotus sapidus .......................................................................... 169 

4.9.1.1 Modellsubstrate ....................................................................... 169 

4.9.1.2 Lignin organosolv .................................................................... 169 

4.9.2 In-vitro Umsetzungen mit Überständen von Pleurotus sapidus 
Submerskulturen ........................................................................... 170 

4.9.2.1 Stroh ....................................................................................... 170 

4.9.3 Probenvorbereitung für die HPLC .................................................. 171 

4.9.4 Probenvorbereitung für die HPSEC ............................................... 171 

4.9.5 Probenvorbereitung für die GC-FID / GC-MS ................................ 171 

5 Literaturverzeichnis ............................................................... 172 

6 Anhang ................................................................................... 191 

6.1 Massenspektrometrische Identifizierung der gereinigten polyvalenten 
Peroxidase ........................................................................................... 191 

6.2 Heterologe polyvalente Peroxidase aus Hansenula polymorpha ......... 193 

6.3 Peptiddaten der Übersichtsanalyse ...................................................... 194 

6.4 Peptiddaten der kinetischen Sekretomanalyse .................................... 200 



 
 S e i t e  | 5 
 
1 Einleitung 

1.1 Hintergrund 
Bereits 1902 entstand die Idee, Weißfäulepilze zur Verbesserung der 

Bioverfügbarkeit von pflanzlichen Abfällen einzusetzen (Falck 1902). Seit den 

siebziger Jahren des 20. Jahrhunderts wurden die Forschungsarbeiten am 

Abbau von pflanzlichem Material durch Mikroorganismen intensiviert. Die 

Arbeiten wurden auf mögliche Anwendung lignolytischer Systeme in der 

Papierindustrie, zur Gewinnung nützlicher Produkte und in der Abfallaufbereitung 

fokussiert. Heute bezeichnet man pflanzliches Material als nachwachsende 

Rohstoffe. Diese besitzen ein großes energetisches und chemisches Potential. 

Die Hauptkomponenten pflanzlichen Materials sind Cellulose, Hemicellulose und 

Lignin, das zweithäufigste Biopolymer der Erde. Das Makromolekül Lignin ist aus 

den aromatischen Grundeinheiten Coniferyl-, Sinapyl- und Cumarylalkohol 

(Sarkanen et al. 1971, Adler 1977) aufgebaut. Die Phenylpropangrundeinheiten, 

die teilweise am Phenylring methoxyliert und am Propanrest hydroxyliert sind, 

werden durch Ether- und C-C-Bindungen auf unterschiedliche Weise miteinander 

verknüpft. So entsteht ein komplexes dreidimensionales Netzwerk, in welchem 

Cellulose und Hemicellulose eingebunden sind. Zur Isolierung einzelner 

Bestandteile, Kohlenhydrate und aromatischer Verbindungen, muss das 

Lignocellulosegerüst aufgeschlossen werden. Das Netzwerk ist chemisch nur 

schwer angreifbar, benötigt werden hohe Temperaturen und hoher Druck 

(Ohgren et al. 2006, Ruiz et al. 2008) oder auch ein niedriger pH-Wert (Guo et al. 

2008). Auch für einen Großteil der Mikroorganismen stellt das 

Lignocellulosenetzwerk ein großes Hindernis dar. 

Die effektivsten Lignocellulose-abbauenden Mikroorganismen finden sich unter 

den filamentösen Pilzen. Asco- und Basidiomyceten (Schlauch- und 

Ständerpilze) leben saprophytisch und beziehen den zum Wachstum benötigten 

Kohlenstoff aus ihrer Umgebung (Kendrick 2000). Sie sind neben den Bakterien 

die wichtigsten Destruenten der Lignocellulose und deshalb von fundamentaler 

Bedeutung für den Kohlenstoffkreislauf der Erde. Der Lignocelluloseabbau durch 

Mikroorganismen kann dabei in drei Gruppen eingeteilt werden (Huckfeldt et al. 

2006). Bei der Moderfäule („soft rot“) wird das Holz oberflächlich durch Pilze, 



 
 S e i t e  | 6 
 
überwiegend Ascomyceten und fungi imperfecti, angegriffen. Bei hoher 

Feuchtigkeit werden die Zellwände des Holzes abgebaut und somit dessen 

Festigkeit herabgesetzt (Daniel et al. 1992, Blanchette 1995). Bei der Braunfäule 

(„brown rot“) bauen die Mikroorganismen vorwiegend Cellulose ab. Das 

verbleibende Lignin färbt das Holz schwarzbraun (Abbildung 1a) (Eriksson et al. 

1990, Blanchette 1995). Bei der Weißfäule („white rot“) wird zunächst und 

überwiegend Lignin abgebaut und das Holz dadurch entfärbt (Abbildung 1a) 

(Eriksson et al. 1990, Blanchette 1995). Der biologische Ligninabbau verläuft in 

zwei Stufen: Bereits gelöste Ligninfragmente können von Bakterien, wie zum 

Beispiel durch Vertreter der Familie Streptomycetaceae (Crawford und Crawford 

1980, Berrocal et al. 1997) oder Pseudomonadaceae (Zimmermann 1990) 

verwertet werden. Der direkte enzymatische Abbau des Holzes wird überwiegend 

von Weißfäulepilzen katalysiert. Einige wichtige Vertreter der Weißfäulepilze sind 

die Trameten aus der Familie der Porlingsartigen, die Seitlingsartigen 

(Pleurotaceae) (Abbildung 1b) und die Holzkeulenartigen (Xylariaceae) (Hlasek 

2009) (Abbildung 1c). 

 

Abbildung 1: a: Holzstück mit der Braunfäule im oberen und der Weißfäule in unteren Bildteil 
(Rüpke und Fiedler 2010); b: Fruchtkörper des Weißfäulepilzes Pleurotus sapidus in einer 

Oberflächenkultur nach 8 Wochen, c: Fruchtkörper des Weißfäulepilzes Xylaria polymorpha 
(Hlasek 2009) 

Sie nutzen eine komplexe, einzigartige Ausstattung an extrazellulären 

Biokatalysatoren, Sekretom genannt, die ihnen den Aufschluss von lignifizierten 

Biopolymeren ermöglicht. Diese extrazellulären Enzyme lassen sich in drei 

Gruppen einteilen. Die erste Gruppe umfasst die Enzyme, welche die 

Kohlenhydrate Cellulose und Hemicellulose und das Lignin direkt umsetzen. 

Dazu gehören unter anderem Cellulasen und Xylanasen (Baldrian et al. 2005), 

Phenoloxidasen für den Ligninabbau und Dioxygenasen (Hofrichter und Ullrich 

2006, Scheibner et al. 2008, Liers et al. 2010). Die Enzyme der zweiten Gruppe 



 
 S e i t e  | 7 
 
katalysieren den Ligninabbau nur indirekt; dazu gehören Superoxid-Dismutasen 

(Gralla und Kosman 1992). In einer dritten Gruppe werden die Enzyme 

zusammengefasst, die unterschiedliche Metabolismen miteinander verknüpfen. 

Diese Gruppe enthält unter anderem Glyoxaloxidase, Arylalkoholoxidasen, 

Glucoseoxidasen, Pyranoseoxidasen und Cellobiosedehydrogenasen (Kersten et 

al. 1995, Varela et al. 2000, Zamocky et al. 2006).  

In vorangegangenen Arbeiten zum Holzabbau durch Basidiomyceten lag der 

Fokus vorwiegend auf der Charakterisierung der unmittelbar am Ligninabbau 

beteiligten Oxidoreduktasen und der Entschlüsselung der beteiligten 

Reaktionsmechanismen (Abbildung 2). Zahlreiche Manganperoxidasen, 

Ligninperoxidasen und Laccasen wurden biochemisch charakterisiert und ihre 

Sequenzen in Gendatenbanken hinterlegt (http://srs6.ebi.ac.uk/ 30.06.2011). 

Auch Peroxidasen vom Dye-Decoulorising-Typ (DyP) und polyvalente 

Peroxidasen wurden bislang für unterschiedliche Weißfäulepilze beschrieben 

(Hofrichter et al. 1999, Scheibner et al. 2008). 

 

Abbildung 2: Schematische Darstellung des Ligninkreislaufs in holzzersetzenden Basidiomyceten, 
modifiziert nach (Hofrichter et al. 2001b) 

Das Sekretom von Basidiomyceten enthält neben den typischen lignolytischen 

und Wasserstoffperoxid-produzierenden Enzymen auch zahlreiche Glycosidasen  

http://srs6.ebi.ac.uk/


 
 S e i t e  | 8 
 
und Esterasen/Lipasen. Des Weiteren wurden unterschiedliche Peptidasen in 

Kulturen von Pleurotus sapidus (Zorn et al. 2005a), Pleurotus ostreatus (Faraco 

et al. 2005) und Phanerodontia chrysosporium (Wymelenberg et al. 2005) 

detektiert. Darüber hinaus wiesen Untersuchungen von Xylaria Spezies auf die 

Bildung spezieller Esterasen, die am Holzabbau beteiligt sind (Liers et al. 2006) 

hin. 

Zur Charakterisierung der Sekretome von Basidiomyceten sind umfangreiche 

Informationen über die Art, den Umfang, die Induktion und die kinetischen 

Parameter der beteiligten Enzyme notwendig. Diese Informationen sind am 

besten aus hochauflösenden zweidimensionalen Gelelektrophoresen und 

anschließender massenspektrometrischer Identifizierung der beteiligten Proteine 

zu gewinnen. Die zweidimensionale Gelelektrophorese kombiniert die Trennung 

von Proteinen nach ihrem isoelektrischem Punkt (erste Dimension) und nach 

ihrem Molekulargewicht (zweite Dimension). Dieses Trennverfahren für komplexe 

Proteingemische wurde von O´Farrell (1975) und Klose (1975) unabhängig 

voneinander entwickelt. Die heutige Technik erlaubt die Ausführung im 

Hochdurchsatzverfahren, bei dem bis zu 12 Proben gleichzeitig analysiert 

werden können. Moderne Auswertesoftware ermöglicht den quantitativen 

Vergleich einzelner Proteine untereinander oder die Auswertung kinetischer 

Parameter einzelner Proteine in komplexen Gemischen (Bandow et al. 2008). 

Unter statischen Bedingungen wurden Sekretome einzelner Basidiomyceten 

bereits untersucht. Von Phanerodontia chrysosporium wurden Sekretomanalysen 

auf Weichholz (21 Tage statischer Kultur, Ravalason et al. 2008), und auf 

Eichenholz (21 Tage statischer Kultur, Abbas et al. 2005) durchgeführt. Das 

Sekretom von Pleurotus sapidus wurde auf den Substraten Erdnussschalen und 

Glaswolle/Glucose (2 - 7 Tage, statisch-dynamische Kultur, Zorn et al. 2005b) 

untersucht. 

Die Entschlüsselung des extrazellulären Enzymsystems von holzzersetzenden 

Mikroorganismen soll zukünftig zu einer besseren stofflichen Nutzung des 

Rohstoffs Lignocellulose führen. Nach Schätzungen beträgt die jährliche globale 

Biomasseproduktion derzeit etwa 200 Milliarden Tonnen (Strasburger et al. 

2002). Verholzte Pflanzen besitzen einen Anteil von 15 – 30% Lignin (50 - 60 



 
 S e i t e  | 9 
 
Milliarden Tonnen pro Jahr), sowie eine Anteil an aromatischen Strukturen von 

ca. 40% im Lignin. Bereits heute wird Lignin aus Nebenströmen der Industrie, wie 

zum Beispiel die „Schwarzlauge“ aus der Papierindustrie, als Energielieferant 

eingesetzt. Die Schwarzlauge besitzt einen hohen Heizwert, der den Bedarf einer 

Papierfabrik zu ~80% deckt (Kamm et al. 2006). Auch Lignosulfonate aus dem 

Sulfitverfahren werden bereits als Dispergier- und Bindemittel, zum Beispiel in 

Beton, Lacken oder Düngemitteln, eingesetzt. Genutzt werden hier die 

polyelektrolytischen Eigenschaften, die Adsorptionswirkung, die geringe 

Viskosität und die dunkle Farbe der Ligninsulfonate (Faix 1992). Lignin kann 

ebenfalls als Biowerkstoff eingesetzt werden. So besteht zum Beispiel 

ARBOFORM®, ein Biowerkstoff der Firma Tecnaro GmbH, hauptsächlich aus 

Lignin und Cellulose. Er ist thermoplastisch verformbar und kann mit etablierten 

Kunstoffverarbeitungsverfahren bearbeitet werden. Arboform® kann daher eine 

Alternative zu herkömmlichen Kunststoffen aus der Petrochemie sein. 

Die zukünftigen Verwendungsmöglichkeiten des nachwachsenden Rohstoffs 

Lignocellulose lassen sich in drei Bereiche gliedern: Energie, Makromoleküle und 

Aromaten bzw. Feinchemikalien. Eine Bioraffinerie nach dem Prinzip der 

ganzheitlichen Nutzung von Biomasse (Abbildung 3) steht derzeit im Interesse 

der Forschung. 

 

Abbildung 3: schematische Darstellung einer Bioraffinerie, modifiziert nach (Holladay et al. 2007) 

 



 
 S e i t e  | 10 
 
Ein Praxisbeispiel ist die Grüne-Bioraffinerie-Demonstrationsanlage in Utzenaich. 

In der 2009 in Betrieb gegangenen Anlage werden aus Grassilage Milchsäure 

und Aminosäuren gewonnen. In künftig entstehenden Bioraffinerien könnten aus 

dem nachwachsenden Rohstoff Lignocellulose Makromoleküle und 

Feinchemikalien entstehen (Abbildung 4, Holladay et al. 2007). Somit könnten 

Teile der petrochemischen Produkte ersetzt werden. Die dabei freigesetzten 

Kohlenhydrate könnten zudem große Mengen Biokraftstoffe liefern oder zur 

Papierherstellung genutzt werden. 

 

Abbildung 4: schematische Darstellung der Produktmöglichkeiten aus dem Rohstoff Lignin, 
modifiziert nach (Holladay et al. 2009) 

Wenn es in der Zukunft möglich wäre, einen Teil des Papierbedarfs aus 

strohähnlichen Materialien zu decken, könnten große Einsparungen beim 

Energie- und Prozesswasserverbrauch erzielt werden. Darüber hinaus könnte auf 

bis zu 40% der für die Bleichung notwenigen aggressiven Chemikalien (z. B. 

ClO2) verzichtet werden. 

aromatenreiche
Pyrolyseöle

gemischte organische/
Aromatische Säuren

gemischte 
Phenole

gemischte 
benzolische
Aldehyde

verschiedene 
Chinone

kostengünstige 
Füllstoffe

Kohlenstoff-
Fasern

Makromoleküle

Polyurethane und 
hitzestabile Polyurethane

thermoplastische 
Elastomere

feste 
Copolymere

Copolymere in 
Polyestern

Copolymere mit HMF 
(hohe Festigkeit und 
Hitzestabilität)

flüssiger Treibstoff 
(BTX Typ)



 
 S e i t e  | 11 
 
1.2 Zielsetzung 
In dieser Arbeit sollte ein Schlüsselenzym des Lignocelluloseabbaus, die 

polyvalente Peroxidase aus Pleurotus sapidus chromatographisch gereinigt und 

biochemisch charakterisiert werden. Das gereinigte Wildtypenzym und das in 

Hansenula polymorpha heterolog exprimierte Enzym sollten in zellfreien 

Umsetzungen von Ligninmodellsubstraten eingesetzt werden.  

In Erweiterung dieser Arbeiten sollte der Basidiomycet Pleurotus sapidus 

submers (Flüssigkultur) und emers (Oberflächenkultur) auf Rapsstroh kultiviert 

und die extrazellulären Enzymaktivitäten über den Kulturverlauf hinweg qualitativ 

und quantitativ erfasst werden. Als ein weiteres lignocellulosehaltiges Substrat 

sollte der Rückstand einer Biogasanlage eingesetzt werden. Die zeitaufgelöste 

Analyse umfasste photometrische Methoden und hochauflösende, 

zweidimensionale elektrophoretische Trennungen. Schlüsselenzyme aus dem 

Sekretom von Pleurotus sapidus sollten massenspektrometrisch identifiziert und 

die Kinetik der Enzymexpression bioinformatisch ausgewertet werden. Zellfreie 

Umsetzungen sollten mit den Überständen der Pleurotus sapidus Kulturen mit 

unterschiedlichen Ligninmodellsubstraten durchgeführt werden. 

  



 
 S e i t e  | 12 
 
2 Ergebnisse 

2.1 Polyvalente Peroxidase 
Für die zellfreie Umsetzung von Ligninmodellsubstraten und Lignocellulose 

wurde die Sekretion einer polyvalenten Peroxidase aus Pleurotus sapidus 

zunächst induziert. Das Wildtypenzym wurde chromatographisch gereinigt und 

biochemisch charakterisiert. 

2.1.1 Wildtypenzym aus Pleurotus sapidus 

2.1.1.1 Induktion der polyvalenten Peroxidase 

Zur Induktion der polyvalenten Peroxidase wurde der Basidiomycet Pleurotus 

sapidus submers in einem Minimalmedium (4.6.1.2), im 200 mL-Maßstab 

kultiviert. Als Kohlenstoffquelle wurden unterschiedliche lignin-haltige Substrate 

(20 g L-1) eingesetzt: Rapsstroh (Durchmesser 3 mm und ~15 mm), der 

Rückstand einer Biogasanlage, Kakaoschalen (ganz und gemörsert) und Lignin 

organosolv bei unterschiedlichen pH-Werten des Mediums (pH-Wert 6,0 und 

8,0). Die Enzymaktivität wurde täglich bestimmt (4.7.1.3). Die Kombination aus 

Minimalmedium (4.6.1.2) und dem Rückstand einer Biogasanlage als 

Kohlenstoffquelle zeigte nach acht Kulturtagen die höchste Enzymaktivität mit 

0,2 U mg-1 (Abbildung 5). 

 



 
 S e i t e  | 13 
 

 

Abbildung 5: Vergleich der Aktivitäten der polyvalenten Peroxidase in Submerskulturen von 
Pleurotus sapidus auf unterschiedlichen Substraten; Kakaoschale 3 mm (schwarz), Rückstand 

Biogasanlage (schraffiert, absteigend), Lignin organosolv pH 6,0 (dunkelgrau), Lignin organosolv 
pH 8,0 (gepunktet), Rapsstroh 3 mm (grau), Rapsstroh 10-20 mm (schraffiert, aufsteigend), 

Rapsstroh 10-20 mm mit Hefeextrakt (hellgrau) und Rückstand Biogasanlage mit Hefeextrakt 
(gekreuzt) 

 

2.1.1.2 Reinigung einer polyvalenten Peroxidase  

Die Reinigung erfolgte nach einer modifizierten Methode von Langhoff (2002). 

Die Kulturüberstände von Pleurotus sapidus wurden mittels Ultrafiltration (10 kDa 

Ausschluss, Macrosep®) um den Faktor 10 konzentriert und auf den Startpuffer 

(4.8.1.1 bis 4.8.1.3) der jeweiligen Reinigungsstufe umgepuffert. 

a) Hydrophobe Interaktionschromatographie 

Das Zielprotein wurde bei einem pH von 3,5 und einer Salzkonzentration von 

1 mol L-1 Natriumchlorid an eine hochsubstituierte Phenyl-Sepharose-Matrix 

gebunden (4.8.1.1). Die Elution erfolgte mit einem Puffer abnehmender 

Ionenstärke. Die proteinhaltigen Fraktionen wurden auf ihre Aktivität hin 

untersucht. Aktivität wurde in den Fraktionen 35-37 detektiert (Abbildung 6). Bei 

einer Wiederfindung von 66% wurde ein Reinigungsfaktor von 10,8, bezogen auf 

die spezifische Aktivität, erzielt (Tabelle 1). 

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

2 4 6 8 10 12 14

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
U

 m
g-1

]

Kulturdauer [Tage]



 
 S e i t e  | 14 
 

 

Abbildung 6: Hydrophobe Interaktionschromatographie an einer hochsubstituierten Phenyl-
Sepharose-Matrix; blau: Extinktion (λ = 280 nm); rot: Leitfähigkeit [mS];                              

schwarz: Enzymaktivität [U L-1] gemessen mittels β,β-Carotin Assay 

 

Tabelle 1: Bilanzierung der Reinigung an einer Phenyl-Sepharose-Matrix mit einem 
Natriumchloridgradienten 

 Aktivität  
[U L-1] 

Spezifische 
Aktivität 
[U mg-1] 

Gesamt-
aktivität 

[mU] 

Wieder-
findung 

[%] 

Reinigungs-
faktor 

Kulturüberstand 0,2 ± 0,02 0,005 ± 0,0006 2   

nach 
Konzentrierung 0,41 ± 0,03 0,012 ± 0,001 1,81 91 2,4 

nach HIC 0,18 ± 0,02 0,054 ± 0,008 1,32 66 10,8 

 

b) Ionenaustausch Chromatographie 

Für die Ionenaustauschchromatographie wurde ein schwacher 

Anionenaustauscher (DEAE Sepharose) eingesetzt. Das Zielprotein wurde bei 

einem pH-Wert von 4,5 an die Matrix gebunden und mit einem Shift zu pH 3,0 

eluiert (4.8.1.2). 

Aktivität wurde in drei Fraktionen detektiert (Abbildung 7), 71% der eingesetzten 

Aktivität wurden von der Säule eluiert. 

0,00

0,05

0,10

0,15

0,20

0,25

0,30

En
zy

m
ak

tiv
itä

t[
U

 L
-1
]

Le
itf

äh
ig

ke
it 

[m
S]

Ex
tin

kt
io

n
[2

80
 n

m
]

Elutionszeit [h:min:s]

Fraktion:



 
 S e i t e  | 15 
 

 

Abbildung 7: Ionenaustauschromatographie an einem schwachen Anionentauscher (DEAE-
Sepharose); blau: Extinktion (λ = 280 nm); schwarz: Enzymaktivität [U L-1] gemessen mittels β,β-

Carotin Assay 

 

c) Gelfiltrationschromatographie 

Für die Gelfiltrationschromatographie (4.8.1.3) wurde eine analytische 

Sephadexsäule eingesetzt. Das Zielprotein wurde bei einem pH-Wert von 4,5 

und Zusätzen an Eisen-, Mangan-, Zink- und Kupfersalzen zur Vermeidung von 

Aktivitätsverlusten eluiert. 

Aktivität wurde in insgesamt zwei Fraktionen detektiert (Abbildung 8). 72% der 

eingesetzten Gesamtaktivität wurden von der Säule eluiert. 

 

 

 

0,0

0,2

0,4

0,6

0,8

1,0

1,2

1,4

1,6

En
zy

m
ak

tiv
itä

t[
U

 L
-1
]

Elutionszeit [h:min:s]

Ex
tin

kt
io

n
[2

80
 n

m
]

Elutionszeit [h:min:s]



 
 S e i t e  | 16 
 

 

Abbildung 8: Gelfiltrationschromatographie an einer analytische Sephadexsäule; blau: Extinktion 
(λ = 280 nm); schwarz: Enzymaktivität [U L-1] gemessen mittels β,β-Carotin Assay 

 

d) Kombinierte Reinigung 

Der Kulturüberstand von Pleurotus sapidus wurde mittels tagentialer Ultrafiltration 

konzentriert und die hydrophobe Interaktionschromatographie als ersten 

Reinigungsschritt genutzt. Die aktiven Fraktionen mehrerer Läufe wurden gepoolt 

und in der zweiten Reinigungsstufe (DEAE) eingesetzt. Die aktiven Fraktionen 

mehrerer Läufe wurden wiederum gepoolt, mittels Ultrafiltration (10 kDa 

Ausschluss, Macrosep®) konzentriert und der Gelfiltration zugeführt. Das 

erhaltene Enzympräparat besaß eine spezifische Aktivität von 1,3 U mg-1 und 

wurde mit einer Ausbeute von 12% aus Submerskulturen von Pleurotus sapidus 

gereinigt. Der Reinigungsfaktor betrug, bezogen auf die spezifische Aktivität, 130 

(Tabelle 2). 

 

 

 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t  
[U

 L
-1

]
Fraktion:

E
xt

in
kt

io
n

[2
80

 n
m

]

00:30:0000:00:00 01:00:00

0.0035

0.0005

0.0010

0.0015

0.0020

0.0025

0.0030

Elutionszeit [h:min:s]
01:30:00

0.0045

0.0040

1     5      10    15     20    25    30    35    40   45    50   55    60     65    70   75    80   85   90   95   100  105 110

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94 97 10
0

10
3

10
6

10
9

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

1 4 7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40 43 46 49 52 55 58 61 64 67 70 73 76 79 82 85 88 91 94 97 10
0

10
3

10
6

10
9



 
 S e i t e  | 17 
 

Tabelle 2: Bilanzierung der Reinigung einer polyvalenten Peroxidase aus Pleurotus sapidus 

 Aktivität 
[U L-1] 

Spezifische 
Aktivität 
[U mg-1] 

Gesamt-
aktivität [U] 

Ausbeute 
[%] 

Reinigungs-
faktor 

vor Reinigung 2,3 ± 
0,06 0,01 ± 0,001 8,50 ± 0,5   

nach HIC 1,7 ± 
0,01 0,04 ± 0,001 5,08 ± 0,06 60 4 

nach DEAE 2,1 ± 
0,05 0,27 ± 0,01 2,3 ± 0,03 28 27 

nach 
Gelfiltration 

1,0 ± 
0,001 1,3 ± 0,001 1,0 ± 0,002 12 130 

      
 

e) Charakterisierung der Enzympräparation 

Nach erfolgter chromatographischer Reinigung über drei Stufen wurde eine 

Trennung mittels SDS-PAGE (4.7.2) durchgeführt und mittels Colloidal 

Coomassie (4.7.6.1) gefärbt. Der Reinigungseffekt wurde über die gesamte 

Reinigung dokumentiert (Abbildung 9 links). Nach der Gelfiltrations-

chromatographie wurden zwei Hauptbanden mit abgeschätzten 

Molekulargewichten von 26 und 38 kDa detektiert. Es wurde ebenso eine 

isoelektrische Fokussierung (4.7.4) mit anschließender Färbung (4.7.6.1) 

durchgeführt. Dabei wurden zwei Banden mit pI-Werten von 3,6 und 3,7 

detektiert (Abbildung 9 rechts). 

Die zwei Hauptbanden mit abgeschätzten Molekulargewichten von 26 und 

38 kDa wurden aus dem SDS-Gel ausgeschnitten. Die Sequenzierung der 

ausgeschnittenen Banden erfolgte nach tryptischem Verdau und anschließender 

Analyse mittels MALDI-MS/MS (Tabelle 3, Massenspektren s. Anhang a1). Die 

Proteinidentifizierung wurde anhand von Peptidsequenz-Datenbankrecherchen 

(Protein Blast NCBI, Altschul et al. 1997) durchgeführt. Für die Peptide zwei bis 

vier der 26kDa-Bande wurden keine Homologien gefunden. Für die Peptide eins 

bis drei der 38 kDa-Bande und für Peptid eins der 26 kDa-Bande wurde eine 

Homologie von jeweils 100% zu einer polyvalenten Peroxidase aus Pleurotus 

sapidus (Zugriffsnummer CAJ01576) gefunden. Zudem ergab die 

Datenbankrecherche für die Peptide eine Homologie von 94% zu polyvalenten 

Peroxidasen aus Pleurotus eryngii (Zugriffsnummern Q9UR19.1 und o94753.1) 



 
 S e i t e  | 18 
 
und eine 80%ige Homologie zu einer polyvalenten Peroxidase aus Bjerkandera 

adusta (Zugriffsnummer ABQ44529.1). In der Aminosäuresequenz des Proteins 

wurde die mutmaßliche Lage der Peptidsequenzen bestimmt (Abbildung 10).  

 

Abbildung 9: links: SDS-PAGE (Gradientengel (Serva) 8-16%ig) der einzelnen Reinigungsstufen 
der β,β-Carotin-abbauenden Enzyme aus P. sapidus 1: konz. Kulturüberstand, 30 μL; 2: konz. 

HIC-Fraktionen, 30 μL; 3: konz. DEAE-Fraktionen, 30 μL; 4: konz. GFC-Fraktion , 30 μL; rechts: 
IEF-Gel (pH 3-10) der konz. GFC-Fraktion, 10 μL 

 

Tabelle 3: Peptidsequenzen durch ESI-MS/MS- Sequenzierung und Edmann-Abbau; L = I oder L, 
K = Q oder K und F = F oder Mox 

38 kDa-Bande 26 kDa-Bande Edmann-Sequenz 

GEVQSPLQGEIR LFPGTPDNKGEVQSPLQGEIR AT(C)ADGGTTA 

LFPGTPDNKGEVQSPLQGEIR RAAQLAGFPAPR  

LQSDHLLAR TAFPISGGFYSIR  

 PLSGGFYSLNSEHPR  

 

pI

3,5

4,2

4,5

5,2
5,3

6,0

6,9
7,4
7,8
8,0
8,3

9,5
10,7

pI 3,6

pI 3,7

kDa

250
130
100

70

55

35

25

15

1 2 3 4 

38 kDa

26 kDa

kDa



 
 S e i t e  | 19 
 

 

Abbildung 10: Vergleich der Aminosäuresequenz einer polyvalenten Peroxidase aus Pleurotus 
sapidus (Zugriffsnummer CAJ01576) mit dem N-Terminus des reifen Proteins (grau unterlegt) 

und den de novo bestimmten Peptidsequenzen aus Tabelle 3 



 
 S e i t e  | 20 
 
Der N-Terminus des gereinigten Enzyms wurde nach einem Westernblot (4.7.3) 

mittels Edman-Abbau (Analytischer Service des biochemischen Institutes, 

Justus-Liebig-Universität Giessen) ansequenziert. Die ersten zehn Aminosäuren 

des reifen Proteins wurden bestimmt: NH2 – AT(C)ADGGTTA (Abbildung 10) und 

anhand von Peptidsequenz-Datenbankrecherchen (Protein Blast NCBI, Altschul 

et al. 1997) identifiziert. Für das N-terminale Peptid wurden Homologien von 90% 

zu polyvalenten Peroxidasen aus Pleurotus sapidus (Zugriffsnummer CAJ01576) 

und Pleurotus eryngii (Zugriffsnummer Q9UR19.1) und zu Manganperoxidasen 

aus weiteren Pleurotus sp. gefunden. 

 

2.1.1.3 Biochemische Charakterisierung 

Die Enzympräparation aus der kombinierten Reinigung wurde konzentriert, die 

Konzentration mittels Bradford-Assay bestimmt (4.7.1.11) und biochemisch 

charakterisiert. Hierzu wurden die optimalen Reaktionsbedingungen (4.7.7.2) und 

die kinetischen Konstanten (4.7.7.3) für verschiedene Substrate bestimmt.  

a) Optimierung der Reaktionsbedingungen 

Für die Optimierung der Reaktionsbedigungen wurden in jedem Ansatz 0,1 nMol 

des gereinigten Enzyms eingesetzt. Zur Bestimmung des optimalen pH-Wertes 

wurde das gereinigte Enzym mit einem 50 mM Natriumacetatpuffer versetzt und 

der β,β-Carotin Aktivitätsassay bei 30 °C durchgeführt (4.7.1.3). Der optimale pH-

Wert betrug 4,5 (Abbildung 11), daher wurden alle weiteren Messungen bei 

diesem pH-Wert durchgeführt. Bei der Bestimmung des Temperaturoptimums 

wurden alle verwendeten Lösungen jeweils fünf Minuten bei der gewünschten 

Temperatur vorinkubiert, die Enzympräparation zugefügt und die Aktivität 

bestimmt. Die optimale Reaktionstemperatur betrug 30 °C (Abbildung 12). Diese 

Temperatur wurde für alle weiteren Messungen verwendet. Um den Einfluss der 

Wasserstoffperoxidkonzentration zu bestimmen, wurden Konzentrationen von 

0,05 bis 4 mM im Aktivitätstest eingesetzt. Die optimale Konzentration lag bei 

2 mM (Abbildung 13) und wurde in weiteren Versuchen eingesetzt. 



 
 S e i t e  | 21 
 

 

Abbildung 11: relative Enzymaktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert des 50 mM 
Natriumacetatpuffers 

 

Abbildung 12: relative Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Reaktionstemperatur  

 

Abbildung 13: relative Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Wasserstoffperoxidkonzentration  

0

20

40

60

80

100

120

3,0 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]

pH-Wert

0

20

40

60

80

100

120

0,05 0,1 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]

Wasserstoffperoxidkonzentration [mM]



 
 S e i t e  | 22 
 
Zur Steigerung der Enzymaktivität wurden Mangansulfat und Coniferylalkohol 

zugesetzt. Die optimalen Konzentrationen betrugen hier 0,2 mM Mangansulfat 

(Abbildung 14 oben) beziehungsweise 5 µM Coniferylalkohol (Abbildung 14 

unten). Ein Vergleich der Standardassaybedingungen (4.7.1.3) mit den 

optimierten Assaybedingungen erbrachte eine Aktivitätssteigerung um 150% 

bezogen auf die Standardbedingungen (Abbildung 15). 

 

 

 

 

Abbildung 14: relative Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Mangansulfatkonzentration (oben), 
der Coniferylalkoholkonzentration (unten)  

0

20

40

60

80

100

120

0 0,05 0,1 0,2 0,5

re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]

Mangansulfatkonzentration [mM]

0

20

40

60

80

100

120

0 1 2 5 10

re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]

Coniferylalkoholkonzentration [µM]



 
 S e i t e  | 23 
 

 

Abbildung 15: relative Enzymaktivität der polyvalenten Peroxidase: Vergleich der 
Standardassaybedingungen (50 mM Natriumacetatpuffer pH 3,5, 30 °C und 0,35 mM 

Wasserstoffperoxid) mit den optimierten Bedingungen (50 mM Natriumacetatpuffer pH 4,5, 30 °C, 
2 mM Wasserstoffperoxid, 0,2 mM Mangansulfat und 5 µM Coniferylalkohol) 

 

b) Bestimmung der kinetischen Konstanten der Enzympräparation 

Zur Bestimmung der kinetischen Konstanten (4.7.7.3) wurde die 

Reaktionsgeschwindigkeit so eingestellt, dass sie während der ersten fünf 

Minuten im linearen Bereich lag. Die Proteinkonzentrationen der verwendeten 

Enzymlösung wurde mittels Bradfordassay (4.7.1.11) bestimmt. Für das Substrat 

Syringol wurden 0,01 nMol Enzym und für die restlichen Substrate wurden 

0,025 nMol Enzym für die Messungen verwendet. Das Cosubstrat 

Wasserstoffperoxid lag in allen Reaktionen mit 2 mM gegenüber 

Substratkonzentrationen von 0,01 bis 0,5 mM im Überschuss vor. Die 

Reaktionsgeschwindigkeiten wurden in Abhängigkeit der unterschiedlichen 

Substratkonzentrationen bestimmt und im Lineweaver-Burk-Diagrammm 

aufgetragen (Abbildung 16). 

In Abhängigkeit vom Substrat wurden Wechselzahlen von 993 bis 54471 s-1 

bestimmt (Tabelle 4). Die katalytischen Konstanten betrugen 0,13 bis   

3,95 108 M-1 s-1. 

 

0

20

40

60

80

100

120

Standardassay opt. Bedingungen

re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]



 
 S e i t e  | 24 
 

 

 

Abbildung 16: Lineweaver-Burk-Diagramm des gereinigten Enzyms aus Pleurotus sapidus mit 
verschiedenen Substratkonzentrationen an ABTS (oben) und Veratrylalkohol (unten) 

 

Tabelle 4: Michaelis-Menten-Konstante (Km), Wechselzahl (kcat) und katalytische Konstante 
 (kcat Km

-1) der Enzympräparation aus Pleurotus sapidus 

 Km [mM] kcat [s-1] kcat Km
-1 [108 M-1 s-1] 

Syringol 0,138 ± 0,02 54471 ± 2926 3,95 ± 0,22 
ABTS 0,177 ± 0,08 12334 ± 1330 0,70 ± 0,07 

β,β-Carotin 0,050 ± 0,00 993 ± 90 0,20 ± 0,02 
Veratrylalkohol 0,166 ± 0,01 1537 ± 173 0,13 ± 0,02 

y = 0,0118x + 0,0622
R² = 0,9981

-0,05

0

0,05

0,1

0,15

0,2

0,25

-10 -5 0 5 10 15

1 
/ R

ea
kt

io
ns

ge
sc

hw
in

di
gk

ei
t 

[(∆
E

 m
in

-1
)-1

]

1 / Substratkonzentration [(mM)-1]

y = 0,0475x + 0,4049
R² = 0,9972

-0,2

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

-15 -10 -5 0 5 10 15

1 
/ R

ea
kt

io
ns

ge
sc

hw
in

di
gk

ei
t 

[(Δ
E

 m
in

-1
)-1

]

1 / Substratkonzentration [(mM)-1]



 
 S e i t e  | 25 
 

2.1.1.4 Zellfreie Umsetzungen von Substraten 

Die gereinigte Enzympräparation aus Pleurotus sapidus besaß optimale 

katalytische Eigenschaften bei einem pH-Wert von 4,5, einer Temperatur von 

30 °C und einer Wasserstoffperoxidkonzentration von 2 mM. Mit diesen 

Bedingungen wurden Umsetzungen mit verschiedenen Ligninmodellsubstraten 

durchgeführt (4.9.1.1). 

Das Edukt Veratrylalkohol wurde durch die polyvalente Peroxidase umgesetzt 

(Abbildung 17), wobei ein neues Produkt entstand. Die Anfangskonzentration des 

Veratrylalkohols wurde innerhalb von 12 Stunden bis auf 1% ab- (Abbildung 18) 

und quantitativ zum Produkt umgebaut. 

Zur Identifizierung des Reaktionsproduktes wurden die Proben mittels 

Mikroextraktion mit Pentan/Diethylether und mittels GC-MS untersucht (4.8.3.2). 

Über einen Datenbankvergleich wurde das Produkt als Veratrumaldehyd 

(Abbildung 19 unten) identifiziert. Essigsäure war im eingesetzten Puffersystem 

(4.9.1.1) vorhanden. 

  



 
 S e i t e  | 26 
 

 

Abbildung 17: HPLC-DAD Chromatogramm einer in-vitro Umsetzung von Veratrylalkohol mit 
gereinigter polyvalenter Peroxidase aus Pleurotus sapidus, gestrichelte Linie: Blindprobe,     

graue Linie: Umsatz nach 24 h 

 

 

Abbildung 18: In-vitro Umsetzung von Veratrylalkohol mit gereinigter polyvalenter Peroxidase aus 
Pleurotus sapidus, dunkelgrau: Edukt Veratrylalkohol, hellgrau: Produkt Veratrumaldehyd 

 

  

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

0 2 4 6 8 10 12 14

E
xt

in
kt

io
n 

 [2
30

 n
m

]

Retentionszeit  [min]

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0 120 240 720

S
ub

st
ra

tk
on

ze
nt

ra
tio

n 
[g

 L
-1

]

Inkubationszeit [min]



 
 S e i t e  | 27 
 

 

 

 

Abbildung 19: GC-MS Chromatogramme der Umsetzung von Veratrylalkohol; Blindprobe (oben) 
und aktive Probe nach 48 h (unten) 

 

 



 
 S e i t e  | 28 
 
In einer weiteren Modellreaktion wurde das Edukt Coniferylalkkohol durch die 

gereinigte polyvalente Peroxidase umgesetzt. Nach einer Reaktionszeit von 

1,5 Stunden entstanden drei neue Produkte (Abbildung 20), die im Laufe der 

fortschreitenden Reaktion weiter umgesetzt  wurden (Abbildung 21). Es entstand 

ein unlösliches Produkt. 

 

 

Abbildung 20: HPLC-DAD Chromatogramm, Umsetzung von Coniferylalkohol mit einer 
gereinigten Enzympräparation aus Pleurotus sapidus, gestrichelte Linie: Blindprobe, 

hellgraue Linie: Reaktion nach 1,5 h, schwarze Linie: Reaktion nach 3,5 h 

 

 

-0,02

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0 2 4 6 8 10 12 14

E
xt

in
kt

io
n 

[2
70

 n
m

]

Retentionszeit [min]



 
 S e i t e  | 29 
 

 

Abbildung 21: Abnahme der Eduktkonzentration in einer in-vitro Umsetzung von Coniferylalkohol 
mit gereinigter polyvalenter Peroxidase aus Pleurotus sapidus, dunkelgrau: Edukt 

 

 

Lignin organosolv wurde unter Zusatz von 10% Ethanol als Suspension 

eingesetzt (4.9.1.2). Während der Umsetzung wurde die Partikelgrößenverteilung 

in der Suspension gemessen. Die Partikelgrößen in der Blindprobe wiesen zwei 

Bereiche 0,1 bis 1 µm und 10 bis 400 µm (Abbildung 22 oben) auf. In der aktiven 

Probe war bereits nach 5 Stunden eine Verschiebung des Maximums von 100 

auf 20 bis 30 µm zu detektieren (Abbildung 22 oben). Nach einer Inkubationszeit 

von 240 Stunden wurden mehr kleinere Partikel (0,1 bis 1 µm) detektiert. Die 

Menge der größeren Partikel von 200 µm war geringer, während die Anzahl der 

mittleren Partikel mit einem Durchmesser von 5 bis 40 µm anstieg (Abbildung 22 

unten). 

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0 15 30 45 60 90

S
ub

st
ra

tk
on

ze
nt

ra
tio

n 
[g

 L
-1

]

Inkubationszeit [min]



 
 S e i t e  | 30 
 

 

Abbildung 22: Partikelgrößenverteilung des Lignin organosolv (371017, Sigma) nach in-vitro-
Umsetzung: rot/grün: aktives Enzym in Doppelbestimmung, blau: inaktives Enzym; oben: nach 

5 h Reaktionszeit und unten: nach 240 h Reaktionszeit 

 

2.1.2 Rekombinantes Enzym aus Hansenula polymorpha 

Für die technische Umsetzung von Modellsubstraten wurden große Mengen 

(~ 10 bis 15 Units pro Ansatz) der polyvalenten Peroxidase benötigt. Aus 

Pleurotus sapidus wurden nur geringe Mengen des Wildtypenzyms isoliert 

(2.1.1.2). Ausgehend von der bekannten Aminosäuresequenz der polyvalenten 

Peroxidase aus Pleurotus sapidus wurden in Kooperation mit der Firma Artes® 

Biotechnology GmbH, Langenfeld rekombinante Hansenula polymorpha Stämme 

generiert (6.2). Diese wurden für die Expression und biochemische 

Charakterisierung zur Verfügung gestellt. 



 
 S e i t e  | 31 
 

2.1.2.1 Expression der polyvalenten Peroxidase 

Für die Maßstabsvergrößerung der Enzymproduktion wurde je Konstrukt ein 

Stamm in 200 mL Submerskultur überführt (4.6.2.4). Die Derepression wurde in 

zwei unterschiedlichen Medien durchgeführt. Im YNB ungepuffert/ 

Glucose/Glycerol-Medium wurde nur für einen rekombinanten Hansenula 

polymorpha Stamm eine Peroxidaseaktiviät (0,18 U L-1) nachgewiesen 

(Abbildung 23). Im YNB ungepuffert/Glycerol-Medium wurden Aktivitäten von 

0,07 U L-1 in zwei rekombinanten Hansenula polymorpha Stämmen detektiert. 

 

Abbildung 23: Enzymaktivität einer rekombinanten polyvalenten Peroxidase, verwendet wurden 
unterschiedliche Derepressionsmedien: dunkel: YNB/Glucose/Glycerol; hell: YNB/Glycerol 

 

2.1.2.2 Biochemische Charakterisierung 

Für die Charakterisierung wurden die Kulturüberstände von Hansenula 

polymorpha mittels Ultrafiltration konzentriert und zweimal mit Reinstwasser 

gewaschen (4.6.2.5). 

Zur Bestimmung des optimalen pH-Wertes wurde der Kulturüberstand mit  

Natriumacetatpuffer (50 mM) versetzt und mittels β,β-Carotin Aktivitätsassay 

analysiert. Der optimale pH-Wert betrug 2,8 (Abbildung 24 oben). Für die 

Untersuchung niedrigerer pH-Werte musste das Puffersystem gewechselt 

werden. Mit einem 100 mM Glycin/Salzsäurepuffer konnten pH-Werte bis 1,2 

0

0,02

0,04

0,06

0,08

0,1

0,12

0,14

0,16

0,18

0,2

MFaE-VP(331)-H6 MFaE-VP(339)-H6 MFaE-RB11-H6

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t (
A

B
TS

) 
[U

 L
-1

]

MFαE-VP(331)-H6 MFαE-VP(339)-H6 MFαE-RB11-H6 



 
 S e i t e  | 32 
 
untersucht werden. In diesem Puffer wurde bei pH 1,2 die höchste Aktivität 

detektiert, daher wurden alle weiteren Messungen bei diesem pH-Wert 

durchgeführt (Abbildung 24 unten).  

Bei der Bestimmung des Temperaturoptimums wurden alle verwendeten 

Lösungen jeweils fünf Minuten bei der gewünschten Temperatur vorinkubiert, 

Kulturüberstand zugefügt und die Aktivität bestimmt. Die optimale 

Reaktionstemperatur betrug 30 °C (Abbildung 25). Diese Temperatur wurde für 

alle weiteren Messungen verwendet. 

Um den Einfluss der Wasserstoffperoxidkonzentration zu bestimmen, wurden 

Konzentrationen von 0,05 bis 4 mM im Aktivitätstest eingesetzt. Höhere 

Konzentrationen führten zu stark erhöhten Blindwerten und wurden daher nicht 

weiter untersucht. Die optimale Konzentration betrug im genannten Messbereich 

4 mM (Abbildung 26 oben) und wurde in weiteren Versuchen eingesetzt. 

Eine Abhängigkeit der Enzymaktivität von Mangan wurde untersucht. Dem 

Reaktionsansatz wurde Mangansulfat zugesetzt und eine Steigerung der Aktivität 

wurde detektiert. Die optimale Konzentration betrug 0,05 mM (Abbildung 26 

unten). 

Ein Vergleich der Standardassaybedingungen (4.7.1.3) mit den optimierten 

Assaybedingungen (4.7.7.2) ergab eine Aktivitätssteigerung um den Faktor 25 

(Abbildung 27). 

 



 
 S e i t e  | 33 
 

 

  

Abbildung 24: relative Enzymaktivität in Abhängigkeit vom pH-Wert des 50 mM 
Natriumacetatpuffers (oben) beziehungsweise vom pH-Wert des 100 mM Tris-Glycin-Puffers 

(unten) 

 

Abbildung 25: relative Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Temperatur  

0

20

40

60

80

100

120

2,8 3,5 4,0 4,5 5,0 5,5 6,0 6,5re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]

pH-Wert 

0

20

40

60

80

100

120

Na-Ac. 
2,8

1,2 1,5 2 2,3 2,6 2,9

re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]

pH-Wert

0

20

40

60

80

100

120

25 30 35 40 45 50

re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]

Temperatur [°C]



 
 S e i t e  | 34 
 

 

Abbildung 26: relative Enzymaktivität in Abhängigkeit von der Wasserstoffperoxidkonzentration 
(oben) und der Mangansulfatkonzentration (unten) 

 

Abbildung 27: relative Enzymaktivität im Vergleich die Standardassaybedingungen mit den 
optimierten Bedingungen  

0

20

40

60

80

100

120

0 0,2 0,5 1,0 2,0 4,0

re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]

Wasserstoffperoxidkonzentration [mM]

0

20

40

60

80

100

120

0 0,05 0,1 0,2 0,35

re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]

Mangansulfatkonzentration [mM]

0

20

40

60

80

100

120

optimiert f. wt optimierte Bedingungen

re
la

tiv
e 

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]



 
 S e i t e  | 35 
 
Mittels SDS-PAGE (4.7.2) wurden heterolog exprimierte Proteine mit 

Molekulargewichten von 58 und 44 kDa bestimmt (Abbildung 28).  

 

Abbildung 28: SDS-PAGE der Hansenula polymorpha Überstände, konzentriert und gewaschen: 
1: Negativkontrollstamm, 2: MFα E-VP(331)-H6, 3: MFα E-VP(339)-H6, M: Proteinstandard 

(Fermentas) 

 

2.2 Sekretomanalyse von Pleurotus sapidus 
Pleurotus sapidus wurde im Weiteren auf Schlüsselenzyme des 

Lignocelluloseabbaus hin untersucht. Dazu wurde der Basidiomycet submers und 

emers auf lignocellulosehaltigen Substraten kultiviert und die sekretierten 

Enzyme über den Kulturverlauf bestimmt. 

2.2.1 Erfassung von Enzymaktivitäten als Summenparameter 

Geführt wurden jeweils drei Kulturreihen mit je drei unabhängigen biologischen 

Proben. Die Messung der Enzymaktivitäten erfolgte in Dreifachbestimmungen. 

Rapsstroh und der Rückstand einer Biogasanlage wurden als Substrate 

verwendet. Die Ernte (4.6.1.12) der Oberflächenkulturen (4.6.1.11) erfolgte nach 

28, 42, 56, 84 und 112 Tagen, die Ernte (4.6.1.10) der Flüssigkulturen (4.6.1.8) 

erfolgte nach 2, 4, 6, 8, 10, 12, 14, 16 und 18 Tagen. 

2.2.1.1 Anwendbarkeit der kombinierten Laccase/Peroxidasemessung 

mittels ABTS 

Bevor die Sekretomanalysen begonnen wurden, wurde untersucht, ob sekretierte 

Laccasen oder Peroxidasen durch Wasserstoffperoxid inhibiert werden. Der 

optimale pH-Wert der Reaktion wurde ebenfalls bestimmt. 



 
 S e i t e  | 36 
 
Hierzu wurde eine Laccase aus Trametes versicolor (Fluka, 53739) und eine 

Peroxidase aus Mycetinis scorodonius (DSM, MaxiBrightTM) bekannter Aktivität 

mit unterschiedlichen Konzentrationen an Wasserstoffperoxid versetzt und ein 

ABTS-Assay (Abbildung 29 oben) durchgeführt. Bereits nach einer Zugabe von 

0,25 mM Wasserstoffperoxid wurde eine um 10% geminderte Laccaseaktivität 

detektiert, bei einer schrittweisen Erhöhung der Konzentration an 

Wasserstoffperoxid wurde eine weitere Hemmung der Laccaseaktivität 

beobachtet (Abbildung 29 oben). Das Maximum der Peroxidaseaktivität wurde 

bei einer Wasserstoffperoxidkonzentration von 0,35 mM beobachtet. Mit weiter 

steigender Wasserstoffperoxidkonzentration fiel die Aktivität auf <70% der 

Ausgangsaktivität ab (Abbildung 29 unten). In den weiteren Bestimmungen der 

Peroxidaseaktivität wurde die optimale Wasserstoffperoxidkonzentration von 

0,35 mM verwendet. 

 

0

50

100

150

200

250

300

350

0 0,25 0,5 0,75 1 1,25 1,5

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t  
[U

 L
-1

]

Wasserstoffperoxidkonzentration  [mM]



 
 S e i t e  | 37 
 

 

Abbildung 29: Abhängigkeit der Laccaseaktivität von verschiedenen 
Wasserstoffperoxidkonzentrationen (oben) und Abhängigkeit der Peroxidaseaktivität von 

verschiedenen Wasserstoffperoxidkonzentrationen (unten) 

 

In einer kombinierten Messung von Laccase und Peroxidase musste im Fall der 

Laccasebestimmung sichergestellt sein, dass kein Wasserstoffperoxid in der 

Reaktion enthalten war. Aus diesem Grund wurde eine Laccase aus Trametes 

versicolor (Fluka, 53739) bekannter Aktivität mit unterschiedlichen 

Konzentrationen an Catalase versetzt und ein ABTS-Assay (4.7.1.1) 

durchgeführt. Bei einem Catalasegehalt von 300 U pro Reaktionsansatz wurde 

keine Hemmung der Laccase festgestellt. Höhere Catalasegehalte führten zu 

einem Abfall der Laccaseaktivität (Abbildung 30 oben). In einem weiteren 

Versuch wurde die Wirksamkeit der Catalase mit Hilfe einer Peroxidase aus 

Mycetinis scorodonius (DSM, MaxiBrightTM) bekannter Aktivität überprüft. 

Verschiedene Wasserstoffperoxidkonzentrationen (0,15 bis 1 mM) wurden mit 

300 U Catalase versetzt und 2 Minuten inkubiert. Eine Peroxidase bekannter 

Aktivität wurde zugefügt und ein ABTS-Assay durchgeführt (Abbildung 30 unten). 

0

50

100

150

200

250

300

350

400

450

0 0,15 0,25 0,35 0,5 0,75 1 1,25 1,5

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t  
[U

 L
-1

]

Wasserstoffperoxidkonzentration  [mM]



 
 S e i t e  | 38 
 

 

 

Abbildung 30: Abhängigkeit der Laccaseaktivität von verschiedenen Catalasegehalten (oben) und 
Bestimmung der Peroxidaseaktivität unter Verwendung von 300 U Catalase pro Ansatz und 

verschiedenen Wasserstoffperoxidkonzentrationen (unten) 

 

 

0

50

100

150

200

250

0 300 450 900

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t  
[U

 L
-1

]

Catalasegehalt pro Assay [U]

0

20

40

60

80

100

120

140

0 0 0,15 0,35 0,5 0,65 0,85 1

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t  
[U

 L
-1

]

Wasserstoffperoxidkonzentration  [mM]

keine Catalase
0,35 mM H2O2



 
 S e i t e  | 39 
 
Zur Bestimmung des optimalen pH Werts der Reaktion wurde Kulturüberstand 

von Submerskulturen mit unterschiedlichen Substraten im ABTS Assay 

eingesetzt. Verwendet wurden verschieden Natriumacetatpuffer mit einer 

Molarität von 50 mM und den pH-Werten 3,0; 3,5; 4,0; 4,5 und 5,0. Für jeden 

Ansatz wurden 100 µL Puffer verwendet. Nach der Reaktion wurde der pH-Wert 

des Reaktionsansatzes bestimmt. Der optimale pH Wert im Assay betrug für die 

Peroxidaseaktivität pH 3,35, für die Laccase zwischen 3,28 und 3,35 (Abbildung 

31). In den nachfolgenden Messungen wurde ein pH Wert von 3,3 eingestellt. 

Dies geschah durch die Zugabe von 100 µL 50 mM Natriumacetatpuffer pH 3,5 

pro Messansatz. 

 

 

 

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

3,28 3,35 3,79 4,18 4,76

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t  
[U

 L
-1

]

pH Wert im Assay



 
 S e i t e  | 40 
 

 

Abbildung 31: Abhängigkeit der Laccase- und Peroxidaseaktivitätaktivität von verschiedenen pH-
Werten des 50 mM Natriumacetat-Puffers; Submerskulturen mit den Substraten Rückstand 

Biogasanlage (oben) und Rapsstroh (unten); schwarz: Laccaseaktivität, grau: Peroxidaseaktivität 

 

 

2.2.1.2 Oberflächenkulturen auf dem Rückstand einer Biogasanlage 

Bei der Kultivierung von Pleurotus sapidus auf dem Rückstand einer 

Biogasanlage wurden bereits nach 14 Tagen die ersten Ansätze zur 

Fruchtkörperbildung beobachtet (Abbildung 32 a). Während der weiteren 

Kulturdauer wurde kontinuierlich die Bildung neuer Fruchtkörper beobachtet 

(Abbildung 32 b und c). 

 

Abbildung 32: Pleurotus sapidus in Emerskultur mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; a: nach 14 Tagen, b: nach 28 Tagen und c: nach 56 Tagen  

0

10

20

30

40

50

60

70

80

90

3,28 3,35 3,79 4,18 4,76

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t  
[U

 L
-1

]

pH Wert im Assay



 
 S e i t e  | 41 
 
Nach 28 Tagen wurde ein Proteingehalt (4.7.1.11) von 50 mg L-1 und während 

der restlichen Kulturdauer durchgehend ein Proteingehalt von ~ 40 mg L-1 

detektiert (Abbildung 33).  

 

Abbildung 33: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; Proteinkonzentration während des Kulturverlaufs 

 

Nach 28 Tagen wurde ein Wasserstoffperoxidgehalt (4.7.1.10) von 5 mg L-1 

detektiert, der bis auf 9 mg L-1 (42 Kulturtage, Abbildung 34) anstieg. Im weiteren 

Kulturverlauf fiel der Wasserstoffperoxidgehalt kontinuierlich ab. 

Die Laccaseaktivität (4.7.1.1) betrug während der ersten 28 Kulturtage  

~ 135 U L-1 und fiel im späteren Kulturverlauf ab (Abbildung 35). 

35

40

45

50

55

60

28 42 56 84 112

P
ro

te
in

ko
nz

en
tra

tio
n 

 [m
g 

L-1
]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 42 
 

 

Abbildung 34: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; Wasserstoffperoxidkonzentration während des Kulturverlaufs 

 

 

Abbildung 35: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; Laccaseaktivität während des Kulturverlaufs 

0

2

4

6

8

10

28 42 56 84 112

W
as

se
rs

to
ffp

er
ox

id
ko

nz
en

tra
tio

n 
 [m

g 
L-1

]

Kulturdauer  [Tage]

0

20

40

60

80

100

120

140

160

28 42 56 84 112

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t  
[U

 L
-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 43 
 
Nach 28 Kulturtagen wurde eine Peroxidaseaktivität (4.7.1.1) von ~ 6 U L1 

detektiert. Während der nächsten 84 Tage war keine Peroxidaseaktivität mehr 

nachweisbar und nach 112 Kulturtagen wurde eine Aktivität von 2,5 U L-1 

bestimmt (Abbildung 36 oben). Der Aktivitätsverlauf der gesondert vermessenen 

Manganperoxidasen (4.7.1.2) und der polyvalenten Peroxidasen (4.7.1.3) 

unterschieden sich deutlich vom Verlauf des Summenparameters. Die Aktivität 

der Manganperoxidasen wies einen wellenförmigen Verlauf mit zwei Maxima 

nach 28 (350 U L-1) und 56 Kulturtagen (160 U L-1) auf (Abbildung 36 Mitte). Die 

Aktivität der polyvalenten Peroxidasen wurde während den ersten 56 Kulturtagen 

mit einer Aktivität von ~0,75 bis 0,85 U L-1 bestimmt (Abbildung 36 unten). Im 

weiteren Kulturverlauf wurden Aktivitäten < 0,2 U L-1 detektiert. 

 

 

 

 

 

0

1

2

3

4

5

6

7

28 42 56 84 112

E
nz

ym
ak

tiv
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[U

 L
-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 44 
 

 

 

 

 

Abbildung 36: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; oben: Peroxidaseaktivität als Summenparameter (ABTS); Mitte: Manganperoxidase-

Aktivität und unten: polyvalente Peroxidase-Aktivität  

 

0

50

100

150

200

250

300

350

400

28 42 56 84 112

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[U

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-1

]

Kulturdauer  [Tage]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

0,9

1,0

28 42 56 84 112

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t  
[U

 L
-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 45 
 
Esteraseaktivität (4.7.1.4) wurde nach 84 Kulturtagen mit einem Maximum von 

12 U L-1 und während der weiteren Kultivierung im Bereich von 7 bis zu 9 U L-1 

bestimmt. Die höchste Lipaseaktivität (4.7.1.8) wurde am Kulturtag 28 (5 U L-1) 

detektiert (Abbildung 37). Im weiteren Kulturverlauf fiel die Lipaseaktivität ab. 

 

 

Abbildung 37: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; Esteraseaktivität (grau) und Lipaseaktivität (schraffiert) 

 

Sowohl die Aktivitäten der Cellulasen (4.7.1.6), als auch die der Xylanasen 

(4.7.1.7) wurden mit nahezu gleichbleibender Aktivität detektiert. Die 

Cellulaseaktivitäten wurden zu 30 bis 40 U L-1 und die Xylanaseaktivität zu 120 

bis 130 U L-1 bestimmt (Abbildung 38). 

 

0

2

4

6

8

10

12

14

28 42 56 84 112

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-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 46 
 

 

Abbildung 38: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; Cellulase- (hellgrau) und Xylanaseaktivität (gekreuzt) 

 

 

2.2.1.3 Oberflächenkulturen auf Rapsstroh 

Bei der Kultivierung von Pleurotus sapidus auf Rapsstroh wurden nach 28 Tagen 

die ersten Ansätze zur Fruchtkörperbildung beobachtet (Abbildung 39 a). 

Während der weiteren Kulturdauer wurde kontinuierlich das Entstehen neuer 

Fruchtkörper beobachtet (Abbildung 39 b und c). 

 

Abbildung 39: Pleurotus sapidus in Emerskultur mit Rapsstroh als Substrat; a: nach 28 Tagen, 
b: nach 56 Tagen und c: nach 84 Tagen  

0

20

40

60

80

100

120

140

160

28 42 56 84 112

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t  
[U

 L
-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 47 
 
Der Proteingehalt der Extrakte (4.7.1.11) wurde während der ersten 84 

Kulturtage zu ~60 mg L-1 bestimmt. Danach stieg die Proteinkonzentration 

innerhalb von 28 weiteren Tagen auf ~ 100 mg L-1 (Abbildung 40).  

 

Abbildung 40: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat; 
Proteinkonzentration der Kulturextrakte während des Kulturverlaufs 

 

Nach 28 Tagen wurde eine Wasserstoffperoxidkonzentration (4.7.1.10) von 

9 mg L-1 detektiert. Ein weiteres Maximum wurde nach 56 Kulturtagen mit  

5 mg L-1 (Abbildung 41) bestimmt. Im weiteren Kulturverlauf fiel der 

Wasserstoffperoxidgeahlt kontinuierlich ab. 

Das Maximum der Laccaseaktivität (23 U L-1, 4.7.1.1) wurde nach 28 Kulturtagen 

detektiert (Abbildung 42).  

 

0

20

40

60

80

100

120

28 42 56 84 112

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 [m
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L-1
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Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 48 
 

 

Abbildung 41: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat; 
Wasserstoffperoxidkonzentration während des Kulturverlaufs 

 

Abbildung 42: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat; Laccaseaktivität 
während des Kulturverlaufs 

 

0

2

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6

8

10

28 42 56 84 112

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L-1

]

Kulturdauer  [Tage]

0

5

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20

25

30

28 42 56 84 112

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]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 49 
 
Die höchste Peroxidaseaktivität (1,3 U L-1, 4.7.1.1) wurde nach 42 Kulturtagen, 

ein weiteres Maximum nach 84 Kulturtagen detektiert (0,7 U L-1, Abbildung 43 

oben). Der Aktivitätsverlauf der gesondert vermessenen Manganperoxidase- 

(4.7.1.2) und polyvalenten Peroxidase-Aktivität (4.7.1.3) unterschied sich vom 

Verlauf des Summenparameters. Beide Peroxidase-Aktivitäten zeigten Maxima 

an den gleichen Kulturtagen (56 und 112). Manganperoxidase-Aktivität wurde 

während der Kultivierung zu ~5 - 9 U L-1 bestimmt (Abbildung 43 Mitte). Die 

maximale Aktivität der polyvalenten Peroxidasen wurde während der Kultivierung 

bei 0,4 und 0,7 U L-1 detektiert (Abbildung 43 unten). 

 

 

 

0

0,2

0,4

0,6

0,8

1

1,2

1,4

28 42 56 84 112

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-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 50 
 

 

 

 

Abbildung 43: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat; 
oben: Peroxidaseaktivität als Summenparameter (ABTS); Mitte: Manganperoxidase-Aktivität und 

unten: polyvalente Peroxidase-Aktivität 

 

0

1

2

3

4

5

6

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9

10

28 42 56 84 112

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]

Kulturdauer  [Tage]

0,0

0,1

0,2

0,3

0,4

0,5

0,6

0,7

0,8

28 42 56 84 112

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[U

 L
-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 51 
 
Maxima der Esteraseaktivität (4.7.1.4) wurden an den Tagen 28 (18 U L-1) und 56 

(20 U L-1) detektiert (Abbildung 44). Lipaseaktivität (4.7.1.8) wurde während der 

gesamten Kultivierung gleichbleibend mit ~ 2 U L-1 bestimmt (Abbildung 44). 

 

Während der gesamten Kulturdauer wurden Cellulaseaktivitäten (4.7.1.6) von 

~ 25 U L-1 und Xylanaseaktivitäten (4.7.1.7) von ~ 110 U L-1 detektiert (Abbildung 

45). 

 

 

 Abbildung 44: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat; Esteraseaktivität 
(grau) und Lipaseaktivität (schraffiert)  

 

0

2

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6

8

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14

16

18

20

22

28 42 56 84 112

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U

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-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 52 
 

 

Abbildung 45: Emerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat; Cellulase- 
(hellgrau) und Xylanaseaktivität (gekreuzt) 

 

 

2.2.1.4 Submerskulturen mit dem Rückstand einer Biogasanlage 

Der pH-Wert stieg während des Kulturverlaufs an und erreichte ab dem zehnten 

Kulturtag ein Plateau bei einem pH-Wert von 6,7 (Abbildung 46). Der 

Wasserstoffperoxidgehalt (4.7.1.10) in den Kulturen fiel in den ersten sechs 

Tagen ab und erreichte an Tag zehn das Maximum mit 12 mg L-1 (Abbildung 46). 

Der Proteingehalt (4.7.1.11) der Kulturen stieg während der ersten vier Kulturtage 

auf 120 mg L-1. Das Maximum wurde mit 135 mg L-1 am zwölften Tag detektiert 

(Abbildung 47).  

 

0

20

40

60

80

100

120

28 42 56 84 112

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[U

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-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 53 
 

 

Abbildung 46: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; pH-Wert und Wasserstoffperoxidkonzentration während des Kulturverlaufs 

 

Bis zum Maximum am achten Kulturtag stieg die Laccaseaktivität (1880 U L-1, 

4.7.1.1) an und blieb für sechs Tage nahezu konstant. Danach fiel die Aktivität 

bis zum vierzehnten Kulturtag stark ab (920 U L-1), um im weiteren Kulturverlauf 

erneut anzusteigen (Abbildung 48). 

0

2

4

6

8

10

12

14

6,20

6,30

6,40

6,50

6,60

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6,90

7,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

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L-1

]

pH
-W

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Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 54 
 

 

Abbildung 47: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; Proteinkonzentration während des Kulturverlaufs 

 

 

Abbildung 48: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; Laccaseaktivität während des Kulturverlaufs 

60

70

80

90

100

110

120

130

140

2 4 6 8 10 12 14 16 18

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L-1
]

Kulturdauer  [Tage]

0

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2 4 6 8 10 12 14 16 18

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[U

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-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 55 
 
Die höchste Peroxidaseaktivität (980 U L-1, 4.7.1.1) wurde am achtzehnten 

Kulturtag detektiert. Weitere Maxima wurde am zweiten und zwölften Tag (220 

bzw. 470 U L-1) beobachtet (Abbildung 49 oben). Der Aktivitätsverlauf der 

gesondert vermessenen Manganperoxidasen (4.7.1.2) unterschied sich vom 

Verlauf des Summenparameters. Das Aktivitätsmaximum wurde am zweiten 

Kulturtag (160 U L-1) detektiert. Im weiteren Kulturverlauf fiel die Aktivität ab und 

zwei weitere Aktivitätsmaxima wurden mit 40 (Tag 14) und 30 U L-1 (Tag 18) 

bestimmt (Abbildung 49 Mitte). Die Aktivität der polyvalenten Peroxidasen 

(4.7.1.3) dagegen wies zwei Maxima auf: am achten Kulturtag mit 22 U L-1 und 

am sechzehnten Kulturtag mit 10 U L-1 (Abbildung 49 unten). 

 

 

 

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

2 4 6 8 10 12 14 16 18

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[U

 L
-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 56 
 

 

 

 

Abbildung 49: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat; oben: Peroxidaseaktivität als Summenparameter (ABTS), Mitte: Manganperoxidase-

Aktivität und unten: polyvalente Peroxidase-Aktivität 

 

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

2 4 6 8 10 12 14 16 18

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[U

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]

Kulturdauer  [Tage]

0

5

10

15

20

25

2 4 6 8 10 12 14 16 18

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[U

 L
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]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 57 
 
Die Esteraseaktivität (4.7.1.4) stieg während der ersten acht Kulturtage stark an 

und erreichte mit 100 U L-1 ein Maximum (Abbildung 50). Die Lipaseaktivität 

(4.7.1.8) stieg während der ersten zehn Kulturtage stark an und erreichte mit 

170 U L-1 ein erstes Maximum.  

 

 

Abbildung 50: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat: Esteraseaktivität (grau) und Lipaseaktivität (schraffiert) 

 

Die Cellulaseaktivität (4.7.1.6) stieg während der ersten zehn Kulturtage bis zu 

einem Maximum von 170 U L-1 (Abbildung 51) stetig an. Xylanaseaktivität 

(4.7.1.7) wurde erst ab dem vierten Kulturtag detektiert (570 U L-1) (Abbildung 

51). 

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

200

220

2 4 6 8 10 12 14 16 18

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-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 58 
 

 

Abbildung 51: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Rückstand einer Biogasanlage als 
Substrat: Cellulase- (hellgrau) und Xylanaseaktivität (gekreuzt) 

 

 

2.2.1.5 Submerskulturen mit Rapsstroh 

Der pH-Wert stieg während des Kulturverlaufs an und erreichte ab dem zehnten 

Kulturtag ein Plateau bei einem pH-Wert von 6,8 (Abbildung 52). Der 

Wasserstoffperoxidgehalt (4.7.1.10) in der Kultur erreichte das Maximum an Tag 

zwölf mit 30 mg L-1. Während der weiteren Kultivierung wurden Konzentrationen 

von fünf bis zwölf mg L-1 Wasserstoffperoxid detektiert (Abbildung 52). Der 

Proteingehalt (4.7.1.11) der Kulturen stieg bis zum zehnten Kulturtag auf 

120 mg L-1 an (Abbildung 53).  

0

100

200

300

400

500

600

700

800

2 4 6 8 10 12 14 16 18

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[U

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]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 59 
 

 

Abbildung 52: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat;                    
pH-Wert und Wasserstoffperoxidgehalt während des Kulturverlaufs 

 

 

Abbildung 53: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat; 
Proteinkonzentration während des Kulturverlaufs  

0

5

10

15

20

25

30

35

5,80

6,00

6,20

6,40

6,60

6,80

7,00

0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20

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L-1
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pH
-W

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Kulturdauer  [Tage]

0

20

40

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2 4 6 8 10 12 14 16 18

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lt [
m

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L-1

]

Kulturdauer [Tage]



 
 S e i t e  | 60 
 
Das Maximum der Laccaseaktivität (4.7.1.1) wurde am zweiten Kulturtag mit 

950 U L-1 detektiert. Danach fiel die Aktivität bis zum achten Kulturtag ab 

(230 U L-1) (Abbildung 54). 

 

Abbildung 54: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat; 
Laccaseaktivität während des Kulturverlaufs 

 

Maximale Peroxidaseaktivität (4.7.1.1) wurde ebenfalls am zweiten Kulturtag mit 

76 U L-1 detektiert (Abbildung 55 oben). Der Aktivitätsverlauf der gesondert 

vermessenen Manganperoxidasen (4.7.1.2) und polyvalenten Peroxidasen 

(4.7.1.3) unterschied sich vom Verlauf des Summenparameters. Die 

Manganperoxidaseaktivität war am zweiten Kulturtag (3,6 U L-1) und an den 

Tagen zehn bis vierzehn maximal (2,4 U L-1). Die Aktivität der polyvalenten 

Peroxidasen stieg während der ersten acht Kulturtage stetig (2,7 bis 8,2 U L-1) an 

(Abbildung 55 unten). 

0

100

200

300

400

500

600

700

800

900

1000

2 4 6 8 10 12 14 16 18

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[U

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-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 61 
 

 

 

Abbildung 55: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat; oben: 
Peroxidaseaktivität als Summenparameter (ABTS); unten: Manganperoxidase-Aktivität 

(dunkelgrau) und polyvalente Peroxidase-Aktivität (gepunktet) während des Kulturverlaufs  

 

0

10

20

30

40

50

60

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2 4 6 8 10 12 14 16 18

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Kulturdauer  [Tage]

0,0

1,0

2,0

3,0

4,0

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2 4 6 8 10 12 14 16 18

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[U

 L
-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 62 
 
Die Esteraseaktivität (4.7.1.4) stieg während der ersten sechs Kulturtage stark an 

und erreichte mit 160 U L-1 am sechsten Kulturtag ein Maximum (Abbildung 56). 

Die Lipaseaktivität (4.7.1.8) stieg während der Kultivierung an und erreichte ihr 

Maximum am vierzehnten Kulturtag (93 U L-1) (Abbildung 56). 

 

Abbildung 56: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat: 
Esteraseaktivität (grau) und Lipaseaktivität (schraffiert) 

 

Das Maximum der Cellulaseaktivität (4.7.1.6) wurde an den Tagen sechs und 

acht (140 U L-1) (Abbildung 57) detektiert. Im weiteren Kulturverlauf lag die 

Aktivität bei 70 bis 120 U L-1. Xylanaseaktivität (4.7.1.7) wurde erst am vierten 

Kulturtag detektiert (750 U L-1) und stieg bis zum Maximum an Tag sechs an 

(1030 U L-1). Im weiteren Kulturverlauf fiel die Aktivität der Xylanasen 

kontinuierlich ab und wurde ab dem vierzehnten Kulturtag nicht mehr detektiert 

(Abbildung 57). 

 

0

20

40

60

80

100

120

140

160

180

2 4 6 8 10 12 14 16 18

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-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 63 
 

 

Abbildung 57: Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit Rapsstroh als Substrat:          
Cellulase- (hellgrau) und Xylanaseaktivität (gekreuzt) 

 

 

2.2.1.6 Zellfreie Umsetzung von Rapsstroh 

Bei den Umsetzungen von Rapsstroh mit Überständen von Submerskulturen 

wurde die Glucosefreisetzung (4.7.1.12) als Indikator für den Abbau der 

Lignocellulose verwendet. In den eingesetzten Kulturüberständen wurde keine 

Glucose detektiert. Die optimale Reaktionstemperatur wurde bei 40 °C 

festgestellt (Abbildung 58). In weiteren zellfreien Umsetzungen wurden die 

Überstände in Laufe der Inkubationszeit gewechselt (dynamischer Ansatz, 

4.9.2.1). Die größte Glucosemenge wurde bei einem Wechsel zwischen den 

Überständen der Tage 3, 6 und 9 detektiert (Abbildung 59). 

 

0

200

400

600

800

1000

1200

2 4 6 8 10 12 14 16 18

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[U

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-1

]

Kulturdauer  [Tage]



 
 S e i t e  | 64 
 

 

Abbildung 58: Umsetzung von feingemahlenem Rapsstroh mit Überständen von Pleurotus 
sapidus, detektiert wurde die freigesetzte Glucose in Abhängigkeit von der Inkubationstemperatur 

 

 

Abbildung 59: Umsetzung von feingemahlenem Rapsstroh mit Überständen von Pleurotus 
sapidus, detektiert wurde die freigesetzte Glucose in Abhängigkeit von den verwendeten 

Überständen 

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

24 30 40 50

G
lu

co
se

ko
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tra

tio
n 

pr
o 

ei
ng

es
et

zt
er

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ge
 

[m
g 

µg
-1

]

Inkubationstemperatur [°C]

0,00

0,02

0,04

0,06

0,08

0,10

Tag 3 Tag 6 Tag 9 Tag 12 Tag 3 und 6 Tag 3, 6 und 9 Tag 3, 6, 9 
und 12

G
lu

co
se

ko
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en
tra

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n 

pr
o 

ei
ng

es
et

zt
er

 P
ro

te
in

m
en

ge
  

[m
g 

µg
-1

]

verwendete Überstände



 
 S e i t e  | 65 
 
Nach viertägiger Inkubationsdauer (4.9.2.1) im dynamischen Ansatz wurde das 

Rapsstroh extrahiert (4.9.4). Die Extrakte wurden mittels HPSEC untersucht 

(4.8.2.2). Sowohl bei dem Extraktblindwert als auch bei der Umsetzung mit 

hitzeinaktiviertem Kulturüberstand wurden lösliche Fragmente im Bereich von 

neun bis elf Minuten beobachtet. Gemäß der durchgeführten Kalibrierung 

besaßen die gelösten Fragmente Größen von ~ 50 bis ~ 150 kDa (Abbildung 60). 

Bei aktiven Überständen waren geringe Mengen löslicher Fragmente bereits ab 

sechs Minuten zu detektieren. Auch die Konzentration der löslichen Fragmente 

war in den aktiven Proben höher (Abbildung 61 oben). In den 

Doppelbestimmungen zeigten beide aktiven Proben ein identisches HPSEC-

Profil (Abbildung 61 unten). 

 

 

Abbildung 60: HPSEC-Chromatogramm von Polystyrolstandardsubstanzen, die Detektion erfolgte 
bei 280 nm 

 



 
 S e i t e  | 66 
 

 

 

 

Abbildung 61: HPSEC-Elutionsprofil eines in-vitro Verdaus von Rapsstroh mit Kulturüberständen 
von Pleurotus sapidus; oben: hellgrau: Extraktionsblindwert, dunkelgrau: inaktive Überstände, 
gepunktet: aktive Überstände; unten: grau: Extraktionsblindwert, gepunktet/dunkelgrau: aktive 

Überstände (Doppelbestimmung) 

 

-0,02

-0,01

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0 2 4 6 8 10 12 14

E
xt

in
kt

io
n 

(λ
= 

22
0 

nm
)

Retentionszeit [min]

-0,02

-0,01

0

0,01

0,02

0,03

0,04

0 2 4 6 8 10 12 14

E
xt

in
kt

io
n 

(λ
= 

22
0n

m
)

Retentionszeit [min]



 
 S e i t e  | 67 
 

2.2.2 Zweidimensionale elektrophoretische Analyse des Sekretoms 

2.2.2.1 Optimierung der Probenvorbereitung und Visualisierung von 

Proteinmustern 

Die Probenvorbereitung für eine elektrophoretische Trennung von 

Proteingemischen muss für jedes Kultursystem optimiert werden. Daher wurden 

zunächst drei verschiedene Parameter untersucht, um eine gleichbleibende 

Probenqualität zu gewährleisten. 

a) Degradation von Proteinen während der Probenvorbereitung 

Eine Degradation von Proteinen lässt sich auf Peptidaseaktivitäten zurückführen. 

Bei einer Kulturdauer von 30 Tagen wurde in Submerskulturen von Pleurotus 

sapidus Peptidaseaktivitäten von 30 bis 350 U L-1 bestimmt (4.7.1.5). Das 

Maximum der Aktivität wurde am sechsten Kulturtag detektiert (350 U L-1) 

(Abbildung 62). 

 

Abbildung 62: Peptidaseaktivität in Submerskulturen von Pleurotus sapidus mit dem Substrat 
Rapsstroh während des Kulturverlaufs 

 

 

0

50

100

150

200

250

300

350

400

2 3 6 9 12 15 18 21 24 27 30

E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
U

 m
L-1

]

Kulturdauer [Tage]



 
 S e i t e  | 68 
 
Mit einem komplexen Peptidaseinhibitorcocktail (Mix 1, 4.6.1.5) wurde die 

Peptidaseaktivität vollständig gehemmt (Abbildung 63). Eine Verdünnung des 

komplexen Inhibitors von 1:5 (Abbildung 63) reichte hierfür nicht mehr aus. Eine 

Wirkung von Pepstatin wurde nicht detektiert. Durch das Einsetzen 

verschiedener Inhibitorkonzentrationen und –kombinationen wurde der Mix weiter 

optimiert. Der optimale Peptidaseinhibitor (Mix 2, Abbildung 63, 4.6.1.5) wurde 

bei den Sekretomstudien durchgehend eingesetzt. 

 

Abbildung 63: relative Peptidaseaktivität bei Zusatz von verschiedenen Peptidaseinhibitoren 
bezogen auf die Aktivität ohne Inhibitoren und Vergleich verschiedener Konzentrationen an 

Peptidaseinhibitorgemischen (Mix 1, Mix 2 siehe 4.6.1.5) 

 

b) Konzentrierung der extrazellulären Proteine 

Zur Gewährleistung einer ausreichenden Proteinmenge wurden die 

extrazellulären Enzyme mittels Ultrafiltration (UF) konzentriert. Zwei zur 

Verfügung stehende Ultrafiltrationseinheiten (4.4) mit einem Größenausschluss 

von 10 kDa wurden auf ihre Effizienz getestet. Bei der Amicon® 

Ultrafiltrationseinheit wurde eine Filterkuchenbildung auf der Membran 

beobachtet. Dies führte zu einem Proteinverlust von 40%. Bei der Macrosep® 

Einheit wurde lediglich ein Verlust von 7% bestimmt (Tabelle 5). 

0

20

40

60

80

100

120

re
la

tiv
e 

 E
nz

ym
ak

tiv
itä

t [
%

]



 
 S e i t e  | 69 
 

Tabelle 5: Vergleich zweier Ultrafiltrationsmodule an Hand des Protein- und Phenolgehaltes 
aufgearbeiteter Submerskulturüberstände 

 
Amicon Ultra® Macrosep® 

 

Proteinmenge 
[µg] 

Phenole 
[µg Gallussäure-

equivalent] 
Proteinmenge 

[µg] 
Phenole 

[µg Gallussäure-
equivalent] 

Ausgangs-
menge 1150 µg 240 µg  1150 µg 240 µg  
Retentat 
der UF 687 µg 115 µg  1058 µg 208 µg  
Permeat 
der UF 3,4 µg 40 µg 5,8 µg 17 µg 

   
  

 

 

c) Proteinfällung 

Proteinextrakte, die wie unter 4.6.1.10 und 4.6.1.12 beschrieben erhalten 

wurden, wiesen eine tiefbraune Färbung auf. Zur Entfernung störender 

Substanzen wurden die Proteine zunächst gefällt. Zwei Fällungsmethoden 

wurden hierzu miteinander verglichen. Ein Extrakt einer Emerskultur nach 

vierzehn Tagen wurde aufgearbeitet (4.6.1.12) und die Proteine gefällt (4.7.5.1 

und 4.7.5.2). Beide Präzipitate wiesen eine starke Braunfärbung auf. 

Nach der Trichloressigsäure-Fällung wurde im Elektropherogramm eine vertikale 

Schlierenbildung über den gesamten Molekülgrößenbereich im sauren pI-Bereich 

beobachtet (Abbildung 64). Bei der Methanol/Chlorform-Fällung wurden 

dagegen, neben einer geringen Schlierenbildung im oberen 

Molekülmassenbereich des sauren pI-Bereichs, zweidimensional getrennte 

Proteine detektiert (Abbildung 65). 



 
 S e i t e  | 70 
 

 

Abbildung 64: zweidimensionales Elektropherogramm extrazellulärer Enzyme einer Pleurotus 
sapidus Emerskultur auf Rapsstroh, Extrakte nach 14 Kulturtagen, mit Silber gefärbt; nach 

Ultrafiltration und Trichloressigsäure-Fällung (4.7.5.1) 

 

 

Abbildung 65: zweidimensionales Elektropherogramm extrazellulärer Enzyme einer Pleurotus 
sapidus Emerskultur auf Rapsstroh: Extrakte nach 14 Kulturtagen, mit Silber gefärbt; nach 

Ultrafiltration und Methanol/Chloroform Fällung (4.7.5.2) 
 

kDa pI   3,0  6,0

200

119

66

43

29

kDa pI   3,0  6,0

200

119

66

43

29



 
 S e i t e  | 71 
 
 

2.2.2.2 Übersichtsanalyse von Oberflächenkulturen auf Rapsstroh 

Die Emerskulturen von Pleurotus sapidus wurden am Erntetag extrahiert 

(4.6.1.12) und aufgearbeitet (4.7.5.2). Nach zwei Wochen Inkubationszeit, waren 

wenige Spots im niederen Molekulargewichtsbereich (~ 35 kDa) zu detektieren 

(Abbildung 66, oben links). Nach weiteren zwei Wochen waren zusätzliche Spots 

im mittleren (~ 50 kDa) und niederen Molekulargewichtsbereich (~ 29 kDa) zu 

detektieren. Im späteren Kulturverlauf (42 und 56 Tage) wurden insgesamt mehr 

Proteinspots nachgewiesen (Abbildung 66 unten). Die Schlierenbildung im 

gesamten Molekülgewichtsbereich des sauren pI-Bereichs wurde im Kulturverlauf 

stärker (Abbildung 66). Die Proteinspots waren im pI- Bereich von drei bis sechs 

zu finden und wiesen eine Größenverteilung von 30 bis 100 kDa (Tag 42) und 30 

bis 60 kDa (Tag 56) auf. 

  



 
 S e i t e  | 72 
 

Abbildung 66: zweidimensionale Elektropherogramme extrazellulärer Enzyme von Pleurotus 
sapidus: Extrakte nach 14, 28, 42 und 56 Kulturtagen, mit Colloidal-Coomassie gefärbt 

 

2.2.2.3 Übersichtsanalyse von Submerskulturen mit Rapsstroh 

Bei der Kultivierung von Pleurotus sapidus in Schüttelkulturen mit Rapsstroh als 

Substrat wurde der neunte Kulturtag zur Übersichtsanalyse ausgewählt. Aus dem 

zweidimensionalen Elektropherogramm wurden insgesamt 30 Spots ausgewählt 

und diese mittels ESI-MS/MS partiell de novo sequenziert (Protagen AG, 

Abbildung 67). Von den 30 ausgewählten Proteinspots wurden 163 

Peptidsequenzen generiert (siehe 6.3). Über Homologievergleiche (BLAST-

Datenbank-Recherche) wurden Enzyme, die am Lignocelluloseabbau beteiligt 

sind, identifiziert. Die in der Übersichtsprobe enthaltenen Proteine gehörten zu 

den Proteinfamilien der Oxidoreduktasen, Peptidasen und Esterasen (Tabelle 6). 



 
 S e i t e  | 73 
 

 

Abbildung 67: zweidimensionales Elektropherogramm extrazellulärer Enzyme von Pleurotus 
sapidus Submerskultur auf Rapsstroh, Extrakt nach 9 Kulturtagen, Auswahl von 30 Proteinspots 

zur massenspektrometrischen Analyse 

 

  



 
 S e i t e  | 74 
 

Tabelle 6: Proteinidentifizierung anhand von Peptidsequenz-Datenbankrecherchen; (*)Protein 
Blast NCBI (Altschul et al. 1997) und MS Blast EMBL (Shevchenko et al. 2001); ≠: Peptide 

wurden Proteinen unbekannter Funktion zugeordnet; Sequenzdaten siehe 6.3 

Spotnummer Identifizierte Proteine/Homologien Homologie 

126-01* Laccase 2, P. sapidus 100% 

126-02 Arylalkoholoxidase Vorläufer, P. eryngii 94% 

126-03* Laccase 2, P. sapidus 92% 

126-04 Xanthophyllester-Lipase Vorläufer, P. sapidus 88 - 100% 

126-05 Serinprotease aus X. campestris 75 - 100% 

126-06* Laccase Untereinheit POXA 3a/b, P. ostreatus 84 – 92% 

126-07 ≠ ≠ 
126-08 ≠ ≠ 

126-09 Phosphatidylglycerol spezifische Phospholipase C, 
T. stipitatus 74% 

126-10 Alkoholoxidase, P. glucozyma, P. trehalophila 75% 

126-11 Peptidyl-Lysyl-Metallendopeptidase, P. ostreatus 93% 

126-12 div. Peptidasen, V. vulnificus 77% 

126-13 Methanoldehydrogenase, Acinetobacter sp. 66 – 85% 

126-14 Serin/Threonin-Kinase, O. sativa 75  – 100% 

126-15 ≠ ≠ 

126-16 Laccase 2, P. sapidus 75 – 85% 

126-17 Laccase, P. ostreatus 90 – 100% 

126-18 ≠ ≠ 
126-19* ≠ ≠ 

126-20 Peroxidase, L. plantarum 100% 

126-21 Laccase, P. ostreatus 75% 
126-22 ≠ ≠ 
126-23 ≠ ≠ 
126-24 extrazelluläre Dioxygenase, A. flavus 74% 

126-25* Aldehydreduktase II, A. fumigatus 100% 

126-26 Glycosid Hydrolase Familie 72, L. bicolor 99% 

126-27 Xanthophyllester-Lipase Precursor, L. bicolor 72% 
126-28 ≠ ≠ 
126-29* Laccase Untereinheit POXA 3a/b, P. ostreatus 70 – 90% 

126-30* Aldehydreduktase II, A. fumigatus 88% 



 
 S e i t e  | 75 
 
Zur qualitativen Beurteilung der Proteinexpression an unterschiedlichen 

Kulturtagen wurden zusätzlich zweidimensionale Elektrophoresen der Kulturtage 

6 und 12 erstellt (Protagen AG) (Abbildung 68 und 69). Die 30 sequenzierten 

Spots (Abbildung 67) wurden hinsichtlich einer Intensitätsänderung von Tag 6 

nach Tag 9 (Abbildung 68), sowie von Tag 9 nach Tag 12 (Abbildung 69), 

untersucht. Nur bei wenigen Proteinspots (~20%) wurde eindeutig eine 

Regulation beobachtet (Tabelle 7). 

 

 

Abbildung 68: zweidimensionale Elektropherogramme extrazellulärer Enzyme von Pleurotus 
sapidus Submerskulturen auf Rapsstroh: Extrakte nach 6 und 9 Kulturtagen 

 



 
 S e i t e  | 76 
 

 

Abbildung 69: zweidimensionale Elektropherogramme extrazellulärer Enzyme von Pleurotus 
sapidus Submerskulturen auf Rapsstroh: Extrakte nach 9 und 12 Kulturtagen 

 

  



 
 S e i t e  | 77 
 

Tabelle 7: Zuordnung der identifizierten Proteine zu den Spotintensitäten (Abbildung 68 und 
Abbildung 69); nd: nicht detektiert; ↑: vermehrte Proteinexpression; ↓: verminderte 

Proteinexpression; -: gleichbleibende Proteinexpression; ≠: Peptide konnten keinem bekannten 
Protein zugeordnet werden; Sequenzdaten siehe 6.3 

Spotnummer ID Tag 6  Tag 9 Tag 9  Tag 12 

126-01 Laccase 2 (100%), P. sapidus 
nd nd 

126-02 Arylalkoholoxidase Vorläufer (94%), 
P. ostreatus nd ▬ 

126-03 Laccase 2 (92%), P. sapidus ↑ ↑ 

126-04 Carotinoidester Lipase Vorläufer 
(78%), P. sapidus ↓ ↑ 

126-05 Serinprotease (75%), X. campestris ▬ ▬ 

126-06 Laccase Untereinheit POXA 3a/b, 
P. ostreatus (83%) ▬ ▬ 

126-07 ≠ ↓ ↑ 

126-08 ≠ ▬ ▬ 

126-09 Phosphotidylglycerol spezifische 
Phospholipase (74%), T. stipitatus ▬ ▬ 

126-10 Alkoholoxidase (75%), P. 
glucozyma und P. trehalophila ↓ ↑ 

126-11 Peptidyl-Lys Metalloendopeptidase 
(93%), P. ostreatus ▬ ▬ 

126-12 Peptidasen (77%), V. vulnificus ↑ ▬ 

126-13 Methanoldehydrogenase (66%), 
Acinobacter. sp. ▬ nd 

126-14 Serin/Threonin-Kinase (75%), O. 
sativa ▬ ▬ 

126-15 ≠ nd nd 

126-16 Laccase 2 (76%) aus P. sapidus nd nd 

126-17 Laccase (90%) aus P. sapidus ▬ ▬ 

126-18 ≠ ↑ ▬ 



 
 S e i t e  | 78 
 
126-19 ≠ ▬ ▬ 

126-20 Peroxidase (100%), L. plantarum ▬ nd 

126-21 Laccase 2 (85%) aus P. sapidus ▬ ▬ 

126-22 ≠ ↓ ↑ 

126-23 ≠ nd ↓ 

126-24 extrazelluläre Dioxygenase (74%), 
A. flavus ▬ ↓ 

126-25 Aldehydreduktase II (100%), A. 
fumigatus ▬ ▬ 

126-26 Glycosid Hydrolase (83%), L. 
bicolor ▬ ↑ 

126-27 Xanthophyllester-Lipase Vorläufer 
(72%), L. bicolor ▬ ▬ 

126-28 ≠ ↑ ↓ 

126-29 Laccase Untereinheit POXA 3a/b, 
(84%), P. ostreatus ▬ ▬ 

126-30 Aldehydreduktase II (88%), A. 
fumigatus nd nd 

 

2.2.2.4 Kinetische Analyse von Submerskulturen mit Rapsstroh 

Für die kinetischen und massenspektrometrischen Untersuchungen wurden 

Kulturüberstände aus Submerskulturen, wie unter (4.7.5.2) beschrieben, 

vorbereitet und dem Projektpartner Protagen AG zur Verfügung gestellt.  

Für jeden Projekttag wurden zweidimensionale Elektropherogramme der Proben 

angefertigt. Die isoelektrischen Punkte der Proteine an den verschiedenen 

Kulturtagen lagen in einem pI-Bereich von 4 ≤ pI ≤ 8 und einem 

Molekulargewichtsbereich von 10 – 170 kDa (Abbildung 70).  

Für die Identifizierung einzelner Proteine mittels Massenspektrometrie wurde 

eine Mischprobe der Einzelzeitpunkte erstellt, um alle vorkommenden Spots in 



 
 S e i t e  | 79 
 
einem Gel zu detektieren (Abbildung 71). Aus der Mischprobe wurden insgesamt 

214 Spots vermessen. 

Die erhaltenen Peptiddaten eines Proteinspots wurden zunächst mit dem nicht 

annotiertem Genom des Basidiomyceten Pleurotus ostreatus mittels BLAST-

Analyse einem Protein zugeordnet. Danach wurden sämtliche Peptide eines 

Spots über ein Alignment dem gefundenen Protein zugeordnet. Das im Pleurotus 

ostreatus Genom gefundene Protein wurde parallel mittels Datenbanksuchen 

über NCBI BLAST (pBLAST Stand: 15.04.2010) und PFAM 

(http://pfam.sanger.ac.uk/; Stand: 15.04.2010) identifiziert. Die zugehörigen 

Peptiddaten sind im Anhang aufgelistet (6.4). 

 

http://pfam.sanger.ac.uk/


 
 S e i t e  | 80 
 

 

Abbildung 70: zweidimensionale Elektropherogramme extrazellulärer Enzyme von Pleurotus 
sapidus Submerskulturen nach 3, 6, 9 und 12 Kulturtagen. 

 

pI4 10pI4 10

MW
[kDA]
170
130
100
72
55

40

33

24

17

11

pI4 10pI4 10

MW
[kDA ]

170
130
100
72
55

40

33

24

17

11

pI4 10pI4 10

MW
[kDA]
170
130
100
72
55

40

33

24

17

11

pI4 10pI4 10

MW
[kDA]
170
130
100
72
55

40

33

24

17

11

MW
[kDa]
170
130
100
72
55

40

33

24

17

11

MW
[kDa]
170
130
100
72
55

40

33

24

17

11

MW
[kDa]
170
130
100
72
55

40

33

24

17

11

MW
[kDa]
170
130
100
72
55

40

33

24

17

11

104 pI 104 pI

104 pI 104 pI

Tag 3
Tag 6

Tag 9 Tag 12



 
 S e i t e  | 81 
 

 

Abbildung 71: Zweidimensionales Elektropherogramm mit allen mittels MALDI-MS/MS 
analysierten Proteinen. Insgesamt wurden 214 Proteinspots vermessen.  



 
 S e i t e  | 82 
 
Nur ein kleiner Anteil (10%) der Proteine konnte so nicht identifiziert werden. Die 

in der Mischprobe enthaltenen Proteine gehörten zu 80% der Proteinfamilie der 

Glycosidasen an. Esterasen und Peptidasen waren mit je 3,4% und Lipasen und 

Oxidoreduktasen mit je 4,4% vertreten (Abbildung 72). Identifiziert wurden 

daneben Lyasen und zelluläre Hilfsenzyme wie zum Beispiel Ubiquitin oder 

Cyclophilin. 

 

Abbildung 72: schematische Darstellung der Zuordnung der identifizierten Proteine aus der 2D-
Elektrophorese zu verschiedenen Proteinfamilien; hellgrau: Glycosidasen; k