Josefine Bennien INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Giessen Der Sodium-dependent Organic Anion Transporter SOAT Substratspektrum, genetische Varianten im Menschen und Effekte in der Soat Knockout Maus Verlag der DVG Service GmbH Friedrichstraße 17  35392 Gießen Tel.: 0641 / 24466  Fax: 0641 / 25375 E-Mail: info@dvg.de  Web: www.dvg.de ISBN: 978-3-86345-450-0 Gi es se n 20 18 Jo se fi ne B en ni en SO AT : S ub st ra ts pe kt ru m , G en et is ch e Va ri an te n & K no ck ou t M au s Bibliografische Informationen der Deutschen Bibliothek Die Deutsche Bibliothek verzeichnet diese Publikation in der Deutschen Nationalbibliografie; detaillierte bibliografische Daten sind im Internet abrufbar über http://dnb.ddb.de © 2018 by Verlag: Deutsche Veterinärmedizinische Gesellschaft Service GmbH, Gießen Printed in Germany ISBN 978-3-86345-450-0 1. Auflage 2018 Verlag: DVG Service GmbH Friedrichstraße 17 35392 Gießen Tel.: 0641/24466 info@dvg.de www.dvg.de Aus dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Betreuer: Prof. Dr. Joachim Geyer DER SODIUM-DEPENDENT ORGANIC ANION TRANSPORTER SOAT SUBSTRATSPEKTRUM, GENETISCHE VARIANTEN IM MENSCHEN UND EFFEKTE IN DER SOAT KNOCKOUT MAUS Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Grades eines Dr. med. vet. beim Fachbereich Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Eingereicht von: JOSEFINE BENNIEN TIERÄRZTIN AUS HENSTEDT-ULZBURG Gießen 2018 Mit Genehmigung des Fachbereichs Veterinärmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen Dekan: Prof. Dr. Dr. h.c. Martin Kramer 1. Gutachter: Prof. Dr. Joachim Geyer 2. Gutachter: Prof. Dr. Hermann Willems Tag der Disputation: 30.08.2018 Prüfungskommission: Prof. Dr. Joachim Geyer Prof. Dr. Hermann Willems Prof. Dr. Gerhard Schuler Inhaltsverzeichnis I INHALT Abkürzungen ..................................................................................................................................................... III 1. EINLEITUNG .................................................................................................................................................. 1 1.1. STEROIDHORMONE .......................................................................................................................... 1 1.1.1. Struktur der Steroidhormone .................................................................................................. 1 1.1.2. Synthese der Steroidhormone ................................................................................................ 3 1.1.3. Wirkungsweise der Steroidhormone ...................................................................................... 4 1.1.4. Sulfokonjugation der Steroidhormone ................................................................................... 4 1.1.4.1 Sulfotransferasen .......................................................................................................... 5 1.1.4.2. Sulfatase Syntheseweg (sulfatase pathway) ................................................................ 6 1.1.4.3. Steroidsulfatase (StS) ................................................................................................... 8 1.2. TRANSPORTER SULFOKONJUGIERTER STEROIDHORMONE ............................................................. 9 1.2.1. Aufnahmetransporter ............................................................................................................. 9 1.2.1.1. Organic anion transporting polypeptides, OATPs ...................................................... 10 1.2.1.2. Organic anion transporters, OATs .............................................................................. 12 1.2.2. Effluxtransporter ................................................................................................................... 14 1.2.2.1. Multidrug resistance-associated proteins, MRPs....................................................... 14 1.3. DER HODEN ALS STEROIDHORMON-SYNTHETISIERENDES ORGAN ............................................. 14 1.3.1. Der Hoden als endokrines Organ, Leydig-Zellen ................................................................... 15 1.3.2. Der Hoden als exokrines Organ, Sertoli-Zellen und Samenkanälchen .................................. 16 1.3.2.1 Spermatogenese und Keimzellen ................................................................................ 18 1.3.2.2. Stadien der Spermatogenese ..................................................................................... 18 1.3.3. Störungen der Spermatogenese ........................................................................................... 20 1.4. SODIUM-DEPENDENT ORGANIC ANION TRANSPORTER, SOAT/SOAT ....................................... 21 2. ÜBERSICHT DER PUBLIKATIONEN MIT DARSTELLUNG DES EIGENANTEILS .............................................. 23 2.1. PUBLIKATION #1 ............................................................................................................................ 23 2.1.1 Eigenanteil Publikation #1 ...................................................................................................... 24 2.2. PUBLIKATION #2 ............................................................................................................................ 26 2.2.1 Eigenanteil Publikation #2 ...................................................................................................... 27 2.3. PUBLIKATION #3 ............................................................................................................................ 28 2.3.1 Eigenanteil Publikation #3 ...................................................................................................... 29 Inhaltsverzeichnis II 3. DISKUSSION ................................................................................................................................................ 32 3.1. SLC10A6/SLC10A6-GEN UND SOAT/SOAT-PROTEIN ........................................................... 32 3.2. TRANSPORTFUNKTION ................................................................................................................... 33 3.3. SOAT: GEWEBEEXPRESSION IN MENSCH UND MAUS ............................................................... 45 3.4. SOAT: POLYMORPHISMEN UND GENETISCHE VARIANTEN ........................................................ 46 3.4.1. PolyPhen ................................................................................................................................ 49 3.4.2. SIFT ........................................................................................................................................ 50 3.4.3. Transportaktivität und Plasmamembran-Expression der SOAT-Varianten ........................... 50 3.5. SOAT KNOCKOUT MAUS ............................................................................................................... 53 3.6. WEITERE UNTERSUCHUNGEN UND AUSBLICK ............................................................................. 57 3.6.1. Cholesterin-Sulfat .................................................................................................................. 57 3.6.2. Oxysterole ............................................................................................................................. 62 4. ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................................................................ 64 5. SUMMARY .................................................................................................................................................. 65 6. LITERATURVERZEICHNIS ............................................................................................................................. 67 7. DANKSAGUNGEN ....................................................................................................................................... 89 8. ANHANG ..................................................................................................................................................... 93 Publikation #1 Publikation #2 Publikation #3 ERKLÄRUNG Abkürzungen III ABKÜRZUNGEN [3H] Tritium 17α-OH-PregS 17α-Hydroxy-Pregnenolon-Sulfat 24OHC 24S-Hydroxycholesterin 25OHC 25-Hydroxycholesterin 27OHC 27-Hydroxycholesterol ABC ATP-binding Cassette ABP Androgen-bindendes Protein AMH Anti-Müller-Hormon AnS Androsteron-Sulfat ASBT Apical Sodium-dependent Bile Acid Transporter BCRP Breast Cancer Resistance Protein BHS Blut-Hoden-Schranke BK Brustkrebs bp Basenpaare cAMP Zyklisches Adenosin-Monophosphat CASA Computer Assisted Sperm Analysis CS Cholesterin-Sulfat DHEA Dehydroepiandrosteron DHEAS Dehydroepiandrosteron-Sulfat DHT 5α-Dihydrotestosteron DHTS Dihydrotestosteron-Sulfat DMSO Dimethylsulfoxid E1 Estron E1S Estron-3-Sulfat E2 17β-Estradiol E2-17S 17β-Estradiol-17-Sulfat E2-3S 17β-Estradiol-3-Sulfat E2-diS Estradiol-Disulfat E3 Estriol epiAnS Epiandrosteron-Sulfat epiTS Epitestosteron-Sulfat EtOH Ethanol FKS Fetales Kälberserum FSH Follikelstimulierendes Hormon GnRH Gonadoliberin HVL Hypophysenvorderlappen hyp Hypospermatogenese Abkürzungen IV IHC Immunhistochemie LC-MS/MS Flüssigchromatographie mit Tandem-Massenspektrometrie- Kopplung LH Luteinisierendes Hormon LSC Liquid Scintillation Counting maf Major Allele Frequency MetOH Methanol MRP Multidrug Resistance-associated Protein NM Neisseria meningitides NTCP Natrium/Taurocholate Cotransporting Polypeptide OAT Organic Anion Transporter OATP Organic Anion Transporting Polypeptide OAT-Syndrom Oligoasthenoteratozoospermie OCT Organic Cation Transporter PAP Adenosin-3,5-Diphosphat PAPS 3‘-Phosphoadenosin-5‘-phosphosulfat PAPSS PAPS-Synthetase PBS Phosphatgepufferte Kochsalzlösung PK Prostatakrebs Preg Pregnenolon PregS Pregnenolon-Sulfat RXLI Rezessive X-chromosomale Ichthyose sco Sertoli Cell Only Syndrome sda Spermatidenarrest sga Spermatogonienarrest Slc10a6-/- Soat Gen-Knockout Maus SNP Einzelnukleotidpolymorphismus SO4 2- Sulfat SOAT/Soat Sodium-dependent Organic Anion Transporter (Mensch/Tier) StS Steroidsulfatase SULT Sulfotransferase sza Spermatozytenarrest T Testosteron TC Taurocholat tet Tetracyclin TMD Transmembrandomäne TS Testosteron-Sulfat YF Yersinia frederiksenii Einleitung 1 1. EINLEITUNG 1.1. STEROIDHORMONE Steroidhormone sind von essentieller Bedeutung für die Entwicklung, Differenzierung und Homöostase von Menschen und Wirbeltieren. Sie werden in 5 Klassen eingeteilt. Man unterscheidet Androgene, Östrogene, Glucocorticoide, Mineralocorticoide und Gestagene [Simons, 2008]. Dehydroepiandrosteron (DHEA) kann als Vorstufe von sowohl Androgenen als auch Östrogenen genutzt werden und stellt das am häufigsten im menschlichen Organismus vorkommende Steroidhormon dar. Die wichtigsten Vertreter der Androgene, auch „männliche“ Geschlechtshormone genannt, sind Testosteron (T) und 5α-Dihydrotestosteron (DHT). Zu den natürlich vorkommenden Östrogenen, den „weiblichen“ Geschlechtshormonen, gehören Estron (E1), Estradiol (E2) und Estriol (E3). Geschlechtshormone steuern das Wachstum und die Ausbildung primärer und sekundärer Geschlechtsmerkmale [Silverthorn, 2009]. Auch im weiblichen Organismus wird Testosteron gebildet, sowie im männlichen Organismus Östrogene. Dies geschieht jedoch in der Regel in wesentlich geringeren Konzentrationen, sodass sich die mundartlichen Begriffe der „männlichen“ und „weiblichen“ Geschlechtshormone etabliert haben [Burger, 2002]. Ein weiteres wichtiges Geschlechtshormon ist das Progesteron, das auch Gelbkörperhormon genannt wird. Es gehört zu den Gestagenen und trägt maßgeblich zur Entstehung und Aufrechterhaltung der Schwangerschaft, sowie zur Steuerung der Uterusfunktionen bei [Allen, 1941; Niswender et al., 2000]. Zu den Glucocorticoiden, welche den Glucose Stoffwechsel steuern, gehören vor allem Cortisol und Cortikosteron. Die beiden bedeutendsten Mineralocorticoide, Aldosteron und Desoxycorticosteron, regulieren den Elektrolythaushalt [Häggström und Richfield, 2014]. 1.1.1. STRUKTUR DER STEROIDHORMONE Alle Steroidhormone werden vom Cholesterin (englisch Cholesterol) abgeleitet und besitzen die gleiche, typische Grundstruktur, das Steroidgerüst. Dieses Gerüst, auch Steran genannt, besteht aus 17 Kohlenstoffatomen, die sich zu drei Cyclohexanringen (Ringe A, B, C) und einem Cyclopentanring (Ring D) zusammenlagern. Die unterschiedlichen Steroidhormone werden auch nach Anzahl ihrer Einleitung 2 Kohlenstoffatome (inklusive Seitenketten) in C21- (Gestagene und Glucocorticoide), C19- (Androgene) und C18-Steroide (Östrogene) klassifiziert. Die für die biologische Wirksamkeit der Steroidhormone wichtigen Substituenten sind an den Positionen 3, 10, 13 und 17 angelagert. Typisch für die Struktur der Glucocorticoide ist zum Beispiel eine 17α-Hydroxylgruppe [Schmitt und Rousseau, 1979]. Moleküle liegen in meist energetisch möglichst günstiger Konformation vor. Durch die 6 chiralen Kohlenstoffatome an den jeweiligen Ring-Verbindungsstellen sind theoretisch 64 verschiedene Stereoisomere denkbar, von denen allerdings nur sehr wenige natürlicherweise auftreten. Die Ringe A/B, B/C und C/D können jeweils in cis- oder in trans-Konformation miteinander verknüpft sein. Die Ringverknüpfung B/C der natürlichen Steroide zeigt immer eine trans-Konformation. Die Ringverknüpfungen B/C und C/D liegen bei Steroidhormonen und auch bei Gallensäuren immer in der energetisch günstigen trans-Konformation vor [The Nomenclature of Steroids, 1989]. Abb. 1: Grundgerüst der Steroidhormone (A) Steran (tetracyclisches Kohlenstoffskelett Hexadecahydro-cyclopenta[a]phenanthren) (B) Sterangerüst in trans-trans-trans-Konformation B A Einleitung 3 1.1.2. SYNTHESE DER STEROIDHORMONE Die Vorstufe der Steroidhormone, das Cholesterin, wird entweder über die Nahrung aufgenommen oder de novo aus Acetyl-CoA, meist in der Leber aber auch in anderen Geweben, gebildet. Das lipophile Cholesterin wird zum Transport im Blut an Lipoproteine (low density lipoprotein, LDL) gebunden und in der Nebennierenrinde, sowie in den weiblichen und männlichen Gonaden, zu den verschiedenen Steroidhormonen weiterverarbeitet. Die Biosynthese beginnt mit der Oxidation von Cholesterin über Pregnenolon (Preg) zu Progesteron. Im weiteren Verlauf finden eine Hydroxylierung an Position 17α, sowie die Abspaltung der Cholesterin-Seitenkette statt. Diese Reaktionen laufen in den Mitochondrien und dem glatten endoplasmatischen Retikulum verschiedener endokriner Organe ab [Häggström und Richfield, 2014]. Die Mineralocorticoide und Glucocorticoide werden in der Nebennierenrinde (NNR) gebildet. Androgene entstehen sowohl in der NNR, als auch im Hoden, Östrogene und Gestagene in den Ovarien und der Plazenta. Von ihrem Bildungsort gelangen die Steroidhormone über den Blutkreislauf zu den Zielorganen [Ruiz-Cortés, 2012]. Synthese und Ausschüttung von Steroidhormonen aus den endokrinen Organen unterliegen klassischerweise der regulatorischen Kontrolle des Hypothalamus. Die Steuerung erfolgt über die Hypothalamus-Hypophysen-Achse und sog. Releasing-Hormone (Liberine) [Gonzalez et al., 1991; Ehrhart-Bornstein et al., 1998]. Da die lipophilen Steroidhormone schlecht wasserlöslich sind, werden sie zu Transportzwecken in der Blutbahn nicht-kovalent an Serumproteine gebunden. Auf diese Weise sind sie vor einem schnellen Abbau geschützt und besitzen eine wesentlich längere Halbwertszeit [Ruiz-Cortés, 2012]. Der Abbau der Steroidhormone erfolgt über die Leber und in den Tubuluszellen der Niere. Die Ausscheidung erfolgt unverändert oder in Form von Metaboliten (meist Sulfaten oder Glucuroniden) über Galle und Urin [Träger, 1977]. Steroide sind in der Natur weit verbreitet und kommen auch im Pflanzenreich vor, hier zum Beispiel als Phytohormone, zu denen auch die Herzglycoside zählen [Zeelen, 1995]. Herzglycoside weisen eine cis-trans-cis Anordnung der Steroidringe auf [Heasley, 2012]. Einleitung 4 1.1.3. WIRKUNGSWEISE DER STEROIDHORMONE Freie Steroidhormone können aufgrund ihrer Lipophilie via Diffusion in die Zielzellen gelangen und intrazellulär an nukleäre Steroidrezeptoren binden. Nach klassischer Vorstellung binden Steroidhormone an die Ligandenbindungsdomäne (LBD) des jeweiligen Rezeptors. Der Rezeptor- Steroid-Komplex bindet wiederum an spezifische, biologisch aktive DNA-Sequenzen, die sogenannten Hormon-Response-Elemente (HREs). Durch diese Interaktion wird die Genexpression von Zielgenen reguliert [Beato, 1989; Simons, 2008]. Der Rezeptor-Steroid-Komplex wirkt also als Transkriptionsaktivator. 1.1.4. SULFOKONJUGATION DER STEROIDHORMONE Hydrophobe Steroidhormone können in verschiedenen Geweben des Körpers sulfokonjugiert werden. Durch die Sulfokonjugation erhalten die Moleküle eine negative Ladung und ihre Wasserlöslichkeit wird verbessert [Müller et al., 2015]. Dies erleichtert wiederum ihren Transport über den Blutkreislauf und ermöglicht ihre Ausscheidung über Galle und Urin. Aus diesem Grund wurden sulfokonjugierte Steroide lange Zeit lediglich als unwirksame, metabolische Endprodukte angesehen. Tatsächlich haben konjugierte Steroidhormone keinerlei Wirkung mehr an nukleären Steroidrezeptoren. Interessanterweise ist jedoch die Konzentration der sulfokonjugierten Steroidhormone im Blut wesentlich höher als die der freien Formen. So ist z. B. der Serumspiegel von Estron-3-Sulfat (E1S) 10-fach höher als der des unkonjugierten Estron oder Estradiol [Samojlik et al., 1982]. Darüber hinaus ist die Halbwertszeit des E1S im Blut im Vergleich zum Estron bis zu 9- mal länger [Ruder et al., 1972]. In den letzten zwei Jahrzehnten konnte in mehreren Studien gezeigt werden, dass sulfokonjugierte Steroide als zirkulierendes Reservoir für die periphere Bildung bioaktiver Hormone fungieren können [Labrie et al., 2003]. Sulfatierung und Desulfatierung können dabei als gegenläufige biologische Prozesse angesehen werden, welche die Steroidhormonwirkung in einer Vielzahl von Steroid responsiven Geweben regulieren [Müller et al., 2015]. Die Sulfokonjugation von Hydroxylgruppen der Steroidhormone wird durch die Enzyme aus der Familie der zytosolischen Sulfotransferasen katalysiert [Lindsay et al., 2008]. Einleitung 5 Das für die Sulfokonjugation benötigte Sulfat (SO4 2-) wird dabei aus der Nahrung und dem intrazellulären Stoffwechsel von schwefelhaltigen Aminosäuren, einschließlich Methionin und Cystein, gewonnen. Das Sulfuryldonor-Cosubstrat für die SULT-katalysierte Reaktion ist das 3- Phosphoadenosin-5-phosphosulfat (PAPS) [Secky et al., 2013]. PAPS agiert als universeller Sulfuryldonor im Organismus. Sein ubiquitäres Auftreten als Sulfuryldonor wird auch durch die Tatsache bestätigt, dass die dreidimensionalen Strukturmerkmale der Bindungsstelle für PAPS unter den unterschiedlichen Sulfotransferasen hoch konserviert sind [Negishi et al., 2001]. Die Biosynthese von PAPS erfolgt in einem zweistufigen Prozess, der durch die PAPS-Synthetase (PAPSS) durchgeführt wird [Lyle et al., 1994]. Bei Menschen wurden zwei Isoformen von PAPSS identifiziert und charakterisiert, PAPSS1 und PAPSS2 [Kurima et al., 1999; Fuda et al., 2002]. Die Reaktionsprodukte nach der Sulfokonjugation der Steroidhormone sind das jeweils sulfokonjugierte Steroidhormon und Adenosin-3,5-Diphosphat (PAP) [Duffel, 2010]. 1.1.4.1 SULFOTRANSFERASEN Die Sulfotransferasen (SULTs) katalysieren die Transferreaktion der Sulfatgruppe vom universellen Sulfuryldonor PAPS zur Akzeptorgruppe zahlreicher Substrate, wie z. B. der Steroidhormone. Diese Reaktion, die oft auch als Sulfuryltransfer, Sulfatierung oder Sulfokonjugation bezeichnet wird, wird häufig und in vielen Spezies von Bakterien bis hin zu Menschen beobachtet und spielt eine Schlüsselrolle bei verschiedenen biologischen Prozessen wie Zellkommunikation, Abwehr, Wachstum und Entwicklung [Negishi et al., 2001]. Sulfotransferasen sind eine große Proteinfamilie, die in membrangebundene, Golgi-assoziierte Enzyme und lösliche, cytoplasmatische Sulfotransferasen eingeteilt wird [Hemmerich et al., 2004; Goettsch et al., 2006]. Golgi-assoziierte Sulfotransferasen sind für die Sulfokonjugation von Proteinen, Kohlenhydraten und Proteoglykanen verantwortlich, während cytoplasmatische Sulfotransferasen hauptsächlich hydrophobe, niedermolekulare Substanzen wie Phenole, Xenobiotika und Steroide modifizieren [Müller et al., 2015]. Obwohl die Sequenzkonservierung zwischen den verschiedenen Sulfotransferasen gering ist, sind ihre Faltung und katalytischen Eigenschaften, einschließlich der Bindung von PAPS, hoch konserviert. Es gibt speziesabhängig Einleitung 6 verschiedene Sulfotransferasen, die mit der Steroidsulfokonjugation assoziiert sind, z. B. SULT1A1, SULT1E1, SULT2A1 sowie die zwei Isoformen des SULT2B1-Gens, SULT2B1a und SULT2B1b [Strott, 2002]. SULT2B1a bevorzugt Pregnenolon als Substrat, wohingegen SULT2B1b Cholesterin vorzieht [Fuda et al., 2002]. Die Isoform SULT1E1 ist als Östrogen-Sulfotransferase bekannt, da sie die Sulfokonjugation von E1 und E2 mit hoher Effizienz bei physiologischen Konzentrationen katalysiert. Die Sulfokonjugation der Androgene wird hauptsächlich durch die Isoform SULT2A1 erreicht [Lindsay et al., 2008]. 1.1.4.2. SULFATASE SYNTHESEWEG (SULFATASE PATHWAY) Da sulfokonjugierte Steroidhormone aufgrund ihrer Hydrophilie und Ladung nicht via Diffusion Zellmembranen überwinden können, werden sie durch spezifische Transportproteine über die Plasmamembran transportiert (siehe Abb. 2). Innerhalb der Zelle kann die SO4 2--Gruppe durch die mikrosomale Steroidsulfatase (StS) vom Molekül abgespalten werden und das auf diese Weise reaktivierte Steroidhormon kann wiederum an nukleäre Steroidrezeptoren binden. Dieser als sulfatase pathway beschriebene Prozess entspricht also einer Reaktivierung bzw. einem Recycling der im Kreislauf zirkulierenden, inaktiven sulfokonjugierten Steroidvorstufen zu biologisch wirksamen Steroidhormonen. Der sulfatase pathway ist unter anderem beim hormonabhängigen Mammakarzinom pathophysiologisch von Bedeutung [Labrie et al., 2003; McNamara und Sasano, 2015; Müller et al., 2015; Ziegler et al., 2015]. Hormonabhängige Mammakarzinome proliferieren hormonabhängig und zeigen im Vergleich zu benachbartem, normalem Brustgewebe häufig erhöhte intratumorale Östrogenkonzentrationen [Chetrite et al., 2000]. Es gibt zwei Hauptwege für die Bildung von aktiven Östrogen im hormonabhängigen Mammakarzinom: Desulfatierung von sulfatierten Estron oder Estradiol über die StS und Androgen-Aromatisierung. Die StS-Aktivität kann jedoch im Brustkrebsgewebe 50-200 Mal höher sein als die Aromatase-Aktivität [Pasqualini et al., 1996]. Außerdem wird StS-mRNA häufig in Brusttumoren nachgewiesen, während die Aromatase-Spiegel im Vergleich niedrig sind [Suzuki et al., 2009]. Dies legt die Vermutung nahe, dass StS der Hauptantrieb für die lokale Estron-Produktion bei hormonabhängigem Brustkrebs sein könnte Einleitung 7 [Santner et al., 1984; Wood et al., 2011]. Für das hormonabhängige Mammakarzinom wurde darüber hinaus gezeigt, dass die Bildung von Estron mittels Reaktivierung aus dem konjugierten E1S deutlich größer ist als die Bildung von Estron via Neusynthese [Santner et al., 1984; Wood et al., 2011]. Auch im Hoden verschiedener Spezies scheinen der sulfatase pathway und die lokale Synthese von aktiven Steroidhormonen aus den inaktiven, sulfokonjugierten Vorstufen eine Rolle zu spielen. Die im Hoden produzierten Androgene wirken über den nukleären Androgenrezeptor primär in den Leydig-Zellen, Sertoli-Zellen und den peritubulären Zellen [Walker, 2009]. Außerdem wurde gezeigt, dass im Hoden auch sulfokonjugierte Steroidhormone wie Pregnenolon-Sulfat (PregS), Dehydroepiandrosteron-Sulfat (DHEAS) und Testosteron-Sulfat (TS) synthetisiert werden können [Laatikainen et al., 1971; Ruokonen et al., 1972]. Darüber hinaus konnten Payne et al. zeigen, dass die Testosteronsynthese im Hoden auch durch Desulfatierung und Umwandlung von PregS, DHEAS und Androstendiol-3-Sulfat zustande kommt und dass die StS in diesem Fall als Schlüsselenzym fungiert [Payne et al., 1971; Payne et al., 1973; Payne und Jaffe, 1975; Ruokonen, 1978]. Einleitung 8 Abb. 2: Intrakrine Steroidsynthese: Sulfatase Syntheseweg (sulfatase pathway) Steroidhormone werden über die Sulfotransferase (SULT) sulfokonjugiert und damit inaktiviert. Die sulfokonjugierten Steroidhormone können nicht via Diffusion in die Zellen gelangen, sondern werden z. B. über den sodium-dependent organic anion transporter (SOAT) im Cotransport mit Natrium (Na+) in die Zelle aufgenommen. Innerhalb der Zelle trennt die Steroidsulfatase (StS) die Sulfatgruppe (S) vom Molekül ab. Das auf diesem Weg reaktivierte Steroidhormon kann nun an den nukleären Steroidhormonrezeptor binden und biologische Prozesse anstoßen. 1.1.4.3. STEROIDSULFATASE (STS) Die Sulfatase-Enzymfamilie katalysiert die Hydrolyse von Sulfatesterbindungen einer Vielzahl von Substraten. Die primären Hormonsubstrate der StS sind E1S, DHEAS, PregS und Cholesterin-Sulfat (CS). Aus diesem Grund stellt dieses Enzym einen der Hauptwege für die Regeneration biologisch aktiver Steroidhormone dar, sowohl in steroidalen als auch in nicht steroidalen Geweben [Rizner, 2016]. Einleitung 9 Die StS besitzt eine hydrophobe Domäne und ist ein membrangebundenes, mikrosomales Enzym, das vor allem im Lumen des Rauen Endoplasmatischen Retikulums (RER) lokalisiert ist, wo es Homodimere bildet [Suzuki et al., 2011]. StS kommt ubiquitär im menschlichen Gewebe vor, wobei die größte mRNA-Expression und Aktivität in der Plazenta auftritt [Warren und French, 1965]. Interessanterweise ändert sich die StS-Aktivität während der Pubertät, unterscheidet sich zwischen Männern und Frauen und ist bei präpubertären Frauen am höchsten [Cuevas-Covarrubias et al., 1993]. Darüber hinaus ist StS häufig in verschiedenen tumorösen Geweben, wie z. B. in Brustkrebsgeweben erhöht [Santner et al., 1984; Utsumi et al., 2000]. Außerdem kann es durch einen Mangel an StS, die auch in der Haut exprimiert wird, zur Ausprägung der rezessiven X- chromosomalen Ichthyose (RXLI) durch vermehrte Cholesterin-Sulfat Einlagerung im stratum corneum der Haut kommen [Hernandez-Martin et al., 1999]. Diese Krankheit stellt einen der häufigsten, angeborenen Stoffwechselfehler des Menschen dar [Alperin und Shapiro, 1997]. Ein Anstieg der StS Genexpression und der StS Aktivität kann dagegen zur Entstehung bzw. zur Proliferation von Brusttumoren führen [Utsumi et al., 2000; Al Sarakbi et al., 2006]. Beim Menschen wurde StS als ein vielversprechendes pharmakologisches Target für Östrogen- und Androgendeprivationstherapien bei hormonellen Erkrankungen identifiziert [Stanway et al., 2007]. 1.2. TRANSPORTER SULFOKONJUGIERTER STEROIDHORMONE 1.2.1. AUFNAHMETRANSPORTER Es sind mehrere Transportproteine bekannt, welche die Aufnahme der hydrophilen und damit diffusionsunfähigen, konjugierten Steroidhormone in die Zelle ermöglichen [Burckhardt und Burckhardt, 2003; Hagenbuch und Meier, 2004; Geyer et al., 2006]. Sulfatierte Steroidhormone sind chemisch gesehen organische Anionen. Transporter für organische Anionen können in zwei Gruppen eingeteilt werden: (I) Aufnahme-Transporter und (II) Effluxtransporter. Erstere gehören meist in die Familie der sog. Solute Carriers (SLC-Familie), letztere in die Familie der ATP-binding cassette (ABC) Transporter [Roth et al., 2012]. Zu den SLC-Transporter gehören folgende Transporter für organische Anionen: organic anion transporting polypeptides (OATPs, Genfamilie SLCO) sowie organic anion transporters (OATs, Einleitung 10 Genfamilie SLC22). Typisch für diese Transporter ist der Transport von endogenen Substanzen wie konjugierten Steroiden oder Neurotransmittern sowie von Xenobiotika und Arzneistoffen [Obaidat et al., 2012]. Einzelne Mitglieder dieser beiden SLC-Familien werden im Wesentlichen in jedem Epithel des Körpers exprimiert [Roth et al., 2012]. OATPs transportieren dabei eher größere hydrophobe organische Anionen, zu denen auch die sulfokonjugierten Steroidhormone gehören, während die OATs eher für den Transport von kleinen hydrophilen organischen Anionen zuständig sind. 1.2.1.1. ORGANIC ANION TRANSPORTING POLYPEPTIDES, OATPS In den letzten Jahren wurden mehrere Mitglieder der OATP-Familie unter anderem als Transporter für sulfokonjugierte Steroide identifiziert: Für OATP1A2 konnte der Transport von E1S nachgewiesen werden [Lee et al., 2005], für OATP1B1 der Transport von E1S [Hirano et al., 2004] und von DHEAS [Abe et al., 1999; Hsiang et al., 1999; Cui et al., 2001; Kullak-Ublick et al., 2001], für OATP1B3 der Transport von E1S [Kullak-Ublick et al., 2001; Nozawa et al., 2004b; Nozawa et al., 2005] sowie der Transport von DHEAS [König et al., 2000; Cui et al., 2001; Kullak-Ublick et al., 2001], für OATP2B1 der Transport von E1S [Tamai et al., 2001; Pizzagalli et al., 2003; Nozawa et al., 2004a; Hirano et al., 2006] und von PregS [Grube et al., 2006] sowie für OATP1C1, OATP3A1_v1, OATP4A1 und OATP4C1 der Transport von E1S [Tamai et al., 2000; Pizzagalli et al., 2002; Nozawa et al., 2004a Grube et al., 2006; Hirano et al., 2006; Yamaguchi et al., 2010]. Für alle OATPs/Oatps (OATP als Abkürzung für die humanen OAPTs, Oatp entsprechend für die tierischen Homologe) wird zurzeit ein Strukturmodell mit 12 TMDs angenommen [Hagenbuch und Meier, 2003]. Sie wirken als ATP- und Natrium-unabhängige Transportproteine [Jacquemin et al., 1994; Kullak-Ublick et al., 1994; Noe et al., 1997; Walters et al., 2000] und können eine Vielzahl verschiedener, amphipathischer, organischer Verbindungen durch die Zellmembran schleusen. Zu ihren Substraten zählen Gallensalze, Steroidkonjugate, Schilddrüsenhormone, anionische Oligopeptide, sowie zahlreiche Pharmaka und Xenobiotika. Nach dem von Hagenbuch und Meier im Jahr 2004 eingeführten System teilen sich die OATPs in sechs Familien (mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 40%) auf, die wiederum verschiedenen Einleitung 11 Subfamilien (mit einer Aminosäuresequenz-Identität von 60%) enthalten. Die einzelnen Familien werden mit den Ziffern 1 bis 6 nummeriert, während Subfamilien mit Hilfe der Buchstaben A, B und C unterschieden werden. Die nach Zahl und Buchstabe im Namen folgende Nummerierung bezieht sich dann chronologisch auf den Zeitpunkt der Entdeckung des jeweiligen Proteins (z. B. OATP1B1 des Menschen, Oatp1b2 der Ratte und OATP1B3 des Menschen), zumindest dann, wenn keine klare Orthologie vorliegt. Orthologe OATPs/Oatps werden dagegen bei Mensch und Tier mit dem gleichen Namen bezeichnet (z. B. OATP2B1/Oatp2b1). Die meisten OATPs/Oatps werden in mehreren verschiedenen Geweben (meist epithelialen Ursprungs) exprimiert, allerdings gibt es auch einige Vertreter, die nur in bestimmten Organen vorkommen. Ein Beispiel für einen ubiquitär auftretenden OATP ist OATP2A1, dessen mRNA sowohl in Gehirn, Kolon, Herz, Leber als auch in der Niere nachgewiesen werden konnte, sowie in Ovar, Lunge, Pankreas, Prostata, Skelettmuskel, Milz und Dünndarm [Schuster, 2002]. OATP1B3 hingegen wird exklusiv in der basolateralen Membran der Leber exprimiert [Abe et al., 1999; Hsiang et al., 1999; König et al., 2000; Obaidat et al., 2012]. In einzelnen Organen können allerdings auch verschiedene OATPs exprimiert werden. So konnten im Hoden z. B. OATP1A2 [Kullak-Ublick et al., 1995; Steckelbroeck et al., 2004], OATP1C1 [Pizzagalli et al., 2002] und OATP3A1 [Adachi et al., 2003; Huber et al., 2007] nachgewiesen werden. Letzterer kommt in zwei Spleißvarianten vor. Die erste, OATP3A1_v1, wurde besonders in Keimzellen nachgewiesen, während die andere, OATP3A1_v2, vorwiegend in Sertoli-Zellen gefunden wurde. OATPs/Oatps transportieren ihre Substrate ATP- und Natrium-unabhängig [Jacquemin et al., 1994; Kullak-Ublick et al., 1994; Noe et al., 1997; Walters et al., 2000]. Ihr genauer Transportmechanismus ist noch nicht endgültig aufgeklärt. Es gibt jedoch Hinweise darauf, dass der OATP/Oatp-vermittelte Transport pH-abhängig und elektroneutral ist [Satlin et al., 1997]. Außerdem wurde beschrieben, dass OATPs/Oatps als Anionenaustauscher fungieren können, indem sie die Aufnahme organischer Verbindungen an den Efflux von z. B. Bikarbonat, Glutathion- oder Glutathion-Konjugaten koppeln [Shi et al., 1995; Satlin et al., 1997; Li et al., 2000; Li et al., 1998]. Obwohl dies noch nicht für alle OATPs/Oatps gezeigt wurde, können OATPs/Oatps als bidirektionale Transportsysteme angesehen werden. Entsprechend wäre die Richtung des Transports vom lokalen Substratgradienten abhängig [Hagenbuch und Meier, 2004]. Einleitung 12 1.2.1.2. ORGANIC ANION TRANSPORTERS, OATS Gründungsmitglied der Familie der Transporter für organische Anionen (OATs) ist der OAT1, ehemals basolateraler p-Aminohippurat (PAH)- Transporter, welcher ursprünglich aus dem proximalen Nierentubulus der Ratte isoliert wurde [Reid et al., 1998; Sekine et al., 2000] . Mittlerweile sind zehn Mitglieder der OAT-Familie bekannt, welche mit Ziffern durchnummeriert werden (OAT1, OAT2, OAT3, etc.) [Roth et al., 2012]. Am besten untersucht sind bisher OAT1, OAT2, OAT3 und OAT4, sowie ein OAT der Flunder (frOat) [Sekine et al., 2000]. Auch für OATs wird ein Modell mit 12 TMDs angenommen und auch sie vermitteln, wie die OATPs, einen Natrium- unabhängigen Transport. Ferner sind die OATs multispezifisch, was bedeutet, dass sie als Substrat sowohl endogene Anionen, wie z. B. zyklische Nukleotide, Prostaglandine, Harnsäure und Dicarboxylate, als auch verschiedene exogene Anionen, wie z. B. anionische Arzneistoffe, als Substrate erkennen. Einige Mitglieder der OAT-Familie wurden in Leber, Gehirn und Plazenta detektiert. Bevorzugter Expressionsort ist jedoch die Niere. Damit ermöglichen OATs einen renalen Sekretionsweg für organische Anionen. Außerdem sind sie an der Verteilung organischer Anionen im Organismus beteiligt [Sekine et al., 2000]. OAT1 wird überwiegend in der Niere und schwach im Gehirn exprimiert [Sekine et al., 1997]. Die funktionelle Charakterisierung von OAT1 wurde zunächst mit PAH als Substrat durchgeführt. Die Aufnahme von PAH ist Natrium-unabhängig und wird durch einen nach außen gerichteten Konzentrationsgradienten von α-Ketoglutarat oder Glutarat erhöht [Köpsell, 2013]. OAT1 ist ein Anion/Dicarboxylat-Austauscher, zu dessen Substraten Tetracyclin, Acyclovir [Uwai et al., 2007], Cimetidin, Ranitidin, Furosemid, Ibuprofen und sulfokonjugierte Flavonoidkonjugate gehören [Rizwan und Burckhardt, 2007; Wong et al., 2011; Köpsell, 2013]. OAT2 (früher novel liver transporter, NLT) wird vorwiegend in den sinusoidalen Membranen der Leber und nur schwach in der Niere exprimiert [Simonson et al., 1994]. Expression, Geschlechtsabhängigkeit und Expressionsort von OAT2 sind allerdings speziesabhängig [Köpsell, 2013]. Der humane OAT2 vermittelt den zellulären Efflux von Glutamat und transportiert darüber hinaus eine Vielzahl von Substanzen, wie z. B. Glutarat [Kobayashi et al., 2005], Harnsäure [Sato et al., 2010], Purin und Pyrimidin Nukleobasen, cAMP, Prostaglandine, E1S, sowie DHEAS und α-Ketoglutarat [Rizwan und Burckhardt, 2007; Srimaroeng et al., 2008]. OAT3 wird sowohl in der Leber, als auch in Niere und Einleitung 13 Gehirn, sowie schwach im Auge exprimiert [Kusuhara et al., 1999], während OAT4 in Plazenta und Niere auftritt [Cha et al., 2000]. In diesen beiden Lokalisationen vermittelt OAT4 hochaffin den Transport von E1S, DHEAS und Ochratoxin A. Im Vergleich zu den anderen OAT-Isoformen scheint das Substratspektrum von OAT4 relativ beschränkt zu sein [Sekine et al., 2000]. Über menschliches OAT5 ist wenig bekannt, seine Expression konnte allerdings in der Leber gezeigt werden [Sun et al., 2001; Roth et al., 2012]. Sun et al. fanden heraus, dass der Oat5 der Ratte nur etwa 55% Sequenzidentität im Vergleich mit dem menschlichen OAT5 aufweist. Aus diesem Grund wurde das Homolog der Ratte als SLC22A19 bezeichnet, wobei die menschliche Form den systematischen Namen SLC22A10 behielt [Emami Riedmaier et al., 2012]. OAT6 bzw. SLC22A20 wurde bisher nur aus der Maus kloniert und charakterisiert [Monte et al., 2004; Schnabolk et al., 2006; Köpsell, 2013]. Der Oat6 der Maus ist ein Anion/Dicarboxylat-Austauscher, dessen Expression in der Riechschleimhaut nachgewiesen werden konnte und der damit eine Rolle bei der Geruchswahrnehmung spielen könnte [Köpsell, 2013]. OAT7 wird ausschließlich in der adulten und fetalen Leber, in der basolateralen Membran der Hepatozyten, exprimiert [Shin et al., 2007; Roth et al., 2012]. OAT7 vermittelt die Aufnahme von E1S, DHEAS und Butyrat [Shin et al., 2007]. Im Vergleich mit den anderen humanen OAT-Subtypen weist OAT7 eine spezifischere Substratselektivität einschließlich der Sulfat-Konjugate auf [Köpsell, 2013]. Tatsächlich zeigt OAT7 nur etwa 5 bis 46% Sequenzidentität verglichen mit den Sequenzen von OAT1-4 [Emami Riedmaier et al., 2012]. Der humane OAT10 weist die höchste Expression in der Niere auf, gefolgt von Gehirn, Herz, Dünndarm und Kolon [Nishiwaki et al., 1998; Bahn et al., 2008]. Der Oat10 der Ratte wurde in der Bürstensaummembran der proximalen Nierentubuli lokalisiert [Köpsell, 2013]. OAT10 wurde 1998 aufgrund seiner strukturellen Ähnlichkeit als OCT identifiziert und anfänglich als organic cation transporter like-3 (ORCTL3) bezeichnet [Nishiwaki et al., 1998; AbuAli und Grimm, 2014]. Bahn et al. fanden allerdings statt der erwarteten organischen Kationen eine Aufnahme von organischen Anionen. Basierend auf Substratstudien und Proteinsequenz-Alignments aller bekannten OCTs und OATs, wurde hORCTL3 schließlich als OAT klassifiziert und in OAT10 umbenannt [Bahn et al., 2008; Emami Riedmaier et al., 2012]. Zu seinen Substraten gehören Nicotinat, Lactat, Harnsäure, Succinat und Glutathion, sowie Cyclosporin A und Pyrazinoat [Köpsell, 2013]. Die Subtypen OAT8 und OAT9 wurden bislang noch nicht charakterisiert. Einleitung 14 1.2.2. EFFLUXTRANSPORTER 1.2.2.1. MULTIDRUG RESISTANCE-ASSOCIATED PROTEINS, MRPS Neben den OATPs und OATs, welche wie beschrieben die Aufnahmen von Substanzen in die Zelle vermitteln, gibt es auch Transporter, die für den Efflux, also das Herausschleusen von Substanzen aus der Zelle verantwortlich sind. Im Falle der sulfokonjugierten Steroidhormone sind hier besonders die multidrug resistance-associated proteins (MRPs) zu nennen. MRPs gehören zur Familie der ATP-binding cassette (ABC) Transporter und können Moleküle über die Plasmamembran sowie über die Membranen intrazellulärer Vesikel transportieren. Die Transportaktivität der ABC-Transporter wird energetisch durch die Bindung und Hydrolyse von ATP angetrieben, was die notwendigen Protein-Konformationsänderungen und damit die Translokation der Substrate ermöglicht [Cole, 2014]. MRPs fungieren als multispezifische Transporter. Zu ihren Substraten gehören unterschiedliche Glutathionkonjugate, Gallensalze, Glucuronsäure- und Sulfat-Konjugate sowie weitere organische Anionen [Deeley und Cole, 1997; Sodani et al., 2012]. Damit spielen MRPs auch für den Transport von sulfokonjugierten Steroidhormonen eine Rolle. Hartmann et al. konnten die Expression verschiedener MRPs in Sertoli-Zellen des Hodens nachweisen. Damit könnten sulfokonjugierte Steroide an der sonst undurchlässigen Blut-Hoden- Schranke vorbei, durch Sertoli-Zellen in Richtung Keimzellen transportiert werden [Hartmann et al., 2016]. 1.3. DER HODEN ALS STEROIDHORMON-SYNTHETISIERENDES ORGAN Der Hoden ist das wichtigste Steroidhormon-bildende Organ des männlichen Körpers. Die Bezeichnung „testis“ für diesen Körperteil entwickelte sich aus einem altertümlichen, römischen Ritual, in dem sich Männer beim Schwören eine Hand auf das Genital legten. „Testis“ bedeutet übersetzt „Zeuge“ und so wurde das männliche Privileg vor Gericht sprechen zu dürfen der Namensgeber für dieses exklusiv männliche Organ in den Anatomie-Büchern des Altertums Einleitung 15 [Silverthorn, 2009]. Dass „Zeuge“ etymologisch nicht allzu weit entfernt von „zeugen“ zu sein scheint, mag Zufall sein. Der Hoden liegt bei den meisten Tieren, sowie beim Mensch, außerhalb des Körpers und ist ein paariges, meist eiförmiges Organ mit einer festen, fibrinösen, äußeren Kapsel. Innerhalb der Kapsel befindet sich eine Vielzahl von Kompartimenten-bildenden Samenkanälchen. Zwischen den Kanälchen liegt interstitielles Gewebe, welches die Blutgefäße und die Leydig-Zellen umschließt. Die Samenkanälchen vereinigen sich zum Epididymis, dem Nebenhoden, der außerhalb der Hodenkapsel einen Strang bildet. Die Übergangsstelle bildet der Nebenhodenkopf, an den sich der Nebenhodenkörper anschließt, der in den Nebenhodenschwanz und schließlich in den ductus deferens übergeht. Der ductus deferens verläuft in Richtung Abdomen und mündet letztendlich in die Urethra [Silverthorn, 2009]. 1.3.1. DER HODEN ALS ENDOKRINES ORGAN, LEYDIG-ZELLEN Der Steroidhormon-produzierende Teil des Hodens, und somit sein endokriner Part, besteht vor allem aus den im Interstitium gelegenen Leydig-Zellen. Ihre Aktivität und somit die Androgen- Produktion beginnt bereits im Fetus-Alter, wenn sich die männlichen Geschlechtsmerkmale ausbilden. Innerhalb dieser Aktivitätsphase wird auch von „fetalen Leydig-Zellen“ gesprochen. Nachdem die Maskulinisierung des Körpers abgeschlossen ist, treten die Leydig-Zellen in einen Aktivitäts-Stopp, welcher erst wieder mit dem Eintritt in die Pubertät aufgehoben wird [Silverthorn, 2009]. Ab diesem Zeitpunkt spricht man auch von „adulten Leydig-Zellen“. Histologisch stellen diese sich als große Zellen mit einem dezentralen, ovoid bis runden Kern dar. In ihrem Zytoplasma sind nur wenige Lipidtröpfchen erkennbar, was mit der Steroidbiosynthese in Verbindung gebracht wird. Außerdem besitzen Leydig-Zellen während ihrer Aktivitätsphase ein deutlich erkennbares ER, sowie zahlreiche Mitochondrien [Prince, 1984]. Die Spermatogenese wird maßgeblich durch die hormonelle Kontrolle über die Hypothalamus- Hypophysen-Achse gesteuert. Der Hypothalamus schüttet das Gonadoliberin (gonadotropin- releasing hormone, GnRH) aus, welches die Freisetzung des follikelstimulierenden Hormons (follicle Einleitung 16 stimulating hormone, FSH) und des luteinisierenden Hormons (luteinizing hormone, LH) aus dem Hypophysenvorderlappen (HVL) bedingt. Die GnRH- Ausschüttung erfolgt dabei regelmäßig und pulsatil im Abstand von ca. 90 Minuten und beeinflusst die LH-Freisetzung in gleicher Weise. Die FSH-Freisetzung wird zusätzlich durch Inhibin und Aktivin beeinflusst und folgt deswegen nicht diesem regelmäßigen Schema. Die männlichen Keimzellen besitzen im Gegensatz zu den weiblichen Keimzellen keine Rezeptoren für FSH und so stimuliert FSH im männlichen Organismus die Spermatogenese indirekt durch eine Bindung an Sertoli-Zellen [Silverthorn, 2009]. Diese wirken durch die Synthese parakriner Moleküle aktivierend auf die Mitose der Spermatogonien. Außerdem wirkt FSH sowohl anregend auf die Synthese des Androgen-bindenden Proteins (androgen binding protein, ABP), als auch auf die Synthese von Inhibin [Silverthorn, 2009]. Die Leydig-Zellen spielen vielleicht die wichtigste Rolle für die endokrine Kontrolle der Spermatogenese. Durch die Anregung der Leydig-Zellen mit LH wird ihre Testosteron-Produktion stimuliert. Testosteron hemmt wiederum die Ausschüttung von LH im HVL, sowie die Synthese von GnRH im Hypothalamus. Die Anregung der LH-Rezeptoren an der äußeren Zellmembran bewirkt eine Aktivierung der Adenylatcyclase und damit einen Anstieg des intrazellulären cAMP [Saez, 1994]. Dieser Mechanismus ruft eine Rekrutierung von Cholesterin hervor, aus welchem dann in den Mitochondrien Pregnenolon gebildet wird [Miller, 2007]. Pregnenolon wird im ER dann weiter zu Testosteron umgebaut. Die Spermatozyten besitzen zwar keine Rezeptoren für Androgene wie Testosteron, exprimieren allerdings Rezeptoren für ABP. Die Sertoli-Zellen hingegen besitzen Androgen-Rezeptoren und sezernieren ABP. Deswegen wird davon ausgegangen, dass die Wirkung des Testosterons auch indirekt über die Sertoli-Zellen vermittelt wird [Silverthorn, 2009]. 1.3.2. DER HODEN ALS EXOKRINES ORGAN, SERTOLI-ZELLEN UND SAMENKANÄLCHEN Die Samenkanälchen, oder auch tubuli seminiferi convoluti, bilden in ihrer Summe den exokrinen Teil des Hodens. Sie beinhalten jeweils zwei verschiedene Arten von Zellen, die Keimzellen in unterschiedlichen Stadien der Entwicklung, und die Sertoli-Zellen. Die Sertoli-Zellen gestalten das Gerüst der Samenkanälchen, indem sie radspeichenartig in das Lumen hineinragen und Ausläufer in lateraler und apikaler Richtung ausbilden. Zwischen den Sertoli-Zellen und ihren Ausläufern findet Einleitung 17 die Spermatogenese statt. Hier entwickeln sich die Spermatogonien vom Spermatogonium bis zum Spermatozoon (Spermium). Die Sertoli-Zellen nehmen dabei direkten Einfluss auf die Keimzellen und regulieren ihre Entwicklung. So durchlaufen die Sertoli-Zellen, abhängig vom Zyklus des Keimepithels, morphologische und funktionelle Veränderungen und wirken außerdem über Rezeptoren für FSH, die auf oder innerhalb der Zelle lokalisiert sind, auf die Entwicklung der Keimzellen ein [Heckert und Griswold, 1993; Ye et al., 1993]. Darüber hinaus sind sie für die Versorgung und Regulierung der Spermienentwicklung zuständig, indem sie Proteine wie Inhibin und Aktivin, sowie Wachstumsfaktoren, Enzyme und ABP sezernieren. ABP bindet im Lumen des Samenkanälchens an Testosteron, wodurch dieses besser löslich wird. Durch die Proteinbindung des Testosterons wird auch eine Anreicherung im Lumen ermöglicht [Silverthorn, 2009]. Da Sertoli- Zellen im adulten Organismus nicht mehr mitotisch aktiv sind, bestimmt ihre Anzahl die Größe und die Produktionsleistung des Hodens [Clermont und Perey, 1957; Orth et al., 1988]. Die Spermatogenese findet von außen nach innen statt, sodass der Reifegrad der Spermatogonien entsprechend von außen nach innen hin zunimmt, bis die reifen Spermatozoen in das Lumen des Samenkanälchens entlassen werden und von dort ihren Weg durch den Nebenhoden beginnen. Um die tubuli seminiferi herum befindet sich eine Basallamina, die als Barriere dient und das jeweilige Kanälchen vor größeren Molekülen aus der interstitiellen Flüssigkeit abschirmt. In dieser Funktion trägt die Basallamina auch zur Bildung der sogenannten Blut-Hoden-Schranke (BHS) bei [Bergmann et al., 1989]. Die BHS unterteilt das Keimepithel in ein basales und ein adluminales Kompartiment. Hauptbestandteil dieser Blut-Hoden-Schranke bilden allerdings die Sertoli-Zellen, die durch tight junctions miteinander verbunden sind und so einen umfangreichen Schutz der Samenkanälchen gegen äußere Einflüsse gewährleisten. Neben ihrer Ammenfunktion und der Bildung der Blut- Hoden-Schranke, sind die Sertoli-Zellen während der Embryonalentwicklung durch die Sekretion des Anti-Müller-Hormons (AMH) an der Rückbildung der Müller-Gänge beteiligt. Die Struktur der BHS wurde durch Bergmann et al. untersucht und im Menschen beschrieben [Bergmann et al., 1989]. Sie fungiert als Schutzschild der Keimzellen vor exogenen und endogenen Einflüssen aus der interstitiellen Flüssigkeit. In den letzten Jahren gab es mehr und mehr Interesse an Transportern, die Substanzen unter Umgehung der BHS in den Hoden hinein oder aus dem Hoden hinaus schleusen können. Eine solche Passage, welche durch die Sertoli-Zellen hindurch verlaufen muss, könnte z. B. durch MRP1, MRP4 oder das breast cancer resistance protein (BCRP) vermittelt werden [Robillard et al., 2012; Fietz et al., 2013]. Einleitung 18 1.3.2.1 SPERMATOGENESE UND KEIMZELLEN Die Spermatogenese findet innerhalb der testikulären Samenkanälchen statt, die aus der peritubulären Lamina propria und dem Samenepithel bestehen. Letzteres besteht aus den Keimzellen und den somatischen Sertoli-Zellen. Die Urkeimzellen der Spermatogenese sind die Spermatogonien. Die spermatogenen Zellen werden von den Sertoli-Zellen und ihren Ausläufern eingefasst und machen im Zuge ihrer Entwicklung eine umfangreiche Vermehrung und Transformation durch: Zunächst durchlaufen sie mehrere mitotische Teilungen, was zu einer Anhäufung von Spermatogonien in der Nähe des basalen Endes der Sertoli-Zellen führt. Einige dieser neugebildeten Spermatogonien verbleiben an ihrer Position um in Zukunft weitere Spermatogonien zu bilden, während sich andere im ersten Schritt der Spermatogenese auf meiotischem Weg zu primären Spermatozyten entwickeln [Silverthorn, 2009]. Im weiteren Verlauf gehen aus diesen meiotisch erst die sekundären Spermatozyten und dann die haploiden Spermatiden hervor [Weyrauch et al., 2009]. Letztere vollführen in der Endphase der Spermatogenese eine Transformation zu Spermien. In dieser Phase findet auch die Golgi-, Kappen-, Akrosomen- und Reifungsphase statt, nach deren Durchlaufen die Spermien in das Lumen der Samenkanälchen entlassen werden. Erst während der Passage des intratestikulären, spermienableitenden Systems und des Nebenhodens erlangen die Spermien ihre Eigenmotilität und ihre Befruchtungsfähigkeit [Weyrauch et al., 2009]. 1.3.2.2. STADIEN DER SPERMATOGENESE Wie in Punkt 3.2. bereits beschrieben durchlaufen die Keimzellen im Zuge ihrer Entwicklung verschiedene Stadien. Diese Stadien werden in sechs verschiedene Phasen unterteilt [Heller und Clermont, 1963; Clermont, 1966]. Die Spermatogenese umfasst dabei die Proliferation der Spermatogonien, die Meiose der Spermatozyten und die Differenzierung von Spermatiden zu Spermatozoen. Diese sogenannten "Stadien der Spermatogenese" treten sequenziell entlang der Länge eines Samenkanälchens auf, wobei sich die Keimzellen mit zunehmender Ausreifung in Richtung des Lumens schieben [Bergmann, 2005]. Histologisch können die einzelnen Stadien wie folgt voneinander differenziert werden: Einleitung 19 Stadium I:  Zwei verschiedene Generationen von Spermatiden treten auf  Runde und elongierte Spermatiden liegen scheinbar ungeordnet zusammen  Auftreten von primären Spermatozyten im Pachytänstadium  Vorkommen von Typ A und Typ B Spermatogonien (Sowohl Typ A als auch Typ B sind mitotisch aktiv. Unterschieden werden Typ A Spermatogonien, die den Stammzellpool bilden und Typ B Spermatogonien, die zur Weiterentwicklung in die Meiose eintreten) Stadium II:  Einige Spermien sind kurz vor der Reifung  Die Residualkörperchen-Abschnürung kann bei den Spermatiden beobachtet werden, sowie eine Vollendung der Spermiation  Es treten pachytäne Spermatozyten auf  Weiterhin Vorkommen von Typ A und Typ B Spermatogonien  Entlassung der Spermien in das Lumen des Samenkanälchens Stadium III:  Nur noch eine Spermatidengeneration erkennbar  Auftreten von pachytänen und präleptotenen Spermatozyten  Vorkommen von Typ A Spermatogonien Stadium IV:  Beginn der Elongation runder Spermatiden  Auftreten von präleptotenen und leptotenen Spermatozyten  Vorkommen von Typ A Spermatogonien Einleitung 20 Stadium V:  Elongation der runden Spermatiden  Auftreten von präleptotenen und leptotenen Spermatozyten  Vorkommen von Typ A Spermatogonien  Eintritt der Spermatozyten in die 1. Meiotische Reifeteilung Stadium VI:  Auftreten von sekundären Spermatozyten mit Übergang in die 2. Meiotische Reifeteilung  Vorkommen runder Spermatiden 1.3.3. STÖRUNGEN DER SPERMATOGENESE Die Störungen der hormonellen und genetischen Kontrollmechanismen der Spermatogenese, unabhängig von ihrer Ätiologie, können zu einer inkonsistenten Spermienproduktion, zur Bildung fehlerhafter oder nicht funktioneller Spermien und in schweren Fällen zu Azoospermie und Unfruchtbarkeit führen. Man unterscheidet Störungen der hormonellen Regulationsmechanismen, Störungen der genetischen Regulationsmechanismen, Störungen der sequenziellen Expression von Kernproteinen in haploiden Spermatiden, Störungen der transkriptionellen Regulationsmechanismen und Störungen der translationalen Regulationsmechanismen [Steger, 2001]. Störungen der Spermatogenese können also verschiedene Ursachen haben, die auf jeder Ebene der Spermienentwicklung zu finden sind. Nur wenige führen dabei zu Unfruchtbarkeit. Man spricht allgemein von einer Hypospermatogenese (hyp), wenn die Spermatogenese zwar qualitativ intakt ist, aber quantitativ reduziert ist. In diesem Fall werden noch intakte Spermien gebildet, weshalb es bei dieser Störung in der Regel nicht zur Ausbildung einer Infertilität kommt. Einleitung 21 Die Spermatogenese kann allerdings auch auf verschiedenen Stufen sistieren. In diesem Fall spricht man von einem Arrest der Entwicklung. Dieser wird, je nach der Stufe des Entwicklungsstopps, benannt in Spermatidenarrest (sda), Spermatozytenarrest (sza) oder Spermatogonienarrest (sga). Wenn sich in den Samenkanälchen neben den Sertoli-Zellen keinerlei Entwicklungsstadien der Spermatogonien befinden, spricht man von einer Germinalzellaplasie, oder dem sertoli cell only syndrome (SCO). Dies wird noch gesteigert durch den sogenannten „Tubulusschatten“. In diesem Fall fehlen im Samenkanälchen sowohl jegliche Entwicklungsstadien der Spermatogonien, als auch die Sertoli-Zellen. Bei zytologischen Untersuchungen der Samenflüssigkeit wird besonders häufig das OAT-Syndrom (Oligoasthenoteratozoospermie) diagnostiziert [Cooper et al. 2010]. In diesem Fall scheint der Serum-FSH-Spiegel eine Rolle zu spielen. Er korreliert negativ mit der Spermienzahl und positiv mit dem Schweregrad eines SCO [Bergmann et al., 1994; Martin-du-Pan und Bischof, 1995; Yaman et al., 1999; Steger, 2001]. Die OAT ist gekennzeichnet durch das Bild der „bunten Atrophie“, was bedeutet, dass in benachbarten Samenkanälchen gleichzeitig sowohl eine qualitativ normale Spermatogenese, ein Entwicklungsarrest auf verschiedenen Stufen, als auch das SCO auftreten können [Sigg, 1979; Steger, 2001]. Die Ausbildung einer generellen Unfruchtbarkeit setzt voraus, dass schwerwiegende Störungen in bestimmten, kritischen Phasen der Entwicklung auftreten. Diese kritischen Phasen umfassen vor allem die Differenzierung von Spermatogonien zu Spermatozyten, die Meiose innerhalb der Spermatozyten und die Metamorphose während der Spermiogenese [Toshimori et al., 2004]. Tritt beispielsweise eine Mutation in Form eines Polymorphismus in der Sequenz eines Gens auf, welches eine dieser Phasen substanziell beeinflusst, kann es von verschiedenen, milden Störungen der Spermatogenese bis hin zur Ausbildung einer manifestierten Infertilität kommen. 1.4. SODIUM-DEPENDENT ORGANIC ANION TRANSPORTER, SOAT/SOAT Neben der de novo Steroidhormonsynthese in den Reproduktionsorganen bietet der Weg über die StS eine alternative Möglichkeit, biologisch aktive Steroidhormone in peripheren Organen zu bilden [Pasqualini et al., 1989; Labrie et al., 2003; Luu-The, 2013]. Um dies zu ermöglichen werden jedoch Aufnahmetransporter benötigt, welche Steroidsulfate aus der Blutzirkulation in eine Zielzelle Einleitung 22 aufnehmen können. Darüber hinaus kann ein Zusammenspiel von Aufnahme- und Effluxtransportern für Steroidsulfate die Überwindung von Blut-Gewebe-Schranken wie der BHS ermöglichen [Hartmann et al., 2016]. Neben den bereits bekannten Aufnahmetransportern für sulfokonjugierte Steroidhormone wurde im Jahr 2004 der sodium-dependent organic anion transporter SOAT/Soat identifiziert [Geyer et al., 2004]. SOAT/Soat hebt sich dabei durch seine hohe Substratspezifität für Steroid-Sulfate von den anderen bereits beschriebenen Transportern ab. Während OATPs, OATs und MRPs multispezifisch eine Vielzahl von unterschiedlichen Substraten erkennen und transportieren, scheint SOAT/Soat auf den Transport sulfokonjugierter Steroidhormone spezialisiert zu sein. Eine weitere Besonderheit von SOAT/Soat ist die strikte Natrium-Abhängigkeit des Transportes. Interessant werden diese Charakteristika allerdings erst, wenn man sich das Expressionsprofil von SOAT/Soat ansieht: Im Menschen wird SOAT prädominant im Hoden exprimiert und wurde unter anderem auch in Haut, Pankreas und Brustdrüse nachgewiesen. In der Maus zeigt Soat die höchste Expression in Lunge, Haut und Hoden. In beiden Spezies wurde das Protein mittels Immunhistochemie (IHC) vor allem in Spermatozyten und Spermatiden detektiert, was vermuten lässt, dass SOAT/Soat im Hoden von Mensch und Maus ähnliche Funktionen wahrnimmt [Geyer et al., 2007; Fietz et al., 2013; Grosser et al., 2013]. Darüber hinaus konnten Fietz et al. eine verminderte Expression von SOAT bei verschiedenen Störungen der Spermatogenese nachweisen [Fietz et al., 2013]. Durch das auffällige Expressionsprofil von SOAT/Soat sowie seine hohe Spezifität für sulfokonjugierte Steroidhormone könnte dieser Transporter eine besondere Rolle für die lokale Versorgung mit Steroiden im Hoden und somit für die männliche Fruchtbarkeit spielen. Basierend auf dieser Hypothese sollte in der vorliegenden Arbeit ein Zusammenhang zwischen SOAT-vermitteltem Transport sulfokonjugierter Steroide und einer Störung der Spermatogenese untersucht werden. Hierfür wurden zwei Situationen betrachtet, in denen von einem defizienten SOAT-Transport ausgegangen werden muss. Hierbei handelte es sich zum einen um funktionsbeeinträchtigende, natürlich vorkommende genetische Varianten beim Menschen und zum anderen um eine gezielte Mutation des Slc10a6-Gens in einer Slc10a6-Knockout-Maus. In beiden Situationen sollte untersucht werden, ob der Funktionsverlust von SOAT/Soat zu einer Störung der Spermatogenese und einer möglichen anschließenden Unfruchtbarkeit führt. Die Ergebnisse dieser Untersuchungen werden in der folgenden Diskussion vorgestellt und diskutiert. Übersicht der Publikationen mit Darstellung des Eigenanteils 23 2. ÜBERSICHT DER PUBLIKATIONEN MIT DARSTELLUNG DES EIGENANTEILS Der vorliegenden Dissertationsschrift liegen die folgenden drei Publikationen zu Grunde (Volltext siehe Anhang). 2.1. PUBLIKATION #1 Grosser, G., Bennien, J., Sánchez-Guijo, A., Bakhaus, K., Döring, B., Hartmann, M., Wudy, S.A., Geyer, J. (2018): „Transport of steroid 3-sulfates and steroid 17-sulfates by the sodium-dependent organic anion transporter SOAT (SLC10A6)“ Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 179 (2018) 20-25 doi: 10.1016/j.jsbmb.2017.09.013 (Authors in bold equally contributed) Abstract: The sodium-dependent organic anion transporter SOAT/Soat shows highly specific transport activity for sulfated steroids. SOAT substrates identified so far include dehydroepiandrosterone sulfate, 16α-hydroxydehydroepiandrosterone sulfate, estrone-3-sulfate, pregnenolone sulfate, 17β- estradiol-3-sulfate, and androstenediol sulfate. Apart from these compounds, many other sulfated steroids occur in mammals. Therefore, we aimed to expand the substrate spectrum of SOAT and analyzed the SOAT-mediated transport of eight different sulfated steroids by combining in vitro transport experiments in SOAT-transfected HEK293 cells with LC–MS/MS analytics of cell lysates. In addition, we aimed to better understand the structural requirements for SOAT substrates and so selected structural pairs varying only at specific positions: 3α/3β-sulfate, 17α/17β- sulfate, mono- sulfate/di-sulfate, and 17α-hydroxylation. We found significant and sodium-dependent SOAT mediated transport of 17α-hydroxypregnenolone sulfate, 17β-estradiol-17-sulfate, androsterone sulfate, epiandrosterone sulfate, testosterone sulfate, epitestosterone sulfate, and 5α- dihydrotestosterone sulfate. However, 17β-estradiol-3,17-disulfate was not transported by SOAT. In conclusion: SOAT substrates from the group of sulfated steroids are characterized by a planar and lipophilic steroid backbone in trans-trans-trans conformation of the rings and a negatively charged mono-sulfate group at positions 3′ or 17′ with flexibility for α- or β- orientation. Furthermore, 5α- reduction, 16α-hydroxylation, and 17α-hydroxylation are acceptable for SOAT substrate recognition, whereas addition of a second negatively charged sulfate group seems to abolish substrate binding to SOAT, and so 17β-estradiol-3,17-disulfate is not transported by SOAT. Übersicht der Publikationen mit Darstellung des Eigenanteils 24 2.1.1 EIGENANTEIL PUBLIKATION #1 Publication 1: Grosser, G., Bennien, J., Sánchez-Guijo, A., Bakhaus, K., Döring, B., Hartmann, M., Wudy, S.A., Geyer, J. (2017): „Transport of steroid 3-sulfates and steroid 17-sulfates by the sodium-dependent organic anion transporter SOAT (SLC10A6)“ Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, in press, corrected proof. http://dx.doi.org/10.1016/j.jsbmb.2017.09.013 Authors in bold equally contributed. In this publication, I was involved in study design and selection of the analytes. Furthermore, the transport studies were performed by me, including cell culture, substance preparation, handling of the samples, conducting the experiment and protein measurement. The following LC/MS-MS analysis took place in the laboratory of Prof. Wudy. Dr. Sánchez-Guijo subsequently provided me the raw data, which I processed statistically and graphically. Moreover, I was involved in the composition of the manuscript, particularly in the material and methods part, the results part, and the discussion. I hereby confirm that I fully agree with the presentation of the contribution of Josefine Bennien to the publication given above: Prof. Dr. Joachim Geyer Prof. Dr. Stefan A. Wudy Dr. Gary Grosser Dr. Alberto Sánchez-Guijo Dr. Katharina Bakhaus Dr. Barbara Döring Dr. Michaela Hartmann Übersicht der Publikationen mit Darstellung des Eigenanteils 25 Publication 1 (Fortsetzung): Grosser, G., Bennien, J., Sánchez-Guijo, A., Bakhaus, K., Döring, B., Hartmann, M., Wudy, S.A., Geyer, J. (2017): „Transport of steroid 3-sulfates and steroid 17-sulfates by the sodium-dependent organic anion transporter SOAT (SLC10A6)“ Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, in press, corrected proof. http://dx.doi.org/10.1016/j.jsbmb.2017.09.013 Authors in bold equally contributed. In this publication, I was involved in study design and selection of the analytes. Furthermore, the transport studies were performed by me, including cell culture, substance preparation, handling of the samples, conducting the experiment and protein measurement. The following LC/MS-MS analysis took place in the laboratory of Prof. Wudy. Dr. Sánchez-Guijo subsequently provided me the raw data, which I processed statistically and graphically. Moreover, I was involved in the composition of the manuscript, particularly in the material and methods part, the results part, and the discussion. I hereby confirm that I fully agree with the presentation of the contribution of Josefine Bennien to the publication given above: Prof. Dr. Joachim Geyer Prof. Dr. Stefan A. Wudy Dr. Gary Grosser Dr. Alberto Sánchez-Guijo Dr. Katharina Bakhaus Dr. Barbara Döring Dr. Michaela Hartmann Übersicht der Publikationen mit Darstellung des Eigenanteils 26 2.2. PUBLIKATION #2 Bennien, J., Fischer, T., Geyer, J. (2018): „Rare genetic variants in the sodium-dependent organic anion transporter SOAT (SLC10A6): Effects on transport function and membrane expression“ Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 179 (2018) 26-35 doi: 10.1016/j.jsbmb.2017.09.004 Abstract: Sulfo-conjugated steroid hormones, such as dehydroepiandrosterone sulfate (DHEAS), pregnenolone sulfate or estrone-3-sulfate are abundant in the body, but are biologically inactive at classical androgen and estrogen steroid receptors. However, after carrier-mediated import and de- conjugation by the steroid sulfatase, these compounds participate in the overall steroid regulation of reproductive organs. The sodium-dependent organic anion transporter SOAT, coded by the SLC10A6 gene, is specific for the transport of steroid sulfates and is highly expressed in testicular germ cells, including pachytene spermatocytes, secondary spermatocytes, and round spermatids. Therefore, SOAT is supposed to be involved in the regulation of spermatogenesis and male fertility. In the present study, the SLC10A6 gene was analyzed for rare genetic variants, which might affect transport function or membrane expression of SOAT. Among the 31 SOAT variants analyzed, L44P, Q75R, P107L, G109S, S112F, N113K, S133F, G241D, G263E, G294R, and Y308N showed no transport activity for DHEAS at all. In the case of P107L, G241D, G263E, and Y308N, this was most likely due to significantly reduced expression in the plasma membrane. Other variants are located directly at (Q75R, S112F, N113K) or close to (G109S, S133F, and G263E) the supposed SOAT Na+ binding sites and thus could disable the sodium-coupled transport cycle. If these loss-of-function SOAT variants are more frequent in men with impaired spermatogenesis or infertility needs further investigation. Übersicht der Publikationen mit Darstellung des Eigenanteils 27 2.2.1 EIGENANTEIL PUBLIKATION #2 Publication 2: Bennien, J., Fischer, T., Geyer, J. (2017): „Rare genetic variants in the sodium-dependent organic anion transporter SOAT (SLC10A6): Effects on transport function and membrane expression“ Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, in press, corrected proof. http://dx.doi.org/10.1016/j.jsbmb.2017.09.004 In this publication, I was involved in the experimental design. In addition, I planned and conducted all mutations of the constructs, including primer design, generation of the PCR protocol, performing of the PCR and evaluation and amplification of the constructs. Furthermore, I carried out the transport experiments with radiolabeled compounds. These included cell culture, transfection of the mutant constructs into the cells, preparation of the samples, and performance of the experiments, protein measurement and liquid scintillation counting. The evaluation, statistical and graphical processing of the data was performed by Dr. Fischer and me. 3D homology modelling of SOAT was carried out by me. Moreover, I was involved in the preparation of the draft manuscript, particularly regarding the material and methods part, the results part and the discussion. I hereby confirm that I fully agree with the presentation of the contribution of Josefine Bennien to the publication given above: Prof. Dr. Joachim Geyer Dr. Thomas Fischer Übersicht der Publikationen mit Darstellung des Eigenanteils 28 2.3. PUBLIKATION #3 Bakhaus, K., Bennien, J., Fietz, D., Sánchez-Guijo, A., Hartmann, M., Serafini, R., Love, C.C., Golovko, A., Wudy, S.A., Bergmann, M., Geyer, J. (2018): „Sodium-dependent organic anion transporter (Slc10a6−/−) knockout mice show normal spermatogenesis and reproduction, but elevated serum levels for cholesterol sulfate“ Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology 179 (2018) 45-54 doi: 10.1016/j.jsbmb.2017.07.019 (Authors in bold equally contributed) Abstract: The sodium-dependent organic anion transporter SOAT (gene name SLC10A6 in man and Slc10a6 in mice) is a plasma membrane transporter for sulfated steroids, which is highly expressed in germ cells of the testis. SOAT can transport biologically inactive sulfated steroids into specific target cells, where they can be reactivated by the steroid sulfatase (StS) to biologically active, unconjugated steroids known to regulate spermatogenesis. Significantly reduced SOAT mRNA expression was previously found in different forms of impaired spermatogenesis in man. It was supposed that SOAT plays a role for the local supply of steroids in the testis and consequently for spermatogenesis and fertility. Thus, an Slc10a6−/− Soat knockout mouse model was established by recombination-based target deletion of the Slc10a6 gene to elucidate the role of Soat in reproduction. However, the Slc10a6−/− knockout mice were fertile, produced normal litter sizes, and had normal spermatogenesis and sperm vitality. This phenotype suggests that the loss of Soat can be compensated in the knockout mice or that Soat function is not essential for reproduction. In addition to reproductive phenotyping, a comprehensive targeted steroid analysis including a set of 9 un- conjugated and 12 sulfo-conjugated steroids was performed in serum of Slc10a6−/− knockout and Slc10a6+/+ wildtype mice. Only cholesterol sulfate, corticosterone, and testosterone (only in the males) could be detected in considerable amounts. Interestingly, male Slc10a6−/− knockout mice showed significantly higher serum levels for cholesterol sulfate compared to their wildtype controls. As cholesterol sulfate has a broader impact apart from the testis, further analysis of this phenotype will include other organs such as skin and lung, which also show high Soat expression in the mouse. Übersicht der Publikationen mit Darstellung des Eigenanteils 29 2.3.1 EIGENANTEIL PUBLIKATION #3 Publication 3: Bakhaus, K., Bennien, J., Fietz, D., Sánchez-Guijo, A., Hartmann, M., Serafini, R., Love, C.C., Golovko, A., Wudy, S.A., Bergmann, M., Geyer, J. (2017): „Sodium-dependent organic anion transporter (Slc10a6−/−) knockout mice show normal spermatogenesis and reproduction, but elevated serum levels for cholesterol sulfate“ Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, in press, corrected proof. http://dx.doi.org/10.1016/j.jsbmb.2017.07.019 Authors in bold equally contributed. In this publication, I contributed to the experimental design and the development of the study course. I conducted the dissection of the mice, as well as the preparation and processing of the organ samples. The process of immunohistochemistry was performed by Dr. Bakhaus and me; I carried out the microscopic analysis of the immunostained organ-slides and generated the fluorescent pictures. Furthermore, I was involved in RNA and cDNA preparation. The raw data regarding the reproductive behavior of the mice was evaluated and processed graphically and statistically by Dr. Bakhaus and me. The LC/MS-MS analysis took place in the laboratory of Prof. Wudy. Dr. Sánchez-Guijo subsequently provided the raw data, which I processed statistically and graphically. CASA-analysis was performed at the College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences. The raw data regarding the sperm analysis was provided by Dr. Golovko. Evaluation, as well as graphical and statistical processing of the CASA data was performed by me. In addition, I was involved in the preparation of the manuscript. I hereby confirm that I fully agree with the presentation of the contribution of Josefine Bennien to the publication given above: Prof. Dr. Joachim Geyer Prof. Dr. Martin Bergmann Prof. Dr. Stefan A. Wudy Dr. Katharina Bakhaus Dr. Daniela Fietz Dr. Michaela Hartmann Übersicht der Publikationen mit Darstellung des Eigenanteils 30 Publication 3 (Fortsetzung): Bakhaus, K., Bennien, J., Fietz, D., Sánchez-Guijo, A., Hartmann, M., Serafini, R., Love, C.C., Golovko, A., Wudy, S.A., Bergmann, M., Geyer, J. (2017): „Sodium-dependent organic anion transporter (Slc10a6−/−) knockout mice show normal spermatogenesis and reproduction, but elevated serum levels for cholesterol sulfate“ Journal of Steroid Biochemistry and Molecular Biology, in press, corrected proof. http://dx.doi.org/10.1016/j.jsbmb.2017.07.019 Authors in bold equally contributed. In this publication, I contributed to the experimental design and the development of the study course. I conducted the dissection of the mice, as well as the preparation and processing of the organ samples. The process of immunohistochemistry was performed by Dr. Bakhaus and me; I carried out the microscopic analysis of the immunostained organ-slides and generated the fluorescent pictures. Furthermore, I was involved in RNA and cDNA preparation. The raw data regarding the reproductive behavior of the mice was evaluated and processed graphically and statistically by Dr. Bakhaus and me. The LC/MS-MS analysis took place in the laboratory of Prof. Wudy. Dr. Sánchez-Guijo subsequently provided the raw data, which I processed statistically and graphically. CASA-analysis was performed at the College of Veterinary Medicine and Biomedical Sciences. The raw data regarding the sperm analysis was provided by Dr. Golovko. Evaluation, as well as graphical and statistical processing of the CASA data was performed by me. In addition, I was involved in the preparation of the manuscript. I hereby confirm that I fully agree with the presentation of the contribution of Josefine Bennien to the publication given above: Prof. Dr. Joachim Geyer Prof. Dr. Martin Bergmann Prof. Dr. Stefan A. Wudy Dr. Katharina Bakhaus Dr. Daniela Fietz Dr. Michaela Hartmann Dr. Alberto Sánchez-Guijo Übersicht der Publikationen mit Darstellung des Eigenanteils 31 Publication 3 (Fortsetzung): Andrei E. Golovko, PhD, MBA Rosanna Serafini DVM, PhD Charles C. Love DVM, PhD Diskussion 32 3. DISKUSSION 3.1. SLC10A6/SLC10A6-GEN UND SOAT/SOAT-PROTEIN Der sodium-dependent organic anion transporter (SOAT als Abkürzung für das menschliche Protein, Soat entsprechend für die tierischen Homologe) wurde das erste Mal im Jahr 2004 aus Nebennierengewebe einer Ratte kloniert und charakterisiert [Geyer et al., 2004]. Im Jahr 2007 wurde auch das menschliche SOAT-Gen beschrieben [Geyer et al., 2007]. Das SLC10A6- Gen besitzt eine Gesamtlänge von 25,8 kb. Es befindet sich auf Chromosom 4 und wird durch sechs Exone kodiert, die in der Region 4q21.3 kartiert sind. Seine Zugehörigkeit zur SLC10-Transporter- Familie, die auch als sodium/bile acid cotransporter family bekannt ist, basiert auf seiner hohen Aminosäuresequenzhomologie zum apical sodium-dependent bile acid transporter (ASBT) (41,8% Sequenzidentität, 69,7% Sequenzähnlichkeit) und zum natrium/taurocholate cotransporting polypeptide (NTCP) (33,4% Sequenzidentität, 62,6% Sequenzähnlichkeit) [Geyer et al., 2007]. NTCP, ASBT und SOAT haben einige gemeinsame Sequenzmotive, von welchen das Motiv „ALGMMPL“ als Signaturmotiv der SLC10-Familie beschrieben wurde [Geyer et al., 2006]. Das SOAT-Transkript umfasst insgesamt 1502 Basenpaare (bp) und beinhaltet einen offenen Leserahmen von 1134 bp. Das SOAT-Protein besteht aus 377 Aminosäuren und hat ein berechnetes Molekulargewicht von 41,2 kDa. Das scheinbare Molekulargewicht der glycosylierten Form liegt im Western Blot bei 46 kDa, nach PNGase F-Behandlung liegt das scheinbare Molekulargewicht der unglycolisierten Form bei 42 kDa. Die Membrantopologie wurde mit Hilfe von bioinformatischen Berechnungen auf 7-9 Transmembrandomänen bestimmt. Experimentell konnte für den N-Terminus des Proteins eine extrazelluläre und für den C-Terminus eine intrazelluläre Lokalisation festgestellt werden [Döring, 2009], was eine Struktur mit 8 Transmembrandomänen ausschließt. Basierend auf zwei jüngeren Kristallstrukturen von bakteriellen homologen zu NTCP, ASBT und SOAT, spricht einiges für eine 9 Transmembrandomänen Struktur von SOAT [Hu et al., 2011; Zhou et al., 2014; Döring et al., 2012]. Diskussion 33 3.2. TRANSPORTFUNKTION Im Laufe des Charakterisierungsprozesses von SOAT/Soat wurde die physiologische Transportfunktion des Proteins in verschiedenen Expressionsmodellen untersucht. Obwohl SOAT/Soat phylogenetisch in die sodium/bile acid cotransporter family gehört, zeigt das Protein keinerlei Transportaktivität für Gallensäuren. In verschiedenen Experimenten konnte allerdings eine Transportaktivität für E1S, DHEAS und PregS nachgewiesen werden, welche infolgedessen grundlegend für seine Charakterisierung als spezifischer Steroid-Sulfat Aufnahme-Transporter waren [Geyer et al., 2004; Geyer et al., 2007; Grosser et al., 2013; Geyer et al., 2017]. Zunächst wurde getestet, ob das Homolog der Ratte (rSoat) als Transporter für Steroid-Substrate fungiert. Hierzu wurde die Aufnahmen von E1S, DHEAS, Taurocholat (TC), Estradiol-17β-Glucuronid und Ouabain im xenopus laevis-Expressionssystems gemessen [Geyer et al., 2004]. Auf diese Weise konnte gezeigt werden, dass rSoat in x. laevis Oozyten zwar Transportaktivität für E1S und DHEAS besitzt, jedoch nicht für TC, Estradiol-17β-Glucuronid und Ouabain. Im weiteren Verlauf der Experimente in x. laevis Oozyten konnte gezeigt werden, dass der Ersatz von NaCl durch äquimolare Konzentrationen von Cholinchlorid im Transportpuffer die E1S-Aufnahme aufhebt. Auf diese Weise konnte eine Abhängigkeit des rSoat-Transports vom elektrochemischen Natrium-Gradienten bewiesen werden. Darüber hinaus wurde auch die Kinetik der rSoat-vermittelten E1S- und DHEAS- Aufnahme, unter Verwendung zunehmender Substratkonzentrationen, in diesem System gemessen [Geyer et al., 2004]. Im Jahr 2007 wurde die funktionelle Charakterisierung des menschlichen SOAT Proteins in stabil transfizierten SOAT-HEK293-Zellen unter Verwendung des Flp-In-T-REx-Expressionssystems durchgeführt [Geyer et al., 2007]. In diesem System steht die SOAT-Expression unter der Kontrolle des Tetracyclin-regulierten Cytomegalovirus/tetO2-Hybrid-Promotors. Deswegen wurde die Expression durch eine Vorbehandlung mit Tetracyclin induziert. Die Transportexperimente wurden mit mehreren radioaktiv markierten Steroidverbindungen durchgeführt. Eine SOAT-spezifische Transportaktivität konnte im Zellsystem nicht für unkonjugierte Steroide (Estron und Dehydroepiandrosteron), glucuronidierte Steroide (Estradiol-17β-D-Glucuronid und Estron-3β-D- Glucuronid), Gallensäuren (Taurocholsäure, Cholsäure, Chenodesoxycholsäure, Desoxycholsäure und Lithocholsäure) oder Herzglykoside (Ouabain und Digoxin) nachgewiesen werden. Ein Diskussion 34 spezifischer Transport wurde jedoch für DHEAS, E1S und PREGS beobachtet. Außerdem wurden im Zellsystem auch eine Charakterisierung des SOAT-Transports hinsichtlich Zeitabhängigkeit, Natrium- Abhängigkeit und Konzentrationsabhängigkeit durchgeführt. Klonierung, Expressionsanalyse und funktionelle Charakterisierung des Maus-Soat (mSoat) wurde im Jahr 2013 durchgeführt und seine Eigenschaften mit dem menschlichen SOAT-Protein verglichen [Grosser et al., 2013]. Auch hier wurden stabil transfizierte HEK293-Zellen verwendet, diesmal transfiziert mit dem mSoat Protein. Auch für mSoat konnte ein Natrium-abhängiger Transport für DHEAS, E1S und PREGS gezeigt werden. Im Gegensatz zu menschlichem SOAT, der DHEAS als Substrat bevorzugt, wies mSoat die höchste Transportrate für PREGS auf, was vermutlich Unterschiede in Steroidmuster und metabolischen Steroidwegen der beiden Spezies widerspiegelt [Conley und Bird, 1997; Fluck et al., 2003; Maninger et al., 2009; Grosser et al., 2013]. Möglicherweise liegt dieser Unterschied im Km-Wert für DHEAS zwischen SOAT und mSoat darin begründet, dass Ratten und Mäuse in der Peripherie niedrigere Konzentrationen von DHEAS aufweisen als Menschen, bei denen DHEAS das am häufigsten vorkommende Steroid im Kreislauf ist [Cutler et al., 1978; Longcope, 1996; Maninger et al., 2009; Grosser et al., 2013]. Im menschlichen Organismus wird DHEAS sowohl in den Nebennieren, als auch in den Gonaden gebildet, während die Produktion im Organismus von Ratten und Mäusen auf die Gonaden beschränkt ist [Perkins und Payne, 1988; Longcope, 1996; Maninger et al., 2009; Grosser et al., 2013]. Obwohl gewisse Unterschiede zwischen dem menschlichen SOAT-Protein und mSoat existieren, konnten beide Proteine als homologe Transporter eingeordnet werden [Grosser et al., 2013]. Klassischerweise werden Transportexperimente in vitro über eine Markierung der zu testenden Substanz mit einem radioaktiven Anhang, z. B. Tritium [3H], über Flüssigszintillationsmessung durchgeführt (liquid scintillation counting, LSC). Ein Problem bei der Nutzung von radioaktiv markierten Substanzen ist deren begrenzte kommerzielle Verfügbarkeit. Außerdem besteht bei dieser Methode die Möglichkeit, dass durch Hydrolyse dekonjugierte, oder anderweitig modifizierte Steroide fälschlicherweise mit analysiert werden, da bei dieser Methode nicht direkt das intakte Steroidmolekül, sondern nur die Radioaktivität im Flüssigszintillationscounter nachgewiesen wird [Geyer et al., 2006; Roth et al., 2012]. Aufgrund dieser Limitationen wurden auch Transportexperimenten ohne radioaktive Markierung der Substanzen mit Hilfe der Massenspektrometrie, mit vorgeschalteter Flüssigchromatografie (LC-MS/MS) durchgeführt. Diese Analysen erfolgtem im Labor von Prof. Dr. Wudy (Abteilung für pädiatrische Endokrinologie und Diskussion 35 Diabetologie, Zentrum für Kinder- und Jugendmedizin der Justus-Liebig-Universität Gießen). Diese Methode repräsentiert den Goldstandard für die Steroidanalytik und ermöglicht es hochspezifisch verschiedenste intakte und sulfokonjugierte Steroide in einem LC-MS/MS Lauf zu detektieren und zu quantifizieren [Galuska et al., 2013; Sanchez-Guijo et al., 2015a]. Mittels dieser Technik konnte die Funktionsweise von SOAT/Soat genauer unter die Lupe genommen werden [Fietz et al., 2013]. Zudem wurden Estradiol-3-Sulfat (E2-3S) und Androstendiol-Sulfat als neue SOAT-Substrate identifiziert. Auf Grundlage dieser Vorarbeiten sollte das Substratspektrum von SOAT mit Hilfe der LC-MS/MS systematisch untersucht und erweitert werden (siehe Publikation #1). Die verschiedenen sulfokonjugierten Steroide sehen sich strukturell sehr ähnlich. Den Grundaufbau bildet bei allen Vertretern das Steroidgerüst, bestehend aus drei Cyclohexanringen und einem Cyclopentanring. Angelagert an dieses Gerüst befinden sich eine oder mehrere Sulfatgruppen (SO4 2-). Moleküle nehmen ohne Energiezufuhr immer eine energetisch möglichst günstige Konformation ein. Wenn dies energetisch nicht von Bedeutung ist, können Seitengruppen auch in unterschiedlichen Konformationen vorkommen, so z. B. die SO4 2--Gruppe der Steroid-Sulfate in α- oder β-Konformation. Um definieren zu können, welche Modifikationen oder Konformationsänderungen im Steroid- Sulfatmolekül von SOAT für den Transport noch toleriert werden, wurden bedeutende Strukturunterschiede, die bei sulfokonjugierten Steroiden auftreten, näher untersucht. Der Fokus lag dabei auf der Anzahl und der Lokalisation der Sulfatgruppen an den Positionen C3 und/oder C17 (17β-Estradiol-3-Sulfat (E2-3S) vs. 17β-Estradiol-17-Sulfat (E2-17S) vs. Estradiol-Disulfat (E2-diS)), sowie deren Orientierung in C3α, C3β, C17α oder C17β Konformation (Androsteron-Sulfat (AnS), Epiandrosteron-Sulfat (epiAnS), Epitestosteron-Sulfat (eTS), Testosteron-Sulfat (TS)). Außerdem wurden mit 17α-Hydroxy-Pregnenolon-Sulfat (17α-OH-PregS) und 5α-Dihydrotestosteron-Sulfat (DHTS) noch weitere mögliche Modifikationen untersucht. Die verschiedenen sulfokonjugierten Steroide wurden in Zelltransport-Experimenten mit SOAT- HEK293 Zellen inkubiert. Über LC-MS/MS wurden die jeweiligen Steroide aus dem Zelllysat quantifiziert und so ermittelt, ob die Testsubstanz von SOAT transportiert wird. Diskussion 36 Erste Hinweise darauf, dass neben den bereits bekannten SOAT-Substraten noch weitere Steroid- Sulfate von SOAT transportiert werden, wurden zunächst mit Hilfe von Inhibitionsexperimenten ermittelt. E2-17S und E2-diS konnten dabei den [3H]DHEAS-Transport konzentrationsabhängig hemmen. E2-17S stellte sich dabei in seiner Hemmwirkung sogar als potenter heraus als E2-3S. Als Vergleich zeigte Estrone-3-Glucuronid, welches nicht von SOAT transportiert wird [Geyer et al., 2007], nur eine geringe Inhibition des [3H]DHEAS Transports, sogar bei 100-fach höherer Konzentration als das Transportsubstrat. Aus diesem Grund wurde angenommen, dass neben den bekannten an ’C3-sulfokonjugierten Steroiden auch an ’C17-sulfokonjugierte Steroide von SOAT transportiert werden könnten. Darüber hinaus wurde vermutet, dass auch das an den Positionen ’C3 und ’C17 doppelt sulfokonjugierte E2- diS ein Substrat von SOAT sein könnte. SOAT zeigt bekanntermaßen einen signifikanten Natrium-abhängigen Transport von PregS [Geyer et al., 2017; Grosser et al., 2013]. Darüber hinaus konnte mit der kombinierten Methode aus Zelltransport und LC-MS/MS nun auch 17α-OH-PregS als neues SOAT-Substrat identifiziert werden (Publikation #1). Im Vergleich zu PregS scheint hier allerdings die zusätzliche, polare OH-Gruppe an Position C17 sowohl die SOAT-Transportrate als auch die unspezifische, transportunabhängige Aufnahme von 17α-OH-PregS in die SOAT-HEK293-Zellen und in die entsprechenden Kontrollzellen zu beeinträchtigen. Daher spielt die Polarität des Substrats vermutlich eine Rolle für den SOAT- vermittelten Transport (Publikation #1). Pregnenolon (Preg) und seine Derivate PregS und 17-OH-PregS werden als wirksame Neurosteroide angesehen und kommen im ZNS in unterschiedlichen Konzentrationen vor. Im Gehirn verschiedener Mausstämme konnte zum Beispiel gezeigt werden, dass PregS im Vergleich zu Preg in relativ hohen Konzentrationen vorkommt und 17-OH-PregS, verglichen mit seiner unkonjugierten Form, prädominant vorkommt [Tagawa et al., 2006]. Neurosteroide gelten als Modulatoren von Neurotransmitter-Rezeptoren und haben daher einen Einfluss auf viele ZNS-Funktionen [Schumacher et al., 1997; Flood und Roberts, 1988; Flood et al., 1988; Baulieu, 1997; Farr et al., 2004]. Aus der Gruppe der Östrogene wurde der Transport von E2-3S, E2-17S und E2-diS über SOAT untersucht, wobei E2-3S bereits als SOAT-Substrat bekannt war [Fietz et al., 2013] Es konnte gezeigt werden, dass E2-3S und E2-17S Natrium-abhängig von SOAT transportiert werden. Im Gegensatz dazu konnte E2-diS, obwohl es im Zelllysat nachweisbar war, nicht quantifiziert werden. Dies ist Diskussion 37 höchstwahrscheinlich auf die sehr hohe Polarität und die doppelt negative Ladung des Moleküls zurückzuführen. Damit ist auch die Membranpermeabilität von E2-diS erwartungsgemäß gering. Aus diesen Gründen wird angenommen, dass E2-diS kein Substrat von SOAT ist (Publikation #1). Dass sowohl E2-3S, als auch E2-17S von SOAT transportiert werden, erscheint zunächst unplausibel. Die Erklärung hierfür ist allerdings in der hohen strukturellen Ähnlichkeit der beiden Moleküle zu finden. Sulfokonjugierte Steroide sind pseudosymmetrisch, was bedeutet, dass es strukturell gesehen gleichgültig ist, auf welcher Seite des Moleküls die SO4 2--Gruppe angehängt ist. Sowohl bei E2-3S, als auch bei E2-17S liegt das Steroidgrundgerüst in trans-trans-trans-Konformation vor. Hinzu kommen jeweils eine SO4 2--Gruppe an einem und eine OH-Gruppe am anderen Ende des Moleküls. Dieser Aufbau bewirkt, dass die beiden Moleküle eine sehr hohe strukturelle Überlappung aufweisen, wenn eins der beiden um 180° in der Ebene gedreht wird. So lässt sich auch erklären warum der Transport mit einer weiteren, am gegenüberliegenden Ende lokalisierten SO4 2--Gruppe nicht mehr funktioniert. Die zusätzliche Raumforderung, die durch die zweite SO4 2--Gruppe im E2- diS entsteht, könnte die Bindung des Moleküls in der Substrat-Bindungstasche von SOAT sterisch behindern. Eine weitere Möglichkeit könnte sein, dass die zusätzliche negative Ladung eine Bindung bzw. einen Transport über SOAT unmöglich macht. Die pathophysiologische Bedeutung von E2-3S, besonders für die Proliferation des hormonabhängigen Mammakarzinoms, ist gut bekannt [Pasqualini und Chetrite, 2012]. E2-3S wird durch Transporter vermittelte Prozesse in die Tumorzellen aufgenommen und die Sulfat-Gruppe durch die StS abgespalten [Müller et al., 2015]. Das nun biologisch aktive Estradiol aktiviert daraufhin die nukleären Östrogenrezeptoren und trägt so zur Proliferation der malignen Zellen bei. Basierend auf diesem Mechanismus sind neben Östrogenrezeptor-Antagonisten auch StS- Inhibitoren für die Brustkrebstherapie wirksam [Day et al., 2009]. Im Gegensatz dazu ist über die Rolle und das quantitative Vorkommen von E2-17S und E2-diS in Blut und Urin bis heute noch nicht viel bekannt [Zhang und Henion, 1999]. Sowohl der Serum- als auch der Urinspiegel von E2-17S nehmen im Verlauf einer Schwangerschaft zu [Yoshizawa et al., 1992]. Da die genaue Position der Sulfokonjugation am Steroidmolekül also nicht ausschlaggebend für den Transport zu sein scheint, bleibt die Frage, welche Konformation die SO4 2--Gruppe an den Positionen ’C3 oder C17 des Steroidmoleküls einnehmen kann, damit das Steroid-Sulfat als Substrat von SOAT Diskussion 38 erkannt wird. Interessanterweise konnte für alle in diese Richtung untersuchten Substanzen ein signifikanter, Natrium-abhängiger Transport über SOAT nachwiesen werden. Die Substraterkennung von SOAT scheint also an der Sulfat-Position flexibel zu sein und akzeptiert eine Konformation der SO4 2-Gruppe in 3α- (AnS) oder 3β- (epiAnS) sowie 17α- (epiTS) oder 17β-Position (TS). Außerdem konnte gezeigt werden, dass neben E2-17S noch weitere, C17 einfach sulfokonjugierte Steroide von SOAT transportiert werden: TS und epiTS (Publikation #1). Als weitere Testsubstanz wurde DHTS verwendet, das auf Grund der 5α-Reduktion eine etwas andere Konformation des A-Rings im Vergleich zu TS aufweist, aber genau wie TS an eine C17 eine SO4 2--Gruppe in β-Konformation besitzt. Auch für DHTS wurde ein signifikanter Transport gezeigt und damit ergänzt DHTS die Liste der SOAT Substrate. Sulfokonjugierte Steroidhormone wurden ursprünglich als metabolische Abfallprodukte betrachtet. In den letzten Jahren hat sich allerdings herausgestellt, dass sie ein im Organismus zirkulierendes Reservoir für biologisch aktive Steroidhormone darstellen [Selcer et al., 2002; Pasqualini, 2005; Pasqualini und Chetrite, 2005; Geyer et al., 2017]. Dank ihrer längeren Halbwertszeit können sulfokonjugierte Steroide im Kreislauf länger persistieren als ihre nicht konjugierten Formen. Ihre Hydrolyse durch die StS findet größtenteils in hormonabhängigen Geweben wie der Brustdrüse, den Ovarien, dem Hoden, der Plazenta (speziesabhängig) und dem Uterus statt [Hobkirk, 1993; Reed et al., 2005; Müller et al., 2015; Geyer et al., 2017]. Bemerkenswert ist, dass die plazentare StS-Expression während der Schwangerschaft wesentlich höher ist als die StS-Expression in anderen Geweben und dass auch die Blutspiegel für sulfokonjugierte Steroide während dieser Zeit stark erhöht sind [Hill et al., 2010a; Hill et al., 2010b]. Besonders die Werte von PregS und DHEAS, die neben AnS die dominierenden, sulfokonjugierten Steroide im Organismus darstellen, waren im Blut der Umbilikal-Arterie, im Vergleich zu ihren nicht sulfokonjugierten Formen, deutlich höher [Labrie et al., 2003; Mathur et al., 1980; Hill et al., 2010a; Müller et al., 2015]. Der Transport von Steroid-Sulfaten aus dem fetalen Kreislauf in die Zellen der Plazenta muss durch plazentare Transporter, wie z. B. OATP2B1, OAT4 und SOAT vermittelt werden [Schweigmann et al., 2014; Ugele et al., 2003; Ugele et al., 2008; St-Pierre et al., 2002]. Das im mütterlichen Blut zirkulierende PregS kann in endokrinen Geweben als Vorläufer für verschiedene Steroidhormone genutzt werden [Komatsuzaki et al., 1987]. Diskussion 39 Darüber hinaus konnten Labrie et al. zeigen, dass verschiedene hormonabhängige, humane Krebsformen, wie z. B. Prostatakrebs (PK) und Brustkrebs (BK), nicht passiv von zirkulierenden Steroiden abhängig sind, sondern selber lokal Steroidhormone aus nicht aktiven, zirkulierenden Vorläufern erzeugen können [Labrie, 1991]. Zirkulierendes DHEAS kann beispielsweise in PK- bzw. BK-Gewebe als Vorläufer für die lokale Bildung von Androgenen und Östrogenen genutzt werden. SOAT, der als Aufnahmetransporter für sulfokonjugierte Steroide dient, wird besonders in hormonabhängigen Geweben exprimiert [Geyer et al., 2007; Fietz et al., 2013]. Diesem Transporter kommt daher vermutlich eine physiologische Funktion für die Versorgung dieser Gewebe mit Steroiden zu. In hormonabhängigen Tumoren, wie BK oder PK, könnte SOAT darüber hinaus auch pathophysiologisch von Bedeutung sein. Besser untersucht sind in dieser Beziehung jedoch OATPs. So wurde für einige OATPs beschrieben, dass ihre Expression bei bestimmten Krebsformen entweder nach oben oder nach unten reguliert wird. Z. B. ist die Expression von OATP2B1 im BK- Gewebe im Vergleich zu nicht malignem Brustgewebe niedriger [Wlcek et al., 2008]; die Transkriptionsniveaus von OATP1A2 waren in malignem BK-Gewebe höher als in benachbartem, nicht malignem Brustgewebe [Meyer zu Schwabedissen et al., 2008]; und eine OATP1B3-Expression wurde in PK-Gewebe, allerdings nicht in normalem Prostatagewebe oder benigner Prostatahyperplasie gefunden [Hamada et al., 2008]. OATPs transportieren jedoch eine Vielzahl verschiedener amphipathischer Verbindungen und sind daher im Transport nicht spezifisch für sulfatierte Steroide, wie SOAT [Obaidat et al., 2012]). Mit Hilfe der hier präsentierten Daten können nun die strukturellen Anforderungen von SOAT- Substraten sowie die Abmessungen der mutmaßlichen SOAT-Bindungstasche weiter definiert werden. Während Konformationsänderungen des Steroidgrundgerüsts (z. B. für Gallensäuren in cis- trans-trans-Konformation) oder eine Glucuronid-Konjugation (z. B. 17β-Estradiol-3-Glucuronid) einen Transport über SOAT verhindern, wird die Orientierung der Sulfatgruppe in C3 oder in C17 Position sowohl in α- als auch in β-Konformation akzeptiert. Dies lässt vermuten, dass die negativ geladene Sulfatgruppe, die mit SOAT vermutlich eine Wasserstoffbindung eingeht, sehr flexibel in der SOAT-Bindungstasche andocken kann. In allen Transportversuchen wurden zwei verschiedene Negativkontrollen verwendet. SOAT- HEK293-Zellen wurden entweder mit Natrium-haltigem oder Natrium-freier Transportpuffer (Natrium-freie Kontrolle) inkubiert und alle Experimente wurden zusätzlich in HEK293-Zellen ohne das gene of interest (GOI) durchgeführt (Kontrollzellen). Diskussion 40 Obwohl keine kinetischen Transportmessungen durchgeführt wurden, können die Transportraten der verschiedenen Substrate anhand ihrer Transportverhältnisse (Transport in Natrium-haltigem Puffer vs. Transport unter Natrium-freien Bedingungen) verglichen werden (Tabelle 1). Scheinbar beeinflusst nicht die Position der Sulfatgruppe an sich, sondern die Gesamtkonformation des sulfokonjugierten Steroids die Transportaktivität von SOAT. Diese Strukturinformationen könnten helfen, bereits etablierte SOAT-Inhibitoren zu optimieren, die in der Therapie des hormonabhängigen Brust- oder Prostatakrebses relevant sein könnten [Grosser et al., 2016]. Diskussion 41 Name Struktur Position MG (g/mol) Transportratio Estron-Sulfat (E1S) Aromatischer A-Ring Position 3‘: SO4 2--Gruppe 350,4 12,2# * 17β-Estradiol-3- Sulfat (E2-3S) Aromatischer A-Ring Position 3‘: SO4 2--Gruppe Position 17‘: OH-Gruppe in β-Konformation 374,4 19§ ^ 17β-Estradiol-17- Sulfat (E2-17S) Aromatischer A-Ring Position 17‘: SO4 2--Gruppe in β-Konformation 352,4 -§ ^ - TABELLE 1: SUBSTRATE VON SOAT/SOAT – ÖSTROGEN-SULFATE + [Geyer et al., 2004] # [Geyer et al., 2007] § [Grosser et al., 2018] * LSC ^ LC-MS/MS Diskussion 42 Name Struktur Position MG (g/mol) Transportratio Pregnenolon-Sulfat (PregS) Doppelbindung zwischen Positionen 5‘ + 6‘ Position 3‘: SO4 2--Gruppe in β-Konformation 418,5 6§ ^ 17α-Hydroxy- Pregnenolon-Sulfat (17α-OH-PregS) Doppelbindung zwischen Positionen 5‘ + 6‘ Position 3‘: SO4 2--Gruppe in β-Konformation Position 17‘: OH-Gruppe in α-Konformation 412,5 -§ ^ TABELLE 2: SUBSTRATE VON SOAT/SOAT – GESTAGEN-SULFATE + [Geyer et al., 2004] # [Geyer et al., 2007] § [Grosser et al., 2018] * LSC ^ LC-MS/MS Diskussion 43 Name Struktur Position MG (g/mol) Transportratio Androsteron-Sulfat (AnS) Position 3‘: SO4 2--Gruppe in α-Konformation Position 5‘: Zusätzliches H+-Ion in α-Konformation 370,5 20§ ^ Epiandrosteron- Sulfat (epiAnS) Positio