Untersuchungen zu leukozytären Oberflächenantigenen und der Bildung von IFN-gamma und IL-4 bei Zellen aus der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALF) von Pferden mit COB - Franz, Manuela; Justus Liebig University Giessen (My University, 2006)
Die Erkenntnisse zur Pathogenese der Chronisch Obstruktiven Bronchitis (COB) des Pferdessind lückenhaft, so dass bis zum heutigen Zeitpunkt lediglich eine symptomatische Therapiezur Verfügung steht. Obwohl von mehreren Autoren vermutet wird, dass die Erkrankung wiedas Asthma des Menschen auf einer überschießenden TH2-Reaktion beruht, gelangten dieUntersucher, die ihren Studien hauptsächlich exazerbierte COB-Formen zugrunde legten,bislang nicht zu einem einheitlichen Ergebnis.Die Hypothese der vorliegenden Arbeit war, dass eine verbesserte phänotypische undfunktionelle Charakterisierung der Lymphozyten aus der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit(BALF) bei klinischen COB-Patienten eine Detektion und Quantifizierung lymphozytärerVeränderungen erlaubt, die Rückschlüsse auf die Pathogenese der Erkrankung zulassen. In einem ersten Untersuchungsblock wurden 48 equine Patienten zunächst klinisch undlabordiagnostisch untersucht, tracheobronchoskopiert und einer bronchoalveolären Lavageunterzogen. Die gewonnenen Zellen aus der BALF wurden lichtmikroskopisch differenziert. Daneben erfolgte eine durchflusszytometrische Charakterisierung von Granulozyten,Makrophagen und insbesondere Lymphozytensubpopulationen anhand vonZweifachmarkierungen und der Detektion von Aktivierungsantigenen. Diedurchflusszytometrische Zelldifferenzierung wurde mit den lichtmikroskopischenDifferentialzellbildern verglichen. Zudem wurden über die Markierung mitDetektionsantikörpern die beiden Zytokine IFN-gamma und IL-4 auf Niveau der Einzelzelle direktquantifiziert. Die durchflusszytometrischen Daten wurden auf Zusammenhänge mit denParametern aus der routinemäßigen COB-Diagnostik überprüft. Aus der Tiergruppe wurden15 Pferde medikamentell mit Dexamethason, dem beta2-Sympathomimetikum Clenbuterol unddem Mukolytikum Dembrexin behandelt. Weitere sieben Patienten wurden mitLaserakupunktur therapiert. Diese Tiere erhielten keine Pharmaka und können alsVergleichsprobanden dienen. Sieben Tage nach Beginn der jeweiligen Therapie wurden diePatienten einem zweiten Untersuchungsblock unterzogen, so dass ein prä-/posttherapeutischerVergleich auf Ebene des Einzeltieres ermöglicht wurde.Bei der an Blutzellen orientierten durchflusszytometrischen Identifikation der einzelnenAbwehrzellpopulationen in der BALF wurde deutlich, dass sich in den eingestelltenMessregionen nicht ausschließlich die gewünschten Leukozyten befanden. Dieimmunphänotypische Untersuchung ermöglichte die eindeutige Identifikation derLymphozyten, deren Nachweis auch in den Bereichen der Granulozyten und Makrophagengelang. In der Messregion der Lymphozyten trug im Vergleich mit CD4+ Zellen ein größererProzentsatz der CD8+ Lymphozyten das CD9-Antigen, das auf aktivierten T-Zellen zu findenist. Zudem weisen insbesondere die Korrelationen mit der lichtmikroskopischenDifferenzierung darauf hin, dass Granulozyten aus der BALF sowohl das CD13- als auch dasCD9-Antigen tragen.Im Zuge der posttherapeutischen Verbesserung der klinischen Krankheitssymptomatikkonnten in den Regionen von Lymphozyten und Makrophagen prozentuale Anstiege vonCD9+ Lymphozyten verzeichnet werden, die nicht mit den übrigen Lymphozytenmarkernanzufärben waren, so dass diese aktivierten Zellen mit einem günstigen Einfluss auf dieLungengesundheit der Patienten verknüpft sind.Zur Beurteilung der Lymphozytenfunktion wurde erstmals eine direkte Quantifizierung derIFN-gamma bzw. IL-4 produzierenden Zellen aus der BALF mit kreuzreagierenden bovinenDetektionsantikörpern durchgeführt. Die prätherapeutischen Prozentsätze der IFN-gamma bzw. IL-4bildenden Lymphozyten sprechen für ein TH2-geprägtes Zytokinmuster in den Atemwegender untersuchten COB-Patienten. Posttherapeutisch war bei den meisten Pferden ein Anstiegdes Anteils IFN-gamma+ Lymphozyten aus der bronchoalveolären Lavageflüssigkeit (BALL) zuverzeichnen. Der Quotient der Prozentsätze IFN-gamma+ zu IL-4+ BALL stieg statistisch signifikantan. Unterschiede zwischen den beiden Therapiemethoden konnten nicht ermittelt werden. Sowohl in der Medikamenten- als auch in der Laserakupunkturgruppe wurde bei einemGroßteil der Probanden mit einer klinischen Verbesserung das Zytokinmuster in den tiefenAtemwegen in Richtung eines TH1-Profils verändert.Neben einer erweiterten und detaillierteren Untersuchung der Lymphozytensubpopulationenist somit insbesondere die funktionelle Charakterisierung der Lymphozyten aus der BALFüber die direkte Quantifizierung von IFN-gamma und IL-4 zur Aufdeckung lymphozytärerVeränderungen bei klinischen COB-Patienten geeignet. Obwohl die Methodik des direktenZytokinnachweises für die Routinediagnostik bislang noch zu aufwendig erscheint, könnte siein zukünftigen Pathogenesestudien zur equinen COB bzw. für Entwicklung, Optimierung undVergleich neuer Therapieverfahren als wertvolles und objektivierbares Diagnostikum dienen.

Since knowledge of the pathogenesis of recurrent airway obstruction (RAO) in the horse isincomplete, merely a symptomatic therapy is available. Many authors suspect, that thedisorder is comparable to human asthma and is based on an excessive TH2 reaction. However,researchers, who mainly have investigated exacerbated forms of RAO, have not yet reached auniform conclusion. The hypothesis of this dissertation was that an improved phenotypic and functionalcharacterization of lymphocytes in the bronchoalveolar lavage fluid (BALF) allows thedetection and quantification of lymphocytic changes in clinical RAO patients, allowingconclusions to the pathogenesis of the disorder.In the first examination block, 48 equine patients with RAO underwent clinical and laboratoryexaminations, tracheobronchoscopy and bronchoalveolar lavage. BALF cells weredifferentiated by light microscopy. In addition, a flow cytometric characterization ofgranulocytes, macrophages and particularly lymphocyte subpopulations was performed byimmunofluorescent double staining and the detection of activation antigens. Results of flowcytometric analysis were compared with cell differentiation by light microscopy. Furthermore, via direct detection by antibodies, IFN-gamma and IL-4 were quantified on single-celllevel. All flow cytometric data were checked for correlations with the parameters of theroutine RAO diagnostics. From the total group of 48 animals, 15 horses were subsequentlymedicated with Dexamethasone, the gamma2-sympathomimetic Clenbuterol and the mucolyticDembrexine. Additionally seven patients were treated with laser acupuncture. These animalsdid not receive any pharmaceuticals and therefore serve to some degree as control subjects.After seven days of therapy, the patients underwent a second examination block to enable apre/post-therapeutic comparison on a single-animal basis.The blood cell oriented flow cytometric identification of BALF cell populations revealed, thatwithin the preset measuring gates, there were not exclusively expected leucocytes present. The immunophenotypic analysis allowed a definite identification of lymphocytes, which wereto some degree detected in the granulocyte and macrophage gates. In the lymphocyte gate,compared to the CD4+ cells, a higher percentage of CD8+ lymphocytes carried the CD9antigen, which can be found on activated T-cells. Furthermore correlation coefficientsbetween flow cytometric and light microscopic cell differentiation indicate that granulocytesin the equine BALF carry CD13 and CD9 antigens concurrently. With post-therapeutic improvement of the clinical signs, increases of CD9+ lymphocytepercentages,which could not be stained by the other lymphocyte markers, were recorded inthe lymphocyte and macrophage gates. This leads to the conclusion that these activated cellshave a positive effect on the patients lung health.For the first time, as known to the author, lymphocyte function was assessed by directquantification of IFN-gamma and/or IL-4 producing BALF cells using cross-reacting bovinedetection antibodies. Percentages of IFN-gamma and/or IL-4 forming lymphocytes in BALF ofRAO patients were consistent with a TH2 cytokine pattern. After therapy, in most horses anincrease of the IFN-gamma+ bronchoalveolar lavage lymphocytes (BALL) was seen. Statistically,the ratio IFN-gamma+/IL-4+ BALL percentages rose significantly. Differences between the twotherapy methods could not be detected. Medication and laser acupuncture caused in a majorityof subjects a significant clinical improvement and a change of the cytokine pattern in the deepairways towards a TH1-profile. In addition to an extended and more detailed examination of BALF lymphocytesubpopulations, the direct quantification of IFN-gamma and IL-4 is especially helpful for theassessment of functional changes in clinical RAO-patients. Direct cytokine detection so far istoo elaborate for routine diagnostic. However, in research towards pathogenesis andimprovement of therapy of equine RAO, it will serve as a valuable method.
Keywords: ddc:630