Biotechnologische Produktion einer Vitamin D reichen, alternativen Proteinquelle durch Basidiomyceten auf industriellen Nebenströmen - Ahlborn, Jenny; Justus Liebig University Giessen (My University, 2019)
Im Zuge der stetig wachsenden Weltbevölkerung muss nach alternativen Nahrungsquellen geforscht werden, um den Kalorien- und Proteinbedarf der Bevölkerung decken zu können. Innovative Lebensmittel sollten nicht nur ressourcenschonend produziert werden, sondern auch der Nachfrage der Bevölkerung nach gesunden und nachhaltigen Lebensmitteln gerecht werden. Ziel dieser Arbeit war es daher, anfallende Nebenströme der Lebensmittelindustrie zu verwenden und als Kohlenstoffquelle für das Wachstum von Basidiomyceten (Speisepilze) zu verwenden. Das durch Submerskultivierung erzeugte Myzel sollte proteinreich und schnell zu produzieren sein, um es als alternative Proteinquelle für die Herstellung von veganen oder vegetarischen und innovativen Lebensmittel in der menschlichen Ernährung verwenden zu können.Zu Beginn wurden verschiedene Pilz-Substrat-Kombinationen auf die erzeugte Biomasse und den Proteingehalt hin untersucht. Als Substrate wurden verschiedene Trester (Apfel, Granatapfel und Aronia), Blattspinat und Rübenmelasse untersucht, sowie acht verschiedene Basidiomyceten. Pleurotus sapidus, der für vier Tage auf Apfeltrester kultiviert wurde, lieferte mit etwa 14 g L-1 die höchste Biotrockenmasse; der Reinproteingehalt betrug 21%. Das Produkt wurde lyophilisiert und für alle weiteren Analysen eingesetzt. Im Verlaufe der Arbeit wurde dieses Lysophilisat auf seine Zusammensetzung hin untersucht: 4% Fett (davon 45% Linolsäure als Hauptfettsäure), 2% Asche und 74% Kohlenhydrate. Die Analyse des Chitingehaltes ergab 6,3%. Das Aminosäureprofil wurde eingehend untersucht und nicht nur der durchschnittliche Proteinstickstoffgehalt (17,9%) analysiert, sondern auch der Stickstoff-zu-Protein- Umrechnungsfaktor Nnet (4,11) ermittelt, der bei der Berechnung des Reinproteingehaltes Verwendung findet. Mit einem Wert von 86 wies das Lyophilisat eine sehr gute biologische Wertigkeit auf, mit Cystein und Methionin als limitierende Aminosäuren. Wiederfindungsraten der Aminosäuren wurden über die Analyse eines Referenzproteins mit bekannter Zusammensetzung ermittelt. Der Einfluss des C:N-Verhältnisses auf die Proteinbildung wurde ebenfalls diskutiert. Demnach kann ein hoher Stickstoffanteil unter Umständen zu höheren Proteinausbeuten führen. Eine Maßstabsvergrößerung im 150 L Bioreaktor konnte erfolgreich durchgeführt werden. Die hohe Biomasse konnte aufrechterhalten werden, wohingegen das Myzel 20% weniger Protein enthielt.Um den reinen Pilzanteil am Lyophilisat zu quantifizieren, wurde eine Biomassenquantifizierungsmethode über die Bestimmung des Ergosterolgehaltes mittels Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC) etabliert. So konnte festgestellt werden, dass das analysierte Lyophilisat lediglich etwa 50% Myzel enthielt. Zahlreiche Versuche wurden durchgeführt, um diesen Anteil zu steigern. Ein Fed-Batch-Verfahren lieferte letztendlich 89% Pilzanteil mit 5,4 g L-1 Trockenmasse nach sechstägiger Kultivierung mit 6,15 g L-1 Apfeltrester und erneuter Substratzugabe nach vier Tagen. Reines Pilzmyzel, das als Bezugswert zur Berechnung des Pilzanteils herangezogen wurde und auf Malzextraktmedium kultiviert wurde, wies einen Ergosterolgehalt von (7.147,5 ± 353,7) myg (g TM)-1 auf.Ergosterol diente nicht nur als Biomarker, sondern auch als Präkursor für die Anreicherung mit Vitamin D2, die durch UV-B Belichtung erzielt wurde. Die Gehalte an Ergosterol und Vitamin D2 wurden mittels HPLC analysiert. Verschiedene Studien zeigten, dass es nach 10- bis 20-minütiger Belichtung zu einer Stagnation bei der Anreicherung kam. Im belichteten Lyophilisat von P. sapidus auf Apfeltrester konnten so bis zu 115 myg (g TM)-1 Vitamin D2 erzielt werden. Neben verschiedenen Belichtungszeiten wurden auch Messreihen mit aktivem und hitzeinaktiviertem Myzel in vollständiger Submerskultur durchgeführt. Weiterhin wurden der Einfluss der Oberfläche und die Lagerstabilität von belichtetem Lyophilisat untersucht.

As the world´s population continues to rise, alternative nutritional food sources need to be developed to meet the increasing global protein demand. Innovative food should not only be produced in a time and resource efficient way, but should also meet the society´s demand of being healthy and sustainable. The aim of this work was thus to produce protein rich basidiomycetes (edible mushrooms) via submerged cultivation, while making use of by-products of the food industry as sole carbon source. The product (fungal mycelium) obtained from the submerged cultivation could then qualify as an alternative source of protein for the production of vegan/vegetarian foods to be used for human nutrition.Various fungus-substrate combinations were screened for biomass production and protein content. As substrates, different pomaces (apple, pomegranate and aronia), leaf spinach and beet molasses were investigated. Eight different basidiomycetes, including Pleurotus sapidus, were tested. P. sapidus grown on apple pomace provided the best results. The product obtained from the submerged fermentation from these cultures was lyophilised and used for further experiments. After four days of submerged cultivation, 14 g L-1 dry biomass with a pure protein content of 21% was obtained. The lyophilisate was analysed for its chemical composition: 4% fat with 45% linoleic acid as the main fatty acid, 2% ash and 74% carbohydrates including 6.3% chitin. The amino acid profile was examined in detail. The average nitrogen content of the protein (17.9%) was analyzed. A nitrogen-to-protein conversion factor, Nnet (4.11), was calculated to determine pure protein contents. With a value of 86, the lyophilisate showed a high biological value, with cysteine and methionine as limiting amino acids. Recovery rates of the amino acids were determined by analysis of a reference protein of known composition. The influence of the C:N ratio on the protein content was also evaluated, and a high nitrogen content may lead to higher protein yields.Upscaling to a 150 L bioreactor was successfully performed. High biomass production could be achieved, whereas the mycelium contained 20% less protein.In order to quantify the fungal content of the lyophilisate, a high performance liquid chromatographic (HPLC) method was established to determine the ergosterolcontent of the biomass. The lyophilisate obtained from a 4 day submerged cultivation of Pleurotus sapidus grown on apple pomace contained only about 50% fungal mycelium. Numerous attempts were made to increase this proportion. Finally, a fed-batch process yielded 89% fungal content with 5.4 g L-1 dry matter after six days of cultivation. The initial concentration of apple pomace in the culture medium was 6.15 g L-1. After four days another 6.15 g L-1 were added. Pure mushroom mycelium cultured in malt extract medium was used as a reference for calculating the fungal content. The reference mycelium had an ergosterol content of (7147.5 ± 353.7) myg (g dry matter)-1.Ergosterol did not only serve as a biomarker, but also as a precursor for vitamin D2. Vitamin D production was achieved by exposure of the mycelia to UV-B light. Various experiments showed stagnation after 10 to 20 minutes of exposure. In the exposed lyophilisate of P. sapidus cultivated on apple pomace, up to 115 myg (g dry matter)-1 vitamin D2 were formed. In addition to different exposure times, a series of measurements with heat-inactivated submerged cultures, the influence of surface area and storage stability of the UV-B exposed lyophilisate, on vitamin D2 accumulation were investigated.
Biotechnological production of a vitamin D rich, alternative protein source by basidiomycetes on industrial side streams
Keywords: Basidiomyceten; Vitamin D; alternative Proteinquelle; Biomassenquantifizierung; basidiomycetes; vitamin D; alternative protein source; biomass quantification; ddc:540