Konventionelle und molekulare Analysen von Trachealsekret, Mekonium und Stuhl zur ergänzenden Sepsisdiagnostik von Frühgeborenen unter Anwendung der PCR/DHPLC (WAVE©) - Assmann, Mirjam; Justus Liebig University Giessen (My University, 2014)
Obwohl sich in den letzten Jahren die Überlebenschancen der sehr kleinen Frühgeborenen mit einem Gestationsalter <32 Schwangerschaftswochen deutlich verbessert haben, ist deren oft langwierige Krankenhausbehandlung häufig mit Komplikationen verbunden. Diese ergeben sich vor allem durch die Unreife der Organsysteme des Frühgeborenen. Infektionen während der Schwangerschaft vor allem aufsteigende innerhalb des Genitalbereichs der Mutter - gelten als eine der Hauptursachen für eine Frühgeburt, und können sowohl vor als auch nach der Geburt zu einer Sepsis des immungeschwächten Frühgeborenen führen. Auch während des oft langen Krankenhausaufenthaltes kommt es bei Frühgeborenen gehäuft zur Sepsis, dabei umso häufiger, je geringer das Gestationsalter ist. Viele Erreger sind bekannt, jedoch ist ein Erregernachweis mit konventionellen Methoden besonders bei schwer kultivierbaren Bakterien oder bei einer Mischinfektion schwierig, auch aufgrund des geringen Blutvolumens bei Frühgeborenen. Der Goldstandard in der Sepsisdiagnostik die Blutkultur ist trotz klinischer Symptomatik in vielen Fällen negativ.Mit der vorliegenden Arbeit sollten mit einer neuen, kultivierungsunabhängigen molekularbiologischen Methode, der DHPLC (denaturing high-performance liquid chromatography), schwer anzüchtbare Bakterien oder Mischinfektionen in Mekonium und Trachealsekret als mögliche Auslöser einer Frühgeburtlichkeit oder einer konnatalen Sepsis nachgewiesen werden. Darüber hinaus sollte die Entwicklung der Stuhlflora bei sehr kleinen Frühgeborenen mit kultureller Anzucht und DHPLC untersucht werden, auch im Hinblick auf mögliche Zusammenhänge mit einer späteinsetzenden Sepsis. Dazu wurden Mekonium, Trachealsekret und wöchentliche Stuhlproben von insgesamt 25 Frühgeborenen mit einem Gestationsalter von <32 Schwangerschaftswochen untersucht. Die Bakterien im Untersuchungsmaterial wurden zum einen konventionell mikrobiologisch nachgewiesen, zum anderen molekularbiologisch durch PCR und DHPLC. Darüber hinaus wurden klinische Angaben zu den Kindern und den Umständen der Frühgeburt recherchiert.Dabei ließen sich in Mekonium und Trachealsekret Bakterien nachweisen, die eine konnatale Sepsis auslösen können. Aus der Verbindung zwischen der Studienlage zu den einzelnen Bakterien und der klinischen Befunde der Kinder ergaben sich die deutlichsten Hinweise für einen kausalen Zusammenhang zur Sepsis für Fusobacterium nucleatum, Bacillus cereus, Achromobacter xylosoxidans und Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus. In Bezug auf Zusammenhänge zwischen den nachgewiesenen Bakterien und deren möglichem Auslösen der Frühgeburt sind insbesondere Fusobacterium nucleatum, Bacillus cereus, Achromobacter xylosoxidans, Enterococcus faecalis und Bacillus licheniformis hervorzuheben. Die meisten der genannten Bakterien, vor allem aus Trachealsekret, ließen sich nicht anzüchten. Bei allen Kindern fanden sich im Mekonium Laktokokken, die möglicherweise aus der Nahrung mit Ersatzmilch stammen. Die Blutkulturen der Kinder, bei denen oben genannte Bakterien nachgewiesen wurden, waren negativ. Bei der Untersuchung von 112 Stuhlproben konnten von Beginn an vor allem anaerobe und fakultativ anaerobe - insbesondere Enterobacteriaceae, sowie Enterokokken nachgewiesen werden. Darüber hinaus konnten auch Bakterienspezies nachgewiesen werden, die nicht kulturell angezüchtet werden konnten, wie z.B. Veillonella sp., Clostridium sp. und Fusobacterium sp, und die als Auslöser von Sepsis vorbeschrieben sind. Insgesamt stieg die Anzahl der Bakterienspezies bis zur fünften Lebenswoche stetig an, parallel dazu stieg die Anzahl der Peaks in der DHPLC an. Ab der fünften Woche überstieg die Anzahl der Peaks die Anzahl der angezüchteten Bakterienspezies pro Kind. Mit der DHPLC aus Stuhlproben ließen sich bis zu vier verschiedene Bakteriengattungen und spezies auftrennen.Die im Verlauf entnommenen Blutkulturen zeigten dreimal so häufig ein positives Ergebnis wie die Blutkulturen unmittelbar nach Geburt, was mit den verabreichten Antibiotika bei Müttern und Kindern sub partu zusammenhängen könnte. Dabei wurden hauptsächlich koagulasenegative Staphylokokken nachgewiesen, einmalig Enterococcus faecalis und Bacillus cereus. Bei zwei Kindern mit koagulasenegativen Staphylokokken in der Blutkultur zeigte sich dasselbe Bakterium in anschließenden Stuhlproben. Bei drei Kindern waren bis zu drei Tage vor der Verdachtsdiagnose Sepsis keine Bakterien anzüchtbar, bei zwei war kein Peak in der DHPLC zu sehen. Dies ist möglicherweise durch die zuvor verabreichten Antibiotika erklärbar, die auch einen Risikofaktor bei der Entwicklung einer Sepsis darstellen.Insgesamt handelt es sich bei der DHPLC um eine empfehlenswerte Methode zur Ergänzung der Diagnostik bei konnataler Sepsis. Dabei sind die Materialien Mekonium und Trachealsekret leichter verfügbar als Blut, und in der vorliegenden Arbeit konnten damit häufiger sepsisauslösende Bakterien nachgewiesen werden. Bei der Untersuchung von Stuhl mit DHPLC konnte der Darm als Erregerreservoir für eine Sepsis durch Anaerobier, Enterobacteriaceae und Enterokokken aufgezeigt werden im Rahmen der Diagnostik zur späteinsetzenden Sepsis scheint die DHPLC aufgrund der großen Bakteriendiversität im Stuhl nur eingeschränkt geeignet.

Although the chances of survival for preterm neonates below 32 weeks of gestation have notably improved during the last years, their often longterm hospital care is in many cases accompanied with complications. Most of all, these are induced by the immaturity of the preterms organic systems. Infections during pregnancy mainly ascendant in the mothers genitourinary tract are considered to be one of the main causes for preterm birth. Before and even after birth, they can cause septicaemia in the immunodeficient preterm neonates. Septicaemia also often appears during the longterm hospital stay - the lower the gestational age the more frequent. Numerous causative pathogens are already known, but the detection of non-cultivable organisms or polymicrobial infections with conventional microbial diagnostics is still difficult, in addition because of the preterms low blood volume. Blood cultures the gold standard method in the diagnostic of septicaemia often show no results despite clinical symptoms.The aim of this study was to detect non-cultivable bacteria or polymicrobial infections causing early- or late-onset septicaemia or premature birth with a new culture-independent molecular method, the DHPLC (denaturing high performance liquid chromatography). Therefore, samples of meconium, tracheal aspirate and stool from 25 preterm neonates at a gestational age below 32 weeks were collected and examined with conventional microbial diagnostic and with PCR/DHPLC. Underlying was the idea, that with this culture-independent method it would be able to detect bacteria in meconium or tracheal aspirate, respectively, being related to preterm birth or early-onset septicaemia. A further aim was to extend the common knowledge of the development of the preterm neonates gut colonization and to examine stool samples for potential causative agents of late-onset septicaemia.By both conventional and culture-independent methods it was possible to detect bacteria in meconium and tracheal aspirate potentially able to cause early-onset septicaemia. In relation to previous studies and the preterms clinical results the most causative connection between germ and septicaemia was found for Fusobacterium nucleatum, Bacillus cereus, Achromobacter xylosoxidans and Staphylococcus hominis subsp. novobiosepticus. Causal relationship between the detected bacteria and preterm birth was strongest for Fusobacterium nucleatum, Bacillus cereus, Achromobacter xylosoxidans, Enterococcus faecalis and Bacillus licheniformis. Most of the above mentioned bacteria, especially from tracheal aspirate, were not cultivable. Furthermore, in meconium samples of all preterm neonates, Lactococcus sp. was detectable, probably deriving from food. Any blood cultures taken immediately after birth from preterm neonates colonized with the above mentioned bacteria were negative. The examination of weekly taken stool samples showed right from the beginning mainly anaerobes, facultative anaerobes especially Enterobacteriaceae - and Enterococcus sp. Furthermore, with DHPLC non-cultivated bacteria such as Veillonella sp., Clostridium sp. and Fusobacterium sp. were detected, each of them known as potential causative agent of septicaemia. The number of different bacterial species arised continually until fifth week after birth, as it was with the number of peaks in DHPLC. After the fifth week, the number of peaks exceeded the number of cultivated species per child. With DHPLC it was possible to separate up to four bacterial species in one stool sample.Blood cultures taken during the hospital stay showed three times as much bacterial growth as it was with the ones taken immediately after birth. This could be related with the administered antibiotics for both mother and child during and after birth. Positive blood cultures mainly showed growth of coagulase-negative staphylococci, as well as Enterococcus faecalis and Bacillus cereus once each. Two children with positive blood culture for coagulase-negative staphylococci showed the same bacteria in following stool samples. Stool samples of three preterm neonates were culture-negative up to three days before diagnosis of septicaemia. Two of them even showed no peak in DHPLC. This may be caused by previous administered antibiotics, which are also described as a risk factor for developing late-onset septicaemia.In conclusion, the DHPLC is a recommendable method to complement the diagnostic process during early-onset septicaemia by examining meconium and tracheal aspirate. Both sample materials are easy available, and examined by both culture-dependent and culture-independet methods seem to reveal more often pathogens related to septicaemia as do blood cultures. Examining of stool samples confirmed the human gut as a potential reservoir for pathogens causing late-onset septicaemia, especially for anaerobes, Enterobacteriaceae and enterococci. Due to the wide intestinal bacterial diversity in stool samples the usage of DHPLC for detecting pathogens during septicaemia seems to be limited.
Keywords: ddc:610